CN117946902A - 一株植物乳植杆菌及其发酵红参须的方法、红参须发酵产物及其应用 - Google Patents

一株植物乳植杆菌及其发酵红参须的方法、红参须发酵产物及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一株植物乳植杆菌及其发酵红参须的方法、红参须发酵产物及其应用，涉及人参发酵技术领域，该植物乳植杆菌(Lactobacillus plantarum)命名为KMHD‑2，已于2023年8月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.28270。本发明利用该植物乳植杆菌发酵红参须，得到发酵液，再进行提取，从而得到红参须发酵产物，解决了现有技术中使用菌株的发酵周期过长、稀有人参皂苷转化率不高的技术问题，达到了有效提升红参须的使用价值、红参须发酵产物能显著促进斑马鱼I型胶原蛋白基因表达，以及红参须发酵产物能用于化妆品而有效促进皮肤抗皱的技术效果。

Description

一株植物乳植杆菌及其发酵红参须的方法、红参须发酵产物 及其应用
技术领域
本发明涉及人参发酵技术领域，尤其是涉及一株植物乳植杆菌及其发酵红参须的方法、红参须发酵产物及其应用。
背景技术
人参是传统的名贵的中药材，化学成分丰富，生物活性广泛，具有较高的保健与药用价值。人参对生长环境有一定的要求，是一种喜冷、湿润而耐荫的植物，即怕积水，又不耐旱，忌强光直射，对生长环境要求比较苛刻；并且人参的种植存在轮种限制，即使在移栽的情况下，土地也需要修养3-4年，一般情况下需要修养7年左右。因此，如何利用好人参资源是一个热点研究方向。
人参皂苷是人参主要的活性成分。目前，人参皂苷从人参属植物中发现超过180种；人参皂苷的基本结构组成是甾族骨架和加上不同的糖基(葡萄糖(glc)，鼠李糖(rha)，木糖(xyl)和阿拉伯糖(ara)连接在C3，C6和C20上)。首次从根部分离出来的人参皂命名方式是以“R”为前缀，后面跟着一个字母和根据色谱极性升序排名的数值，例如Ra是极性最小的人参皂首，来源于根部，随后是Rbl，而Rg3的极性比Rg1大。糖基化的主要人参皂苷，如Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re和Rg1，占野生人参总皂苷的80％以上。稀有皂苷如CK、Rh1、Rh2、Rg3、Rk1、Rg5等糖基的数量较少。糖基的种类、数量，以及结合位点(C-3、C-6、C-20)的不同已被证明影响生物活性，比如糖基数量不同的人参皂苷的抗肿瘤活性的影响规律是：苷元皂苷>单糖苷皂苷>二糖苷皂苷>三糖苷皂苷。去糖基化的次级人参皂苷在原人参属植株中含量甚微，但是去糖基化人参皂苷比糖基化人参皂苷更具药理活性和生物利用度。
红参是人参的熟用品，是经过浸润、清洗、蒸制、晾晒以及烘干等工序制备而成。经过炮制的红参中，人参皂苷Rg3、Rg5、Rk1和20(S)-PPD的含量明显高于在生晒参(即原人参)中的含量。有研究证明口服红参粉能够显著降低眼部皮肤皱纹的粗糙度和总的皮肤损伤分数；也有学者经过动物实验证明外用红参提取物能够证明显著抑制了UVB暴露引起的皱纹，同时显著抑制UVB照射诱导的皮肤表皮厚度的增加。另外，通过荧光和共聚焦显微镜分析研究人参皂甙Rg3立体异构体在UVB照射的角质形成细胞实验中抗皮肤光老化性能，证明红参具有一定的抗衰功效。传统红参产品以红参主根为主，红参须为红参产品的副产物，而红参须中的人参皂苷含量要高于主根。以红参须为研究对象，可以提升红参整体的利用价值。
同时，有研究证明发酵红参相比红参具有更高的活性，用的发酵菌株主要包括霉菌、酵母、人参内生菌，但是这些菌种的安全性还需要进一步研究，例如现有技术CN112980720公开了一株人参内生菌成都肠杆菌可将人参皂苷Rg1快速转化成人参皂苷F1，但是该菌株不在《可用于食品的菌种名单》中，所以发酵后的产品不能直接用于食品领域，具有一定的局限性。
乳酸菌广泛存在于自然界中，在日常生活中可从乳制品、泡菜、腌菜、啤酒以及葡萄酒等中分离得到。乳酸菌是有较高认可度的益生菌，大量研究标明，乳酸菌具有多种功能，比如调节肠道菌群、控制肠道内腐败菌生长，以及提高食物消化率和生物效价等。植物乳植杆菌是乳酸菌中的一种，也是《可用于食品的菌种名单》中的一种，具有很好的安全性。
现有技术CN109536560公开了一种提高人参水提取物中稀有皂苷含量的方法，包括以下步骤：(1)将人参破碎粉磨后过筛得到人参粉末，再将人参粉末溶于水中进行超声微波处理以过滤掉人参粉渣，得到人参水提取物；(2)取步骤(1)制得的人参水提取物，加入复配菌和糖源在28～40℃发酵4～8天，所述复配菌为乳酸菌和醋酸杆菌；(3)升高发酵温度至42～55℃，继续发酵10～20天，发酵结束后，过滤留下发酵液；该方法发酵后人参皂苷Rg3浓度0.043mg/L，增加224.87％；然而，该方法存在发酵周期过长和转化率不高的问题。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一株植物乳植杆菌(Lactobacillusplantarum)，该菌株具备体外抗氧化能力，于2023年8月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.28270。
本发明的目的之二在于提供一种植物乳植杆菌发酵红参须的方法，不仅发酵周期短，而且能够有效增加稀有人参皂苷Rg3、Rg5、Rk1和Rh1的产量，有效提升了红参须的使用价值。
本发明的目的之三在于提供一种红参须发酵产物，稀有人参皂苷含量高，可应用于食品和化妆品领域。
本发明的目的之四在于提供一种红参须发酵产物的应用，能够有效实现皮肤抗皱和紧致功效，取得突出的应用效果。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
第一方面，一株植物乳植杆菌，为植物乳植杆菌(Lactobacillusplantarum)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.28270，该植物乳植杆菌为活细胞形式，在体外具备抗氧化功能。
进一步的，所述植物乳植杆菌来源于酸菜。
第二方面，一种植物乳植杆菌发酵红参须的方法，包括以下步骤：
以红参须作为底物，通过上述任一项所述的植物乳植杆菌进行发酵，得到发酵液，取所述发酵液进行提取，得到红参须发酵产物。
进一步的，所述红参须作为底物的添加形式包括通过红参须粉末制成的悬浊液和/或红参须提取液进行添加；
优选地，所述红参须粉末的目数为40-80目。
进一步的，所述植物乳植杆菌的添加量为3～10％；
优选地，所述悬浊液的溶剂包括水；
优选地，所述悬浊液中红参须粉末与水的比例为1：10；
优选地，所述发酵的温度为30～37℃，发酵的时间为24～72h。
进一步的，所述红参须提取液的制备方法包括以下步骤：
红参须与水混合后在100℃的温度下进行提取，浓缩，得到所述红参须提取液。
进一步的，所述发酵的转速条件为0-150转/min；
优选地，所述发酵之后还包括进行离心的步骤，得到发酵液；
优选地，所述发酵液的提取条件包括在70-100℃的温度下提取2～3h；
优选地，所述发酵液在提取之后还包括进行冷冻干燥的步骤，得到红参须发酵产物。
第三方面，一种由上述任一项所述的方法制备得到的红参须发酵产物。
进一步的，所述红参须发酵产物中稀有人参皂苷Rg3含量为21.94-27.12mg/g；
优选地，所述红参须发酵产物中稀有人参皂苷Rg5含量为17.31-23.79mg/g；
优选地，所述红参须发酵产物中稀有人参皂苷Rk1含量为5.90-8.58mg/g；
优选地，所述红参须发酵产物中稀有人参皂苷Rh1含量为4.59-5.23mg/g。
第四方面，一种上述任一项所述的红参须发酵产物在制备皮肤抗皱产品中的应用。
与现有技术相比，本发明至少具有如下有益效果：
本发明提供的植物乳植杆菌，其为活细胞形式，在体外具备抗氧化功能，采用该植物乳植杆菌发酵红参须，能够提高红参须的皮肤抗皱效果。
本发明提供的植物乳植杆菌发酵红参须的方法，以红参须作为底物经过特定的植物乳植杆菌进行发酵，再提取，从而能够获得高价值的红参须发酵产物，大大提高了红参整株的价值，解决了现有技术中使用菌株的发酵周期过长、稀有人参皂苷转化率不高的技术问题，达到了在较短的发酵周期内能够有效增加稀有人参皂苷Rg3、Rg5、Rk1和Rh1的产量、显著提升红参须的使用价值和提高人参资源利用率的技术效果。
本发明提供的红参须发酵产物，稀有人参皂苷含量高，能够应用于食品和化妆品领域中，具有高的皮肤抗皱效果，同时也为发酵红参作为化妆品原料提供了数据依据。
本发明提供的红参须发酵产物的应用，能够有效实现皮肤抗皱和紧致功效，取得突出的应用效果。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1提供的菌株KMHD-2的菌落形态图；
图2为本发明实施例1提供的菌株KMHD-2的镜检图；
图3为本发明试验例2得到的斑马鱼I型胶原蛋白基因相对表达量变化示意图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
根据本发明的第一方面，提供了一株植物乳植杆菌(Lactobacillusplantarum)，该菌株具备体外抗氧化能力，于2023年8月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.28270。
本发明提供的植物乳植杆菌，其为活细胞形式，在体外具备抗氧化功能，采用该植物乳植杆菌发酵红参须，能够提高红参须的皮肤抗皱效果。
在一种优选的实施方式中，本发明植物乳植杆菌可以来源于酸菜，其通过酸菜分离获得的方法包括以下步骤：
通过含有溴甲酚绿指示剂的MRS培养基，从酸菜样本中筛选分离纯化出潜在的植物乳杆菌，通过模拟胃酸和模拟肠液的抗性评价获得耐受性良好的菌株，对菌株进行分子学鉴定获得植物乳植杆菌；对植物乳植杆菌进行体外抗氧化能力评价，获得具有抗氧化能力的植物乳植杆菌；
其中，抗氧化能力评价包括对DPPH自由基的清除能力、清除羟自由基能力和还原能力。
根据本发明的第二个方面，提供了一种植物乳植杆菌发酵红参须的方法，包括以下步骤：
以红参须作为底物，通过上述任一项所述的植物乳植杆菌进行发酵，得到发酵液，取该发酵液进行提取，得到红参须发酵产物。
在一种优选的实施方式中，本发明提供的植物乳植杆菌发酵红参须的方法，包括以下步骤：
红参须粉末制成的悬浊液和/或红参须提取液与植物乳植杆菌混合后进行发酵，得到发酵液，取该发酵液进行提取，得到红参须发酵产物。
在一种优选的实施方式中，红参须粉末的目数可以为40-80目，其典型但非限制性的目数例如为40目、60目、80目，更有利于提高红参须的发酵效果，使其得到充分发酵、有效提高稀有人参皂苷产量。
在一种优选的实施方式中，悬浊液的溶剂包括但不限于水；其中，悬浊液中红参须粉末与水的比例可以为1：10，但不限于此，更有利于提高红参须的发酵效果。
在一种优选的实施方式中，悬浊液包括但不限于灭菌后的悬浊液，更有利于提高植物乳植杆菌的发酵作用；其中，灭菌的方式包括但不限于巴氏灭菌。
在一种优选的实施方式中，红参须提取液的制备方法包括以下步骤：
红参须与水混合后在100℃的温度下进行提取，浓缩，得到红参须提取液；其中，提取次数可以为2次，但不限于此；每次可以提取2h，再将过滤液浓缩，从而得到提取液。
在一种优选的实施方式中，植物乳植杆菌的添加量可以为3～10％，其典型但非限制性的添加量例如为3％、5％、10％，植物乳植杆菌适宜的用量更有利于提高红参须的发酵效果，使其得到充分发酵、有效提高稀有人参皂苷产量；倘若植物乳植杆菌的用量过高，则会导致总皂苷降解过多；倘若植物乳植杆菌的用量过低，则会导致Rg3、Rg5、Rk1和Rh1的转化量较低。
在一种优选的实施方式中，发酵的温度可以为30～37℃，其典型但非限制性的发酵温度例如为30℃、33℃、35℃、37℃，适宜的发酵温度更有利于提高红参须的发酵效果，使其得到充分发酵、有效提高稀有人参皂苷产量；倘若发酵温度过高，则会导致菌株生长状态不佳而影响发酵效果；倘若发酵温度过低，则会导致菌株活力不足。
在一种优选的实施方式中，发酵的时间可以为24～72h，其典型但非限制性的发酵时间例如为24h、36h、48h、60h、72h，适宜的发酵时间更有利于提高红参须的发酵效果，使其得到充分发酵、有效提高稀有人参皂苷产量；倘若发酵时间过长，则会导致生产周期过长；倘若发酵时间过短，则会导致皂苷转化效果不佳。
在一种优选的实施方式中，发酵时的转速条件可以为0-150转/min，其典型但非限制性的转速例如为0、10转/min、20转/min、30转/min、40转/min、50转/min、60转/min、70转/min、80转/min、90转/min、100转/min、110转/min、120转/min、130转/min、140转/min、150转/min，更有利于进一步提高植物乳植杆菌对于红参须的发酵效果。
本发明提供的植物乳植杆菌发酵红参须的方法，通过植物乳植杆菌对红参须进行发酵，在各工艺参数的协同配合下，不仅发酵周期短，而且能够有效增加稀有人参皂苷Rg3、Rg5、Rk1和Rh1的产量，从而显著提升了红参须的使用价值，提高了人参资源的利用率。
在一种优选的实施方式中，本发明在发酵之后还包括进行离心的步骤，从而得到发酵液。
发酵之后，通过离心过滤去除杂质，以获得发酵液，更有利于提高后续的发酵液的提取效果。
在一种优选的实施方式中，发酵液的提取条件包括但不限于在70-100℃的温度下提取2～3h，提取后的发酵液进行滤纸过滤，从而得到红参须发酵后的提取液。
在一种优选的实施方式中，发酵液在提取之后还包括进行冷冻干燥的步骤，得到红参须发酵产物，例如可以将得到的红参须发酵后的提取液放置在-80℃的温度下24～48h，进行冷冻干燥，收集冻干粉，得到红参须发酵产物，并计算其出膏率。
本发明提供的植物乳植杆菌发酵红参须的方法，在各步骤及其工艺参数的协同配合下，相比于传统红参提取工艺，不仅发酵周期短，而且能够显著提高稀有皂苷含量，得到的红参须发酵产物在抗皱功效上的活性更为出色，同时得到的发酵产物可应用于食品和化妆品领域。因此，本发明的方法有效提升了红参须的使用价值，提高了人参资源的利用率。
根据本发明的第三个方面，提供了一种由上述任一项所述的方法制备得到的红参须发酵产物。
本发明提供的红参须发酵产物，稀有人参皂苷含量高，能够应用于食品和化妆品领域中，具有高的皮肤抗皱效果，同时也为发酵红参作为化妆品原料提供了数据依据。
在一种优选的实施方式中，红参须发酵产物中，稀有人参皂苷Rg3含量可以为21.94-27.12mg/g，稀有人参皂苷Rg5含量可以为17.31-23.79mg/g，稀有人参皂苷Rk1含量可以为5.90-8.58mg/g，稀有人参皂苷Rh1含量可以为4.59-5.23mg/g。
根据本发明的第四个方面，提供了一种上述任一项所述的红参须发酵产物在制备皮肤抗皱产品中的应用。
本发明提供的红参须发酵产物的应用，能够有效实现皮肤抗皱和紧致功效，可以取得突出的应用效果。
下面通过实施例对本发明作进一步说明。如无特别说明，实施例中的材料为根据现有方法制备而得，或直接从市场上购得。
实施例1
一株植物乳植杆菌及其发酵红参须的方法，包括以下步骤：
A、发酵食品中具有抗氧化活性的乳酸菌的分离：
(1)从酸菜中取2.5g样品，加入装有22.5mL无菌的生理盐水的无菌袋中，拍打2min，配置含溴甲酚绿的MRS培养基，通过10倍梯度稀释法获得单个菌落，37℃厌氧培养36-48h，挑取使溴甲酚绿培养基变黄的单菌落在MRS培养基上再次划线，37℃厌氧培养，将得到的菌落多次划线纯化，得到单菌；
(2)植物乳植杆菌耐人工胃酸/肠液实验，获得耐受性良好的菌株；
其中，耐人工胃酸实验：称取2.0g NaCl+3.2g胃蛋白酶，加入7.0mlHCl(浓)，ddH2O定容至1000ml，混匀；分别取该溶液50ml，将pH调制2.0和3.0，过滤除菌备用；将甘油种活化传代两次，取1ml过夜培养的菌液于1.5ml离心管中，离心(5000转/min 5min)去上清；用等体积模拟胃液重悬菌体，混匀后立即吸出以上菌液100μl，混入900μl无菌生理盐水中，并做梯度稀释，一般0h取10-6、10-7进行涂布；取完样的菌液置于37℃培养箱培养，根据实验原定时间长度模拟胃液2h的时间点取样做稀释涂布；每个取样时间点，从离心管取出菌液，混匀后取样做系列稀释；每个菌株做两个平行样，每个平行样做2个重复；涂布的平板置于37℃培养箱培养36～48h后，进行菌落数数，并记录数据；
耐人工肠液实验：称取6.8g磷酸二氢钾ddH2O定容至250ml；量取77ml0.2M NaOH，ddH2O定容至500ml；将250ml磷酸二氢钾与500ml NaOH溶液混匀，并加入10.0g胰酶和0.3％胆盐，调pH至6.8±0，定容至1000ml，过滤除菌备用；将甘油种活化传代两次，取1ml过夜培养的菌液于1.5ml离心管中，离心(5000转/min 5min)去上清；用等体积模拟肠液重悬菌体，混匀后立即吸出以上菌液100μl，混入900μl无菌生理盐水中，并做梯度稀释，一般0h取10-6、10-7进行涂布；取完样的菌液置于37℃培养箱培养，根据实验原定时间长度模拟肠液3、6h的时间点取样做稀释涂布；每个取样时间点，从离心管取出菌液，混匀后取样做系列稀释；每个菌株做两个平行样，每个平行样做2个重复；涂布的平板置于37℃培养箱培养36～48h后，进行菌落数数，并记录数据，见表1；
表1菌株模拟胃酸模拟肠液实验数据
(3)植物乳植杆菌KMHD-2的鉴定：
将KMHD-2多次划线观察菌落形态，形态为圆形、白色或米白色，直径1-2μm，表面光滑湿润，中间弧状突起，不透明，边缘整齐无晕环；进行革兰氏染色为紫色，酶接触反应为阴性，镜检为杆状；菌株KMHD-2的菌落形态见图1，镜检见图2；
分子学鉴定：
根据细菌基因组提取试剂盒步骤提取所述KMHD-2菌株的DNA，以其为模板，使用通用引物27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和1492R(5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’)，通过PCR(聚合酶链式反应)扩增了其16s rDNA序列；扩增产物用1％琼脂糖凝胶进行电泳检测；将PCR扩增产物送样测序，完成测序工作后，扩增产物测序结果在GenBank中进行NCBI-BLAST分析检验，鉴定该菌株KMHD-2为植物乳植杆菌；
16s测序序列：
TCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAACGAACTCTGGTATTGATTGGTGCTTGCATCATGATTTACATTTGAGTGAGTGGCGAACTGGTGAGTAACACGTGGGAAACCTGCCCAGAAGCGGGGGATAACACCTGGAAACAGATGCTAATACCGCATAACAACTTGGACCGCATGGTCCGAGCTTGAAAGATGGCTTCGGCTATCACTTTTGGATGGTCCCGCGGCGTATTAGCTAGATGGTGGGGTAACGGCTCACCATGGCAATGATACGTAGCCGACCTGAGAGGGTAATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGAAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAACTCTGTTGTTAAAGAAGAACATATCTGAGAGTAACTGTTCAGGTATTGACGGTATTTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTTTTTAAGTCTGATGTGAAAGCCTTCGGCTCAACCGAAGAAGTGCATCGGAAACTGGGAAACTTGAGTGCAGAAGAGGACAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTGTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGTATGGGTAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATACCGTAAACGATGAATGCTAAGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCATTCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCTACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATACTATGCAAATCTAAGAGATTAGACGTTCCCTTCGGGGACATGGATACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATTATCAGTTGCCAGCATTAAGTTGGGCACTCTGGTGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGATGGTACAACGAGTTGCGAACTCGCGAGAGTAAGCTAATCTCTTAAAGCCATTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGAGAGTTTGTAACACCCAAAGTCGGTGGGGTAACCTTTTAGGACC
发明人将植物乳植杆菌KMHD-2进行保藏，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2023年8月28日，保藏号为CGMCC No.28270；
(4)植物乳植杆菌KMHD-2体外抗氧化能力：
对DPPH自由基的清除能力：取0.2mL待测菌株生理盐水混悬液，加入0.2mLDPPH溶液，用无水乙醇配置，终浓度0.2mmol/L，混匀后置于室温下遮光反应30min，然后6000转/min离心10min，取上清测定在517nm处的吸光值A样，测三个平行值；空白组样品以等体积的无水乙醇代替DPPH.无水乙醇溶液，对照组样品以等体积的蒸馏水代替样品，并以等体积的蒸馏水和无水乙醇混合液空白调零；清除率＝(A对照－A样)/A对照×100；以专利菌株CGMCCNO.18094为对照，检测结果见表2；
清除羟自由基能力:取1mL的1.25mmol/L邻二氮菲于试管中，依次加入2mL的PBS缓冲溶液(0.2mol/L，pH＝7.4)，混匀后加入1mL的1.25mmol/L FeSO4，再加入1mL的1.5％H2O2，37℃水浴90min，536nm处测其吸光度为A；用1mL蒸馏水代替1mL H2O2为空白组，记作B，用1mL待测样品代替1mL的蒸馏水为样品组，记作C；羟自由基清除率(％)＝(C-A)/(B-A)×100；以专利菌株CGMCCNO.18094为对照，检测结果见表2；
还原活性的测定：取0.2mL待测样品，加入0.2mL PBS缓冲溶液(0.2mol/L、pH＝6.6)，0.2mL铁氰化钾(质量分数1％)，混匀后置于50℃恒温水浴锅中水浴20min，置于冰水中冷却；再加入0.2mL 5％三氯乙酸，6000r/min离心5min，取上清液0.1mL，加入蒸馏水0.1mL、0.1％三氯化铁0.025mL，摇匀，静置反应10min后，于700nm处测定吸光值；A700 nm值越大，代表还原能力越强；结果采用L－半胱氨酸作标准物来表述乳酸菌的还原力；分别配制不同浓度的L－半胱氨酸(0-400umol/L)的标准溶液，按照上述步骤进行测定，制定标准曲线；以专利菌株CGMCCNO.18094为对照，检测结果见表2；
表2：菌株体外抗氧化能力测试
(5)制备发酵液：将菌液在平板上做画线分离获得单一菌落，将单一菌落接种至液体培养基中，静置培养得到发酵菌液；
B、发酵提取：
(a)红参须发酵：红参须经粉碎后过80目筛，之后添加10倍质量的纯净水，制成得到红参须粉末的悬浊液；
红参须粉末的悬浊液经巴氏灭菌后，再添加上述植物乳植杆菌与之混合，然后在37℃、120转/min条件下发酵72h，发酵后进行离心过滤，获得发酵液；
其中，植物乳植杆菌的添加量为10％；
(b)发酵液提取：将发酵液置于100℃温度下提取2～3h，提取后的发酵液进行滤纸过滤，得到红参须发酵后的提取液；
(c)冷冻干燥：将得到的红参须发酵后的提取液放置在-80℃的冰箱中12～36h，然后进行冷冻干燥，收集发酵红参须冻干粉，得到红参须发酵产物，计算出膏率。
实施例2
本实施例与实施例1的区别在于，本实施例在发酵提取的步骤(a)中使用红参须提取浓缩液替换红参须粉末的悬浊液；
红参须提取浓缩液，其提取方法包括：红参须添加10倍水混合，在100℃的条件下提取2次，再将两次获得的提取液混合，然后减压浓缩1倍，得到红参须提取浓缩液；
其余步骤及其工艺参数参考实施例1，得到红参须发酵产物。
实施例3
本实施例与实施例1的区别在于，本实施例在发酵提取的步骤(a)中红参须经粉碎后过筛的目数为60目，其余步骤及其工艺参数参考实施例1，得到红参须发酵产物。
实施例4
本实施例与实施例1的区别在于，本实施例在发酵提取的步骤(a)中红参须经粉碎后过筛的目数为40目，其余步骤及其工艺参数参考实施例1，得到红参须发酵产物。
实施例5
本实施例与实施例1的区别在于，本实施例在发酵提取的步骤(a)中植物乳植杆菌的添加量为5％，其余步骤及其工艺参数参考实施例1，得到红参须发酵产物。
实施例6
本实施例与实施例1的区别在于，本实施例在发酵提取的步骤(a)中植物乳植杆菌的添加量为3％，其余步骤及其工艺参数参考实施例1，得到红参须发酵产物。
实施例7
本实施例与实施例1的区别在于，本实施例在发酵提取的步骤(a)中发酵的温度为30℃，其余步骤及其工艺参数参考实施例1，得到红参须发酵产物。
实施例8
本实施例与实施例1的区别在于，本实施例在发酵提取的步骤(a)中发酵的时间为48h，其余步骤及其工艺参数参考实施例1，得到红参须发酵产物。
实施例9
本实施例与实施例1的区别在于，本实施例在发酵提取的步骤(a)中发酵的时间为24h，其余步骤及其工艺参数参考实施例1，得到红参须发酵产物。
对比例1
本对比例与实施例1的区别在于，本对比例在发酵提取的步骤(a)中植物乳植杆菌的添加量为15％，其余步骤及其工艺参数参考实施例1，得到红参须发酵产物。
与实施例1相比，本对比例方法的缺陷或不足之处在于，虽然增加了菌剂添加量，但是目标皂苷含量并没有得到明显增加。
对比例2
本对比例与实施例1的区别在于，本对比例在发酵提取的步骤(a)中植物乳植杆菌的添加量为1％，其余步骤及其工艺参数参考实施例1，得到红参须发酵产物。
与实施例1相比，本对比例方法的缺陷或不足之处在于，起始菌浓度低，导致发酵较慢，造成稀有皂苷转化效果不佳。
对比例3
本对比例与实施例1的区别在于，本对比例在发酵提取的步骤(a)中发酵的温度为25℃，其余步骤及其工艺参数参考实施例1，得到红参须发酵产物。
与实施例1相比，本对比例方法的缺陷或不足之处在于，目标皂苷的转化率较低。
对比例4
本对比例与实施例1的区别在于，本对比例在发酵提取的步骤(a)中发酵的温度为45℃，其余步骤及其工艺参数参考实施例1，得到红参须发酵产物。
与实施例1相比，本对比例方法的缺陷或不足之处在于，植物乳植杆菌生长不佳，导致目标皂苷转化的效率不高。
对比例5
本对比例与实施例1的区别在于，本对比例在发酵提取的步骤(a)中发酵的时间为18h，其余步骤及其工艺参数参考实施例1，得到红参须发酵产物。
与实施例1相比，本对比例方法的缺陷或不足之处在于，发酵时间短，造成目标皂苷转化效果不佳。
对比例6
本对比例与实施例1的区别在于，本对比例在发酵提取的步骤(a)中发酵的时间为84h，其余步骤及其工艺参数参考实施例1，得到红参须发酵产物。
与实施例1相比，本对比例方法的缺陷或不足之处在于，虽然发酵时间延长，但是目标皂苷含量并没有得到明显增加。
对比例7
本对比例与实施例1的区别在于，本对比例采用传统提取的方法，包括以下步骤：
红参须添加10倍质量的纯净水，在100℃条件下提取两次，将两次得到的提取液进行混合，之后冷冻干燥，得到传统提取的红参须冻干粉。
对比例8
本对比例提供一种市面红参粉1。
对比例9
本对比例提供一种市面红参粉2。
试验例1
实施例1得到的发酵红参须冻干粉、对比例7得到的传统提取的红参须冻干粉以及对比例8-9提供的市面红参粉均采用超高液相色谱来检测其中的人参皂苷含量，结果见表3。
表3稀有人参皂苷含量对比
实施例2-9得到的发酵红参须冻干粉采用上述相同的方法来检测其中的人参皂苷含量，结果见表4。
表4
对比例1-6得到的发酵红参须冻干粉采用上述相同的方法来检测其中的人参皂苷含量，结果见表5。
表5
试验例2
斑马鱼I型胶原蛋白基因表达促进测试方法：胶原蛋白是人体的细胞外基质蛋白中含量最高的，其中I型胶原蛋白是皮肤中最丰富的蛋白质。斑马鱼的I型胶原蛋白分布与人体相同，且显示出与人类的高度保守性，它们的先天表达在受精后6天大时显著下降，并在受精后10到12天之间变得非常低。测试斑马鱼I型胶原蛋白基因(col1a1a，col1a1b和col1a2)表达，比较发酵红参须冻干粉和红参须冻干粉，斑马鱼I型胶原蛋白基因相对表达量变化，结果见图3，计算I型胶原蛋白基因表达促进率可以评价原料或产品的抗皱和紧致功效。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.一株植物乳植杆菌，其特征在于，为植物乳植杆菌(Lactobacillus plantarum)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.28270。
2.根据权利要求1所述的植物乳植杆菌，其特征在于，所述植物乳植杆菌来源于酸菜。
3.一种植物乳植杆菌发酵红参须的方法，其特征在于，包括以下步骤：
以红参须作为底物，通过权利要求1或2所述的植物乳植杆菌进行发酵，得到发酵液，取所述发酵液进行提取，得到红参须发酵产物。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述红参须作为底物的添加形式包括通过红参须粉末制成的悬浊液和/或红参须提取液进行添加；
优选地，所述红参须粉末的目数为40-80目。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述植物乳植杆菌的添加量为3～10％；
优选地，所述悬浊液的溶剂包括水；
优选地，所述悬浊液中红参须粉末与水的比例为1：10；
优选地，所述发酵的温度为30～37℃，发酵的时间为24～72h。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述红参须提取液的制备方法包括以下步骤：
红参须与水混合后在100℃的温度下进行提取，浓缩，得到所述红参须提取液。
7.根据权利要求3-6任一项所述的方法，其特征在于，所述发酵的转速条件为0-150转/min；
优选地，所述发酵之后还包括进行离心的步骤，得到发酵液；
优选地，所述发酵液的提取条件包括在70-100℃的温度下提取2～3h；
优选地，所述发酵液在提取之后还包括进行冷冻干燥的步骤，得到红参须发酵产物。
8.一种由权利要求3-7任一项所述的方法制备得到的红参须发酵产物。
9.根据权利要求8所述的红参须发酵产物，其特征在于，所述红参须发酵产物中稀有人参皂苷Rg3含量为21.94-27.12mg/g；
优选地，所述红参须发酵产物中稀有人参皂苷Rg5含量为17.31-23.79mg/g；
优选地，所述红参须发酵产物中稀有人参皂苷Rk1含量为5.90-8.58mg/g；
优选地，所述红参须发酵产物中稀有人参皂苷Rh1含量为4.59-5.23mg/g。
10.一种权利要求8或9所述的红参须发酵产物在制备皮肤抗皱产品中的应用。
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