CN105193658A - 一种稻米发酵原浆化妆品及其制备方法与应用 - Google Patents

一种稻米发酵原浆化妆品及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种稻米发酵原浆化妆品及其制备方法与应用。本发明提供的稻米发酵原浆的方法，包括如下步骤：对由两歧双歧杆菌菌、稻米干粉和水组成的初始体系进行发酵培养而得。所述菌种为两歧双歧杆菌。通过实验证明：本发明制备的稻米发酵原浆不含任何化学成分，可以直接作为面膜或精华液或爽肤水的成品使用，比现有市面上的其他产品更加天然，不会给肌肤造成任何负作用；而且比普通提取方法获得更小的成分，更易让皮肤充分吸收。

Description

一种稻米发酵原浆化妆品及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种稻米发酵原浆化妆品及其制备方法与应用。
背景技术
稻米，是我国的主要粮食作物之一，具有悠久的种植历史。稻米可提供丰富维生素、谷维素、蛋白质、花青素等营养成分，具有补中益气、健脾养胃、益精强志、和五脏、通血脉、聪耳明目、止烦、止渴、止泻的功效，米粥具有补脾、和胃、清肺功效。稻米还有护肤用途功效，以稻米提取液作为主要成分(其富含y-谷维素、稻糠甾醇、原花青素等成分)，有性质温和安全，具有较强的润白功效，并可补充肌肤所缺失水分，使肌肤光滑细腻，充满弹性功效。我国稻米资源丰富，为开发应用稻米提供有利条件。随着稻米栽培业迅速发展及应用范围拓宽，对稻米营养成分及在医疗保健作用方面研究也逐步深入。对稻米活性物质的提取工艺也不断完善，但是提取方法主要以酶法提取、碱法提取和超声波提取等。
现有的稻米活性物提取最常采用的是碱法：高浓度的碱液可以提取大部分活性物质，但碱的处理也会引起化学性质的变化，促进美拉德反应，产品颜色发暗，产生有毒物质蓝氨酰丙氨酸，对肾脏功能有一定损害。
发明内容
本发明的目的是提供一种稻米发酵原浆化妆品及其制备方法与应用。
本发明提供的制备稻米发酵原浆的方法，包括如下步骤：
对由发酵菌、稻米干粉和水组成的初始体系进行发酵培养，经灭菌、离心得到的上清液为所述稻米发酵原浆。
上述方法中，所述发酵菌和所述稻米干粉与水的用量比为25-40mL：15-25g：300g，具体为30mL：20g：300g。发酵菌菌液的浓度为106-109CFU/mL。
所述发酵培养步骤中，时间为25h-35h，具体为28h；温度为37℃-47℃，具体为38℃。
所述发酵菌为双歧杆菌，具体为两歧双歧杆菌Bifidobacteriumbifidum，ATCC编号为29521；
所述稻米干粉的目数为20-50目。
所述发酵菌以其培养液或悬浮液的形式存在；
所述发酵菌的培养液或悬浮液的pH值为6.5-7.5。
所述方法还包括如下步骤：将发酵培养所得发酵液依次进行灭菌、离心、取上清液。
其中，所述灭菌步骤中，灭菌温度为110-125℃，具体为115℃；灭菌时间为15min-30min，具体为20min；
所述离心步骤中，离心转速为5800-7000r/min，具体为6000r/min；离心时间为25-35min，具体为30min；离心半径为8-12cm，具体为9cm。
另外，按照上述方法在制备具有如下至少一种功能的化妆品中的应用或直接作为具有如下至少一种功能的化妆品中的应用，也属于本发明的保护范围：
1)美白；
2)抗衰老；
3)清除DPPH自由基；
4)抑制酪氨酸酶的活性。
所述化妆品具体可为面膜、精华液或爽肤水。
本发明提供了一种稻米发酵原浆的制备方法，该方法选择合适的菌种对原料进行发酵而得，使产品更加天然，且不需要添加酶等外来物质，不仅节约生产成本，而且最大化的简化了生产步骤，使该发酵技术能够实现大量生产、工业化生产，并能够充分保证产品质量的稳定性。通过实验证明：本发明制备的稻米发酵原浆不含任何化学成分，可以直接作为面膜或精华液或爽肤水的成品使用，比现有市面上的其他产品更加天然，不会给肌肤造成任何负作用；且发酵成分中含有小分子多肽，易于让皮肤充分吸收。
附图说明
图1为稻米发酵原浆的活性多肽分子量分布HPLC图谱。
图2为稻米发酵原浆的清除DPPH自由基结果示意图。
图3为稻米发酵原浆的抑制酪氨酸酶活性示意图。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的液体培养基由溶质和溶剂组成，溶剂为水，溶质及其在液体培养基中的浓度为：葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，酵母膏10g/L，pH值为7.0。
下述实施例中的YPD培养基由溶质和溶剂组成，溶剂为水，溶质及其在液体培养基中的浓度为：酵母提取物1％(质量分数)，胰蛋白胨2％(质量分数)，葡萄糖2％(质量分数)，PH值为7.0。
下述实施例中的稻米来自市面销售。
下述实施例中的两歧双歧杆菌Zygosaccharomycesrouxii的ATCC编号为13356，可从ATCC获得。
实施例1、一种稻米发酵原浆的制备方法
1、菌种的活化
挑取两歧双歧杆菌(Zygosaccharomycesrouxii)菌落一环于液体培养基中，放入摇床中将菌种活化，得到活化后两歧双歧杆菌菌液。
2、菌种的纯化
将步骤1得到的活化后的菌液梯度稀释铺板，以便获取单菌落，得到纯化后巴两歧双歧杆菌。
3、菌种的扩大培养
将步骤2得到的纯化后的菌种接种到YPD培养基(PH值为7.0)中，在32℃的摇床中培养，当OD值＝0.6-1.2时，得到发酵菌菌液(菌种处在对数期，浓度为106-109CFU/ml，pH值为6.5-7.5)。
4、稻米发酵原浆的获得
将30mL步骤3得到的发酵菌菌液接种到20g的稻米干粉和300g的水中，得到发酵体系(发酵体系中菌液总量和稻米干粉与水的配比为30mL：20g：300g)；将发酵体系在38℃摇床中发酵28小时，得到发酵产物；将发酵产物115℃高压灭菌20min，使菌失活，得到灭菌后的发酵产物；将灭菌后的发酵产物在6000r/min、离心半径为9cm的条件下离心30min，弃沉淀，收集上清液，即为本发明提供的稻米发酵原浆。
实施例2、稻米发酵原浆在作为化妆品中的应用
一、稻米发酵原浆的性质
将实施例1所制备所得的发酵提取物外观为粘稠液体、颜色为淡白色至淡黄色。pH值5.2-6.3，粘度200-500cP，可溶性固含物含量1.5-5.0％，菌落总数小于50CFU/ml，无致病菌检出。根据化妆品卫生标准GB7916-87，化妆品细菌总数不高于1000CFU/ml，所以此发酵提取物符合化妆品质量要求。
对该稻米发酵原浆进行成分分析，蛋白质检测方法参照GB5009.5-2010；粗多糖检测方法参照GB/T5009.8-2008；黄酮检测方法参照GB/T5009.124-2003；总酚检测方法参照GB/T8313-2008所得结果如下：
本发明制得的稻米发酵原浆含蛋白质2.893g/kg、粗多糖9.521g/kg、总黄酮0.036g/kg(以芦丁计)、总酚0.058g/kg。
二、稻米发酵原浆的安全性检测
人体斑贴试验主要是用于检测化妆品终产品或原料的刺激性。本发明对实施例1获得的稻米发酵原浆进行人体封闭式斑贴试验，旨在对其潜在皮肤刺激性进行评估。
1、试验对象
选择合适的志愿者30人，年龄范围在18-60岁随机选择。
2、试验方法
称取0.020g-0.025g固体样品或半固体的样品放入斑试器中备用。将液体样品0.2mL到0.025mL滴加在滤纸片上，再将滤纸片置于斑试器内。每个样品均设置空白对照，在对照斑试器孔内加入与样品等量的样品溶剂，如蒸馏水或橄榄油。
试验部位选为人体背部，利用无刺激性的胶带将斑试器固定贴敷于受试者背部。测试周期持续24h。为了试验结果的准确、可信和科学，在测试期间志愿者按照要求，不能摘掉斑试器，亦不可使受试部位接触水。24h后去除斑试器，静置30min后，等待压痕消失，观察皮肤的反应。如果试验结果为阴性，则需要在斑贴试验后24h和48h分别再观察一次。
3、试验结果
斑贴试验结果如表1所示：*"-"＝阴性反应；"±"＝可疑反应：仅有微弱红斑；"+"＝弱阳性反应(红斑反应)：红斑、浸润、水肿、可有丘疹；"++"＝强阳性反应(疱疹反应)；红斑、浸润、水肿、丘疹、疱疹；反应可超出受试区；"+++"＝极强阳性反应(融合性疱疹反应)；明显红斑、严重浸润、水肿、融合性疱疹；反应超出受试区。
根据化妆品卫生规范2007，人体斑贴试验判断标准为：30例受试者中出现1级皮肤不良反应的人数多于5例，或二级皮肤不良反应的人数多于2例，或出现任何1例三级或三级以上皮肤不良反应时，则判定受试物对人体有不良反应，反之，则视为对人体无不良反应。
从表中可以看出：实施例1得到的稻米发酵原浆产生1例可疑反应，说明本发明提供的稻米发酵物均具有安全性，不会给人体带来不良反应。
表1、实施例1获得的稻米发酵原浆的斑贴试验结果
三、稻米发酵原浆的分子量大小检测
分子量大小是检验是否能够进行皮肤渗透的重要因素。本发明通过高效液相色谱(HPLC)测定实施例1制备的稻米发酵原浆的分子量大小。具体步骤如下：
1、试验的试剂和溶液的制备
(1)流动相：乙腈：水：三氟乙酸＝30：70：0.1(v/v/v)。
(2)样品制备：以流动相为溶剂，以实施例1所得稻米发酵原浆为溶质，配制浓度为5mg/ml的样品，再在用微孔膜(0.45μm)过滤后供进样。
(3)标准样品制备：将牛血清蛋白(Mr67000)、B12(Mr1335)、氧化型谷胱甘肽(Mr614)配成混标，每种物质的浓度均为5mg/ml。
2、试验方法
将三种已知分子量的标准品：牛血清白蛋白(Mw67000)，维生素B12(Mw1335)和氧化型谷胱甘肽(Mw614)通过高效液相色谱仪(Waters公司)参照文献“王成忠等.蛋白酶酶解麦胚蛋白及酶解液中多肽分子量分布的研究.粮食加工，2012:37(2)”中的方法进行HPLC分析，绘制分子量对数与洗脱时间的标准曲线。根据凝胶柱渗透层析原理，多肽分子量大的物质先被洗脱出来，洗脱时间与分子量的对数呈线性关系。再按照同样的方法将实施例1中的实验组1、实验组2、和实验组3制备的稻米发酵原浆进行HPLC分析，得到相应峰的洗脱时间，将洗脱时间代入标准曲线，即可得到实施例1制备的稻米发酵原浆的分子量大小。
色谱条件：色谱柱：TsKgel2000SWXL300mm×7.8mm；检测波长：UV280nm；流速：1ml/min；柱温：30℃。
3、试验结果
标准物质的分子量与洗脱时间的如表4所示，根据分子量的对数和洗脱时间做图得到标准曲线：y＝-2.4738x+17.656，R2＝0.9998。其中y为洗脱时间(min)；x为分子量对数。
表4、标准物质的分子量与洗脱时间
实验组1制备的稻米发酵原浆的HPLC图谱如图1所示：从图中可以看出，稻米发酵原浆的图谱中主要包括1个组分峰，洗脱时间为11.62min，将洗脱时间代入标准曲线：y＝-2.4738x+17.656，计算出峰的分子量为275.66Da，并且根据峰面积计算稻米发酵原浆占99.03％。一般认为分子量500Da左右活性肽成分更易被皮肤吸收，所以稻米发酵物中存在容易被吸收的活性多肽。
四、稻米发酵原浆的抗氧化性能检测
DPPH是一种早期合成的有机自由基，常用来评估抗氧化物的供氢能力，它在有机溶剂中非常稳定，呈紫色，而且在517nm处有一个特征吸收峰，当遇到自由基清除剂时，DPPH的孤对电子被配对而使其退色，也就是在最大吸收波长处的吸光值变小。因此，可通过测定吸光值的变化来评价样品对DPPH自由基的清除效果。
DPPH自由基清除实验的具体实验步骤为：
以实施例1所得稻米发酵原浆作为待测物；
(1)取等体积(一般为3mL)的待测物与2×10-4mol/L的DPPH溶液混匀(A1管)；
(2)取等体积的无水乙醇(待测物溶剂)与2×10-4mol/L的DPPH溶液混匀(A2管)；
(3)取等体积的无水乙醇与待测物混匀(A3管)；
(4)反应30min后，在517nm下测A1、A2、A3管吸光度值。
清除率计算公式为：清除率(％)＝[(A2+A3)-A1]/A2
做出稻米发酵提取物对DPPH自由基清除作用曲线，见附图2。
由图可知，实施例1所得稻米发酵原浆对DPPH清除作用的IC50＝17.99％，说明稻米发酵原浆具有较强的抗氧化能力，可清除自由基，促进细胞代谢，增强细胞活力，改善机体的结构和功能，提高机体生命力，从而延缓细胞老化，发挥其抗衰老的作用。
五、稻米发酵原浆的美白功效分析
酪氨酸酶是黑素生成的关键酶，它控制着黑素的形成过程,其活性程度对色素的沉积起主要作用。目前市场上销售的许多美白、祛斑产品都是以抑制酪氨酸酶达到美白作用,故对酪氨酸酶抑制作用的强弱是评价增白化妆品的主要指标。
通过测定样品对酪氨酸酶的影响来评价样品的美白功能，具体方法如下：
按表5配置溶液：
表5、溶液配制列表
单位(mL) C1 C2 T1 T2
L-酪氨酸 2 2 2 2
样品 0 0 2 2
PBS 4 5 2 3
酪氨酸酶 1 0 1 0
总体积 7 7 7 7
注：C1和T1加入1mL酪氨酸酶，酶活为100U/mL；
样品为实施例1所得稻米发酵原浆；
(1)C2管配好摇匀后，在37℃水浴锅中水浴加热10min，波长475nm下调零。
(2)C1管溶液配好摇匀，37℃水浴10min后，加酪氨酸酶1ml，继续水浴10分钟，测定C1吸光度值。
(3)按(1)(2)同样方法，以T2调零测定T1吸光度值。
(4)计算样品对酪氨酸酶的活性抑制率T(％)：T(％)＝(C1-T1)/C1×100％
实验证明，本发明实施例1所得稻米发酵原浆对酪氨酸酶活性的抑制率为77.24％，1％的熊果苷对酪氨酸酶活性的抑制率99.52％，见附图3。即本发明提供的稻米发酵原浆的美白效果相当于0.776％的熊果苷的效果，具有较强的美白功效。

Claims (10)

1.一种制备稻米发酵原浆的方法，包括如下步骤：
对由发酵菌、稻米干粉和水组成的初始体系进行发酵培养，得到所述稻米发酵原浆。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述发酵菌液、所述稻米干粉与水的用量比为25mL-40mL：15g-25g：300g。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述发酵培养步骤中，时间为25h-35h；温度为37℃-47℃。
4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：所述发酵菌为双歧杆菌，具体为两歧双歧杆菌Bifidobacteriumbifidum；
所述稻米干粉的目数为20-50目。
5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：所述发酵菌以其培养液或悬浮液的形式存在；
所述发酵菌的培养液或悬浮液的pH值为6.5-7.5。
6.根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于：所述方法还包括如下步骤：将发酵培养所得发酵液依次进行灭菌、离心、取上清液。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述灭菌步骤中，灭菌温度为110-125℃；灭菌时间为15min-30min；所述离心步骤中，离心转速为5800-7000r/min；离心时间为25-35min；离心半径为8-12cm。
8.权利要求1-7中任一所述方法制备得到的稻米发酵原浆。
9.权利要求8所述稻米发酵原浆在制备具有如下至少一种功能的化妆品中的应用或直接作为具有如下至少一种功能的化妆品中的应用：
1)美白；
2)抗衰老；
3)清除DPPH自由基；
4)抑制酪氨酸酶的活性。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述化妆品为面膜、精华液或爽肤水。
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