CN113440465A - 一种稻米发酵物、稻米发酵提取物及制备方法和应用 - Google Patents

一种稻米发酵物、稻米发酵提取物及制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种稻米发酵物、稻米发酵提取物及制备方法和应用，属于稻米加工技术领域。本发明提供的稻米发酵物的制备方法，包括如下步骤：利用发酵菌对含有稻米和水的混合物进行发酵，得到稻米发酵物；所述发酵菌包括曲霉菌和乳酸菌；所述曲霉菌和乳酸菌的活菌数的比例为1：(1～4)；所述发酵菌在发酵体系中的活菌数为(0.5～2.5)×(105～1018)CFU/g。本发明将稻米采用曲霉菌和乳酸菌双菌发酵，显著提高了发酵后产物的总多酚和总黄酮含量，使得到的稻米发酵物具有良好的抗氧化活性和紧致皮肤的作用，很适合用于护肤品、化妆品和发用产品中。

Description

一种稻米发酵物、稻米发酵提取物及制备方法和应用
技术领域
本发明属于稻米加工技术领域，具体涉及一种稻米发酵物、稻米发酵提取物及制备方法和应用。
背景技术
稻米含有丰富的蛋白质、碳水化合物、钙等营养元素，有色稻米还含有丰富的花青素。稻米花青素属黄酮类化合物，具有改变体内酶活性、改善微循环、提高机体免疫、抗氧化和延缓衰老等功效。
目前关于稻米加工方法常见的有酶解处理或微生物发酵，多用于酿酒、食品和保健等行业。例如，专利CN105193658A和CN107496296A分别用双歧杆菌和酵母菌发酵稻米应用于化妆品中；但是上述两种发酵方法并不能很好地将活性成分分解出来。因此，开发一种能够生产高活性的稻米发酵物的方法具有重要意义。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种稻米发酵物、稻米发酵提取物及制备方法和应用。本发明提供的稻米发酵物的制备方法可以显著提高稻米发酵物中总多酚及总黄酮的含量，得到的稻米发酵物具有良好的抗氧化活性和紧致皮肤的作用，适用于护肤品、化妆品和发用产品。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
本发明提供了一种稻米发酵物的制备方法，包括如下步骤：利用发酵菌对含有稻米和水的混合物进行发酵，得到稻米发酵物；
所述发酵菌在发酵体系中的的活菌数为(0.5～2.5)×(105～1018)CFU/g；
所述发酵菌包括曲霉菌和乳酸菌；
所述曲霉菌和乳酸菌在发酵体系中的活菌数的比例为1：(1～4)；
所述乳酸菌包括德氏乳杆菌保加利亚亚种、嗜热链球菌、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌和干酪乳杆菌中的一种或几种；
优选的，所述稻米包括有色稻米。
优选的，所述乳酸菌包括德氏乳杆菌保加利亚亚种、嗜热链球菌、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌和干酪乳杆菌；所述德氏乳杆菌保加利亚亚种、嗜热链球菌、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、干酪乳杆菌在发酵体系中的活菌数比例为3：(0.6-1.6)：(0.6-1.6)：(0.6-1.6)：(0.6-1.6)。
优选的，所述稻米和水的质量体积比为1g：(1～10)mL。
优选的，所述发酵菌接种的质量占稻米质量的0.5％～10％；所述发酵的温度为30～50℃；所述发酵的时间为18～72h；所述发酵的转速为200～1000rpm。
本发明提供了一种稻米发酵物，采用上述技术方案中所述的制备方法得到，所述稻米发酵物中总多酚含量大于5.0mg/mL，总黄酮含量大于5.0mg/mL。
本发明提供了一种稻米发酵提取物的制备方法，用乙醇水溶液对上述技术方案中所述的制备方法得到的稻米发酵物进行提取，得到稻米发酵提取物。
优选的，所述乙醇水溶液中乙醇的体积百分含量为50％～95％；所述稻米的质量与乙醇水溶液的体积比为1g：(3～12)mL；所述提取的次数为1～5次；每次提取的温度为75～90℃，每次提取的时间为30～180min。
本发明提供了一种稻米发酵提取物，采用上述技术方案中所述的稻米发酵提取物的制备方法得到。
本发明提供了上述技术方案中所述的稻米发酵物的制备方法得到的稻米发酵物或上述技术方案中所述的稻米发酵提取物的制备方法得到的稻米发酵提取物在化妆品行业中的应用。
有益效果：
本发明提供了一种稻米发酵物的制备方法，包括如下步骤：利用发酵菌对含有稻米和水的混合物进行发酵，得到稻米发酵物；所述发酵菌在发酵体系中的活菌数为(0.5～2.5)×(105～1018)CFU/g；所述发酵菌包括曲霉菌和乳酸菌；所述曲霉菌和乳酸菌在发酵体系中的活菌数的比例为1：(1～4)；所述乳酸菌包括德氏乳杆菌保加利亚亚种、嗜热链球菌、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌和干酪乳杆菌中的一种或几种。本发明将稻米采用曲霉菌和乳酸菌双菌发酵，显著提高了发酵后产物的总多酚和总黄酮含量，使得到的稻米发酵物具有良好的抗氧化活性和紧致皮肤的作用，很适合用于护肤品、化妆品和发用产品中。
附图说明
图1为本发明稻米发酵提取物的制备流程图；
图2为本发明不同浓度的稻米发酵提取物的DPPH清除率结果；
图3为未发酵的稻米、实施例1的稻米发酵物和对比例3的稻米发酵物的DPPH清除率结果；
图4为不同处理对角质形成细胞活力的影响；
图5为空白组角质形成细胞处理24h后在显微镜下的图片；
图6为未发酵稻米组角质形成细胞处理24h后在显微镜下的图片；
图7为米曲霉发酵稻米组角质形成细胞处理24h后在显微镜下的图片；
图8为米曲霉&乳酸菌发酵稻米组角质形成细胞处理24h后在显微镜下的图片；
图9为稻米发酵提取物粉末对人真皮成纤维细胞活力的影响；
图10为维生素E与稻米发酵提取物粉末对UVA致真皮成纤维细胞分泌MMP-1的影响对比图；
图11为两种稻米提取物冻干粉的外观稳定性结果对比图；左边为未发酵稻米提取物冻干粉；右边为本发明的稻米发酵提物物冻干粉。
具体实施方式
本发明提供了一种稻米发酵物的制备方法，包括如下步骤：利用发酵菌对含有稻米和水的混合物进行发酵，得到稻米发酵物；
所述发酵菌在发酵体系中的活菌数为(0.5～2.5)×(105～1018)CFU/g；
所述发酵菌包括曲霉菌和乳酸菌；
所述曲霉菌和乳酸菌在发酵体系中的活菌数的比例为1：(1～4)；
所述乳酸菌包括德氏乳杆菌保加利亚亚种、嗜热链球菌、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌和干酪乳杆菌中的一种或几种。
本发明利用发酵菌对含有稻米和水的混合物进行发酵，得到稻米发酵物。在本发明中，所述稻米为禾本科(Gramineae)稻属(Oryza)稻(Oryza sativa L.)；优选包括有色稻米；所述有色稻米进一步优选包括紫米、红米或黑米；更进一步优选为紫米。有色稻米富含花青素，具有较强的抗氧化活性，很适合用于高活性化妆品的开发。在本发明中，所述稻米和水的质量体积比优选为1g：(1～10)mL；进一步优选为1g：3mL。本发明特定的稻米和水的比例，有利于稻米充分进行发酵，使有效活性物质的含量达到最大。本发明优选将稻米和水混合后，对混合物进行灭菌处理，得到含有稻米和水的混合物。本发明对灭菌处理的方法和条件没有特殊要求，能够实现灭菌效果即可。灭菌后，本发明优选利用发酵菌对灭菌后的混合物进行发酵，避免杂菌的影响。
在本发明中，所述发酵菌包括曲霉菌和乳酸菌。本发明实施例中所述曲霉菌优选购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌种保藏编号为：CICC 2014。在本发明中，所述乳酸菌包括德氏乳杆菌保加利亚亚种、嗜热链球菌、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌和干酪乳杆菌中的一种或几种；进一步优选包括德氏乳杆菌保加利亚亚种、嗜热链球菌、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌和干酪乳杆菌。在本发明中，所述乳酸菌优选购自中国工业微生物菌种保藏管理中心；其中德氏乳杆菌保加利亚亚种、嗜热链球菌、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、干酪乳杆菌的菌种保藏编号分别为：CICC 6099、CICC 20174、CICC 6085、CICC 23166、CICC 23184。本发明特定的乳酸菌种类得到的发酵产物能帮助维持皮肤微生态平衡，抗氧化，抑制病原菌等作用。本发明采用曲霉菌和乳酸菌双菌对稻米进行发酵，可显著提高发酵后产物的总多酚和总黄酮含量，抗氧化活性增强，细胞毒性减小。在本发明中，所述发酵菌在发酵体系中总的活菌数为(0.5～2.5)×(105～1018)CFU/g；进一步优选为(1～2)×(108～1016)CFU/gCFU/g；更进一步优选为2×1014CFU/g。在本发明中，所述发酵菌优选以发酵干粉的形式添加到发酵体系中。在本发明中，所述发酵干粉的活菌数优选为108～1020CFU/g；进一步优选为1012～1018CFU/g；更进一步优选为1016CFU/g。在本发明中，所述发酵菌中曲霉菌和乳酸菌在发酵体系中的活菌数的比例为1：(1～4)；进一步优选为1:4。当乳酸菌优选包括德氏乳杆菌保加利亚亚种、嗜热链球菌、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌和干酪乳杆菌时，所述德氏乳杆菌保加利亚亚种、嗜热链球菌、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、干酪乳杆菌在发酵体系中的活菌数比例为3：(0.6～1.6)：(0.6～1.6)：(0.6～1.6)：(0.6～1.6)；进一步优选为3：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)；更进一步优选为3:1:1:1:1。本发明优选在灭菌后，冷却温度≤50℃后再进行接种，以防降低发酵菌的活性。在本发明中，所述发酵菌接种的质量优选占稻米质量的0.5％～10％；进一步优选为2％～8％；更进一步优选为5％。本发明特定的菌浓度、菌比例和接种量可使稻米进行充分发酵，提高稻米发酵产物中活性物质的浓度，提高抗氧化活性。
在本发明中，所述发酵的温度优选为30～50℃；进一步优选为36～40℃；更进一步优选为38℃。在本发明中，所述发酵的时间优选为18～72h；进一步优选为20～36h；更进一步优选为24h。在本发明中，所述发酵的转速优选为200～1000rpm；进一步优选为300～700rpm；更进一步优选为500rpm。本发明特定的发酵条件发酵菌种生长代谢好，发酵速度快，稻米发酵产物活性物质含量高。发酵结束后，得到本发明所述的稻米发酵产物。在本发明中，所述稻米发酵产物优选灭菌后再保存或使用，主要为了将发酵菌灭活。本发明对灭菌的方法没有特殊要求，采用常规的灭菌方法即可。
本发明提供的稻米发酵物的制备方法将稻米采用曲霉菌和乳酸菌双菌发酵，显著提高了发酵后产物的总多酚和总黄酮含量，使得到的稻米发酵物具有良好的抗氧化活性和紧致皮肤的作用，很适合用于护肤品、化妆品和发用产品中。
本发明提供了一种稻米发酵物，采用上述技术方案中所述的制备方法得到，所述稻米发酵物中总多酚含量大于5.0mg/mL，总黄酮含量大于5.0mg/mL。本发明的稻米发酵物具有良好的抗氧化活性，总黄酮和总多酚含量高，适合用于护肤品、化妆品和发用产品中。
本发明提供了一种稻米发酵提取物的制备方法，用乙醇水溶液对上述技术方案中所述的制备方法得到的稻米发酵物进行提取，得到稻米发酵提取物。在本发明中，所述乙醇水溶液中乙醇的体积百分含量优选为50％～95％；进一步优选为60％～90％；更进一步优选为80％。稻米淀粉在本发明特定的乙醇水溶液中溶解度小，不会造成稻米淀粉像煮粥一样的粘稠现象，在保障提取效率的同时便于稻米发酵物的固液分离，也利于乙醇水溶液的回收利用。本发明优选以稻米发酵物中使用稻米的质量来确定乙醇水溶液的加入量；所述稻米的质量与乙醇水溶液的体积比优选为1g：(3～12)mL；进一步优选为1g：(4～10)mL；更进一步优选为1g：5mL。在本发明中，所述提取的次数优选为1～5次；进一步优选为2～4次；更进一步优选为2次。在本发明中，每次提取的温度优选为75～90℃，进一步优选为75～85℃；更进一步优选为80℃。本发明特定的提取温度利于稻米发酵物充分提取。在本发明中，每次提取的时间优选为30～180min；进一步优选为60～120min；更进一步优选为60min。本发明特定的提取时间利于能耗达到一个高效的水平，使稻米发酵液的活性物质提取率高，且能耗相对较少。
提取后，本发明还优选包括对提取料液进行过滤、浓缩和干燥，得到稻米发酵提取物粉末。在本发明中，所述过滤优选包括常压过滤、减压抽滤或正压过滤；进一步优选为减压抽滤。在本发明中，所述过滤的滤材优选为200～300目筛网，或1～120μm滤纸，或0.45～1μm滤膜；进一步优选为30～50μm滤纸。本发明对提取料液进行过滤主要便于在化妆品中使用，使得到的稻米发酵提取物质地更好。在本发明中，所述浓缩的方式优选为减压浓缩或敞口浓缩；进一步优选为减压浓缩。在本发明中，所述减压浓缩的压力优选为-0.05Mpa～-0.08Mpa；进一步优选为-0.06Mpa。在本发明中，所述减压浓缩的温度优选为45～75℃；进一步优选为60～70℃；更进一步优选为65℃。在本发明中，所述浓缩优选至1倍投料量。在本发明中，所述投料量是指制备稻米发酵物的稻米的使用量。本发明特定的浓缩步骤可以缩短干燥时间，降低能耗。在本明中，所述干燥的方式优选包括常压干燥、减压干燥或冷冻干燥；进一步优选为冷冻干燥。本发明的干燥步骤利于稻米发酵提取物的保存和使用。本发明稻米发酵提取物优选以粉末状态保存，具有稳定性强，不易吸潮等优点。本发明的稻米发酵提取物的制备流程图见图1。
本发明提供的稻米发酵提取物的制备方法以乙醇水溶液为提取溶剂，溶剂安全无毒，提取效率高，且方法简便、设备要求低，适合用于工业化生产。
本发明提供了一种稻米发酵提取物，采用上述技术方案中所述的稻米发酵提取物的制备方法得到。本发明的稻米发酵提取物具有良好的抗氧化效果，且外观稳定性强，不易吸潮，可以长期保存和使用，颜色不会发生明显变化。
本发明提供了上述技术方案中所述的稻米发酵物的制备方法得到的稻米发酵物或上述技术方案中所述的稻米发酵提取物的制备方法得到的稻米发酵提取物在化妆品行业中的应用。本发明所述的稻米发酵物或者所述的稻米发酵提取物优选添加到化妆品的配方中进行使用，起到抗氧化、抗衰老的作用。
为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种稻米发酵物、稻米发酵提取物及制备方法和应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的先定。
实施例1
一种稻米发酵物，制备方法如下：
1灭菌：将紫米和水按料液比为1g：3mL混合，加热灭菌。
2接种：待步骤1中混合物冷却至40℃进行接种。其中，发酵菌种为曲霉菌和乳酸菌，曲霉菌购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌种保藏编号为：CICC 2014；乳酸菌购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，包括德氏乳杆菌保加利亚亚种、嗜热链球菌、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、干酪乳杆菌，菌种保藏编号分别为：CICC 6099、CICC 20174、CICC 6085、CICC 23166、CICC 23184。其中，发酵菌在发酵体系中的活菌数为2×1016CFU/g。将发酵菌以稻米质量的5％接种于稻米和水的混合液中，其中，曲霉菌和乳酸菌在发酵体系中的活菌数的比例为1:4；乳酸菌中德氏乳杆菌保加利亚亚种、嗜热链球菌、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、干酪乳杆菌在发酵体系中的活菌数比例为3：1：1：1：1。
3发酵：接种后，在38℃条件下发酵24h，得到稻米发酵物。
实施例2
一种稻米发酵物，制备方法同实施例1，不同之处在于：曲霉菌和乳酸菌的活菌数的比例为1:1。
实施例3
一种稻米发酵物，制备方法同实施例1，不同之处在于：稻米和水按料液比为1g：10mL混合。
实施例4
一种稻米发酵物，制备方法同实施例1，不同之处在于：发酵菌的接种量为稻米质量的1％。
实施例5
一种稻米发酵物，制备方法同实施例1，不同之处在于：发酵时间为48h。
实施例6
一种稻米发酵物，制备方法同实施例1，不同之处在于：乳酸菌含有德氏乳杆菌保加利亚亚种、嗜热链球菌，其中，活菌数比例为3：1.6。
实施例7
一种稻米发酵物，制备方法同实施例1，不同之处在于：乳酸菌含有德氏乳杆菌保加利亚亚种。
实施例8
一种稻米发酵物，制备方法同实施例1，不同之处在于：乳酸菌含有嗜热链球菌、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌，其中，活菌数比例为1:1:1。
实施例9
一种稻米发酵物，制备方法同实施例1，不同之处在于：乳酸菌含有嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、干酪乳杆菌，其中，活菌数比例为1:1:1。
实施例10
一种稻米发酵物，制备方法同实施例1，不同之处在于：乳酸菌含有嗜热链球菌、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、干酪乳杆菌，其中，活菌数比例为1:1:1:1。
实施例11
一种稻米发酵物，制备方法同实施例1，不同之处在于：乳酸菌含有嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌，其中，活菌数比例为1:1。
实施例12
一种稻米发酵物，制备方法同实施例1，不同之处在于：乳酸菌含有德氏乳杆菌保加利亚亚种、干酪乳杆菌，其中，活菌数比例为3：1.6。
对比例1
一种稻米发酵物，制备方法同实施例1，不同之处在于：发酵温度为30℃
对比例2
一种稻米发酵物，制备方法同实施例1，不同之处在于：将曲霉菌省略。
对比例3
一种稻米发酵物，制备方法同实施例1，不同之处在于：将乳酸菌省略。
对比例4
一种稻米发酵物，制备方法同实施例1，不同之处在于：将曲霉菌和乳酸菌替换为酵母菌；所述酵母菌购自安琪酵母有限公司。
对比例5
一种稻米发酵物，制备方法同实施例1，不同之处在于：将曲霉菌替换为酵母菌；发酵菌的菌液中乳酸菌和酵母菌的活菌数的比例为1:1。
对比例6
一种稻米发酵物，制备方法同实施例1，不同之处在于：将曲霉菌替换为酵母菌；发酵菌的菌液中乳酸菌和酵母菌的活菌数的比例为4:1。
对比例7
一种稻米发酵物，制备方法同实施例1，不同之处在于：将曲霉菌替换为酵母菌；发酵菌的菌液中乳酸菌和酵母菌的活菌数的比例为1:4。
对比例8
一种稻米发酵物，制备方法同实施例1，不同之处在于：将乳酸菌替换为酵母菌；发酵菌的菌液中酵母菌和曲霉菌的活菌数的比例为1:1。
对比例9
一种稻米发酵物，制备方法同实施例1，不同之处在于：将乳酸菌替换为酵母菌；发酵菌的菌液中酵母菌和曲霉菌的活菌数的比例为4:1。
对比例10
一种稻米发酵物，制备方法同实施例1，不同之处在于：将乳酸菌替换为酵母菌；发酵菌的菌液中酵母菌和曲霉菌的活菌数的比例为1:4。
实施例13
一种稻米发酵提取物，制备方法如下：
将本发明的稻米发酵物进行高压灭菌后用体积百分含量为80％的乙醇水溶液进行提取。其中，稻米发酵液中稻米的质量与乙醇水溶液的体积比为1g：5mL，在85℃条件下提取60min，共提取2次。提取液冷却至38℃进行减压抽滤浓缩，减压浓缩压力为-0.06Mpa，温度65℃，滤液浓缩至1倍投料量(稻米质量的1倍)。浓缩后采用真空冷冻干燥技术对滤液进行干燥，粉碎过80目，得到稻米发酵提取物粉末。
实施例14不同处理条件对总黄酮和总多酚含量的影响
将未发酵的稻米、实施例1～12和对比例1～10的稻米发酵物采用实施例13的方法进行提取，得到各自的稻米发酵提取物粉末。检测各处理组得到的稻米发酵提取物粉末中总黄酮和总多酚的含量。
总黄酮的检测方法为紫外分光光度法。具体检测方法如下：
1)试剂与样品准备
5％亚硝酸钠溶液：称取亚硝酸钠(NaNO2)，用水溶解，配制成质量百分含量为5％的NaNO2溶液；
10％硝酸铝溶液：称取硝酸铝(Al(NO3)3)，用水溶解，配制成质量百分含量为10％的Al(NO3)3溶液；
4％氢氧化钠溶液：称取氢氧化钠(NaOH)，用水溶解，配制成质量百分含量为4％的NaOH溶液；
芦丁对照品溶液：精密称取芦丁对照品，加入质量百分含量为85％乙醇水溶液溶解并定容，制成1mL含0.2mg的对照品溶液；
供试品溶液：精密移取各稻米发酵物1mL，加入体积百分含量为50％乙醇水溶液溶解稀释至10mL，即得；
精密称取稻米发酵提取物冻干粉于50mL容量瓶中，加入体积百分含量为50％乙醇水溶液溶解并定容至刻度，配制成1mL含3mg的供试品溶液。
2)总黄酮含量检测
按表1将各试管编号后按顺序加入相应溶液，并按步骤操作，比如以1号试管为例，首先在1号试管中加入0.2mL芦丁对照品溶液和0.4mL NaNO2溶液，然后放置5min；放置完成后加入0.4mL Al(NO3)3溶液，再放置5min；放置完成后加入4mL NaOH溶液和5mL水，放置15min即可检测。其中，0～5号为绘制标准曲线的试管，分别加入相应量的芦丁对照品溶液；S为检测样品的试管，加入相应量的待检测样品。以0号管为空白参比，于波长510nm处检测各管的吸光度值。
表1总黄酮检测中各试管加液方法和步骤
Figure BDA0003223687720000101
标准曲线的绘制：以芦丁的浓度(μg/mL)为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线(此处芦丁浓度为配制的芦丁对照品溶液加入表1中所列水、显色液后的最终浓度)。
3)计算：
表2用于检测标准曲线的检测数据
名称 试管编号 浓度(ug/mL) Abs 波长(510nm)
测试点1 1 3.61 0.033 0.033
测试点2 2 7.22 0.077 0.077
测试点3 3 10.83 0.118 0.118
测试点4 4 14.44 0.159 0.159
测试点5 5 18.05 0.202 0.202
由表2得到标准曲线的方程公式：Abs＝0.01163*C-0.0082，可计算C1值。
则稻米发酵物总黄酮含量(mg/mL)＝C1ⅹ4ⅹ10ⅹ10-3
稻米发酵提取物粉末总黄酮含量(％)＝(C1ⅹ4ⅹ10-3/C2)x100％
C1——检测样品溶液的含量(μg/mL)，通过标准曲线计算得来；
C2——供试品溶液浓度(mg/mL)。
总多酚的检测方法为紫外分光光度法。具体检测方法如下：
1)试剂与样品准备
福林酚溶液：精密移取10mL福林酚溶液(1mol/L)，用纯水溶解并定容至50mL，摇匀备用；
7％的Na2CO3溶液：精密称取碳酸钠(Na2CO3)，加纯水溶解定容，配制成质量百分含量7％的Na2CO3溶液；
没食子酸对照品溶液：精密称取没食子酸对照品适量，加纯水溶解并定容，制成1mL含0.1mg的对照品溶液；
供试品：精密移取各稻米发酵物1mL，加入体积百分含量为50％乙醇水溶液溶解稀释至10mL，即得；
精密称取稻米发酵提取物冻干粉于50mL容量瓶中，加50％乙醇溶解并定容至刻度，配制成1mL含3mg的供试品溶液。
2)总多酚含量检测
按表3将各试管编号后按顺序加入相应溶液，并按步骤操作，比如以1号试管为例，首先在1号试管中加入0.1mL没食子酸对照品溶液和4mL福林酚溶液，放置5min；放置完成后加入4mL Na2CO3溶液和1.9mL水，暗处放置90min即可检测。其中，0～5号为标准曲线的加液方法和步骤，S为检测样品的加液方法和步骤。以0号管为空白参比，于波长778nm处检测各管的吸光度值。
表3总黄酮检测中各试管加液方法和步骤
Figure BDA0003223687720000111
标准曲线的绘制：以没食子酸的浓度(μg/mL)为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线(此处没食子酸浓度为配制的没食子酸对照品溶液加入表3中所列水、显色液后的最终浓度)。
3)计算：
表4用于检测标准曲线的检测数据
Figure BDA0003223687720000112
Figure BDA0003223687720000121
由表4得到标准曲线的方程公式：Abs＝0.1298*C+0.0065可计算C1值。
则稻米发酵物总多酚含量(mg/mL)＝C1ⅹ6.67ⅹ10ⅹ10-3
稻米发酵提取物粉末总多酚含量(％)＝(C1ⅹ6.67ⅹ10-3/C2)x100％
C1——检测样品溶液的含量(μg/mL)，通过标准曲线计算得来；
C2——供试品溶液浓度(mg/mL)。
表5不同处理条件对总黄酮和总多酚含量的影响
Figure BDA0003223687720000122
Figure BDA0003223687720000131
由表5的结果可知，本发明实施例1～12的稻米发酵物制备得到的稻米发酵提取物中的总黄酮含量和总多酚含量显著高于对比例；其中，曲霉菌和乳酸菌混合发酵最优，当曲霉菌和乳酸菌的活菌数比例为1：(1～4)时，总黄酮的含量最高为6.80mg/mL，总多酚的含量最高为6.94mg/mL。
实施例15抗氧化活性的评价
将未发酵的稻米、实施例1得到的稻米发酵物和对比例3得到的稻米发酵物进行DPPH清除活性对比，以比较不同处理方法得到的稻米发酵物的抗氧化活性。将实施例1得到的稻米发酵物，用实施例13的提取方法进行提取，得到稻米发酵提取物粉末。检测稻米发酵提取物粉末的DPPH清除活性，考察稻米发酵提取物粉末的抗氧化活性。
具体检测方法如下：
1)试剂与样品准备
DPPH甲醇溶液：取1,1-二苯基-2-苦基肼/DPPH用甲醇定容，配制成1mL含80μg的DPPH甲醇溶液，暗处存放。
供试品溶液：
精确移取未发酵的稻米、米曲霉稻米发酵物(对比例3)、米曲霉&乳酸菌稻米发酵物(实施例1)各0.2mL，用50％甲醇稀释至10mL，即得；
精确称取稻米发酵提取物粉末(实施例1用实施例13的提取方法制备)，用50％甲醇定容，配制成1mL含10mg的溶液。
2)操作流程
试验组：分别取0.050mL、0.100mL、0.150mL、0.250mL、0.350mL、0.500mL供试品溶液于深孔板中，用蒸馏水补足到0.500mL，加入2.0mL DPPH甲醇溶液，混匀，暗处放置30min，不断震荡，测定520nm处的吸光值。
空白组：深孔板中分别取同试验组等体积的供试品溶液，用蒸馏水补足到0.500mL，加入2.0mL的甲醇溶液。混匀后暗处放置30min，不断震荡，测定520nm处吸光值。
对照组：0.500mL蒸馏水加入2.0mL DPPH甲醇溶液。混匀后暗处放置30min，不断震荡，测定520nm处的吸光值。
计算：DPPH清除率(％)＝(A0-A1+A2)/A0*100％
其中A0为对照组吸光度值；A1为试验组吸光度值；A2为空白组吸光度值。
每个检测结果重复三次试验，求平均值，得到不同样品浓度的DPPH清除率，实施例1的稻米发酵物得到的稻米发酵提取物粉末的检测结果如表6和图2。
表6稻米发酵提取物粉末的DPPH清除率结果
样品加量(mL) 浓度(mg/mL) DPPH清除率
0.05 0.2 21.00％
0.10 0.4 32.80％
0.15 0.6 43.81％
0.25 1 58.62％
0.35 1.4 66.40％
0.50 2 87.62％
由表6和图2的结果可知，本发明得到的稻米发酵提取物粉末的DPPH清除活性IC50为0.7mg/mL。
未发酵的稻米、实施例1的稻米发酵物和对比例3的稻米发酵物的检测结果见图3和表7。由图3的结果可知，未发酵的稻米的DPPH清除活性IC50为3.848％；对比例3的稻米发酵物的DPPH清除活性IC50为3.037％；实施例1的稻米发酵物的DPPH清除活性IC50为2.266％。
表7未发酵稻米、米曲霉稻米发酵物及米曲霉&乳酸菌稻米发酵物的DPPH清除率结果
Figure BDA0003223687720000141
Figure BDA0003223687720000151
实施例16细胞毒性测试
1)试验试剂
细胞基础培养基(MEM培养基，BI)、胎牛血清(BI)、细胞完全培养基(80％MEM基础培养基+20％胎牛血清)、MTT(噻唑蓝，索莱宝)、PBS(PH 7.4BI)，0.25％胰酶(BI)
2)试验耗材
移液器枪头(1000μL，200μL，10μL，NEST)，96孔板(NEST)，离心管(2mL，5mL，50mL)，无菌培养皿(60x60mm，NEST)等人表皮角质形成血细胞(Hacat，购自广州赛库生物技术有限公司)
3)试验仪器设备
移液器(1000μL，200μL，10μL，艾本德)，酶标仪(赛默飞)，倒置显微镜(尼康)，超净工作台(上海博讯)，超纯水机(Synergy UV系统)，CO2恒温培养箱(美墨尔特)。
4)试验过程
将未发酵稻米、对比例3的曲霉菌发酵的稻米发酵物和实施例1曲霉菌和乳酸菌发酵的稻米发酵物用高压灭菌锅122℃灭菌30min，得到待测样品；然后用MEM培养基将待测样品配制成质量浓度为5％的待测溶液，再用MEM培养基稀释成质量浓度为2.5％，1.25％，0.625％，0.3125％和0.158％的待测溶液，采用MTT法检测各待测样品对角质形成细胞的细胞毒性。
细胞传代培养:将人表皮角质形成细胞(Hacat细胞，购自广州赛库生物技术有限公司)接种于100mm培养皿中，将培养皿放入CO2恒温培养箱中培养，其中CO2恒温培养箱的温度为37℃，CO2浓度为5％，每隔2d更换新的细胞完全培养基，待细胞密度达70％～80％，弃除旧的培养基，用PBS冲洗细胞2次；然后加入2mL质量百分数为0.25％胰酶，放回培养箱5min，然后加入6mL完全培养基终止消化；移液枪吹打细胞，使细胞脱壁并重悬，转移至2mL圆底离心管中，1000rpm，5min离心；弃上清，加入1mL完全培养基，吹打混匀细胞悬液，并按照1:3的比例进行传代。
MTT法测试样品对角质形成细胞(Hacat)活力的影响：
1)取出密度达70％～80％的Hacat细胞，重悬细胞并调整细胞悬液浓度为8x104cell/mL，吹打混匀备用；
2)取出96孔板，在板子周围一圈每孔加200μL MEM培养基，其余孔每孔加200ul细胞悬液，放回培养箱培养；另设3个不含细胞悬液的孔作为调零孔，每孔加200μLMEM培养基。
3)24h后取出96孔板，弃除旧的培养基，按照每组样品每个浓度3个复孔进行布板。空白对照组加200ul MEM培养基；待测样品组每孔加200ul对应浓度待测样品溶液，放回培养箱继续培养。
4)24h后取出96孔板，观察细胞状态及密度，每孔加20μL浓度为5mg/mL的MTT溶液，放回培养箱继续培养，4h后取出，弃除上清液，然后每孔加150μL DMSO，摇床振摇10min后，酶标仪560nm测定吸光度(OD值)。
细胞活力(％)＝(试验组OD值-调零孔OD值)/(正常对照组OD值-调零孔OD值)×100％
检测结果见表8、图4～图8。
表8不同处理对人表皮角质形成细胞活力的影响
Figure BDA0003223687720000161
Figure BDA0003223687720000171
由表8和图4的结果可知，样品对角质形成细胞的毒性大小顺序为未发酵稻米>米曲霉发酵稻米>米曲霉&乳酸菌发酵稻米，稻米经过米曲霉菌和乳酸菌发酵后可降低对细胞的毒性。
图5～图8为角质形成细胞处理24h后在显微镜下的图片，其中，图5为空白组角质形成细胞处理24h后在显微镜下的图片；图6为未发酵稻米组角质形成细胞处理24h后在显微镜下的图片；图7为米曲霉发酵稻米组角质形成细胞处理24h后在显微镜下的图片；图8为米曲霉&乳酸菌发酵稻米组角质形成细胞处理24h后在显微镜下的图片；各图右下角的标记为各处理样本的浓度。由图5～图8的结果可知，空白组中正常的角质形成细胞为铺路石状，未发酵稻米、米曲霉发酵稻米和米曲霉&乳酸菌发酵稻米，细胞形态存在差异：不同样品作用下，细胞形态出现明显变化，随浓度增大，细胞出现凋亡、碎裂、数量减少等情况；对比空白组、未发酵稻米组、米曲霉发酵稻米组和米曲霉&乳酸菌发酵稻米组可知，在1.25％浓度下，未发酵稻米细胞形态变化最明显，细胞明显凋亡，米曲霉发酵细胞数量明显较空白对照组少，形态与空白对照组相近，米曲霉&乳酸菌发酵细胞数量较前两者多，形态与空白对照组相近，说明米曲霉&乳酸菌发酵稻米对细胞的形态影响最小，米曲霉发酵稻米次之，未发酵稻米对细胞形态影响最大。
实施例17抗光老化活性评价
1)试验试剂
基础培养基(RPMI1640，BI)、完全培养基(90％RPMI1640+10％胎牛血清)、胎牛血清(BI)、MTT(噻唑蓝，索莱宝)、PBS(PH7.4，BI)、维生素E(VE，上海源叶)等。
2)试验耗材
液器枪头(1000μL，200μL，10μL，NEST)，人基质金属蛋白酶1(MMP-1)ELISA试剂盒(索莱宝)，96孔板(NEST)，离心管(2mL，5mL，50mL)，一次性无菌针头过滤器(0.22μm)，一次性无菌注射器(1mL，20mL)等，无菌培养皿(60x60mm，NEST)等。
3)仪器设备
移液器(1000μL，200μL，10μL，艾本德)，酶标仪(BioTek,SYNERGY HTX)，倒置显微镜(尼康)，超净工作台(上海博讯)，超纯水机(Synergy UV系统)，CO2恒温培养箱(美墨尔特)，超低温冷冻储存箱(美菱生物)等。
4)细胞
人真皮成纤维细胞(HDF-a，北纳生物)。
5)试验过程
试验原理：光老化是引起皮肤衰老的主要因素之一，紫外线作用于人体皮肤，引起皮肤氧化损伤、炎症、瘙痒等皮肤问题。研究表明，阳光中的紫外线根据波长大小可分为以下三类：1)长波紫外线(UVA)，波长范围320～400nm，几乎全部到达地面，能穿透真皮，造成皮肤真皮损伤；2)中波紫外线(UVB)，波长范围280～320nm,大部分可到达地面，造成皮肤表皮损伤，3)短波紫外线(UVC)，波长范围200～280nm，均被臭氧层吸收，不能到达地面。因此，UVA和UVB是主要造成皮肤光老化的主要因素。其中，UVA可诱导真皮成纤维细胞表达和分泌基质金属蛋白酶(MMPs)，降解细胞外基质，使真皮弹力纤维变性，使皮肤弹性减小、产生皱纹。MMPs是降解细胞外基质(ECM)的一类重要的蛋白水解酶类，通过水解、破坏及重组细胞外基质，导致皮肤结缔组织结构重建，引起皮肤老化。MMP-1、MMP-3和MMP-9是MMPs中的主要成分，可作为UVA诱导真皮成纤维细胞氧化损伤的检测指标。
试验方法：
MTT法测定由实施例1的稻米发酵物制备得到的稻米发酵提取物粉末最大安全浓度
1)接种：当细胞密度≥70％时，质量百分数为0.25％的胰蛋白酶消化细胞并重悬，1000rpm离心4min，弃上清；重新加入1mL完全培养基，吹打混匀后，稀释适当倍数并计数，根据计数的结果将细胞密度调整为8x104cell/mL，按照每孔200μL的体积接种细胞至96孔板中，放回培养箱孵育(37℃、5％CO2)。
2)试验分组：试验设置空白对照组与试验组，另设3个无细胞的孔作调零孔，试验组中样品设置6个浓度梯度，每个浓度梯度下设置2个复孔；
3)配液：按试验设计，用基础培养基配置不同浓度的受试物，分别为1.0mg/mL、0.5mg/mL、0.25mg/mL、0.125mg/mL、0.0625mg/mL和0.03125mg/mL；
4)给药：24h后取出96孔板，弃除旧培养基，调零孔和空白对照组每孔加200μL基础培养基，试验组每孔加200μL用基础培养基配制的样品，按照每组每个浓度2个复孔进行布板。然后放回培养箱培养(37℃，5％CO2)；
5)检测：加药处理后24h，取出96孔板，每孔加入MTT工作液(5mg/mL)20μL，放回培养箱继续培养4h，然后弃除孔内液体，每孔重新加入150μL DMSO，振摇10min后于560nm波长处测定吸光度(OD值)。
6)细胞相对活力计算：细胞活力％＝(试验组OD值-调零孔OD值)/(空白对照组OD值-调零组OD值)*100％
稻米发酵提取物粉末对UVA致真皮成纤维细胞分泌MMP-1的影响
1)接种：当细胞密度≥70％时，胰蛋白酶(0.25％)消化细胞并重悬，1000rpm离心4min，弃上清；重新加入1mL完全培养基，吹打混匀后，稀释适当倍数并计数，根据计数的结果将细胞密度调整为8x104cell/mL,按照每孔200μL的体积接种细胞至96孔板中，放回培养箱孵育(37℃、5％CO2)。
2)试验分组：试验设置空白对照组(BC)、阴性对照组(NC)、阳性对照组(PC)和试验组，另设3个无细胞的孔作调零组，试验组中样品设置4个浓度梯度，每个浓度梯度下设置3个复孔；
3)配液：根据“MTT法测定稻米发酵提取物粉末最大安全浓度”所得细胞活力测试结果，选择细胞活力≥90％对应的样品浓度为最大作用浓度，并进行2倍梯度稀释，共稀释4个浓度，作为试验组样品待测液；以维生素E(0.5mg/mL)为阳性对照进行试验。
4)给药：24h后取出96孔板，弃除旧培养基，按照每组每个浓度3个复孔进行加样，调零孔、空白对照组(BC)、阴性对照组(NC)每组3个复孔，每孔加200μL基础培养基，试验组每个浓度3个复孔，每孔加200μL对应浓度样品，然后放回培养箱培养(37℃，5％CO2)；
5)UVA照射：给药1h后取出96孔板，用锡箔纸遮挡住空白对照组对应孔后置于UVA光源下进行照射，照射能量累计达到20J/cm2后，将96孔板放回培养箱孵育；
6)细胞上清收集：给药24h后取出96孔板，分别收集各样品组对应的细胞上清液至离心管中，-20℃储存备用。
7)ELISA试剂盒测定细胞上清中MMP-1浓度
测试前30min取出试剂盒及待测样品，放置于室温后使用，测试操作严格按照试剂盒说明书操作。
检测结果见表9、表10、表11、图9。
表9稻米发酵提取物粉末对真皮成纤维细胞(HDF-a)活力的影响
Figure BDA0003223687720000201
由表9和图9可知，稻米发酵提取物粉末浓度≤0.5mg/mL时，细胞活力≥90％，结合细胞状态观察结果，选择0.5mg/mL作为最大安全浓度进行试验。
表10稻米发酵提取物粉末对UVA致真皮成纤维细胞分泌MMP-1的影响——标准曲线数据
Figure BDA0003223687720000202
Figure BDA0003223687720000211
表11稻米发酵提取物粉末对UVA致真皮成纤维细胞分泌MMP-1的影响——MMP-1测定结果
Figure BDA0003223687720000212
根据标曲所得公式：y＝0.0005x，将各组OD值(y)代入公式，即可求出各组MMP-1浓度(x，pg/mL)。
用T-Test进行统计分析，显著性以*表示，P值＜0.001表示为***P＜0.001；PC组、待测样品组与NC组相比，显著性以#表示，P值＜0.05表示为#P＜0.05，##P＜0.01，P值＜0.001表示为###P＜0.001。差异无统计学意义表示为P＞0.05。
稻米发酵提取物粉末对UVA致真皮成纤维细胞分泌MMP-1的影响结果分析，见表12和图10。
表12不同处理细胞上清液中MMP-1浓度
Figure BDA0003223687720000213
由表12和图10的结果可知，与空白对照组相比，阴性对照组MMP-1浓度显著升高(**P＜0.01)；阳性对照组MMP-1浓度明显低于阴性对照组(#P＜0.05)，说明此次刺激条件有效；稻米发酵提取物粉末在0.5mg/mL，0.25mg/mL浓度作用下MMP-1浓度明显低于阴性对照组，差异有统计学意义(###P＜0.001)，0.125mg/mL和0.0625mg/mL浓度作用下MMP-1浓度与阴性对照组对比差异无统计学意义(P＞0.05)。
实施例18稳定性考察
将未发酵的稻米和实施例1的稻米发酵物采用实施例13的方法进行提取，得到未发酵的稻米提取物冻干粉和稻米发酵提物冻干粉。将两种冻干粉避光置于45℃，湿度75％的恒温考察箱中7d，考察两种冻干粉的稳定性。检测结果如图11。
由图11的结果可知，未发酵的稻米冻干粉容易吸潮结块，外观稳定性差；本发明的稻米发酵提取物冻干粉不易吸潮，外观稳定性强。
实施例19紫米精华液的制备
将实施例1的稻米发酵物采用实施例13的方法进行提取，得到稻米发酵提物冻干粉。将得到的稻米发酵提取物冻干粉按表13的配方，制备得到紫米精华液。
表13紫米精华液配方
Figure BDA0003223687720000221
制备工艺：
1)A组分制备：将罗望子提取物和透明质酸钠用1，3-丙二醇室温分散均匀，再加入剩余部分室温搅拌溶解均匀；
2)预配B组分：将B组分升温至75～80℃，搅拌溶解均匀，加入上述混合组分中；
3)加入C组分，搅拌溶解均匀。
上述实施例的结果表明，本发明提供的稻米发酵物经过曲霉菌和乳酸菌双菌发酵，显著提高了发酵后产物的总多酚和总黄酮含量，使得到的稻米发酵物具有良好的抗氧化活性和紧致皮肤的作用，很适合用于护肤品、化妆品和发用产品中。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (10)

1.一种稻米发酵物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：利用发酵菌对含有稻米和水的混合物进行发酵，得到稻米发酵物；
所述发酵菌在发酵体系中的活菌数为(0.5～2.5)×(105～1018)CFU/g；
所述发酵菌包括曲霉菌和乳酸菌；
所述曲霉菌和乳酸菌在发酵体系中的活菌数的比例为1：(1～4)；
所述乳酸菌包括德氏乳杆菌保加利亚亚种、嗜热链球菌、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌和干酪乳杆菌中的一种或几种。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述稻米包括有色稻米。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述乳酸菌包括德氏乳杆菌保加利亚亚种、嗜热链球菌、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌和干酪乳杆菌；所述德氏乳杆菌保加利亚亚种、嗜热链球菌、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、干酪乳杆菌在发酵体系中的活菌数比例为3：(0.6～1.6)：(0.6～1.6)：(0.6～1.6)：(0.6～1.6)。
4.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述稻米和水的质量体积比为1g：(1～10)mL。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述发酵菌接种的质量占稻米质量的0.5％～10％；所述发酵的温度为30～50℃；所述发酵的时间为18～72h；所述发酵的转速为200～1000rpm。
6.一种稻米发酵物，其特征在于，采用权利要求1～5任一项所述的制备方法得到，所述稻米发酵物中总多酚含量大于5.0mg/mL，总黄酮含量大于5.0mg/mL。
7.一种稻米发酵提取物的制备方法，其特征在于，用乙醇水溶液对权利要求1～5任一项所述的制备方法得到的稻米发酵物进行提取，得到稻米发酵提取物。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述乙醇水溶液中乙醇的体积百分含量为50％～95％；所述稻米的质量与乙醇水溶液的体积比为1g：(3～12)mL；所述提取的次数为1～5次；每次提取的温度为75～90℃，每次提取的时间为30～180min。
9.一种稻米发酵提取物，其特征在于，采用权利要求7或8所述的制备方法得到。
10.权利要求1～5任一项所述的制备方法得到的稻米发酵物或权利要求7或8所述的制备方法得到的稻米发酵提取物在化妆品行业中的应用。
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