CN104031839A - 一种桑椹表面致腐菌的筛选方法 - Google Patents

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桂仲争
方银
贾俊强
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Abstract

本发明公开了一种桑椹表面致腐菌的筛选方法，(1)取腐烂的成熟桑椹培养致腐菌液；(2)以果胶或羧甲基纤维素钠为唯一碳源，制备初筛培养基；(3)用无菌生理盐水稀释致腐菌液成不同浓度，取1ml稀释液涂布于初筛培养基上，并在27-28℃条件下培养72-78h，获得菌落群；(4)挑取初筛培养基上长出的菌落至含10％桑椹汁的PDA培养基中进行纯培养，连续分离3-5次，获得的单一菌落即为桑椹致腐菌落。该工艺操作简便，选择性强，分离效果优。

Description

一种桑椹表面致腐菌的筛选方法
技术领域
本发明属于微生物领域，具体是涉及桑椹表面致腐菌-链格饱属菌的筛选方法。
背景技术
桑椹含有丰富的还原糖、有机酸、维生素和各种矿物质以及花青素和白藜芦醇等功能成分，经常食用有利于提高人体免疫力、延缓衰老、美容养颜等,已被国家卫生部列为药食同源的食品。最新研究显示，桑椹还具有促进造血细胞生长、抗诱变、降血糖、降血脂、护肝等药理作用。桑椹属于浆果类，表皮极薄，果实柔软多汁、呼吸旺盛、果表面有柱状突起，成熟期短，成熟果实采摘或运输过程中极易受到损伤；加之桑椹成熟期正值高温天气，易受病原微生物感染，导致大量腐烂。但桑椹自身的防疫机制对大多数病原微生物都有一定的抵御能力，因此真正能够侵入桑椹内部致病的病原菌也只是极少数。筛选并鉴定出导致桑椹腐败的主要病原物，对建立有效的桑椹保鲜技术具有重要意义，已有的研究表明，致使桑椹腐烂的主要病原微生物为真菌，其次为细菌。
发明内容
本发明目的是提供桑椹表面致腐菌的筛选方法，操作简便，选择性强，分离效果优。
为了达到上述目的，本发明所采用的技术步骤如下：
(1)致腐菌液的制备：取腐烂桑椹，切碎后置于无菌生理盐水中，浓度为20-25质量％，振荡培养，所得培养液即为致腐菌液；
(2)初筛培养基的制备：分别以果胶和羧甲基纤维素钠(CMC-Na)为唯一碳源，制备初筛培养基，具体是：称取果胶或CMC-Na0.5％，K2HPO30.1％，(NH4)2SO42％，NaCl0.05％，琼脂1.8％，121℃灭菌20-25min即可，其中涉及的百分比为质量百分比；
(3)致腐菌落群培养：将步骤(1)中的致腐菌液用无菌生理盐水稀释成浓度为10-4,10-5,10-6，分别取1mL稀释液涂布于步骤(2)获得的初筛培养基上，并在27-28℃条件下培养72-78h，获得菌落群；
(4)单菌落培养：挑取步骤(3)获取的初筛培养基上长出的菌落，接种至含10wt％桑葚汁的PDA培养基中进行纯培养，反复分离3-5次，获得的单一菌落即为致腐菌落。
(5)验证试验：
A.培养基验证试验：在无菌条件下，将筛选所得的致腐菌落分别接种至含10％桑椹汁和不含桑椹汁的PDA培养基中，27-28℃培养箱中培养5-7天，观察接种圈生长情况，如果含10％桑椹汁PDA培养基中接种圈明显比不含桑椹汁PDA培养基中接种圈大，则初步说明所筛病原菌为桑椹致腐菌。
B.桑椹验证试验：在无菌条件下，将筛选所得的致腐菌落涂布于已处理的无菌桑椹表面，然后放至已灭菌的培养箱中，27-28℃培养5-7天，观察其腐败状态是否与初筛以前腐败状态一致，如果是，则初步验证所筛病原菌为桑椹致腐菌。
(6)致腐菌株种属特性的分子鉴定：
采用真菌基因组DNA快速抽提试剂盒提取致腐菌菌株总DNA；依据真核微生物18S rRNA保守性设计真菌通用引物；经PCR扩增，PCR扩增产物与pMD18-T载体的连接；细胞转化；基因克隆与测序，与GenBank数据库比对等分子生物学过程，验证该致腐菌的种属特性，证实该致病菌为链格饱属菌。
本发明的优点和有益效果：
1.由于桑椹表皮细胞壁含大量果胶和纤维素，因此发明人以果胶和纤维素为唯一碳源，进行培养基定向筛选，针对性强。
2.利用含桑椹汁的PDA培养基和不含桑椹汁的PDA培养基进行验证试验，以及无菌桑椹的体表验证，可初步判断所筛选微生物的来源。
3.分子生物学手段为鉴定所筛选的病原菌属性提供实质性证据。
附图说明
图1是在PDA培养基的接种圏示意图，其中，图1a是含桑椹汁的PDA培养基；图1b是不含桑椹汁的PDA培养基；从图中可见含10％桑椹汁PDA培养基中接种圈(82mm)明显比不含桑椹汁PDA培养基中接种圈(18mm)大，初步说明所筛病原菌为桑椹致腐菌；
图2是所分离致腐菌菌丝的孢子图。图中可见，菌丝有横隔，孢子椭圆形，说明该致腐菌属真菌类。
图3是系统发育树分析图。
具体实施方式
实施例1
一种桑椹表面致腐菌的筛选方法，步骤如下：
(1)致腐菌液的制备：取腐烂的成熟桑椹，切碎后置于的无菌生理盐水中，浓度为20-25质量％，在28℃，2500rpm振荡条件下培养25-30min，所得培养液即为致腐菌液；
(2)初筛培养基的制备：以果胶为唯一碳源，制备初筛培养基，具体是：称取果胶0.5％，K2HPO30.1％，(NH4)2SO42％，NaCl0.05％，琼脂1.8％，121℃灭菌20-25min，即可；
(3)致腐菌液培养：将步骤(1)中的致腐菌液用无菌生理盐水稀释成浓度为10-4,10-5,10-6(此处不同浓度对后面的结果无影响，主要是便于致腐菌的分离)，分别取1ml稀释液涂布于步骤(2)得到的初筛培养基上，并在27-28℃条件下培养72-78h，获得菌落群；
(4)单菌落培养：挑取初筛培养基上长出的菌落，接种至含10％桑葚汁的PDA培养基中进行纯培养，反复分离3-5次，获得的单一菌落即为桑椹致腐菌落。
所述的PDA培养基含20％马铃薯滤液(马铃薯去皮，切块，煮沸，煮到熟而不烂，四层纱布过滤)，2％琼脂，2％葡萄糖，自然pH下，121℃灭菌20-25min即可。
(5)验证试验：
培养基验证试验：在无菌条件下，将筛选所得的桑椹致腐菌落分别接种至含10％桑椹汁和不含桑椹汁的PDA培养基中，27-28℃培养箱中培养5-7天，观察接种圈生长情况(图1)，含10％桑椹汁PDA培养基中接种圈明显比不含桑椹汁PDA培养基中接种圈大，初步说明所筛病原菌为桑椹致腐菌。
桑椹验证试验：在无菌条件下，将筛选所得的致腐菌落涂布于已处理的无菌桑椹表面，然后放至已灭菌的培养箱中，27-28℃培养5-7天，观察其腐败状态是否与初筛以前腐败状态一致，如果是，则初步验证所筛病原菌为桑椹致腐菌。
(6)致腐菌株种属特性的分子鉴定：
采用真菌基因组DNA快速抽提试剂盒提取致腐菌菌株总DNA；依据真核微生物18S rRNA保守性，设计真菌通用引物：P1:5’-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3’；P2:5’-TCCGCAGGTTCACCTACGGA-3’；经PCR扩增，产物回收，PCR扩增产物与pMD18-T载体的连接；连接产物的感受态细胞转化；转化克隆的筛选与鉴定；基因测序并与GenBank数据库比对，系统发育树分析(图2)等分子生物学过程。证实该致腐菌为链格孢属(基因登录号为KJ489375)，该菌是引起大部分蔬菜和水果病害的重要真菌类群之一。
实施例2
与实施例1不同之处在于：初筛培养基以羧甲基纤维素钠(CMC-Na)为唯一碳源，将果胶替换为CMC-Na。

Claims (6)

1.一种桑椹表面致腐菌的筛选方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)致腐菌液的制备：取腐烂桑椹，切碎后置无菌生理盐水中，混合物溶液的浓度为20-25％，在加热、振荡条件下培养，所得培养液即为致腐菌液；
(2)初筛培养基的制备：按照以下组份和含量制备初筛培养基：果胶或CMC-Na0.5％、K2HPO30.1％、(NH4)2SO42％、NaCl0.05％，琼脂1.8％，混合均匀后，灭菌，即可，其中涉及的百分比为质量百分比；
(3)致腐菌落群培养：将步骤(1)中的致腐菌液用无菌生理盐水稀释成稀释液，取1ml稀释液涂布于步骤(2)得到的初筛培养基上，培养，获得菌落群；
(4)单菌落培养：挑取初筛培养基上长出的菌落，接种至含桑椹汁的PDA培养基中进行纯培养，反复分离3-5次，获得的单一菌落即为致腐菌落；
(5)培养基验证和桑椹验证试验，初步验证所筛的病原菌为桑椹致腐菌；
(6)对所筛选的病原菌进行DNA鉴定，确定该病原菌的种属是链格饱属。
2.根据权利要求1所述的桑椹表面致腐菌的筛选方法，其特征在于步骤(1)的培养条件是28℃，2500rpm振荡条件下培养25-30min。
3.根据权利要求1所述的桑椹表面致腐菌的筛选方法，其特征在于步骤(2)的灭菌条件是：121℃灭菌20-25min。
4.根据权利要求1所述的桑椹表面致腐菌的筛选方法，其特征在于步骤(3)的培养条件是：27-28℃条件下培养72-78h。
5.根据权利要求1所述的桑椹表面致腐菌的筛选方法，其特征在于步骤(3)的稀释液浓度为10-4,10-5,10-6。
6.根据权利要求1所述的桑椹表面致腐菌的筛选方法，其特征在于步骤(4)PDA培养基中桑椹汁的质量浓度是10％。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104328059A (zh) * 2014-10-14 2015-02-04 江苏科技大学 桑椹表面致腐拮抗菌的筛选方法
CN108641963A (zh) * 2018-05-31 2018-10-12 江苏农林职业技术学院 一种铁线莲叶斑病致病菌的筛选方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102329736B (zh) * 2011-08-30 2013-01-16 东华大学 一种链格孢db2菌株及其制备和应用
CN102657365B (zh) * 2012-05-28 2013-05-22 合浦果香园食品有限公司 一种新鲜芒果核的保鲜方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102329736B (zh) * 2011-08-30 2013-01-16 东华大学 一种链格孢db2菌株及其制备和应用
CN102657365B (zh) * 2012-05-28 2013-05-22 合浦果香园食品有限公司 一种新鲜芒果核的保鲜方法

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104328059A (zh) * 2014-10-14 2015-02-04 江苏科技大学 桑椹表面致腐拮抗菌的筛选方法
CN108641963A (zh) * 2018-05-31 2018-10-12 江苏农林职业技术学院 一种铁线莲叶斑病致病菌的筛选方法
WO2019227681A1 (zh) * 2018-05-31 2019-12-05 江苏农林职业技术学院 一种铁线莲叶斑病致病菌的筛选方法

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