CN115806911B - 一株植物乳杆菌、分离方法、用途和药品、食品 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，公开了一株植物乳杆菌(Lactobacillus Plantarum)，保藏编号为：CGMCC NO 24791；保藏日期：2022年4月27日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。该菌株不仅仅具有缓解高尿酸血症、抑制黄嘌呤氧化酶的作用，其还具有促进α‑亚麻酸生成、缓解高钙高蛋白处理造成的血清脯氨酸、色氨酸枯竭的情况，在促进肝脏HGPRT(次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶)和ADSS2(腺苷酸代琥珀酸合成酶)表达，抑制肠道CNT2(浓缩型核苷转运蛋白2)表达，促进肠道和肾脏ABCG2(ATP结合转运蛋白G2)表达，抑制GLUT9(葡萄糖转运蛋白9)和URAT1(尿酸盐转运蛋白1)表达方面具有明显优势。

Description

一株植物乳杆菌、分离方法、用途和药品、食品

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体为一株植物乳杆菌、分离方法、用途和药品、食品。

背景技术

高尿酸血症与高血压、高血糖、高血脂共称为“四高”代谢性疾病。长期高尿酸血症会诱发痛风等多种并发症，严重影响人们身体健康和生活质量。别嘌呤醇等西药治疗高尿酸血症虽然疗效好，但副作用较大，如肾脏毒性和肠胃刺激等，在临床上的应用受到一定限制；因此，探索更加安全有效的降尿酸方案十分必要。

人体内约67％的尿酸由内源性产生，剩下33％的尿酸由饮食中的嘌呤核苷代谢产生。由于人体缺乏有生物活性的尿酸酶，所以尿酸是嘌呤核苷在人体内代谢的终产物。因此，通过减少尿酸合成前体核苷来减少尿酸生成，是防治高尿酸血症的主要方法。

乳酸菌是公认的食品安全微生物，作为人体肠道内正常菌群，具有降尿酸的能力，在治疗高尿酸血症上具有药物治疗无可比拟的优点，如无药物不良反应、无严格限制饮食、患者依从度高等。筛选降尿酸能力强的乳酸菌，用于开发具有降尿酸作用的食品或保健品，作为辅助治疗高尿酸血症的手段，具有巨大的应用前景。

具体可见如下对比文件：

D1-CN202210167880-一株植物乳杆菌及在降尿酸、减重、抗炎症方面的应用；

D2-CN202011515393-一株可缓解高尿酸血症的植物乳杆菌及其用途；

D3-CN201810072829-一株植物乳杆菌UA-416株及其应用；

D4-CN202111473386-一株产尿酸氧化酶并抑制黄嘌呤氧化酶的植物乳杆菌及其应用；

D5-CN201911373420-植物乳杆菌菌株及其用于降低发炎与治疗高尿酸血症的用途。

其中，D1记载了其筛选的植物乳杆菌具有降尿酸、降解胆固醇、提高肠道乙酸和丙酸的含量的用途；

D2记载了该菌株可缓解高尿酸血症，同时可分解鸟苷和肌苷，能够高效抑制黄嘌呤氧化酶。

D3记载了该菌株可降低尿酸、治疗痛风的作用。

D4记载了该菌株同时生产尿酸氧化酶和作为黄嘌呤氧化酶抑制剂的用途。

D5记载了菌株可缓解高尿酸血症。

可见植物乳杆菌广泛的用于缓解高尿酸血症，部分菌株能够明确的作为黄嘌呤氧化酶抑制剂的用途。

本案解决的技术问题是：如何发现功能更为全面和强大的菌株。

发明内容

本发明的目的在于提供一株植物乳杆菌，该菌株不仅仅具有缓解高尿酸血症、抑制黄嘌呤氧化酶的作用，其还具有促进α-亚麻酸生成、缓解高钙高蛋白处理造成的血清脯氨酸、色氨酸枯竭的情况，在促进肝脏HGPRT(次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶)和ADSS2(腺苷酸代琥珀酸合成酶)表达方面具有明显优势。

同时，本发明还提供了该菌的提取方法、用途以及含该菌的药品和食品。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一株植物乳杆菌(LactobacillusPlantarum)，保藏编号为：CGMCC NO 24791；保藏日期：2022年4月27日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

在上述的植物乳杆菌的分离方法中，从高尿酸血症马岗鹅的食糜中筛选得到。

如上所述的植物乳杆菌用于降解降解生物体之外的核苷的用途。

如上所述的植物乳杆菌用于促进α-亚麻酸生成的用途。

如上所述的植物乳杆菌作为生成脯氨酸的用途。

如上所述的植物乳杆菌作为制备用于促进肝脏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶和腺苷酸代琥珀酸合成酶表达的药物的用途。

如上所述的植物乳杆菌作为制备治疗高尿酸血症的药物的用途。

一种药物，含有如上所述的植物乳杆菌。

一种食品，含有如上所述的植物乳杆菌。

同时，本发明的植物乳杆菌可以与其他益生菌复配开发降尿酸发酵乳产品或乳酸菌饮料，也可将该乳酸菌的培养物经冷冻干燥用于生产降尿酸的功能补充剂。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明所提出的植物乳杆菌为植物乳杆菌SQ001，从高尿酸血症马岗鹅采集的食糜样品中分离所得，本发明菌株在体外试验表现出良好的降解核苷能力，同时其可以产生代谢物脯氨酸，促进α-亚麻酸生成，通过促进肝脏HGPRT(次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶)和ADSS2(腺苷酸代琥珀酸合成酶)表达来降低血尿酸水平，验证表明该菌株在体内试验也表现出良好的降尿酸能力，可以作为新一代降尿酸益生菌。

附图说明

图1为植物乳杆菌SQ001生长曲线；

图2为植物乳杆菌SQ001核苷标准曲线；

图3腺苷-鸟苷混标液相峰图；

图4为腺苷-鸟苷-肌苷混标液相峰图；

图5为植物乳杆菌SQ001处理腺苷-鸟苷60min后液相峰图；

图6植物乳杆菌SQ001处理腺苷-鸟苷720min后液相峰图；

图7为植物乳杆菌SQ001处理腺苷-肌苷-鸟苷30min后液相峰图；

图8为植物乳杆菌SQ001处理腺苷-肌苷-鸟苷180min后液相峰图；

图9为植物乳杆菌SQ001胞外代谢组；

图10为植物乳杆菌SQ001胞内代谢组；

图11为植物乳杆菌SQ001及其代谢物体内试验结果；

图12和13为植物乳杆菌SQ001代谢物处理肝脏Hep-G2细胞试验结果。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

第一部分分离和鉴定

1.1.植物乳杆菌SQ001的制备方法

本发明采用传统平板涂布分离法从高尿酸血症马岗鹅采集的食糜样品中分离乳酸菌，通过测定乳酸菌在鸟苷-腺苷磷酸盐缓冲液中的核苷降解率、核苷降解速率，筛选出降尿酸能力较强的乳酸菌；最终确定了降尿酸效果好的乳酸菌菌株。

1.2乳酸菌的分离

本发明中具有降尿酸功能的植物乳杆菌，是从高尿酸血症马岗鹅的食糜中筛选得到，经鉴定属于植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)，命名为SQ001，已于本发明申请日前保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)。该菌株最适生长温度为37℃，兼性厌氧，生长于MRS培养基中。

1.3乳酸菌鉴定

将待试菌株在MRS固体平板(蛋白胨10.0g，牛肉膏粉5.0g，酵母膏粉4.0g，葡萄糖20.0g，吐温-80 1.0mL，磷酸氢二钾2.0g，乙酸钠5.0g，柠檬酸三铵2.0g，硫酸镁(MgSO₄·7H₂O)0.2g，硫酸锰(MnSO₄·4H₂O)0.05g，琼脂15.0g，最终pH 6.2±0.2，蒸馏水1000ml。调ph至6.4，121℃灭菌15min，冷却倒板)上划线分离单菌落，挑单菌落接种至5ml液体MRS培养基，37℃静置培养24h，作为活化一代菌株；再将一代菌株以4％接种量转接至5ml液体MRS培养基中，37℃静置培养24h，作为活化二代菌株，取活化二代菌株用于后续试验。

取活化后乳酸菌株，按质量百分比为3％的比例接种到MRS液体培养基中，于37℃下培养24h。

基于16s rDNA的菌株鉴定：以植物乳杆菌SQ001基因组DNA作为pcr扩增模板，采用25μl反应体系进行PCR扩增。模板DNA0.5ul，10mmol上下游引物(27F:AGAGTTTGATCCTGGCTCAG/1492R:GGTTACCTTGTTACGACTT)各0.5μl，2×taq酶12.5μl，以ddH₂O补至25μl。PCR循环参数为：95℃预变性5min；95℃变性3min，57℃退火30s，72℃延伸2min，循环30次；72℃延伸10min。pcr扩增产物送至上海美吉生物技术有限公司进行测序，将测序得到的序列与ncbi的genbank数据库进行同源比对分析，结果表明本发明菌株SQ001为植物乳杆菌，16s rDNA序列如SEQ ID NO.1所示。

SEQ ID NO.1

GGATCGTGCACTGCTATAATGCAGTCGAACGAACTCTGGTATTGATTGGTGCTTGCATCATGATTTACATTTGAGTGAGTGGCGAACTGGTGAGTAACACGTGGGAAACCTGCCCAGAAGCGGGGGATAACACCTGGAAACAGATGCTAATACCGCATAACAACTTGGACCGCATGGTCCGAGCTTGAAAGATGGCTTCGGCTATCACTTTTGGATGGTCCCGCGGCGTATTAGCTAGATGGTGGGGTAACGGCTCACCATGGCAATGATACGTAGCCGACCTGAGAGGGTAATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGAAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAACTCTGTTGTTAAAGAAGAACATATCTGAGAGTAACTGTTCAGGTATTGACGGTATTTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTTTTTAAGTCTGATGTGAAAGCCTTCGGCTCAACCGAAGAAGTGCATCGGAAACTGGGAAACTTGAGTGCAGAAGAGGACAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTGTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGTATGGGTAGCAAACAGGATTAGATACCCTCTAGTCCATACCGTAAACGATGAATGCTAGTGTTGGAGGATTTCCGCCCTTTCAGTGCTGCAGCTAACGGCATTAAGCATTCCGCCTGAGTG

第二部分性能测试

2.1乳酸菌降解核苷能力评价

鸟苷-腺苷磷酸盐缓冲液：准确称取鸟苷0.02g、腺苷0.02g，用20mmol/l K₃PO₄溶液(ph7.0)定容至100ml并调节ph至7.0，最终缓冲液中鸟苷浓度为0.2g/l(0.706mmol/l)，腺苷浓度为0.2g/l(0.746mmol/l)。

鸟苷-肌苷-腺苷磷酸盐缓冲液：准确称取鸟苷0.02g、肌苷0.02g、腺苷0.02g，用20mmol/l K₃PO₄溶液(ph7.0)定容至100ml并调节ph至7.0，最终缓冲液中鸟苷浓度为0.2g/l(0.706mmol/l)，肌苷浓度为0.2g/l(0.746mmol/l)，腺苷浓度为0.2g/l(0.746mmol/l)。

2.1.1 SQ001和大肠杆菌K88的对比

采用磷酸盐缓冲液体系初步筛选具有降解鸟苷、腺苷能力的乳酸菌。取适量活化二代菌培养液，室温4500r/min离心3min，弃上清，收集菌体，菌体用无菌生理盐水(质量浓度为0.9％的NaCl溶液)洗涤2次，向清洗后的菌体中加入1ml鸟苷-腺苷磷酸盐缓冲液，混合均匀，37℃静置孵育60min，720min。孵育后，取菌液4℃，4500r/min离心3min，取上清810μl，加入90μl反应终止剂0.1mol/l高氯酸溶液，混合均匀后4500r/min离心3min，取上清液使用0.22μl水相滤膜过滤后用于HPLC检测，HPLC峰图见图3-8，分析反应液中鸟苷、腺苷的减少量，具体可见表1；

表1

2.1.2 SQ001和LP 23180的对比

采用磷酸盐缓冲液体系初步筛选具有降解鸟苷、肌苷、腺苷能力的乳酸菌。取适量活化二代菌培养液，室温4500r/min离心3min，弃上清，收集菌体，菌体用无菌生理盐水(质量浓度为0.9％的NaCl溶液)洗涤2次，向清洗后的菌体中加入1ml鸟苷-肌苷-腺苷磷酸盐缓冲液，混合均匀，37℃静置孵育30min，180min。孵育后，取菌液4℃，4500r/min离心3min，取上清810μl，加入90μl反应终止剂0.1mol/l高氯酸溶液，混合均匀后4500r/min离心3min，取上清液使用0.22μl水相滤膜过滤后用于HPLC检测，HPLC峰图见图3-8，分析反应液中鸟苷、肌苷、腺苷的减少量，具体可见表2；

表2

图3表示鸟苷-腺苷标准液的HPLC峰图，图4表示鸟苷-肌苷-腺苷标准液的HPLC峰图，图5-6表示植物乳杆菌处理不同时间的鸟苷-腺苷标准溶液的液相峰图，图7-8表示植物乳杆菌处理不同时间的鸟苷-肌苷-腺苷标准溶液的液相峰图结果表明，植物乳杆菌LPSQ001对鸟苷、肌苷、腺苷具有很强的降解能力，180min可将鸟苷、肌苷和腺苷47％降解，720min可将鸟苷和腺苷85％降解，高于对照商业植物乳杆菌LP 23180(CICC 23180)和大肠杆菌K88。

2.2微生物代谢组学进一步验证植物乳杆菌吸收降解作用

取适量活化二代菌培养液，室温4500r/min离心3min，弃上清，收集菌体，菌体用无菌生理盐水(质量浓度为0.9％的Nacl溶液)洗涤2次，向清洗后的菌体中加入1ml鸟苷-肌苷-腺苷磷酸盐缓冲液，混合均匀，37℃静置孵育3h。利用淬灭法提取其胞外和胞内代谢物进行代谢组学测定。

如图9和10，代谢组学分析表明，植物乳杆菌处理核苷后，上清中三种核苷均显著减少，同时菌体中均显著增多，表明植物乳杆菌可以吸收核苷，此结果也验证了高效液相色谱结果。核苷是嘌呤代谢的原材料，核苷减少代表从源头减少了尿酸的生成。同时，菌体中嘌呤和核苷酸，脱氧核苷酸增多，表明其可能将核苷用于其自身生长繁殖。

此外，我们发现菌体中脯氨酸减少，上清中脯氨酸明显增多，脯氨酸可以缓解高钙高蛋白处理造成的血清脯氨酸枯竭，体外细胞试验验证其代谢物可以通过促进肝脏HGPRT(次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶)表达来降低血尿酸水平。

180min后针对各样品进行取样，分析LPSQ001菌体和上清中脯氨酸含量；具体的检测结果可参考表3。结果表明，菌体中脯氨酸减少了44％和84％，而上清中则提高了13.4倍和8.97倍。

同时，我们还检测了LPSQ001、大肠杆菌K88以及LP 23180三种菌处理核苷180分钟后上清代谢物中α-亚麻酸和脯氨酸的相对含量。表4结果表明，与未处理组相比，LPSQ001、大肠杆菌K88以及LP 23180的α-亚麻酸相对含量分别提高了8.49倍、0.23倍和1.35倍，脯氨酸相对含量分别提高了14.57倍、0.36倍和3.22倍。LPSQ001产生α-亚麻酸和脯氨酸的效率明显高于其他两种菌。

表3

表4

第三部分体外实验

植物乳杆菌的应用实施案例

试验一

植物乳杆菌体外试验中的应用

试验设计和分组

试验一选择1日龄雄性马冈鹅240羽，分为4个处理(A、B、C、D组)，每个处理6个重复，每个重复10羽鹅。第1日龄至第14日龄，A组饲喂基础饲粮(CP16.81％、Ca1.00％)，B、C、D组全部饲喂高钙高蛋白饲粮(CP24.03％、Ca3.04％)，自由饮用自来水,每天记录采食量，以重复为单位计算平均日采食量、平均日增重。第15日龄至第28日龄，在造模成功后的鹅中进行挑选并进行重新分组。A组饲喂基础饲粮(CP16.81％、Ca1.00％)，B、C、D组全部饲喂高钙高蛋白饲粮(CP24.03％、Ca3.04％)。同时处理组C灌胃PBS重悬后的植物乳杆菌，处理组D灌胃植物乳杆菌+代谢物，其余组灌胃PBS，自由饮用自来水。A、B、C、D组于29日龄每个重复采血并屠宰2只采样。所有参试鹅均自由采食、饮水。红外灯控温，持续光照，水槽及粪便每天各清理1次。每天观察鹅只健康状况，记录病死鹅数。按常规程序进行饲养管理。

血清样品采集

试验结束后，从每重复选2只接近平均体重的鹅，称活重后采血。鹅颈静脉采血10mL，静置45min后3000r/min离心10min，取上清液即为血清，分装至1.5mL离心管中，-20℃冰箱保存，用于后续指标的测定。

生长指标

以重复组为单位，记录每日试验鹅的采食量和实际鹅只数，计算终末体重(FinalWeight)、平均日采食量(Average Daily Feed Intake，ADFI)、平均日增重(Average DailyGain，ADG)。

数据处理与分析

数据用平均值±SEM表示。统计分析采用统计分析系统(Graph Pad Prism 8；Graph Pad Software Inc，San Diego，CA，USA)。组间的统计差异分析使用单因素方差分析(ANOVA)，然后进行多重比较分析(Fisher’s Least Significant Difference test)。仅涉及两组的数据采用t检验分析。统计显著水平为P<0.05。

试验结果

由图11可知，在植物乳杆菌灌胃处理后，缓解了高钙高蛋白饲粮引起的体重和采食量下降，同时显著降低高钙高蛋白饲粮引起的血液中尿酸水平的上升。图11中，Finalweight：终末重；UA：尿酸；ADG：平均日增重；ADFI：平均日采食量。

试验二

将Hep-G2细胞接种到6孔板中，共5组，每组6个孔(n＝6)。使用300μM HX和5％LP代谢物同时处理Hep-G2细胞，处理时间为12h。处理结束后收取细胞培养液于无菌EP管中，胰酶消化细胞后收集细胞于无菌EP管中，-80℃冰箱保存。使用尿酸含量测定试剂盒测定尿酸含量。同时，使用Trizol收取细胞，传统法(三氯甲烷萃取)提取总RNA，反转录得到cDNA，RT-qPCR测量相对基因表达量。

试验结果

由图12、13可知，肝脏细胞中添加次黄嘌呤可以导致尿酸的累积，而植物乳杆菌代谢物可以减少肝脏细胞中尿酸生成，提高次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT)的表达，HGPRT可以催化次黄嘌呤转换为次黄嘌呤核苷酸(IMP)，减少尿酸的产生。

图12中，Uric Acid：尿酸，LP：植物乳杆菌；HX：次黄嘌呤。

图13中，HGPRT：次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶；LP：植物乳杆菌；HX：次黄嘌呤。

本发明菌株具有体外吸收降解嘌呤核苷并产生代谢物脯氨酸和亚麻酸的特点，体内试验也表明其可以降低血清尿酸水平。

Claims (6)

1.一株植物乳杆菌（Lactobacillus Plantarum），其特征在于，保藏编号为：CGMCCNO.24791；保藏日期：2022年3月30日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

2.如权利要求1所述的植物乳杆菌用于降解生物体之外的鸟苷、肌苷、腺苷的用途。

3.如权利要求1所述的植物乳杆菌用于促进α-亚麻酸生成的用途。

4.如权利要求1所述的植物乳杆菌作为生成脯氨酸的用途。

5.如权利要求1所述的植物乳杆菌作为制备治疗高尿酸血症的药物的用途。

6.一种药物，其特征在于，含有如权利要求1所述的植物乳杆菌。