KR20230021505A - 신규한 곡류 발효물, 그 곡류 발효물의 피부 보호 용도, 피부 유용 물질 스크리닝 방법 및 산화적 스트레스로 인한 피부 손상 예측 방법 - Google Patents
신규한 곡류 발효물, 그 곡류 발효물의 피부 보호 용도, 피부 유용 물질 스크리닝 방법 및 산화적 스트레스로 인한 피부 손상 예측 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 명세서에는, 신규한 혼합곡류 발효물, 그의 피부 보호 용도에 관한 것이다. 또한, 본 명세서에 개시된 기술은 피부에 유용한 물질을 스크리닝하는 방법에 관한 것이다. 또한 본 명세서 개시된 기술은 피부 손상을 미리 예측하는 방법이 개시된다. 이를 이용하면, 피부 산화적 스트레스에 의한 피부 노화와 햇빛에 의한 광노화를 동시에 억제할 수 있는 조성물을 제공할 수 있다.
Description
본 명세서에 개시된 기술은 신규한 곡류 발효물, 그의 피부 보호 용도에 관한 것이다. 또한, 본 명세서에 개시된 기술은 피부에 유용한 물질을 스크리닝하는 방법에 관한 것이다. 또한 본 명세서 개시된 기술은 산화적 스트레스로 인한 피부 손상을 미리 예측하는 방법에 관한 것이다.
공해가 심한 공업지역의 역학조사 결과 주름, 검버섯 및 건조 피부 등 피부 노화가 대조군 보다 심하게 진행되고 있는 것으로 나타났다. 이후 전 세계를 통해 많은 후속연구가 진행되었고 공해 물질 또는 이들이 흡착되어 있는 미세 먼지가 피부 건강 및 미용에 심각한 영향을 미치는 것이 일반화되기에 이르렀다.
한편 많은 연구를 통해 공해 물질이 피부에 손상을 입히는 분자생물학적 작용기전이 밝혀지게 되었다. 대기 중의 공해 물질은 공장 매연이나 자동차 배기 가스에서 유래되는 아릴하이드로카본(Arylhydrocarbon) 계열의 물질로 분류되며, 사람의 피부세포를 포함한 다양한 세포에는 이들 분자와 특이적으로 결합하는 아릴하이드로카본 수용체(Arylhydrocarbon receptor; 이하 AhR)가 있어 수용체와 - 활성화제(receptor-ligand)의 결합작용으로 피부손상 과정이 시작 되는 것으로 밝혀졌다.
AhR는 케모센서(Chemosensor)로도 알려져 있어 외부로부터 침투된 공해 물질을 최초로 인지하여 경보를 발생하는 방어체계의 역할을 하는 것으로도 알려졌다. AhR는 정상적인 상황에서는 세포질에 불활성화된 상태로 존재하고 있지만 외부 환경으로부터 다이옥신(Dioxine)이나 벤조피렌(Benzopyrene) 같은 아릴하이드로카본이 세포질 내로 들어와 AhR를 활성화시키면 비로서 핵 안으로 들어가서 타겟 유전자의 발현을 촉진하는 전사인자이다. AhR이 활성화되면 우선 CYP1A1(aryl hydrocarbon hydroxylase)유전자의 발현이 증가하게 되며, 이는 활성 산소종(Reactive oxygen species)의 발생으로 이어지고 결국에는 산화적 스트레스(Oxidative stress)를 촉발하게 된다. 산화적 스트레스는 염증반응을 일으켜서 피부의 노화, 색소침착, 피부장벽기능 저하, 필라그린 생성 억제를 통한 피부 건조 등 다양한 피부 문제를 야기하게 된다.
독일의 Symrise사가 2016년 AhR의 억제제(Antagonist)를 공해방지 화장품 소재로 개발한 것을 시작으로 미세먼지와 공해 물질에 의해 유발하는 피부 염증, 피부 노화, 색소침착 및 피부 장벽 기능 저하를 억제하는 효능을 가진 많은 기능성 화장품 소재가 AhR을 타겟으로 개발되기 시작하였다. 그러나 AhR 활성화제(agonist)도 염증 완화에 효과가 있다는 것이 보고되면서 이의 정확한 역할에 대한 논란이 커지게 되었다. 결국 AhR의 양면성은 활성화제의 종류에 따라 그 효과가 반대로 나타날 수 있는데, 이는 NRF2(Nuclear factor erythroid 2-related factor 2, 이하 NRF2)라는 또 다른 전사 인자와 AhR의 상호작용을 통해 규명되었다.
한편 자외선은 이미 광 노화의 주요 원인이며 그 작용기전이 상당히 많은 연구에 의해 정립되어 있다. 최근 일련의 연구에 의하면 공해 물질과 자외선은 상호 시너지 효과를 나타내면서 피부 노화를 더욱 심화시키는 것으로 나타났다. 이는 생체 내에 존재하는 트립토판(Tryptophane)이 자외선의 작용으로 FICZ(6-formylindolo[3,2-b]carbazole)라는 AhR 활성화제로 전환되는 것이 밝혀지면서 둘 사이의 시너지 작용에 대한 규명이 이루어졌다.
지금까지 보고된 선행기술들은 대체로 AhR의 발현을 억제하는 것이거나 NRF2의 발현을 증가시키는 소재를 활용한 화장품의 제조에 관한 것이었다. AhR 활성억제에 관한 것으로는 '포유류에서 AhR 또는 CYP의 발현을 억제시킴으로써 황사로 인한 피부 자극을 완화시키는 방법'(등록특허 10-1566818,2015), '칡 추출물을 이용하여 피부 내 NRF2의 활성을 증가시켜 활성산소(ROS)에 의한 피부손상을 억제하고 피부 보호 및 피부 재생 효과를 나타내는 방법'(등록특허 10-2073760, 2020), '완두콩, 황금, 유근피 및 산자나무 열매 혼합 추출물을 유효성분으로 함유하는 조성물에 관한 것으로서, 상기 추출물은 벤조피렌에 의해 증가된 AhR 또는 CYP1A1 유전자 발현을 억제시키는 효능'(등록특허 10-1829553, 2018), 오리엔틴(orientin) 화합물을 유효성분으로 포함하는 부평초 추출물을 함유하는 조성물에 관한 것으로서, 상기 추출물은 벤조피렌에 의해 증가된 AhR 또는 CYP1A1 유전자 발현을 억제시키고, 중금속에 의한 피부 세포 손상 개선 및 피부 자극 완화를 통해 피부 보호에 우수한 효과'(등록특허 10-2091923, 2020), '비피도박테리움을 유효성분으로 함유하는 미세먼지에 의한 피부의 손상 방지 및 개선을 위한 조성물에 관한 것으로서, AhR, CYP1A1 및 CYP1B1 유전자의 발현을 감소시킴으로써 중금속이 포함된 미세먼지로 인한 피부의 손상을 방지 및 개선하는 효능' (등록특허 10-1958686, 등록특허 10-1979761, 2019) 등이 있다. 그러나 상기에 언급된 특허는 모두 AhR의 발현 억제를 기술하고 있으나 실제 활성화 억제에 필요한 AhR 전사 인자의 핵 이동(Nuclear translocation)을 막는 효능을 확인한 예는 없었다.
한편 NRF2 활성화제 관련 특허 등은 'NRF2 활성화제' (공개특허 10-2019-0111949, 2019), '무(radish) 추출물을 유효성분으로 포함하는 NRF2 활성화 조성물 및 상기 무 추출물의 제조방법' (등록특허 10-2101383, 2020), '화장품용 NRF2 인덕션 리바이탈라이징 제제, 이를 포함하는 화장품 및 이의 제조방법' (등록특허 10-1852878, 2018), '화장품용 NRF2 인덕션 리바이탈라이징 제제, 이를 포함하는 화장품 및 이의 제조방법' (등록특허 10-1782519, 2017), 'NRF2 활성 증진 엉겅퀴 전초 추출물의 제조방법 및 이를 함유하는 화장료 조성물' (등록특허 10-1841959, 2018), 'NRF2 활성증진 감초 추출물의 제조방법, 및 이를 함유하는 화장료 조성물' (등록특허 10-1866742, 2018) 등이 있다. 그러나 상기 나열된 특허는 NRF2의 발현 증가를 대부분 기술하고 있으나 실제 활성화 과정에 필요한 NRF2 전사 인자의 핵 이동(Nuclear translocation)을 확인한 예는 없다.
일 측면에서, 본 발명은 피부 항노화에 유용한 물질을 제공하는 것을 목적으로 한다.
일 측면에서, 본 발명은 신규한 곡류 발효물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
일 측면에서, 본 발명은 곡류 발효물의 용도를 제공하는 것을 목적으로 한다.
일 측면에서, 본 발명은 공해 물질인 아릴하이드로카본을 감지하는 수용체인 AhR 활성은 억제하는 소재를 개발하는 것을 목적으로 한다.
일 측면에서, 본 발명은 항산화 시스템의 핵심 조절자인 NRF2를 활성화시키는 소재를 개발하는 것을 목적으로 한다.
일 측면에서, 본 발명은 공해 물질인 아릴하이드로카본을 감지하는 수용체인 AhR 활성은 억제하고 동시에 항산화 시스템의 핵심 조절자인 NRF2를 활성화시키는 소재를 개발하는 것을 목적으로 한다.
일 측면에서, 본 발명은 AhR 활성과 NRF2 활성을 조절하는 메커니즘이 무엇인지 규명하는 것을 목적으로 한다.
일 측면에서, 본 발명은 피부 항노화에 유용한 물질을 스크리닝하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
일 측면에서, 본 발명은, 피부 손상을 예측하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
일 측면에서 본 발명은, 공해물질과 자외선에 의한 외인적 AhR 활성화제 생성을 억제하는 동시에 NRF2 활성으로 산화적스트레스를 완화시킬 수 있는 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
일 측면에서 본 발명은, 피부 산화적 스트레스에 의한 피부 노화와 햇빛에 의한 광노화를 동시에 억제할 수 있는 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
일 측면에서, 본 발명은, 곡류 발효물을 유효성분으로 포함하는 공해 물질에 반응하는 피부 케모센서 억제용 조성물이다.
일 측면에서, 본 발명은, 피부 산화적 스트레스 저감용 조성물로서, 상기 조성물은 NRF2의 활성화가 필요한 대상에게 제공하기 위한 것이며, 유효성분으로 NRF2 활성화제를 포함하며, 상기 NRF2 활성화제는 곡류 발효물을 포함하는 피부 산화적 스트레스 저감용 조성물이다.
일 측면에서, 본 발명은, 공해 물질에 반응하는 피부 케모센서를 억제하면서 동시에 피부 산화적 스트레스를 저감하기 위한 조성물로서, 상기 조성물은 유효성분으로서 곡류 발효물을 포함하는, 공해 물질에 반응하는 피부 케모센서 억제 및 피부 산화스트레스 저감용 조성물이다.
일 측면에서, 본 발명은, 포아세아에과(Poaceae:벼과, 화본과) 곡류 및 파바세아에과(Fabaceae:콩과) 곡류를 포함하는 혼합 곡류의 발효물이다.
일 측면에서, 본 발명은, 본 발명은 상기한 발효물을 유효성분으로 포함하는, 피부 손상 억제용 조성물이다.
일 측면에서, 본 발명은 공해 물질에 반응하는 피부 케모센서를 억제하고/하거나 피부 산화적 스트레스를 저감하기 위한 물질을 스크리닝하기 위한 방법으로서, 상기 방법은, 후보 물질이 AhR의 핵내 이동을 저해하는지를 측정하는 단계; 및/또는 후보물질이 NRF2의 핵내 이동을 촉진하는지를 측정하는 단계를 포함하는 스크리닝 방법이다.
일 측면에서, 본 발명은, 대상의 공해 물질 및/또는 자외선에 의한 피부 손상을 예측하는 방법으로서, 상기 대상으로부터 채취한 피부 세포에 공해 물질 및/또는 자외선을 가하는 단계; 상기 피부 세포 내에서 AhR의 핵내 이동 정도를 측정하는 단계; 및/또는 상기 피부 세포 내에서 NRF2의 핵내 이동 정도를 측정하는 단계를 포함하는 피부 손상 예측 방법이다.
일 측면에서, 본 발명은 피부 항노화에 유용한 물질을 제공할 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 신규한 곡류 발효물을 제공할 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 곡류 발효물의 용도를 제공할 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 공해 물질인 아릴하이드로카본을 감지하는 수용체인 AhR 활성은 억제하는 소재를 제공할 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 항산화 시스템의 핵심 조절자인 NRF2를 활성화시키는 소재를 제공할 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 공해 물질인 아릴하이드로카본을 감지하는 수용체인 AhR 활성은 억제하고 동시에 항산화 시스템의 핵심 조절자인 NRF2를 활성화시키는 소재를 제공할 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 AhR 활성과 NRF2 활성을 조절하는 메커니즘이 무엇인지 규명할 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 피부 항노화에 유용한 물질을 스크리닝하는 방법을 제공할 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은, 피부 손상을 예측하는 방법을 제공할 수 있다.
일 측면에서 본 발명은, 공해 물질과 자외선에 의한 외인적 AhR 활성화를 억제하는 동시에 NRF2 활성으로 산화적 스트레스를 완화시킬 수 있는 조성물을 제공할 수 있다.
일 측면에서 본 발명은, 피부 산화적 스트레스에 의한 피부 노화와 햇빛에 의한 광 노화를 동시에 억제할 수 있는 조성물을 제공할 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 환경오염이 심해지면서 지속적으로 오염에 노출되어 노화가 촉진되는 스트레스성 노화는 물론 광 노화도 경감시킬 수 있는 조성물을 제공할 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 한국의 전통발효공법을 사용하여 제조함으로써 친환경적이며 지속 가능한 화장품 소재의 개발에 적합한 방법이며 기능성 식품소재로도 활용이 가능하여 '먹고 바르는 신개념의 화장품' 개발을 가능하게 한다. 실증적 효능 데이터를 기반으로 하여 근거중심의 효능을 소구하는 화장품 원료임과 동시에 자연주의 경향과도 어울리는 화장품을 제공할 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 피부에 도포 시 공해 물질로 촉발된 피부스트레스에 의한 피부노화와 햇빛에 의한 광 노화를 동시에 억제할 수 있는 조성물을 제공할 수 있다.
도 1은 일 구현예에 따른 곡류 발효물에 의해 유발되는 일련의 과정으로서, AhR과 NRF2와의 상호작용을 도식화하여 나타낸 것이다.
도 2는 실시예에서 제조된 발효여과물들이 AhR의 핵 이동에 미치는 효과를 보기 위해 대조군과 함께 실험한 결과를 나타낸 사진이다. Untreat는 음성 대조군을 나타내고, Bap은 Benzopyrene만 처리한 것을 나타내고, Bap+Genistein은 벤조피렌과 양성 대조군 항산화제를 함께 처리한 것을 나타낸다. 실시예에서 제조된 발효여과물을 각각 사용한 것은, RW(Rice wine, 표준 막걸리), RON(Wickerhamomyces ciferrii 미접종 실시예1), RONY(Wickerhamomyces ciferrii 접종 실시예1)로 나타내었다.
도 3은 실시예에서 제조된 발효여과물들이 NRF2의 핵 이동에 미치는 효과를 보기 위해 대조군과 함께 실험한 결과를 나타낸 사진이다.
도 4는 실시예에서 제조된 발효여과물들에 의해 AhR과 NRF2가 핵 내로 이동하면서 각각 목표 유전자의 발현을 변경시키는지를 확인하는 실험 결과를 나타내는 사진이다.
도 5는 NRF2에 의해서 발현이 조절되는 단백질인 HO-1 (Heme oxygenase-1) 발현에 미치는 본 발명의 일실시예에 의한 발효여과물들의 효능을 보기 위해 대조군과 함께 실험한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 실시예에서 제조된 발효여과물들의 항염증 및 광노화 억제효능을 인체적용시험을 통한 확인한 결과를 나타내는 사진이다.
도 2는 실시예에서 제조된 발효여과물들이 AhR의 핵 이동에 미치는 효과를 보기 위해 대조군과 함께 실험한 결과를 나타낸 사진이다. Untreat는 음성 대조군을 나타내고, Bap은 Benzopyrene만 처리한 것을 나타내고, Bap+Genistein은 벤조피렌과 양성 대조군 항산화제를 함께 처리한 것을 나타낸다. 실시예에서 제조된 발효여과물을 각각 사용한 것은, RW(Rice wine, 표준 막걸리), RON(Wickerhamomyces ciferrii 미접종 실시예1), RONY(Wickerhamomyces ciferrii 접종 실시예1)로 나타내었다.
도 3은 실시예에서 제조된 발효여과물들이 NRF2의 핵 이동에 미치는 효과를 보기 위해 대조군과 함께 실험한 결과를 나타낸 사진이다.
도 4는 실시예에서 제조된 발효여과물들에 의해 AhR과 NRF2가 핵 내로 이동하면서 각각 목표 유전자의 발현을 변경시키는지를 확인하는 실험 결과를 나타내는 사진이다.
도 5는 NRF2에 의해서 발현이 조절되는 단백질인 HO-1 (Heme oxygenase-1) 발현에 미치는 본 발명의 일실시예에 의한 발효여과물들의 효능을 보기 위해 대조군과 함께 실험한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 실시예에서 제조된 발효여과물들의 항염증 및 광노화 억제효능을 인체적용시험을 통한 확인한 결과를 나타내는 사진이다.
본 명세서에서 "공해 물질"은, 대기 중의 공장 매연이나 자동차 배기 가스 등에서 유래되는 유해 물질을 의미한다. 대표적인 공해 물질로는 아릴하이드로카본(Arylhydrocarbon) 계열 물질로 예컨대, 다이옥신(Dioxine)이나 벤조피렌(Benzopyrene)등을 들 수 있다. 공해 물질은 미세먼지의 형태로서 피부를 공격할 수 있다.
본 명세서에서 "케모센서(Chemosensor)"란 외부 화학물질을 인식하는 센서를 의미한다. 예컨대, 대기 중의 공해 물질이 피부에 존재하는 케모센서에 결합하여 이에 대한 일련의 반응들을 촉발시킨다. 대표적인 피부의 케모센서는 AhR를 들 수 있다. AhR은 대기 중의 아릴하이드로카본(Arylhydrocarbon)에 결합하여 그에 대한 반응을 유발시킨다. 상기 반응은, 피부 염증, 피부 노화, 피부 주름, 피부 탄력 저하, 색소 침착 및 피부장벽 기능 저하 등일 수 있다.
본 명세서에서 “곡류”는 쌀, 밀, 보리, 옥수수, 콩 등의 곡식을 포괄하는 개념이다. "곡류"는 아시아인들, 특히 한국인들이 주식인 쌀에 추가적으로 섞어 먹는 잡곡들을 포함한다. 예컨대, 맵쌀 이외에, 찹쌀, 보리, 밀, 콩, 팥, 옥수수, 기장, 조 따위를 통틀어 이른다.
일 측면에서, 본 발명은, 곡류 발효물을 유효성분으로 포함하는 공해 물질에 반응하는 피부 케모센서 억제용 조성물이다.
일 구현예에서, 상기 공해 물질은 아릴하이드로카본(Arylhydrocarbon) 계열의 물질일 수 있다. 일 구현예에서, 상기 케모센서는 아릴하이드로카본 수용체(AhR)일 수 있다. 아릴하이드로카본(Arylhydrocarbon)은 예컨대, 다이옥신(Dioxine)이나 벤조피렌(Benzopyrene)을 들 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은, 피부 산화적 스트레스 저감용 조성물로서, 상기 조성물은 NRF2의 활성화가 필요한 대상에게 제공하기 위한 것이며, 유효성분으로 NRF2 활성화제를 포함하며, 상기 NRF2 활성화제는 곡류 발효물을 포함하는 피부 산화적 스트레스 저감용 조성물이다.
일 구현예에서, 상기 피부 산화적 스트레스는 AhR의 활성화 및 자외선 중 하나 이상에 의해 유발된 것일 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 공해 물질에 반응하는 피부 케모센서인 AhR을 억제하면서 동시에 피부 산화적 스트레스를 저감하기 위한 조성물로서, 상기 조성물은 유효성분으로서 곡류 발효물을 포함하는, 공해 물질에 반응하는 피부 케모센서 억제 및 피부 산화스트레스 저감용 조성물이다.
일 구현예에서, 상기 공해 물질은 아릴하이드로카본(Arylhydrocarbon)일 수 있다. 일 구현예에서, 상기 케모센서는 AhR 일 수 있다. 일 구현예에서, 상기 피부 산화적 스트레스는 AhR의 활성화 및 자외선 중 하나 이상에 의해 유발된 것일 수 있다. 일 구현예에서, 상기 피부 산화적 스트레스 저감은 NRF2 활성화에 의한 것일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 피부 케모센서 억제는 AhR의 핵내 이동을 억제하는 것일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 피부 산화적 스트레스 저감은, NRF2의 핵내 이동을 촉진하는 것일 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 구현예에 따른 곡류 발효물에 의해 유발되는 일련의 과정으로서, AhR과 NRF2와의 상호작용을 도식화하여 나타낸 것이다.
NRF2는 산화적 스트레스에 대응하는 항산화 시스템의 생성을 위한 핵심적 제어기능을 수행하고 있는 전사 인자이며 AhR의 경우처럼 세포질에 Keap1(Kelch-like ECH-associated protein 1)이라는 단백질과 결합된 형태로 존재하는데, 이러한 상태에서는 핵 내로의 전이가 불가능해서 활성을 나타내지 못한다. NRF2 활성화제의 작용으로 NRF2가 Keap 1과 분리되면 비로서 핵 내로 이동하여 NQO-1(NAD(P)H:quinone oxidoreductase 1), HO1(heme oxygenase-1), CAT (Catalase), SOD(Superoxide dismutase1)등과 같은 항산화 시스템을 구성하는 유전자들의 발현을 유도하여 AhR 활성으로 유발된 산화적 스트레스를 완화시킨다.
AhR과 NRF2와의 상호작용으로 인해 AhR은 억제하면서 동시에 NRF2를 활성화시킬 수 있는 본 명세서의 곡류 발효물이 피부에 미치는 영향은 매우 크다.
본 발명의 발효물의 작용기전은 다음과 같이 제시될 수 있다. 본 발명의 발효물은 크게 두 가지 방법으로 생체의 산화적 스트레스에 의한 노화 및 관련 질환적 증상으로 발전되는 것을 완화 또는 억제하는 효능을 나타낸다. 첫째, 도 1에서 보듯이 산화적 스트레스를 일으키는 AhR 경로에서 AhR의 핵이동의 억제하는 방법. 둘째, NRF2를 활성화 시켜 핵으로 이동시킴으로써 HO-1 발현 등 항산화 작용을 하는 유전자들을 활성화시켜 산화적 스트레스에 대한 대항력을 키우는 방법 등이다. 따라서 본 발명의 발효물의 경우 많은 다른 특허에서 제시하고 있는 AhR 경로의 단독 억제 또는 NRF2 경로의 단독 활성화에 의한 항산화 효능보다 보다 효율적이고 강력한 항산화적스트레스 효능을 나타낼 것으로 예측된다.
일 측면에서 본 발명은, 곡류 발효물로서, 포아세아에과(Poaceae:벼과) 곡류 및 파바세아에과(Fabaceae:콩과) 곡류를 포함하는 혼합곡류의 발효물이다.
일 구현예에서, 상기 조성물에서의 곡류 발효물은, 포아세아에과(Poaceae) 곡류 및 파바세아에과(Fabaceae) 곡류를 포함하는 혼합 곡류의 발효물일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 포아세아에과(Poaceae) 곡류는 오리자속(Oryza sp.) 곡류 및 아베나속(Avena sp.) 곡류를 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 파바세아에과(Fabaceae) 곡류는 비그나속(Vigna sp.)곡류를 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 오리자속(Oryza sp.)은, 오리자 오스트랄리엔시스(Oryza australiensis), 오리자 바씨이(Oryza barthii), 오리자 브라키안싸(Oryza brachyantha), 오리자 코아륵타타(Oryza coarctata), 오리자 에이친제리(Oryza eichingeri), 오리자 글라베리마(Oryza glaberrima), 오리자 그랜디글루미스(Oryza grandiglumis), 오리자 라티폴리아(Oryza latifolia), 오리자 롱기글루미스(Oryza longiglumis), 오리자 롱기스타미나타(Oryza longistaminata), 오리자 메예리아나(Oryza meyeriana), 오리자 미누타(Oryza minuta), 오리자 네오칼레도니카(Oryza neocaledonica), 오리자 오피시날리스(Oryza officinalis), 오리자 펑크타타(Oryza punctate), 오리자 리들레이이(Oryza ridleyi), 오리자 루피포곤(Oryza rufipogon), 오리자 사티바(Oryza sativa) 또는 오리자 스클레크테리(Oryza schlechteri)일 수 있다. 예컨대, 상기 오리자속(Oryza sp.)은, 오리자 사티바(Oryza sativa)일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 아베나속(Avena sp.) 곡류는 아베나 사티바(Avena sativa), 아베나 아비씨니카(Avena abyssinica), 아베나 비잔티네(Avena byzantine), 아베나 누다(Avena nuda), 또는 아베나 스트리고세(Avena strigose)일 수 있다. 예컨대, 상기 아베나속(Avena sp.) 곡류는 아베나 사티바(Avena sativa)일 수 있다.
일 구현예에서, 비그나속(Vigna sp.) 곡류는, 비그나 아코니티폴리아(Vigna aconitifolia), 비그나 안귤라리스(Vigna angularis) 비그나 글라브레센스(Vigna glabrescens), 비그나 그랜디플로라(Vigna grandiflora), 비그나 히르텔라(Vigna hirtella) 비그나 미니마(Vigna minima), 비그나 문고(Vigna mungo), 비그나 문고(Vigna mungo), 비그나 나카시마에(Vigna nakashimae), 비그나 네팔렌시스(Vigna nepalensis), 비그나 라디아타(Vigna radiata), 비그나 레플렉소필로사(Vigna reflexopilosa), 비그나 리우키우엔시스(Vigna riukiuensis), 비그나 스티퓰라세아(Vigna stipulacea), 비그나 서브라마니아나(Vigna subramaniana), 비그나 테누이카울리스(Vigna tenuicaulis), 비그나 트릴로바타(Vigna trilobata), 비그나 트리네르비아(Vigna trinervia), 또는 비그나 엄벨라타(Vigna umbellate)일 수 있다. 예컨대, 비그나속(Vigna sp.) 곡류는, 비그나 라디아타(Vigna radiata)일 수 있다.
녹두와 같은 비그나속(Vigna sp.) 곡류, 특히 비그나 라디아타(Vigna radiata)에는 다양한 비타민, 플라보노이드가 풍부하고 껍질에는 비텍신과 이소비테신이라는 항산화 물질들이 풍부하게 함유되었다. 또한, 귀리와 같은 아베나속(Avena sp.) 곡류, 특히 아베나 사티바(Avena sativa)도 높은 항산화력과 베타글루칸에서 유래하는 면역강화 활성이 우수한 것으로 잘 알려져 있다. 쌀(오리자 사티바(Oryza sativa))과 녹두, 귀리의 성분들을 누룩균과 피키아 효모의 융합발효로 얻어진 발효물은 노화예방, 항산화 효과, 피부 미용 등의 효능이 우수할 것으로 기대된다.
일 구현예에서, 혼합 곡류는, 쌀(오리자 사티바(Oryza sativa)), 녹두 (비그나 라디아타(Vigna radiata)) 및 귀리 (아베나 사티바(Avena sativa))를 포함하는 혼합 곡류일 수 있다. 일 구현예에서, 쌀, 녹두 및 귀리의 중량비는 1-10 : 1-10 : 1-10일 수 있다. 예컨대, 쌀, 녹두 및 귀리의 중량비는 1-8 : 1-8 : 1-8일 수 있다. 또는, 1-7 : 1-7 : 1-7, 1-6 : 1-6 : 1-6, 1-5 : 1-5 : 1-5, 1-4 : 1-4 : 1-4, 1-3 : 1-3 : 1-3, 1-2 : 1-2 : 1-2 또는 약 1:1:1일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 발효는, 누룩균에 의한 발효일 수 있다. 누룩균은 황국균, 흑국균 또는 홍국균 등으로 분류되며, 크게 떡 누룩(병국) 또는 흩임 누룩(신국)으로 분류되기도 한다. 예컨대, 누룩균은 아스퍼질러스속(Aspergillus sp.), 모나스쿠스속(Monascus sp.) 또는 리조푸스속 (Rhizopus sp.) 균주일 수 있다. 예컨대, 누룩균은 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae), 아스퍼질러스 소재(A. sojae), 아스퍼질러스 니거(Aspergillus niger), 아스퍼질러스 아와모리(A. awamori), 아스퍼질러스 우사미이(A. usamii), 아스퍼질러스 루추엔시스(A. luchuensis), 아스퍼질러스 카와치이(A. kawachii), 모나스쿠스 안카(Monascus anka), 모나스쿠스 퍼퍼레우스(Monascus purpureus), 모나스쿠스 바케리(Monascus barkeri) 또는 리조푸스 니그리칸스(Rhizopus nigricans) 일 수 있다. 일 구현예에서, 누룩균은 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae)일 수 있다.
한국전통식품에서 번식하는 미생물의 일종인 누룩은 예로부터 술을 제조하는데 이용되어 왔다. 누룩은 술을 만드는 효소를 갖는 곰팡이를 곡류에 번식시킨 것인데, 누룩균의 주된 역할은 쌀과 같은 전분질 원료를 당화시키는 것으로서, 원시시대에는 술을 만들기 위해서 타액의 아밀라제를 이용하였지만, 이후 곰팡이 균사를 입힌 누룩을 사용하거나 보리를 침지하여 싹을 나게 한 맥아를 사용하는 방법이 보급되었다. 이러한 누룩의 당화 작용에 의한 결과물을 알코올을 만드는 효모균이 성장 영양분으로 이용함으로써 효과적이면서도 간단하게 술을 만들 수 있게 되는 것이다. 따라서 누룩균은 발효의 스타터(starter)라고 불리우며, 대부분 발효는 누룩균의 발효로 시작된다. 된장 만들기, 균비, 발효 비료, 토양 발효 등 어떠한 발효에도 이 균이 없으면 발효는 시작되지 않는다. 누룩균이 없는 상황에서도 된장발효균은 분해 효소를 내어 단백질과 지방을 분해시킬 수도 있지만 능률은 떨어진다. 또한 셀룰로오스와 같이 단단한 조직이라든가 유기물의 세포 속까지는 좀처럼 먹어 들어가지 못한다. 누룩균이 좋아하는 것은 탄수화물(전분)이다. 이를 분해하여 포도당이나 과당의 단당류로 저분자화 하는 것이다. 미생물은 공통적으로 단것을 좋아하며 이 당분이 없으면 대부분의 균은 아무런 활동도 시작하지 않는다. 그러나 당이 여러 분자가 모여서 이루어지는 탄수화물의 상태로는 너무 커서 바로 이용할 수 없기 때문에 누룩균이 최초로 작고 먹기 쉬운 단당류를 많이 만들어 놓으면 비로소 다른 균들이 나타나 그 당을 먹이로 활성화되기 시작한다. 누룩 곰팡이는 일반적으로 그 색상에 따라 황국균, 흑국균 또는 홍국균 등으로 분류되며, 크게 떡 누룩(병국) 또는 흩임 누룩(신국)으로 분류되기도 한다. 병국에 서식하는 곰팡이로는 내부까지 기어드는 발효형으로서, 거미줄곰팡이 (Rhyzopus nigricans), 효모, 털곰팡이 등이 있고, 신국에 서식하는 곰팡이로는 표면에만 번식하는 호흡형으로서, 누룩곰팡이 (Aspergillus oryzae) 등이 있다. 누룩을 제조하기 위한 원료곡물은 주로 밀 또는 쌀에 밀가루를 입힌 것 원부재료로 하고, 여기에 녹두, 찹쌀 또는 보리 등이 함께 사용되기도 한다.
일 구현예에서, 상기 발효는, 누룩균에 의한 1차 발효 및 효모에 의한 2차 발효일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 효모는 스핑고리피드 생산 효모일 수 있다. 일 실시예에서, 상기 스핑고리피드 생산 효모는 위커하모미세스속(Wickerhamomyces sp.) 균주일 수 있다. 예컨대, 상기 스핑고리피드 생산 균주는 위커하모미세스 씨페라이(Wickerhamomyces ciferrii)일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 누룩균에 의한 1차 발효는, 곡류를 세척하여 하룻밤 침지시킨 후 쪄서 고두밥을 만든 후, 고두밥을 식힌 후 누룩과 물을 첨가하여 항아리에 넣은 후 2~3일간 밑술 발효를 시키는 것일 수 있다. 이때 곡류와 누룩과 물의 비율은 발효 온도에 따라 부피 비율로 2~3 : 1~2 : 2 이 되도록 할 수 있다. 덧술 발효에 사용하는 맵쌀의 양을 밑술 대비 2 ~ 5배 늘려 찐 후 식혀서 1차 발효가 끝난 밑술과 합해서 잘 섞어줄 수 있다. 20 ~ 30℃에서 3 ~ 7일 추가 발효를 한 후 술 찌꺼기를 거른 후 상등액을 회수할 수 있다. 발효 상등액은 감압 증류를 통해 알코올을 제거하고 제균 여과를 하여 투명한 발효 여과물을 얻을 수 있다.
일 구현예에서, 상기와 같이 1차 발효를 수행한 다음 밑술과 곡물을 잘 섞은 것에 스핑고지질 생산 효모, 예컨대, Wickerhamomyces ciferrii (한국미생물 보존센터 KCCM 50215, NRRL Y 1031, ATCC 14091)를 추가로 접종하고 2차 발효시킬 수 있다. 2차 발효는 20 ~ 30℃에서 3 ~ 7일 추가 발효를 한 후 술 찌꺼기를 거른 후 상등액을 회수할 수 있다. 발효 상등액은 감압 증류를 통해 알코올을 제거하고 제균 여과를 하여 투명한 발효 여과물을 얻을 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명은, 상기 발효물을 유효성분으로 포함하는, 피부 손상 억제용 조성물일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 피부 손상은, 공해 물질에 의한 피부 산화적 스트레스에 의한 노화 및/또는 광노화일 수 있다. 일 구현예에서, 상기 피부 손상은, 피부 염증, 피부 주름, 피부 탄력 저하, 색소 침착 및 피부장벽 기능 저하 중 하나 이상일 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명은 공해 물질에 반응하는 피부 케모센서를 억제하고/하거나 피부 산화적 스트레스를 저감하기 위한 물질을 스크리닝하기 위한 방법으로서, 상기 방법은, 후보 물질이 AhR의 핵내 이동을 저해하는지를 측정하는 단계; 및/또는 후보물질이 NRF2의 핵내 이동을 촉진하는지를 측정하는 단계를 포함하는 스크리닝 방법이다.
일 구현예에서, 상기 후보물질이 대조군에 비해, AhR의 핵내 이동을 저해하고/하거나 NRF2의 핵내 이동을 촉진하는 경우, 공해 물질에 반응하는 피부 케모센서를 억제하고/하거나 피부 산화스트레스를 저감하기 위한 물질인 것으로 판정하는 단계를 더 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명은 대상의 공해 물질 및/또는 자외선에 의한 피부 손상을 예측하는 방법으로서, 상기 대상으로부터 채취한 피부 세포에 공해 물질 및/또는 자외선을 가하는 단계; 상기 피부 세포 내에서 AhR의 핵내 이동 정도를 측정하는 단계; 및/또는 상기 피부 세포 내에서 NRF2의 핵내 이동 정도를 측정하는 단계를 포함하는 피부 손상 예측 방법이다.
일 구현예에서, 상기 AhR의 핵내 이동 정도가 대조군에 비해 높고/높거나, 상기 NRF2의 핵내 이동 정도가 대조군에 비해 낮으면, 대상의 공해 물질 및/또는 자외선에 의한 피부 손상이 대조군에 비해 클 것으로 예측하는 단계를 더 포함할 수 있다.
일 실시예에서, 본 발명은, 쌀, 녹두 및 귀리의 혼합 곡류의 발효물 및 그 발효물을 포함하는 조성물이다. 예컨대, 대한민국의 전통 발효 기술의 하나인 쌀을 기반으로 하는 전통주 제조기법을 응용한 것일 수 있다. 일 실시예에서, 쌀에 녹두와 귀리 등의 곡물을 혼합하고, 누룩과 피부 보습에 핵심물질인 세라마이드와 스핑고리피드를 생산하는 특수 효모를 융합 발효시켜 얻어진 발효물을 정제하여 AhR 억제효능과 NRF2 활성화 효능을 동시에 갖는 기능성 화장품 소재를 개발하고, 이를 이용한 기능성 화장품, 특히 공해방지 및 광노화 억제 효능을 가지는 다 기능성 화장품을 제조하고자 하였다.
또한 본 발명의 일 측면은 곡류 발효물을 함유하는 피부 외용제 또는 화장품 조성물을 제공한다. 상기 피부 외용제 또는 화장품 조성물은 화장품학 또는 피부 과학적으로 허용 가능한 매질 또는 기제를 함유한다. 이는 국소 적용에 적합한 모든 제형으로, 예를 들면, 용액, 겔, 고체, 반죽 무수 생성물, 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 유상에 수상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 멀티 에멀젼, 현탁액, 마이크로 에멀젼, 마이크로 캡슐, 미세 과립구, 이온형(리포좀) 및 비이온형의 소낭 분산제, 포말(foam), 압축된 추진제를 더 함유한 에어로졸 또는 패치 형태로 사용될 수 있다. 이들 조성물은 당해 분야의 통상적인 방법에 따라 제조될 수 있다.
상기 피부 외용제 또는 화장품 조성물은 상기한 물질 이외에 주 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서, 바람직하게는 주 효과에 상승 효과를 줄 수 있는 다른 성분들을 함유하는 것도 무방하며, 본 발명의 유효 성분 이외에 다른 성분을 기타 화장품 조성물의 제형 또는 사용 목적에 따라 당업자가 어려움 없이 적의 선정하여 배합할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 화장품 조성물은 상기 유효 성분과 더불어 필요에 따라 통상 화장품 조성물에 배합되는 다른 성분을 포함할 수 있고, 이의 예로서 유지 성분, 보습제, 에몰리언트제, 계면 활성제, 유기 및 무기 안료, 유기 분체, 자외선 흡수제, 방부제, 살균제, 산화 방지제, 안정화제, 증점제, 글리세린, pH 조절제, 알콜, 색소, 향료, 혈행 촉진제, 냉감제, 제한(制汗)제, 정제수 등을 들 수 있다. 상기 화장품 조성물에 포함될 수 있는 기타 배합 성분은 이에 한정되는 것은 아니고, 또한 상기 성분의 배합량은 본 발명의 목적 및 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 가능하다.
상기 화장품 조성물의 제형은 특별히 한정되지 않으며, 목적하는 바에 따라 적절히 선택할 수 있다. 예를 들어, 비누형 제제, 유연 화장수, 영양 화장수, 에센스, 영양 크림, 마사지 크림, 팩, 젤, 메이크업 베이스, 파운데이션, 파우더, 립스틱, 패치, 분무제, 아이 크림, 아이 에센스, 클렌징 크림, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 클렌져, 모발 샴푸, 모발 컨디셔닝, 모발 트리트먼트, 모발 에센스, 모발 로션, 두피 헤어토닉, 두피 에센스, 헤어젤, 헤어 스프레이, 헤어팩, 바디 로션, 바디 크림, 바디 오일 및 바디 에센스로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 제형으로 제조될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일측면은 곡류 발효물을 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 이러한 약학 조성물은 유효 성분 이외에 방부제, 안정화제, 수화제, 유화 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염 및/또는 완충제, 희석제(예: 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로오즈 또는 글리신), 활택제(예: 실리카, 탈크, 스테아르산 및 그의 마그네슘 또는 칼슘염 또는 폴리에틸렌 글리콜) 또는 결합제(예: 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분 페이스트, 젤라틴, 트라가칸스, 메틸셀룰로오즈, 나트륨 카복시메틸셀룰로오즈 또는 폴리비닐피롤리딘) 등의 약제학적 보조제 또는 기타 치료적으로 유용한 물질을 추가로 포함할 수 있다. 경우에 따라 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨 염과 같은 붕해제, 흡수제, 착색제, 향미제, 또는 감미제 등의 다른 약제학적 첨가제를 포함할 수 있다.
상기 약학 조성물은 통상적인 방법에 따라 다양한 경구 또는 비경구 투여제 형태로 제형화할 수 있다. 상기 비경구 투여제는 예를 들어, 점적제, 연고, 로션, 겔, 크림, 스프레이, 현탁제, 유제, 좌제(坐劑), 패치, 주사제 등의 제형일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일측면에 따른 상기 약학 조성물은 경구, 비경구 예를 들어 경피, 정맥 등으로 투여될 수 있다. 상기 조성물은 각 투여법에 적합한 제형 및 기준에 준한다. 특히, 정맥 주사의 경우 이에 적합하지 못 한 모든 첨가물을 배제하며, 조성물 자체의 순도 또한 매우 높게 제조된다.
상기 유효 성분의 적용량은 치료 받을 대상의 연령, 성별, 체중, 질환, 병리 상태, 투여 경로 및 처방자의 판단에 따라 달라질 것이다. 이러한 인자에 기초한 적용량 결정은 당업자의 수준 내에 있다.
이하, 실시예, 비교예 및 실험예를 들어 본 발명의 구성 및 효과를 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 이들 실시예, 비교예 및 실험예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위해 예시의 목적으로만 제공된 것일 뿐 본 발명의 범주 및 범위가 하기 실시예, 비교예 및 실험예에 의해 제한되는 것은 아니다.
한편, 본 발명은 일 측면에서 식품 조성물을 제공한다. 예컨대, 특정 기능을 위한 기능성 건강식품 조성물을 제공한다.
실시예 1) 쌀, 녹두, 귀리의 융합 발효물의 제조
다음과 같은 발효물을 제조하였다.
일반적인 쌀 막걸리(RW)
쌀(오리자 사티바(Oryza sativa))은 세척하여 하룻밤 침지시킨 후 쪄서 고두밥을 만들었다. 고두밥을 식힌 후 누룩과 물을 첨가하여 항아리에 넣은 후 2.5일간 밑술 발효를 시켰다. 이때 쌀과 누룩(농업법인 ㈜송학곡자, 소율곡누룩)과 물의 비율은 발효 온도에 따라 부피 비율로 2.5 : 1.5 : 2 이 되도록 하였다. 덧술 발효에 사용하는 맵쌀의 양을 밑술 대비 3.5배 늘려 찐 후 식혀서 1차 발효가 끝난 밑술과 합해서 잘 섞어주었다. 25℃에서 5일 추가 발효를 한 후 술 찌꺼기를 거른 후 상등액을 회수하였다. 발효 상등액은 감압 증류를 통해 알코올을 제거하고 제균 여과를 하여 투명한 발효여과물을 얻었다.
혼합 곡류 막걸리(RON)
맵쌀 단독 대신, 맵쌀(오리자 사티바(Oryza sativa)), 녹두(비그나 라디아타(Vigna radiata)) 및 귀리(아베나 사티바(Avena sativa))를 포함하는 혼합 곡류일 수 있다. (중량비 1:1:1)의 혼합 곡류를 사용했다는 점을 제외하고는 상기 RW와 동일하게 하여 발효여과물을 얻었다.
혼합 곡류 융합 발효 막걸리(RONY)
상기 RON과 동일하게 1차 발효를 수행한 다음 밑술과 곡물을 잘 섞은 것에 스핑고지질 생산 효모 (Wickerhamomyces ciferrii : 한국미생물 보존센터 KCCM 50215, NRRL Y-1031, ATCC 14091)를 추가로 접종하고 25℃에서 5일 추가 발효를 한 후 술 찌꺼기를 거른 후 상등액을 회수하였다. 발효 상등액은 감압 증류를 통해 알코올을 제거하고 제균 여과를 하여 투명한 발효여과물을 얻었다.
실시예 2) AhR의 핵이동 확인
인체각질형성세포(human epidermal keratinocyte, HEKn) (ThermoFisher Scientific, USA)를 u-Slide 8 well (ibidi GmbH, USA)에 3 * 104 세포 밀도가 되게 접종한 후 5% CO2, 37℃온도 하에서 하루 동안 배양하였다. 사용된 배양액은 EpiLite (ThermoFisher Scientific)에 Antiblotlc-Antimycotic Solution (WELGENE, Korea)과 HKGS (ThermoFisher Scientific, USA)을 첨가했다. 배양 후 각 well을 PBS 완충액으로 3회 세척하고, Benzo(a)pyrene (BaP) 1uM이 함유된 배양액에 실시예 1의 발효물(0.1%)을 추가하여 5시간 동안 전 처리하였다. 매 단계마다 PBS 완충액으로 4회 세척하였다. 세포 고정(Fixation)은 4% Paraformaldehyde solution (Sigma-Aldrich, USA)을 사용하여 15분동안 진행했고, 세포 투과화 (Permeabilization)는 0.2% Triton-x100 (Sigma-Aldrich, USA) 용액을 사용하여 15분동안 반응하였다. Blocking은 5% skim milk (Bio-Rad, USA)로 1시간 동안 상온에서 shaking하였고, 1차 항체인 Ah Receptor (Santa Cruz Biotechnology, USA)와 2차 항체인 Alexa Fluor 488 goat anti-mouse (Invitrogen, USA)을 각각 상온에서 1시간동안 shaking 반응하였다. 핵 염색에는 UltraCruz® Aqueous Mounting Medium with DAPI (Santa Cruz Biotechnology, USA)을 사용되었다.
그 결과는 도 2에 나타나 있다. 도 2에서, Untreat는 음성 대조군을 나타내고, Bap은 Benzopyrene만 처리한 것을 나타내고, Bap+Genistein은 벤조피렌과 양성 대조군 항산화제를 함께 처리한 것을 나타낸다. 상기 실시예에서 제조된 발효여과물을 각각 사용한 것은, RW(Rice wine, 일반적인 쌀막걸리), RON(Wickerhamomyces ciferrii 혼합곡류 막걸리), RONY(Wickerhamomyces ciferrii 혼합곡류 융합발효 막걸리)로 나타내었다.
도 2에 나타난 바와 같이, AhR(Arylhydrocarbon receptor)는 정상상태에서는 세포질에 존재하다가 BaP 같은 arylhydrocarbon 리간드가 결합하면 핵 안으로 이동하여 타겟 유전자의 발현을 촉발하는 전사인자로 작용한다. 따라서 AhR의 핵이동을 억제하는 물질은 AhR 경로의 활성화에 의한 산화적 스트레스 유발을 방지하는 효능을 기대할 수 있다. 도 2는 AhR의 단독 면역염색(위)과 DAPI 핵염색과 이중염색(아래)으로 핵으로 이동한 AhR을 확인할 수 있다. 아무것 처리하지 않은 경우(untreat) 75% 정도 세포질에 위치하고, BaP 처리를 하면 4% 만이 세포질에 남아있고 96%가 핵 안으로 이동하였다. 항산화 물질인 genistein을 BaP와 같이 처리한 경우 58%가 세포질에 남아 있다. 일반 막걸리(RW)의 경우 AhR을 핵으로 이동시키는 효능이 없는 것으로 관찰 되었는데, 반면에 RON의 경우 42%, RONY의 경우 이 보다 높은 62%가 세포질에 남아 있는 것이 관찰되었다. 결론적으로 RONY의 경우 genistein 보다 우수한 항스트레스 효능을 보인다고 할 수 있으며 RON의 경우도 상당한 항스트레스 효능을 보이고 있다고 할 수 있다. 이를 표로 정리하면 다음과 같다.
미처치구 | BaP 처리구 | BaP + Genistein |
BaP + RW |
BaP + RON |
BaP + RONY |
|
AhR핵이동 | 25% | 96% | 42% | 100% | 58% | 38% |
실시예 3) NRF2의 핵이동 확인
HEKn 세포를 u-Slide 8 well에 3 * 104 cell/well 되게 접종한 후 하루 동안 5% CO2 공급에 37℃온도 하에서 배양했다. 배양 후 PBS 완충액으로 3회 세척하였고, 배양액에 시료 단독으로 처리하여 1시간 추가 배양했다. 각 단계마다 PBS 완충액으로 4회 세척하였다. 세포 고정(Fixation)은 4% Paraformaldehyde solution을 사용하여 15분동안 반응하였고, 투과화 (Permeabilization)는 0.2% Triton-x100 용액을 사용하여 15분동안 처리하였다. Blocking은 5% skim milk로 1시간 동안 상온에서 shaking하였고, 1차 항체인 NRF2 (Santa Cruz Biotechnology, USA)와 2차 항체인 Alexa Fluor 488 goat anti-mouse을 각각 상온에서 1시간동안 shaking 반응하였다. 핵 염색에는 UltraCruz® Aqueous Mounting Medium with DAPI을 사용되었다.
NRF2의 핵이동 관찰 결과는 도 3에 나타내었다.
NRF2는 생체 항산화시스템 유지에 핵심적 역할을 하는 마스터 조절자 기능을 하는 전사인자이다. AhR과 마찬가지로 불활성화 상태로 세포질에 머물다 산화적 스트레스가 유발되는 경우 이를 완화 시키기 위한 항산화 시스템의 강화를 위해 핵으로 이동하여 HO-1, NQO 등 적절한 타겟 유전자의 발현을 유도한다. 따라서 NRF2의 핵 이동을 촉진하는 물질은 항산화 시스템 강화를 통한 산화적 스트레스 억제 효능이 있는 기능성 물질로 예상된다. 아무것도 처리하지 않은 경우(Blank control) 미약한 수준인 약 11%만이 핵에 존재한다. NRF2 리간드로 알려진 genistein을 처리하면 90% 이상이 핵으로 이동하였다. 일반 막걸리인 RW의 경우 22%에 불과했지만, RON과 RONY는 각기 87%, 80%가 핵을 이동하여 genistein 못지 않은 항산화 효능을 나타내는 것을 확인하였다. 표로 정리하면 다음과 같다.
미처치구 | Genistein | RW | RON | RONY | |
NRF2 핵이동 | 11 % | 90% | 22% | 87% | 80% |
실시예 4) 발효물의 유전자 발현에 미치는 효과 분석
실시에 4에서는 AhR과 NRF2가 핵내로 이동하면서 각각 목표 유전자의 발현을 증가시키는지를 확인하는 실험을 진행하였다. In vitro 실험에 HEKn 세포를 이용했으며, 배양액은 EpiLite (ThermoFisher Scientific, USA)에 Antiblotlc-Antimycotic Solution과 HKGS을 첨가하여 사용했다. 발현 분석에 사용된 RT-PCR 기기는 CFX Connect (BioRad, USA)이다. HEKn 세포를 12well plate (SPL life science, Korea)에 1 * 105cell/well 되게 접종하고 하루 동안 배양했다. 시료 전처리 앞서 PBS 완충액으로 1회 세척했다. CYP1A1 발현 분석은 배양된 세포에 BaP (1uM)과 시료를 동시 처리하여 24시간 추가 배양했고, HO-1은 세포에 시료 단독 처리하여 24시간 추가 배양했다. 그 후 total RNA은 NucleoSpin RNA plus Kit (MACHEREY-NAGEL, Germany)을 이용하여 추출했고, cDNA 합성은 RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit (Thermo Scientific, USA)을 사용했다. RT-PCR은 TB Green Premix Ex Taq (TAKARA, Japan)을 이용하여 유전자를 증폭했으며, Ct 값을 활용하여 정량 분석했다. 이때 사용된 프라이머 서열은 아래 표와 같다.
Name | Primer | 서열번호 |
GAPDH (F) | 5'- GAGTCAACGGATTTGGTCGT -3' | 서열번호 1 |
GAPDH (R) | 5'- TTGATTTTGGAGGGATCTCG -3' | 서열번호 2 |
CYP1A1 (F) | 5'- TAGACACTGATCTGGCTGCAG -3' | 서열번호 3 |
CYP1A1 (R) | 5'- GGGAAGGCTCCATCAGCATC -3' | 서열번호 4 |
HO-1 (F) | 5'- AAGACTGCGTTCCTGCTCAAC -3' | 서열번호 5 |
HO-1 (R) | 5'- AAAGCCCTACAGCAACTGTCG -3' | 서열번호 6 |
AhR의 타겟 유전자인 CYP1A1의 발현분석
CYP1A1은 대표적인 AhR 타겟 유전자이며 주로 아로마틱 하이드로카본 (아릴 하이드로카본)에 의해 발현이 유도된다. 한편 CYP1A1의 효소 활성 가운데 핵심적인 것으로 AHH(Aryl hydrocarbon hydroxylase) 활성이 있다. 이를 통해 BaP와 같은 PAH(Poly aromatic hydrocarbon)을 epoxide 등으로 전환 시킨 후 분해시키는 과정의 시발점에 있다. 도 4에 나타난 바와 같이, BaP를 처리한 각질형성세포(keratinocyte)에서 CYP1A1 발현은 대조군 대비 약 7배나 증가된다. 이렇게 증가된 CYP1A1 발현은 RON이나 RONY의 처리 후 각기 58%와 67%로 감소하였다. RON과 RONY 단독 처리의 경우 아무런 영향이 없는 것으로 나타났다.
본 실시예 4를 통해 본 발명의 발효여과물(RON, RONY)은 AhR의 핵 이동으로 유발되는 CYP1A1 발현증가, 활성산소종의 발생, 산화적스트레스 발생으로 이어지는 일련의 반응을 효과적으로 억제하여주는 것을 확인할 수 있었다.
NRF2의 타겟 유전자인 HO-1의 발현분석
HO-1 (Heme oxygenase-1)은 NRF2에 의해서 발현이 조절되는 단백질로서 독성의 heme을 제거하여 산화적스트레스에 의한 손상을 막아주는 기능을 한다. 실시예1의 발효물의 처리는 각질형성세포에서 HO-1의 발현을 2.8배 이상 증가시켜 주는데 이는 도 5에 나타난 바와 같이 강력한 산화 효능이 있는 EGCG에 비견할 만한 항산화 효능이라 할 수 있다. 본 실시예를 통해 본 발명의 발효물은 NRF2를 핵 내로 이동시켜 HO-1의 발현을 증가시키고 이는 인체의 항산화시스템을 구축하여 산화적스트레스에 대한 방어 기작을 증가시키는 것으로 기대할 수 있었다.
실시예 5) 인체적용시험을 통한 항염증 및 광노화 억제효능 확인
사람의 전박 안쪽 피부에 UVB(312nm) 조사기를 사용하여 자외선을 조사하였다. 예비실험으로 각 피험자의 전박부에 동일 강도의 UVB(312nm)를 시간별(30, 45, 60, 90, 120초) 조사를 하여 MED(minimal erythema dose)를 결정하였다. 본 조사 실험에서는 전박부에 2 MED의 UVB를 2개 부위씩 조사한 후 실시예 1의 발효물 원액과 1/8 희석액을 그림과 같이 동일량을 도포한 후 5일 동안 erythema 생성 및 변화를 관찰하였다. 그 결과는 도 6에 나타나 있다. 도 6에 나타난 바와 같이, 본 발명의 실시예에 따른 발효물은 뚜렷한 자외선에 의한 염증반응을 억제하는 효과를 나타내는 것을 알 수 있었다.
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<120> New cereal fermented products, skin protection uses thereof,
method for screening skin effective ingredient materials, and
method for predicting skin damage due to oxidative stress
<130> 21p308/ind
<160> 6
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GAPDH (F) primer
<400> 1
gagtcaacgg atttggtcgt 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GAPDH (R) primer
<400> 2
ttgattttgg agggatctcg 20
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CYP1A1 (F) primer
<400> 3
tagacactga tctggctgca g 21
<210> 4
<211> 20
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CYP1A1 (R) primer
<400> 4
gggaaggctc catcagcatc 20
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<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HO-1 (F) primer
<400> 5
aagactgcgt tcctgctcaa c 21
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HO-1 (R) primer
<400> 6
aaagccctac agcaactgtc g 21
Claims (22)
- 곡류 발효물을 유효성분으로 포함하는, 공해 물질에 반응하는 피부 케모센서 억제용 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 케모센서는 아릴하이드로카본 수용체(Arylhydrocarbon receptor; AhR)인, 조성물.
- 피부 산화적 스트레스 저감용 조성물로서,
상기 조성물은
엔알에프 2(Nuclear factor erythroid 2-related factor 2 : NRF2)의 활성화가 필요한 대상에게 제공하기 위한 것이며,
유효성분으로 NRF2 활성화제를 포함하며,
상기 NRF2 활성화제는 곡류 발효물을 포함하는 피부 산화적 스트레스 저감용 조성물. - 제3항에 있어서, 상기 피부 산화적 스트레스는 AhR의 활성화 및 자외선 중 하나 이상에 의해 유발된 것인, 조성물.
- 공해 물질에 반응하는 피부 케모센서를 억제하면서 동시에 피부 산화적 스트레스를 저감하기 위한 조성물로서,
상기 조성물은 유효성분으로서 곡류 발효물을 포함하는,
공해 물질에 반응하는 피부 케모센서 억제 및 피부 산화스트레스 저감용 조성물. - 제5항에 있어서,
상기 케모센서는 아릴하이드로카본 수용체(Arylhydrocarbon receptor; AhR)이고,
상기 피부 산화적 스트레스는 AhR의 활성화 및 자외선 중 하나 이상에 의해 유발된 것이며,
상기 피부 산화적 스트레스 저감은 NRF2 활성화에 의한 것인, 조성물. - 제1항 내지 제2항, 및 제5항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 피부 케모센서 억제는 AhR의 핵내 이동을 억제하는 것인, 조성물. - 제3항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 피부 산화적 스트레스 저감은, NRF2의 핵내 이동을 촉진하는 것인, 조성물. - 포아세아에과(Poaceae) 곡류 및 파바세아에과(Fabaceae) 곡류를 포함하는 혼합곡류의 발효물.
- 제9항에 있어서,
상기 포아세아에과(Poaceae) 곡류는 오리자속(Oryza sp.) 곡류 및 아베나속(Avena sp.) 곡류를 포함하고,
상기 파바세아에과(Fabaceae) 곡류는 비그나속(Vigna sp.) 곡류를 포함하는, 발효물. - 제10항에 있어서,
상기 발효는, 누룩균에 의한 발효인, 발효물. - 제11항에 있어서,
상기 발효는, 누룩균에 의한 1차 발효 및 효모에 의한 2차 발효인, 발효물. - 제12항에 있어서,
상기 효모는 스핑고리피드 생산 효모인, 발효물. - 제13항에 있어서, 상기 스핑고리피드 생산 효모는 위커하모미세스속(Wickerhamomyces sp.) 균주인, 발효물.
- 제13항에 있어서, 상기 스핑고리피드 생산 균주는 위커하모미세스 씨페라이(Wickerhamomyces ciferrii)인, 발효물.
- 제9항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 발효물을 유효성분으로 포함하는, 피부 손상 억제용 조성물.
- 제16항에 있어서, 상기 피부 손상은, 공해 물질에 의한 피부 산화적 스트레스에 의한 노화 및/또는 광노화인, 피부 손상 억제용 조성물.
- 제17항에 있어서, 상기 피부 손상은, 피부 염증, 피부 주름, 피부 탄력 저하, 색소 침착 및 피부장벽 기능 저하 중 하나 이상인, 피부 손상 억제용 조성물.
- 공해 물질에 반응하는 피부 케모센서를 억제하고/하거나 피부 산화적 스트레스를 저감하기 위한 물질을 스크리닝하기 위한 방법으로서,
상기 방법은,
후보물질이 아릴하이드로카본 수용체(Arylhydrocarbon receptor; AhR)의 핵내 이동을 저해하는지를 측정하는 단계; 및/또는
후보물질이 NRF2의 핵내 이동을 촉진하는지를 측정하는 단계를 포함하는 스크리닝 방법. - 제19항에 있어서,
상기 후보물질이 대조군에 비해, AhR의 핵내 이동을 저해하고/하거나 NRF2의 핵내 이동을 촉진하는 경우, 공해 물질에 반응하는 피부 케모센서를 억제하고/하거나 피부 산화스트레스를 저감하기 위한 물질인 것으로 판정하는 단계를 더 포함하는, 스크리닝 방법. - 대상의 공해 물질 및/또는 자외선에 의한 피부 손상을 예측하는 방법으로서,
상기 대상으로부터 채취한 피부 세포에 공해 물질 및/또는 자외선을 가하는 단계;
상기 피부 세포 내에서 아릴하이드로카본 수용체(Arylhydrocarbon receptor; AhR)의 핵내 이동 정도를 측정하는 단계; 및/또는
상기 피부 세포 내에서 NRF2의 핵내 이동 정도를 측정하는 단계를 포함하는 피부 손상 예측 방법. - 제21항에 있어서, 상기 AhR의 핵내 이동 정도가 대조군에 비해 높고/높거나, 상기 NRF2의 핵내 이동 정도가 대조군에 비해 낮으면, 대상의 공해 물질 및/또는 자외선에 의한 피부 손상이 대조군에 비해 클 것으로 예측하는 단계를 더 포함하는, 피부 손상 예측 방법.
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