CN102396346B

CN102396346B - 一种猴头菇

Info

Publication number: CN102396346B
Application number: CN 201110265993
Authority: CN
Inventors: 张金霞; 黄晨阳; 陈强; 高巍
Original assignee: Institute of Agricultural Resources and Regional Planning of CAAS
Current assignee: Institute of Agricultural Resources and Regional Planning of CAAS
Priority date: 2010-02-09
Filing date: 2010-02-09
Publication date: 2013-09-11
Anticipated expiration: 2030-02-09
Also published as: CN102396346A

Abstract

本发明公开了一种猴头菇(Hericium erinaceus)中农猴头1，利用本发明培养方法所得的猴头菌中农猴头1的菌丝体生物产量高，可达12g/L，是目前工厂发酵生产水平的2倍以上；其次本发明猴头菌菌株中农猴头1生长速度快，可达5.8mm/d，且产量高。

Description

一种猴头菇

本发明是申请号为：201010109627.2、申请日为：2010.2.9、发明名称为“猴头菇的液体深层发酵培养方法”专利申请的分案申请。

技术领域：

本发明属于食用菌的培养方法，具体涉及猴头菇的液体深层发酵培养方法，还涉及发酵培养用的培养基。还涉及一种猴头菌。

背景技术：

猴头菌(Hericium erinaceus)，因子实体形状酷似小猴子的头而得名。又称猴头菇、猴头蘑、猥菌、对口蘑、喝巴拉(藏名)、山伏菌(日本)和熊头苗(欧洲)。(吕作舟，食用菌栽培学，高等教育出版社，2006年，P262)。猴头菌是一种兼有食用和药用价值的名贵食用菌，猴头菇多糖能明显抑制胃、食管、肝、皮肤癌的生长，(Mizuno，T.International Journal of Medicinal Mushrooms 1，1999.p105-119.)它的主要活性成分有三种：β-D-葡聚糖，具有抗肿瘤功效；麦角固醇，是维生素D的前体物质；Cyathane衍生物，是一种神经生长刺激因子。(Smith等.cancer research UK.2002.p41-42)。

猴头菌的生产途径主要有三种：一、人工栽培，其优点是简单易行，成本低。其缺点是栽培周期长，整个生产周期约3个月。(张金霞，食用菌安全优质生产技术，中国农业出版社，2004，p191-201)；二、固体发酵，用固体培养基培养猴头菌菌丝体，以获得次生代谢产物。菌丝长满培养基约需30天，继续培养10天左右，pH降至4左右开启棉塞，挖出菌质，晒干供提取用。它的优点：①培养基简单且来源广泛，价格便宜；②发酵过程一般不需要严格的无菌操作；③培养过程供氧和温度可以采用直接空气强制通风来控制；④发酵残渣的处理简单，可直接作为饲料或肥料。但其缺点明显：①培养基水分活度低，培养基不均匀且不易搅拌，菌体的生长、对营养物质的吸收和代谢产物的分泌都不均匀，使得发酵参数的检测和控制困难，也使得连续操作和自动化很困难；②微生物呼吸和代谢所产生热量的温度控制非常困难，因为固体培养基的热传导性差；③由于对影响固态的因素了解不够，培养方法大多基于经验数据和操作的经验，与液体深层发酵相比，劳动强度大，占地面积大，易污染杂菌。三、液体深层发酵，最早报道于20世纪80年代末，研究内容包括营养需要、环境因子、发酵工艺等，以获得最佳操作条件在较短时间内生产大量的菌丝体与代谢产物。优点：①可以进行工业化连续生产，通过控制最佳条件来培养菌丝体，生产工艺规范；②培养原料来源广泛，价格便宜；③通过控制发酵罐的通气搅拌系统、温度调节系统、pH值调节系统和培养基补给系统等装置，培养条件最佳，发酵周期短，生产效率高。(杨海龙等。药用真菌深层发酵生产技术，化学工业出版社，2009年，p14-17，p212)，但是目前的液体深层发酵方法(李宇伟等。猴头菌液体培养产多糖条件优化的研究，食用菌，2008(3)，p15-16)菌丝体生物量在6g/L左右，产量较低，因此亟须筛选新的猴头菌菌株以及菌丝体产量高的发酵培养方法。

发明内容

本发明目的在于解决猴头菇生产方法中存在的菌丝体生物产量低的问题，提供一种猴头菇的液体深层发酵培养方法。

本发明第二目的是提供一种猴头菇液体深层发酵用的液体种子培养基。

本发明第三目的是提供一种猴头菇液体深层发酵用的液体发酵培养基。

本发明第四目的是提供一个猴头菇菌株。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

猴头菇的液体深层发酵培养方法，包括如下步骤：

(1)菌种活化：按照3～5％的重量比将猴头菇菌种接种于斜面培养基上，在22～26℃下培养12～16d，得活化的猴头菇菌种；所述的斜面培养基的组成成份及其含量为：马铃薯(取汁)180～220g/L，葡萄糖18～22g/L，琼脂15～20g/L，其余为水；

(2)一级菌种培养：接取活化的猴头菇菌种，捣碎，按照3～6g/L的比例将活化的猴头菇菌种接种于液体种子培养基中，在22～26℃、转速为120～180rpm条件下培养4～7d，得一级菌种；所述的液体种子培养基的组成成份及其重量比为：葡萄糖1～3％、玉米淀粉0.01～0.1％、麦麸0.1～0.5％、蛋白胨0.1～0.3％、酵母粉0.2～0.4％、KH₂PO₄ 0.05～0.2％、MgSO₄·7H₂O 0.01～0.1％、VB₁为8～15mg/L，其余为水；

(3)二级菌种培养：按照8～15％的体积比将步骤(2)所得一级菌种接种于液体发酵培养基中，在24～28℃、压力为0.05MPa、通风量为每分钟罐容积的50～100％条件下培养3～6d，得二级菌种；所述液体发酵培养基的组成成份及其含量为：葡萄糖20～30g/L，玉米淀粉0.05～0.2g/L，酵母粉2～4g/L，蛋白胨2～4g/L，麦麸0.5～1.5g/L，KH₂PO₄1.0g/L，MgSO₄0.5g/L，其余为水；

(4)发酵罐放大培养：按照8～15％的体积比将二级菌种接种于液体发酵培养基中，在24～28℃、压力为0.05MPa、通风量为每分钟罐容积的50～100％条件下培养6～10d，得猴头菇菌丝体；所述的液体发酵培养基的组成成份及其含量同步骤(3)。

上述发酵培养方法中所述的猴头菇菌种可以是通常生产上所用的猴头菇(Hericium erinaceus)菌种、或者所采集的野生猴头菇(Hericium erinaceus)菌种。

上述发酵培养方法中所述的猴头菇菌种是指猴头菌(Hericium erinaceus)中农猴头1，已于2009年12月23日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCC 3536。

上述发酵培养方法步骤(1)中所得的猴头菇菌种的大小为3-5×3-5mm。

上述发酵培养方法步骤(2)中所述的液体种子培养基的装液量为罐容积的40％。

上述发酵培养方法步骤(3)或(4)中所述的液体发酵培养基的罐装液量为罐容积的60～80％。

所述的液体种子培养基的制备方法，包括按照上述重量比将为葡萄糖、玉米淀粉、麦麸、蛋白栋、酵母粉、KH₂PO₄、MgSO₄·7H₂O和VB₁加入水中，搅拌均匀，然后用水定容，再在121℃，灭菌30min即可。

所述的液体发酵培养基的制备方法，包括按照上述重量比将葡萄糖、玉米淀粉、酵母粉、蛋白栋、麦麸、KH₂PO₄和MgSO₄·7H₂O加入水中，搅拌均匀，然后用水定容，在121℃，灭菌30min即可。

本发明所得的猴头菇菌丝体可用于生产保健食品、食品添加剂、饮料等。

本发明中所述的猴头菌、猴头菇、猴头蘑、猥菌、对口蘑、喝巴拉(藏名)、山伏菌(日本)和熊头苗(欧洲)等名称都是指猴头菌(Hericium erinaceus)。

本发明具有的优点：(1)、本发明方法猴头菌菌丝体生物产量高，可达12g/L，是目前工厂发酵生产水平的2倍以上。(2)本发明猴头菌菌株中农猴头1生长速度快，可达5.8mm/d；(3)本发明提供的种子和发酵培养基效果好，可使猴头菇菌丝体产量高。

附图说明

图1 8个猴头菇菌株菌丝体生物量、胞外多糖的利率、胞内多糖含量对比柱形图。

图2中农猴头1的rDNA-IGS2区域PCR扩增片段电泳图谱。

具体实施方式

实施例1猴头菌菌株中农猴头1的筛选

以32个猴头菌株(3个来自中国农业科学院农业资源与农业区划研究所；4个来自中国农业科学院蔬菜花卉研究所；其它引自上海农科院食用菌所、福建三明真菌研究所、吉林省、江苏省等地(具体地点不可知)，所述的32个猴头菌株均为野生种)为材料，在Difco PDA^TM培养基(一种标准培养基，德国生产)上25±0.1℃培养7天，测量菌落直径，菌丝生长速度＝菌落直径/7d，结果(见表1)显示由中国农业科学院农业资源与农业区划研究所采自东北长白山的第18号菌株生长速度最快，说明它的活力比较强。将18号菌株与其它7个菌株进行液体摇瓶培养，测定它们的菌丝体生物量、胞外多糖的利率、胞内多糖的含量等，结果(见图1)这三项指标综合评价最优的是第18号菌株，将18号菌株定名为中农猴头1。

表1猴头菌32个菌株的菌丝生长速度

实施例2猴头菌菌株中农猴头1的鉴定

将实施例1中所筛选出来的第18号猴头菌菌株即“中农猴头1”进行鉴定，其形态特征为：菌丝洁白浓密，菌丝适宜在pH4～5，温度为24～26℃条件下生长，在25℃时在Difco PDA培养基(一种标准培养基，德国生产)上菌丝生长速度为5.8mm/d。“中农猴头1”是中温偏低出菇型品种，优质、高产、抗逆性强。出菇期适宜温度为10～22℃，最适温度为17±1℃。子实体单生，纯白色；子实体直径10cm～30cm，中实；菌柄长2～4cm，菌刺长度2～5cm。

ITS序列测序

采用CTAB法提取中农猴头1的总DNA，以总DNA为模板，以下述序列为引物进行PCR扩增，所述的引物为：

ITS1：5`TCCGTAGGTGAACCTGCGG 3`(SEQID No：3)

ITS4：5`CCTCCGCTTATTGATATGC 3`(SEQID No：4)；

PCR反应体系：Ex Taq(5U/μL)0.25μl，dNTPs(各2.5mmol)4μl，10×buffer(Mg²⁺)5μl，ITS1引物和ITS4引物各2μl，模板DNA 5μl，ddH₂O31.75μl。PCR反应条件：94℃5min；94℃40s，56℃40s，72℃80s，35个循环；72℃10min。扩增得到ITS-PCR产物ITS1-5.8S-ITS2序列，由上海生工生物工程技术服务有限公司克隆测序，3个克隆已在GenBank上登录，登录号分别是GU566756(第1-30个碱基是18S rRNA基因部分序列，31-210个碱基是ITS1序列，第211-368个碱基是5.8S rRNA基因序列，369-572个碱基是ITS2序列，573-631个碱基是28S rRNA基因部分序列)(SEQID No：5)、GU566757(第1-30个碱基是18S rRNA基因部分序列，31-210个碱基是ITS1序列，第211-368个碱基是5.8S rRNA基因序列，369-571个碱基是ITS2序列，572-631个碱基是28S rRNA基因部分序列)(SEQID No：6)、GU566758(第1-30个碱基是18S rRNA基因部分序列，31-210个碱基是ITS1序列，第211-368个碱基是5.8S rRNA基因序列，369-571个碱基是ITS2序列，572-631个碱基是28S基因rRNA部分序列)(SEQID No：7)。经和GenBank数据库猴头菇序列对比，相似度为99％以上，说明中农猴头1属于猴头菇(Hericium erinaceus)。

IGS2(Intergenic spacer 2的简写)序列PCR扩增检测：

以中农猴头1的总DNA为模板，以下述序列为引物PCR扩增rDNA-IGS2区域，所述的引物序列为：

5SRNAR：5`ACCGCATCCCGTCTGAT 3`(SEQID No：1)

invSR1R：5`ACTGGCAGAATCAACCAGGTA 3`(SEQID No：2)；

PCR反应体系：EX 10×buffer 2μl，dNT 0.2mmol/l，5SRNAR引物0pmoles，invSR1R引物80pmoles，EX Taq 1.5unit，模板DNA 20ng，ddH2O补至50μl。PCR反应程序：94℃4min；94℃50s，55℃50s，72℃3min，35个循环；72℃7min。结果(见图2)IGS2(Intergenic spacer 2)扩增生成5个片段：大小分别为：8500bp、3450bp、3030bp、570bp、320bp。经检索，没有发现与猴头菇中农猴头1IGS2的序列数据相似的序列(IGS2序列可用以鉴定种内不同菌株)，结果说明中农猴头1为新的猴头菌菌株。

实施例3猴头菌中农猴头1菌丝体的深层发酵培养

按照如下步骤进行：

(1)、菌种活化在无菌条件下，从中农猴头1(已于2009年12月23日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCC3536)母种试管中取出大小2-4mm×2-4mm的菌丝块，迅速接种于斜面培养基，塞上硅胶塞，于25℃培养箱中培养15d，得到活化的中农猴头1菌种。其中所述的斜面培养基按照如下方法制备：将马铃薯去皮，称取200g，切成1cm3左右的小块，加水煮到马铃薯软而不烂，用4层纱布过滤。取滤液，加入葡萄糖20g，琼脂20g，加热至琼脂完全溶化，此间不停搅拌，防止糊锅，再加水补至1000mL，趁热分装进试管，装液量为试管总容积的1/4～1/3，塞上硅胶塞，包上报纸两层用橡皮筋扎紧，置高压蒸汽灭菌锅中121℃、0.12MPa下灭菌30min，灭菌完毕趁热摆成斜面。

(2)、一级菌种培养在无菌条件下，用接种针将步骤(1)中所得的0.01-0.03cm³大小的活化中农猴头1菌种块，捣碎，放入装有液体种子培养基(装液量100ml)的三角瓶中，塞上瓶塞；在25℃、转速为150rpm条件下培养10d，得到一级菌种(种子液)，置于冰箱备用。其中所述的液体种子培养基的制备：按照下述比例将葡萄糖2.0％、玉米淀粉0.05％、麦麸0.4％、蛋白胨0.2％、酵母粉0.3％、KH₂PO₄0.1％、MgSO₄·7H₂O 0.05％、VB₁ 10mg/L，其余成分为水，混合均匀，在121℃下灭菌30min即可，其中摇瓶中的装液量为200ml/500ml。

(3)、10L种子罐发酵培养：在无菌条件下，迅速取下摇瓶瓶塞，按照10％的体积比将步骤(2)摇瓶中农猴头1的一级菌种液迅速倒入装有液体发酵培养基的10L种子罐内。然后在26℃、罐压0.05MPa、通风量100L/min条件下培养4d，即得二级菌种(或称为猴头菇菌丝体)。其中所述的液体发酵培养基的制备：按照下述含量将葡萄糖27.43g/L，玉米淀粉0.1g/L，酵母粉3.88g/L，蛋白胨2.88g/L，麦麸1.0g/L，KH₂PO₄ 1.0g/L，MgSO₄ 0.5g/L加入水中，混合均匀，然后用水定容，在121℃下灭菌30min即可。

100L气升式发酵罐放大验证在无菌条件下，按照10％的体积比将步骤(3)中所得的发酵4d的中农猴头1二级菌种(种子液)7.5L。在26℃、罐压0.05MPa、通风量100L/min条件下培养7d。其中所述的液体发酵培养基的制备方法同前，发酵罐装液量为75L。

实验实施例1中农猴头1菌丝体生物量、多糖含量和胞内多糖含量测定

(1)菌丝体生物量的测定

按照如下方法进行：取实施例3所得的发酵液100mL，在3500r/min下离心15min，分别收获沉淀(菌丝体)和上清液(发酵液)，将沉淀用蒸馏水冲洗3次，然后在60℃下烘至恒重，称重。重复三次，取平均值。结果实施例3中所得的中农猴头1的菌丝生物量达12.89g/L。

(2)胞外粗多糖含量测定

按照如下方法进行：取实施例3中所制备的发酵液100mL，在3000r/min离心20min，沉淀菌丝，用与发酵液同体积的蒸馏水反复洗涤(洗涤沉淀的菌丝，因为菌丝上可能粘有发酵液)后离心分离(条件同上)，合并上清液，经旋转蒸发浓缩至原体积的1/3，加入95％的乙醇至终浓度为75％醇析，沉淀8h，然后在3000r/min离心20min，沉淀用蒸馏水溶解，然后再加入95％的乙醇至终浓度为75％醇析，醇沉8h，在3000r/min离心20min，收集沉淀，60℃烘干至恒重，即为胞外粗多糖，结果实施例3中所得的中农猴头1的胞外多糖得率为0.48g/L。

(3)胞内多糖含量的测定：

按照如下方法进行：取干菌丝体(W)(上述(1)中所得的菌丝体烘干得到)，粉碎过30目筛，加入30倍于菌丝体干重的蒸馏水，在95℃水浴锅中静置浸提两次，每次浸提2h，合并浸提液，按苯酚-硫酸法测定多糖含量。结果上述中农猴头1的菌丝体中多糖含量为1.65％。

从以上测定结果可知，本发明方法培养的猴头菌的菌丝体生物量高，达到12.89g/L，而现有方法中的猴头菌的菌丝体生物量一般为6g/L左右。其次本发明培养方法所得的猴头菌的胞外多糖和胞内多糖含量也高。

Claims

1.一种猴头菇(Hericium erinaceus)菌株中农猴头1，已于2009年12月23日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCC 3536。