CN106754479B - 一种弯曲乳杆菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种弯曲乳杆菌及其应用，该菌株被命名为弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)5‑1，保藏号为CGMCC No.12891。该菌株具有高效降解嘌呤核苷的能力，同时可以耐受人体正常条件下的酸性环境和胆盐浓度，可以在肠道内分解摄入食物中的嘌呤核苷，从而减少小肠对嘌呤核苷的吸收。因此弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)5‑1是开发辅助治疗高尿酸血症的微生态菌剂的良好菌株。

Description

一种弯曲乳杆菌及其应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，特别是涉及一种弯曲乳杆菌及其应用。
背景技术
高尿酸血症是由于人体内嘌呤代谢紊乱，尿酸生成过多或尿酸排泄减少，造成血液中的尿酸浓度过度超出正常范围的一种机体状态。现代医学研究发现，高尿酸血症与痛风、高血压、高脂血症、动脉粥样硬化、肥胖、胰岛素抵抗等的发生密切相关。虽然高尿酸血症与基因、环境、性别、年龄及生活饮食习惯等因素都有关，发病原因较为复杂，但是随着人们物质生活的丰富和饮食结构的变化，高尿酸血症及其相关病症发病率在我国快速增加，已成为现代人的高发疾病之一。
目前高尿酸血症的治疗主要是服用药物和饮食限制。主要是服用降尿酸药物，如别嘌呤醇、丙磺舒、苯溴马隆等通过抑制尿酸生成或促进尿酸排泄以达到降血尿酸水平的目的，同时辅以饮食理疗，限制摄入高嘌呤食物。药物治疗存在过敏以及个体差异限制等问题。而食物中嘌呤高的种类众多，如红肉、肝肾胰等内脏、鱼类、禽类、啤酒等。另外，鲜味剂中的鸡精、蚝油、鱼露等的主要成分为5’-呈味核苷二钠的嘌呤类。饮食限制也就意味着改变生活方式，患者的生活质量将受到严重的影响。
人体吸收嘌呤的主要形式是嘌呤核苷酸，通过口服具有高效分解嘌呤核苷的微生态菌剂，让其在肠道内分解摄入食物中的嘌呤核苷，可以降低肠道对嘌呤核苷的吸收量，从而达到降低血尿酸水平的目的。因此，用乳酸菌对高尿酸血症进行辅助治疗和预防可以避免或减轻严格饮食限制对患者正常生活的影响。开发辅助治疗高尿酸血症的微生态菌剂的关键就是获得具有高效降解嘌呤核苷的食品安全级微生物。
发明内容
本发明提供了一株具有高效降解嘌呤核苷的乳酸菌。
一种弯曲乳杆菌，分类命名为弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)5-1，保藏于位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期为2016年8月22日，保藏号为CGMCC No.12891。
该菌株形态学特征：在MRS固体培养基菌落为圆形，且边缘整齐，乳白色，不透明，表面湿润光滑，不产色素。
该菌株生理及生化特性：菌株的O-F反应结果为发酵型，能同化麦芽糖、蔗糖和菊糖；不能同化甘露醇、山梨醇、棉子糖、乳糖、纤维二糖和水杨苷；对七叶苷的反应结果为可疑，1％尿酸钠的反应结果是阴性。
该菌株具有高效降解嘌呤核苷的能力，该菌株可以在肠道内分解摄入食物中的嘌呤核苷，从而减少小肠对嘌呤核苷的吸收量。
该菌株可以耐受人体通常胃部酸性环境(pH 3.0)。
该菌株可以耐受人体小肠正常胆盐浓度，在小肠胆汁的浓度范围(0.03％～0.3％)内具有良好的耐受性。
本发明又提供了一种包含所述弯曲乳杆菌的菌剂。
优选的，所述弯曲乳杆菌的浓度不小于106cfu/mL。进一步优选的，所述弯曲乳杆菌的浓度不小于107cfu/mL。
本发明还提供了所述的弯曲乳杆菌在制备预防高尿酸血症的饮用水添加物、食品添加物或饮料添加物中的应用。
本发明还提供了所述的弯曲乳杆菌在制备治疗和预防高尿酸血症的药物中的应用。
本发明筛选获得了一株弯曲乳杆菌，命名为弯曲乳杆菌(Lactobacilluscurvatus)5-1，该菌株具有高效降解嘌呤核苷的能力，同时可以耐受人体正常条件下的酸性环境和胆盐浓度，可以在肠道内分解摄入食物中的嘌呤核苷，从而减少小肠对嘌呤核苷的吸收。因此弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)5-1是开发辅助治疗高尿酸血症的微生态菌剂的良好菌株。
附图说明
图1为弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)5-1菌株在MRS培养基中的生长曲线图；
图2为弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)5-1菌株耐酸性检测结果图；
图3为弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)5-1菌株耐胆盐能力检测结果图，其中不同百分比为胆盐添加的量；
图4为弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)5-1菌株对人工胃肠液耐受能力检测结果图。
具体实施方式
实施例1
弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)5-1菌种的分离筛选及纯化鉴定。
1、乳酸菌的分离
将从浙江省宁波市的超市购买的泡菜充分混匀后，吸取泡菜汁，用0.9％NaCl无菌水溶液稀释合适的倍数后，涂布在MRS固体平板上，30℃静置培养48h，获得单菌落。
2、乳酸菌菌株的筛选
从平板上挑取单菌落，接种于MRS培养基(蛋白胨10g，酵母提取物5g，牛肉膏10g，葡萄糖20g，乙酸钠5g，柠檬酸二铵2g，吐温80 1mL，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.05g，磷酸氢二钾2g，琼脂15～17g，加水至1000mL，调pH至6.2，121摄氏度灭菌20分钟。)中，于30℃静置培养24h。以1％的接种量传代2次活化菌种，作为种子培养基。将种子培养基以1％的接种量接种到MRS培养基中，静置培养48h后，取2mL培养液，于4℃、4000r/min离心10min收集菌体。用无菌的0.9％NaCl溶液清洗菌体2次。
向清洗后的菌体中加入750mL的反应液(含有12.6mM肌苷和12.6mM鸟苷的0.1M、pH7.0K3PO4溶液)，重悬菌体后置于恒温混匀仪中(37℃，800r/min)反应1h。反应后迅速将反应液置于沸水浴中5min，终止反应。10000r/min离心2min，除去菌体，收集上清液。用HPLC法测定上清液中肌苷和鸟苷的含量。按如下公式计算肌苷和鸟苷的降解率：降解率＝(C0－C1)÷C0×100％，其中C0为母液中的浓度，C1为残留的浓度(浓度单位均为g/L)。
肌苷和鸟苷测定条件：反相色谱柱为Hypersil ODS2C18(4.6mm×250mm)；流动相为0.01M KH2PO4溶液∶甲醇＝5∶95(V/V)；流速为1mL/min；柱温为30℃；测定波长为260nm。
通过上述分离和筛选获得的乳酸菌，其中一株对肌苷和鸟苷的降解率最高，分别达到89.37％和93.20％。将其编号为菌株5-1，形态学特征：在MRS固体培养基菌落为圆形，且边缘整齐，乳白色，不透明，表面湿润光滑，不产色素。
3、菌株鉴定
3.1、菌株5-1的O-F反应和糖类利用特性
O/F(氧化/发酵)反应即葡萄糖代谢类型鉴别实验，观察细菌对葡萄糖分解过程中是利用分子氧(氧化型)，还是无氧降解(发酵型)或者不分解葡萄糖(产碱型)。
菌株5-1的O-F反应结果为发酵型，能同化麦芽糖、蔗糖和菊糖；不能同化甘露醇、山梨醇、棉子糖、乳糖、纤维二糖和水杨苷；对七叶苷的反应结果为可疑，1％尿酸钠的反应结果是阴性。
3.2、菌株5-1的16S rDNA测序
用TaKaRa MiniBEST Bacteria Genomic DNA Extraction Kit试剂盒提取菌株5-1的基因组，并用PCR扩增其 16S rDNA的基因片段。扩增引物序列为，16sF：AGAGTTTGATCMTGGCTCAG；16sR：GGCTACCTTGTTACGACTT。将扩增产物委托生工生物工程(上海)股份有限公司进行序列测定。
16S rDNA序列测定结果如SEQ ID No.1所示。
根据糖类利用特性在《伯杰氏细菌手册(第八版)》中对比的结果和16S rDNA测序结果在Genebank中进行BLAST分析的结果，菌株5-1鉴定为弯曲乳杆菌(Lactobacilluscurvatus)，所以将菌株5-1命名为弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)5-1。将弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)5-1保藏于位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.12891。
实施例2
弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)5-1在MRS培养基中的生长曲线。
将活化好的弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)5-1菌株，以1％的接种量接种到MRS培养基中30℃静置培养。测定不同生长时间的菌体OD600值和培养液的pH值。测定结果如图1所示。弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)5-1在5～18h处于对数生长期，这时期菌体生长速度最快，乳酸大量生成(发酵液pH迅速降低)。18h后，菌体生长进入平台期，此时菌体生长速度减缓，趋于稳定，发酵液pH维持在4左右，说明菌株产酸能力在进入平台期后受到了抑制。此外，在74h以内发酵液OD600值都能维持比较稳定的状态。
实施例3
弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)5-1的药敏谱。
采用抗菌药物药敏纸片(杭州微生物试剂有限公司)测定弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)5-1的药敏谱。将200μL菌体培养液均匀涂布到MRS固体平板上，在每个平板上放置3片药物敏感纸片，30℃培养48h后，用游标卡尺测量抑菌圈直径。表1显示弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)5-1对不同类抗生素的敏感性结果。可以看出，弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)5-1对不同的抗生素表现出了不同的敏感性，对苯唑西林、头孢氨苄、四环素类(米诺环素除外)、氨基糖苷类、碳青霉烯类、喹诺酮类、糖肽类、单环内酰胺类、氯霉素和利福平比较不敏感，抑菌圈直径只在药纸片的直径(5.32±0.23mm)附近，而对头孢类的头孢曲松、头孢哌酮、头孢呋辛和头孢唑林及青霉素类的氨苄西林、哌拉西林和羧苄西林则比较敏感，抑菌圈直径在17mm以上。
表1
实施例4
弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)5-1耐酸和耐胆盐能力。
1、耐酸能力试验
将活化好的菌株分别置于pH为6.2(对照组)、2、3和4的MRS培养基中，30℃下处理1h、2h、3h和4h后，进行平板活菌计数。弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)5-1的耐酸能力如图2所示，虽然pH 2.0的酸性环境对其存活有较大影响，但在pH 3.0的条件下处理4h该菌株能够保持107cfu/mL以上的活菌数；而通常胃酸pH在3.0左右，食物通过胃的时间一般为1～2，由此可说明，弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)5-1具备了抵抗多数条件下人体酸性环境的能力。
2、耐胆盐能力试验
将活化好的菌株分别置于牛胆粉浓度分别为0(对照组)、0.1％、0.2％、0.3％、0.6％和0.9％的MRS培养基中，30℃下处理1h、2h、3h和4h后，进行平板活菌计数。人体小肠中胆汁的浓度范围在0.03％～0.3％。能在正常生理胆盐浓度中生长和进行代谢的乳酸菌被认为是能在肠道转运过程中存活。结果如图3所示，在胆盐浓度≤0.3％时，弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)5-1的活菌数保持在107cfu/mL以上，说明弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)5-1可以耐受人体正常胆汁浓度，具备在肠道中生存所需的胆盐耐受能力。
实施例5
弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)5-1在空腹和饱腹状态下对人工消化液的耐受性。
1、相关人工消化液
营养液(1L)：阿拉伯半乳糖，1g；胶质，2g；木聚糖，1g；土豆淀粉，3g；葡萄糖，0.4g；酵母粉，3g；蛋白胨，1g；粘蛋白，4g；L-半胱氨酸，0.5g。
人工胃液：3.33％胃蛋白酶，pH 2或3。
人工肠液(1L)：NaHCO3，12.5g；胆盐，6.0g；胰酶，0.9g，pH 6.8。
空腹状态：不加营养液的人工胃液(pH 2)和人工肠液。饱腹状态：加有营养液成分的人工胃液(pH 3)和人工肠液。
2、肠道模拟处理
人工消化液(空腹和饱腹两个状态)耐受性的测定：取30℃静置培养30h的菌液1mL，4℃、4000r/min离心10min，去掉上清，将菌体悬浮于1mL的人工胃液中处理2h(37℃，800r/min)；离心菌体，弃上清，将菌体悬浮在1mL人工肠液中处理2h(37℃，800r/min)后，进行菌落计数，原菌液作对照。结果如图4所示。虽然在空腹时弯曲乳杆菌(Lactobacilluscurvatus)5-1存活能力不高，活菌数只有103cfu/mL左右，主要是因为其在pH 2的酸性环境中耐受性较弱(图3)。但在饱腹状态下，弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)5-1表现出比较强的存活能力，活菌数在107cfu/mL以上，明显高于活性乳杆菌在肠道发挥其益生作用所要求的菌体数(1×106cfu/mL)。以上结果说明弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)5-1适宜在饭后摄取，以便使其能更好地发挥益生功能。
实施例6
弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)5-1在饱腹的人工肠液中嘌呤物质降解能力。
离心收集2mL菌体培养液，用灭菌生理盐水洗涤2次，将菌体悬浮于750mL含有浓度都为12.6mM的肌苷和鸟苷的缓冲液和饱腹人工肠液中反应(37℃，800r/min)，于1h后测定肌苷和鸟苷的降解率。对照组不加菌体。从表2结果可知，与在缓冲液中一样，弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)5-1在饱腹的人工肠液中同样展现出了高效的肌苷和鸟苷降解能力。
表2
浓度(mM) 肌苷降解率(％) 鸟苷降解率(％)
缓冲液 89.37±1.59 93.20±0.92
饱腹人工肠液 83.44±3.36 86.36±3.08
SEQUENCE LISTING
<110> 浙江大学宁波理工学院
<120> 一种弯曲乳杆菌及其应用
<130>
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1478
<212> DNA
<213> 弯曲乳杆菌（Lactobacillus curvatus）
<400> 1
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gattagatac cctggtagtc catgccgtaa acgatgagtg ctaggtgttg gagggtttcc 840
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<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
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<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ggctaccttg ttacgactt 19

Claims (6)

1.一种弯曲乳杆菌，其特征在于，命名为弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)5-1，保藏号为CGMCC No.12891。
2.一种包含如权利要求1所述弯曲乳杆菌的菌剂。
3.如权利要求2所述的菌剂，其特征在于，所述弯曲乳杆菌的浓度不小于106cfu/mL。
4.如权利要求3所述的菌剂，其特征在于，所述弯曲乳杆菌的浓度不小于107cfu/mL。
5.如权利要求1所述的弯曲乳杆菌在制备预防高尿酸血症的饮用水添加物、食品添加物或饮料添加物中的应用。
6.如权利要求1所述的弯曲乳杆菌在制备治疗和预防高尿酸血症的药物中的应用。
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