KR20200127075A - 기능성 리포펩타이드를 포함하는 피부 개선용 화장료 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 팔미토일 트리펩타이드-1(Pal-GHK), 팔미토일 테트라펩타이드-7(Pal-GQPR), 팔미토일 펜타펩타이드-4(Pal-KTTKS) 및 이의 조합으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 기능성 펩타이드 및 유산균 발효물을 유효성분으로 포함하는 피부 개선용 화장료 조성물 및 의약외품 조성물, 상기 화장료 조성물의 제조방법 등에 관한 것이다.
본 발명의 화장료 조성물은 피부 주름 개선, 항산화, 항노화, 항염, 항스트레스, 피부장벽 개선, 보습, 피부 면역 개선, 피부세포 보호, 피부 에너지 활성 증진 및 발모 촉진 등 피부 개선 효과가 우수하며, 피부 침투 효율이 향상된 것을 특징으로 한다.

Description

기능성 리포펩타이드를 포함하는 피부 개선용 화장료 조성물 {A cosmetic composition for improving skin condition comprising functional lipopeptides}

본 발명은 팔미토일 트리펩타이드-1(Pal-GHK), 팔미토일 테트라펩타이드-7(Pal-GQPR), 팔미토일 펜타펩타이드-4(Pal-KTTKS) 및 이의 조합으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 기능성 펩타이드 및 유산균 발효물을 유효성분으로 포함하는 피부 개선용 화장료 조성물, 의약외품 조성물 및 상기 화장료 조성물의 제조방법 등에 관한 것이다.

인간의 피부는 나이가 들어감에 따라 여러 가지 내적, 외적 요인에 의해 변화를 겪는다. 내적으로는 신진대사를 조절하는 각종 호르몬의 분비가 감소하고, 면역 세포의 기능과 세포들의 활성이 저하되어 생체에 필요한 면역 단백질 및 생체 구성 단백질들의 생합성이 줄어들게 된다. 외적으로는 오존층 파괴로 인하여 태양광선 중 지표에 도달하는 자외선의 함량이 증가하고 환경오염이 더욱 심화됨에 따라 자유 라디칼 및 활성 유해 산소 등이 증가함으로써, 피부의 두께가 감소하고, 주름이 증가하며, 탄력이 감소될 뿐 아니라 피부 트러블이 자주 발생하는 등 여러 가지 변화를 일으키게 된다. 피부 노화 현상이 진행되면 각질형성세포 및 섬유아세포의 분열 감소, 콜라겐 합성의 감소, MMP 생성의 증가, 멜라닌 생성의 신호 전달 증가 등이 발생하게 되고, 이로 인하여 주름은 증가하게 되고 피부의 탄력은 감소하며, 기미, 주근깨 및 검버섯 등은 증가하게 된다. 특히, 피부의 주름 형성이 가장 대표적인 현상으로 받아들여지고 있는데, 주름은 콜라겐의 합성과 분해의 불균형에 기인한다. 보통 피부에서는 type I 콜라겐의 합성과 그 분해 효소인 MMP-1이 균형을 이루고 있으나, 광노화된 피부에서는 type I, III 콜라겐의 합성이 저하되고, MMP-1의 활성이 증가된다.

이러한 변화로 피부의 노화를 억제할 수 있는 소재에 대한 관심과 그를 함유하는 화장품에 대한 사회적 수요가 증가하고, 생체 친화적이면서도 피부 침투율이 우수한 항노화, 즉 주름개선 물질을 개발하는 것이 중요한 과제로 대두되고 있다. 그러나, 기능성 화장품 중 주름 개선용 화장품에 대한 수요와 소비자의 요구가 증대되어 왔으나 이에 부합하는 제품은 제한적인 실정이다. 따라서, 안전성과 안정성 및 피부 침투율이 향상된 주름 개선 소재를 이용한 화장품의 개발이 절실히 필요된다.

한편, 생명공학 기술을 이용한 분야에서는 펩타이드를 이용한 개발 소재가 국내외에서 눈에 띄는 경향을 보인다. 펩타이드는 인체 친화적이고, 독성이 적어 안전하며, 강력한 생리활성을 가지고 있어 고부가가치 화장품 소재로 활용도가 높다. 또한, 펩타이드는 인체 내에서 호르몬으로서 기능하거나 면역에 관여하기도 하는데, 피부 세포와 관련해서 상처 치유, 손상된 피부에 대한 피부 장벽 회복 등의 기능을 한다고 알려져 있다. 화장품이나 의약품의 활성 성분 또는 보조 성분으로서 인체에 투여되는 펩타이드는 신호 펩타이드, 활성 성분의 세포 내로의 이동을 촉진하는 캐리어 펩타이드, 효소 억제 펩타이드 및 신경전달물질 억제 펩타이드로 구분될 수 있다. 그 중에서도 화장품 분야에서 사용되는 펩타이드는 피부 조직 내에서의 특정 단백질 합성을 촉진 또는 유도하는 신호 펩타이드가 사용된다. 펩타이드의 생산 및 응용 기술은 1970년대 고체상 펩타이드 합성법(SPPS) 개발 이후 특별한 합성 기술적 고도성은 증가하지 않았으나, 펩타이드 내 아미노산 서열이 가지는 배열 및 구조에 따라 생체 내 혹은 피부에서 생리활성을 가지게 되어 화장품 소재, 의약품 소재로서 산업적 응용 가능성이 매우 높다.

이러한 배경 하에 본 발명의 발명자들은 주름 개선을 비롯하여 다양한 피부 개선 효과를 나타내면서도 피부 침투 효율을 향상시킨 소재를 개발하고자 예의 노력한 결과, 상기 소재로서 피부 인지질 구성성분의 곁사슬인 지방산과 구조적으로 유사한 팔미트산(palmitic acid)과 펩타이드(GHK. KTTKS, GQPR)가 아마이드 결합으로 연결된 기능성 펩타이드, 및 포도 캘러스 배양 추출물을 포함하는 배지의 유산균 발효물을 포함하는 조성물이 피부 개선 효과가 우수함을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 팔미토일 트리펩타이드-1(Pal-GHK), 팔미토일 테트라펩타이드-7(Pal-GQPR), 팔미토일 펜타펩타이드-4(Pal-KTTKS) 및 이의 조합으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 기능성 펩타이드 및 유산균 발효물을 유효성분으로 포함하는, 피부 개선용 화장료 조성물 및 의약외품 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 하나의 목적은 식물 캘러스 배양 추출물을 포함하는 배지에 유산균을 접종하여 발효시키는 단계; 상기 발효에 의해 얻어진 유산균 발효물 및 기능성 펩타이드를 혼합하는 단계를 포함하는, 피부 개선용 화장료 조성물의 제조방법을 제공하는 것이다.

이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 출원에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 하나의 양태는 본 발명의 하나의 목적은 팔미토일 트리펩타이드-1(Pal-GHK), 팔미토일 테트라펩타이드-7(Pal-GQPR), 팔미토일 펜타펩타이드-4(Pal-KTTKS) 및 이의 조합으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 기능성 펩타이드 및 유산균 발효물을 유효성분으로 포함하는, 피부 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 화장료 조성물은 팔미토일 트리펩타이드-1(Pal-GHK), 팔미토일 테트라펩타이드-7(Pal-GQPR), 팔미토일 펜타펩타이드-4(Pal-KTTKS) 및 이의 조합으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 기능성 펩타이드와 포도 캘러스 배양 추출물을 포함하는 배지의 유산균 발효물의 특이적 조합에 따른 피부 개선 효과의 현저한 증가를 특징으로 하는 것으로, 이러한 조합에 따른 피부 주름 개선 등 효과의 현저한 증가는 본 발명의 발명자들에 의하여 최초로 확인된 점에서 그 의의가 매우 크다.

본 발명에서 용어 "기능성 펩타이드"는 독성이 적어 안전하고, 강력한 생리활성을 나타내며, 빛과 공기에 안정적이고 물과 강한 친화력과 보습력을 갖는 등의 특성을 통해 개체 내에서 다양한 기능을 나타내는 펩타이드를 의미하는 것일 수 있다. 이는 본 명세서 내에서 "기능성 리포펩타이드(lipopeptide)"와 혼용될 수 있다. 구체적으로, 상기 기능성 펩타이드는 개체의 피부 상태 개선을 위한 화장료 조성물 또는 의약외품 조성물에 관한 기능을 나타내는 것일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 기능성 펩타이드는 아래 화학식 1로 표시되는 팔미토일 트리펩타이드-1(Pal-GHK), 아래 화학식 2로 표시되는 팔미토일 테트라펩타이드-7(Pal-GQPR), 아래 화학식 3으로 표시되는 팔미토일 펜타펩타이드-4(Pal-KTTKS) 및 이의 조합으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

[화학식 1]

[화학식 2]

[화학식 3]

일 예로, 본 발명 화장료 조성물 또는 의약외품 조성물에 있어서 팔미토일 트리펩타이드-1는 1 내지 50 mg/L(0.0001~0.005 %), 바람직하게는 20 mg/L (0.002 %) 농도로 포함될 수 있고, 팔미토일 테트라펩타이드-7는 1 내지 20 mg/L(0.0001~0.002 %), 바람직하게는 10 mg/L (0.001 %) 농도로 포함될 수 있으며, 팔미토일 펜타펩타이드-4는 1 내지 20 mg/L(0.0001 ~ 0.002 %), 바람직하게는 20 mg/L (0.002 %) 농도로 포함될 수 있으나, 이에 특별히 제한되는 것은 아니다.

상기 용어 "피부 상태 개선"은 본 명세서 내에서 "피부 개선"과 혼용될 수 있으며, 이는 피부 주름 개선, 항산화, 항노화, 항염, 항스트레스, 피부장벽 개선, 보습, 피부 면역 개선, 피부세포 보호, 피부 에너지 활성 증진 및 발모 촉진으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 용어 "식물 캘러스"는 식물에 상처가 났을 때 세포가 분열 능력을 회복하여 상처를 막고 비대해지는 유상조직으로, 식물에서 잘라낸 조직을 옥신을 함유한 배지에서 배양하거나, 어떤 종류의 식물에 상처를 내거나, 상처 부위를 옥신으로 처리할 경우 생기는 미분화 조직 또는 세포덩어리를 의미하는 것으로, 이를 새로운 배지에 계대 배양함으로써 영구적으로 분열 및 증식을 할 수 있다.

또한, 본 발명의 용어 "식물 캘러스 배양 추출물"은 상기 식물 캘러스를 고체배지에서 배양하여 그 배양물을 상온 또는 가온 상태에서 일정시간 동안 추출하여 수득한 액상성분, 상기 액상성분으로부터 용매를 제거하여 수득한 고형분 등의 결과물을 의미한다. 뿐만 아니라, 상기 결과물의 희석액, 이들의 농축액, 이들의 조정제물, 정제물 등을 모두 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 구체적으로, 본 발명의 식물 캘러스 배양 추출물은 포도 캘러스 배양 추출물을 의미할 수 있다. 또한, 상기 식물 캘러스 배양 추출물 제조에 사용되는 추출 용매 및 추출 방법은 당업계에 알려진 적절한 추출 용매 및 추출방법을 제한없이 선택할 수 있으며, 추출 방법은 예컨대 냉침 추출, 초음파 추출, 환류 추출 또는 열수 추출일 수 있다. 열수추출의 경우 열탕증류기에서 8 ~ 48시간 동안, 80 ~ 100℃ 로 가열하여 열수 추출물을 얻을 수 있으며, 냉수 추출의 경우 예컨대 냉수(15 ~ 25℃)에 상기 캘러스 배양물 자체 또는 그것의 건조된 분말을 혼합하여 3일 동안 추출하여 냉수 추출물을 얻을 수 있다. 또한, 본 발명의 식물 캘러스 배양 추출물은 물, 유기 용매 또는 이의 혼합 용매를 사용하여 추출하는 방법으로 제조될 수 있다. 유기용매를 사용하여 추출하는 경우, 메탄올, 에탄올, 이소프로판올, 부탄올, 에틸렌, 아세톤, 헥산, 에테르, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트, 디클로로메탄, N, N-디메틸포름아미드(DMF), 디메틸설폭사이드(DMSO), 1,3-부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 또는 이들의 혼합 용매를 사용하여 유효 성분이 파괴되지 않거나 최소화된 조건에서 실온 또는 가온 조건에서 추출할 수 있다.

본 발명에서 용어 "유산균 발효물"은 상기 식물 캘러스 배양 추출물을 포함하는 것일 수 있으며, 상기 식물 캘러스 배양 추출물을 포함하는 배지에 유산균을 접종하여 발효시킨 발효물을 의미하는 것일 수 있다. 또한, 상기 유산균은 특히 스트렙토코쿠스 테루모필루스(Streptococcus thermophilus)일 수 있으나, 이에 특별히 제한되는 것은 아니다.

구체적으로, 상기 유산균 발효물은 유산균 배양 배지와 식물 캘러스 배양 추출물을 혼합한 후 가열하여 멸균 처리한 배지 조성물로부터 제조될 수 있다. 보다 구체적으로, 유산균 배양 배지 Lactobacilli MRS Broth(Cat no. DF0881) 및 포도 캘러스 배양 추출물을 포함하는 배지 조성물에 스트렙토코쿠스 테르모필루스 균주를 2일 동안 전배양하고, 이후 0.5 %(v/v) 농도로 접종하여 100rpm으로 교반하면서 37℃에서 72시간 동안 배양하여 상기 유산균 발효물을 수득할 수 있다. 상기 포도 캘러스 배양 추출물은 배지 조성물 전체 100 중량% 기준으로 30 중량% 내지 70 중량% 범위로 포함될 수 있으나, 이에 특별히 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 유산균 발효물은 본 발명의 화장료 조성물 또는 의약외품 조성물 총 중량에 대하여 5 내지 30 중량%로 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 화장료 조성물은 기능성 펩타이드, 즉 팔미토일 트리펩타이드-1(Pal-GHK), 팔미토일 테트라펩타이드-7(Pal-GQPR) 및 팔미토일 펜타펩타이드-4(Pal-KTTKS)와 포도 캘러스 배양 추출물 포함 배지의 발효물을 혼합함으로써 제조될 수 있으며, 그 혼합 방법 및 순서는 해당 기술분야에 알려진 기술상식에 따라 당업자가 적합한 것을 선택할 수 있으며, 이에 특별히 제한되지 않는다. 구체적으로, 본 발명의 일 실시예에서는 팔미토일 트리펩타이드-1 20 mg/L (0.002%), 팔미토일 테트라펩타이드-7 10 mg/L (0.001%), 팔미토일 펜타펩타이드-4 20 mg/L (0.002%) 및 포도 캘러스 배양 추출물 포함 배지의 발효물 10%를 정제수에 혼합하여 상기 조성물을 제조하였다.

본 발명의 화장료 조성물은 용액, 외용연고, 크림, 폼, 영양화장수, 유연화장수, 팩, 유연수, 유액, 메이크업베이스, 에센스, 비누, 액체 세정료, 입욕제, 선 스크린크림, 선오일, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션, 패취 및 스프레이로 구성된 군으로부터 선택되는 제형으로 제조할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명의　화장료　조성물은 일반 피부　화장료에 배합되는 화장품학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 추가로 포함할 수 있으며, 통상의 성분으로 예를 들면 유분, 물, 계면활성제, 보습제, 저급 알콜, 증점제, 킬레이트제, 색소, 방부제, 향료 등을 적절히 배합할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의　화장료　조성물에 포함되는 화장품학적으로 허용 가능한 담체는 제형에 따라 다양하다. 본 발명의 제형이 연고, 페이스트, 크림 또는 젤인 경우에는, 담체 성분으로서 동물성 유, 식물성 유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크, 산화아연 또는 이들의 혼합물이 이용될 수 있다. 본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는, 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록사이드, 칼슘 실케이트, 폴리아미드 파우더 또는 이들의 혼합물이 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진제를 포함할 수 있다. 본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는, 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되며, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알콜, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일이 이용될 수 있으며, 특히, 목화씨 오일, 땅콩 오일, 옥수수 배종 오일, 올리브오일, 피마자 오일 및 참깨 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 이용될 수 있다. 본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는, 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알콜, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다. 본 발명의 제형이 비누인 경우에는 담체 성분으로서 지방산의 알칼리 금속 염, 지방산 헤미에스테르 염, 지방산 단백질 히드롤리제이트, 이세티오네이트, 라놀린 유도체, 지방족 알콜, 식물성 유, 글리세롤, 당 등이 이용될 수 있다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 다른 하나의 양태는 본 발명의 하나의 목적은 팔미토일 트리펩타이드-1(Pal-GHK), 팔미토일 테트라펩타이드-7(Pal-GQPR), 팔미토일 펜타펩타이드-4(Pal-KTTKS) 및 이의 조합으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 기능성 펩타이드 및 유산균 발효물을 유효성분으로 포함하는, 피부 개선용 의약외품 조성물을 제공한다. 상기 용어 기능성 펩타이드, 식물 캘러스, 식물 캘러스 배양 추출물, 유산균 발효물 및 피부 개선은 전술한 바와 같다.

본 발명의 화장료 조성물은 기능성 펩타이드, 즉 팔미토일 트리펩타이드-1(Pal-GHK), 팔미토일 테트라펩타이드-7(Pal-GQPR) 및 팔미토일 펜타펩타이드-4(Pal-KTTKS)와 포도 캘러스 배양 추출물 포함 배지의 발효물을 혼합함으로써 제조될 수 있으며, 그 혼합 방법 및 순서는 해당 기술분야에 알려진 기술상식에 따라 당업자가 적합한 것을 선택할 수 있으며, 이에 특별히 제한되지 않는다. 구체적으로, 본 발명의 일 실시예에서는 팔미토일 트리펩타이드-1 20 mg/L (0.002%), 팔미토일 테트라펩타이드-7 10 mg/L (0.001%), 팔미토일 펜타펩타이드-4 20 mg/L (0.002%) 및 포도 캘러스 배양 추출물 포함 배지의 발효물 10%를 정제수에 혼합하여 상기 조성물을 제조하였다.

본 발명의 의약외품 조성물은 상기 기능성 펩타이드 및 유산균 발효물 외에 필요에 따라 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 더욱 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제는 본 발명의 효과를 해하지 않는 한 제한되지 않으며, 예를 들어 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제, 윤활제, 감미제, 방향제, 보존제 등을 포함할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제의 대표적인 예로는, 락토즈, 덱스트로스, 슈크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 말티톨, 전분, 젤라틴, 글리세린, 아카시아 고무, 알지네이트, 칼슘포스페이트, 칼슘카보네이트, 칼슘실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 광물유, 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 식물성 오일, 주사가능한 에스테르, 위텝솔, 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우리지 등을 들 수 있다.

또한, 본 발명의 의약외품 조성물에는 상기 기능성 펩타이드 및 유산균 발효물 외에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있으며, 예컨대 공지의 주름 개선, 피부 미백, 피부 트러블 개선, 피부 보습 성분 등을 포함할 수 있다. 본 발명의 의약외품 조성물은 소독 청결제, 샤워폼, 연고액, 물티슈, 코팅제 등을 예시할 수 있으나 이에 제한되는 것이 아니며, 의약외품의 제제화 방법, 용량, 이용방법, 구성성분 등은 기술분야에 공지된 통상의 기술로부터 적절히 선택될 수 있다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 다른 하나의 양태는 식물 캘러스 배양 추출물을 포함하는 배지에 유산균을 접종하여 발효시키는 단계; 상기 발효에 의해 얻어진 유산균 발효물 및 기능성 펩타이드를 혼합하는 단계를 포함하는, 피부 개선용 화장료 조성물의 제조방법을 제공한다. 상기 용어 기능성 펩타이드, 식물 캘러스, 식물 캘러스 배양 추출물, 유산균 발효물 및 피부 개선은 전술한 바와 같다.

상기 유산균 발효물 및 기능성 펩타이드의 혼합 방법 및 순서는 해당 기술분야에 알려진 기술상식에 따라 당업자가 적합한 것을 선택할 수 있으며, 이에 특별히 제한되지 않는다. 구체적으로, 본 발명의 일 실시예에서는 팔미토일 트리펩타이드-1 20 mg/L (0.002%), 팔미토일 테트라펩타이드-7 10 mg/L (0.001%), 팔미토일 펜타펩타이드-4 20 mg/L (0.002%) 및 포도 캘러스 배양 추출물 포함 배지의 발효물 10%를 정제수에 혼합하여 상기 조성물을 제조하였다.

본 발명의 화장료 조성물은 피부 주름 개선, 항산화, 항노화, 항염, 항스트레스, 피부장벽 개선, 보습, 피부 면역 개선, 피부세포 보호, 피부 에너지 활성 증진 및 발모 촉진 등 피부 개선 효과가 우수하며, 피부 침투 효율이 향상된 것을 특징으로 한다.

도 1은 본 발명 조성물의 피부 주름 개선 효과를 확인하고자 Detroit551 세포에 대조군(정제수) 및 본 발명 조성물을 처리한 후 MMP-1 생합성 양을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명 조성물의 피부 주름 개선 효과를 확인하고자 Detroit551 세포에 대조군(정제수) 및 본 발명 조성물을 처리한 후 PIP 생합성 양을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명 조성물의 세포 증식 및 이동 촉진에 따른 항노화 효과를 평가하고자 HaCaT 세포에 대해 Wound healing assay를 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명 조성물의 발모 개선 효과를 평가하고자, 본 발명 조성물의 처리에 따른 인간 유래 모유두 세포의 증식과 관련 단백질 Akt 및 ERK의 발현 정도를 측정한 결과를 나타낸 것이다.

이하, 본 발명을 하기 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예만으로 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 기능성 펩타이드 합성 및 정제

1-1: Palmitoyl-GHK 펩타이드 합성 및 정제

1) 트리펩타이드(글리신-히스티딘-리신, GHK)의 합성

트리펩타이드는 9-플루오레닐메톡시카르보닐 (9-fluorenylmethoxycarbonyl; Fmoc)을 아미노산의 보호기로 사용하여 통상의 고체상 펩타이드 합성법(solid phase peptide synthesis: SPPS)에 의해 합성하였으며, N-히드록시벤조 트리아졸(N-hydroxybenzotriazole; HOBt)와 N, N'-디아이소프로필카보디이미드(N, N'-diiso propylcarbodiimide; DIC)를 활성화제로 사용하여 아미노산 잔기를 연장하였다. 구체적으로, 유리 반응기에서 H-Lys(Boc)-2-Chlorotrityl 레진(Nova Biochem, Inc) 154 ㎎(100 μmol 해당량)을 용매인 N, N'-디메틸포름아마이드(N, N'-Dimethylformamide; DMF) 에서 2시간 동안 부풀린(swelling) 다음, 용매를 제거하고, 2 % 1,8-Diazabicyclo(5.4.0)undec-7-ene(DBU)로 2회 처리하여 Fmoc를 제거하였다. Fmoc이 제거된 Lys 레진을 DMF로 3회 처리하고, HOBt 및 DIC로 활성화된 Fmoc-His(Trt)-OH(히스티딘) 용액과 실온에서 약 2시간 동안 반응시켰다. 이와 같은 과정으로 글리신을 연속적으로 반응시켜 수득한 NH₂-보호된 펩타이드(글리신-히스티딘-리신) 레진을 DMF로 3회 세척하였다.

2) 팔미토일-트리펩타이드(글리신-히스티딘-리신, GHK)의 합성

상기 1)에서 합성된 NH₂-보호된 펩타이드(글리신-히스티딘-리신)-레진을 DMF로 세척한 후 팔미트산(Palmitic acid) 3당량과 HOBt(3당량), DIC(3당량)을 혼합하여, 실온에서 하룻밤 동안 커플링 반응시켰다. 반응이 종료된 후 DMF 3회, Methylene chloride (MC)로 4회 세척한 다음 건조시켰다. 건조된 팔미토일-트리펩타이드(글리신-히스티딘-리신) 레진을 트리플루오로아세트산 : 물 : Triisopropyl silane(TIS) (95 : 2.5 : 2.5 (v/v))의 혼합 용액으로 실온에서 2 내지 3시간 동안 반응시켜, 펩타이드를 구성하는 아미노산 잔기의 측쇄에 존재하는 작용기의 보호기인 Boc기를 제거하고 레진으로부터 팔미토일-트리펩타이드(글리신-히스티딘-리신)을 분리시킨 다음, 차가운 디에틸에테르로 상기 펩타이드를 침전 및 건조시켰다.

3) 고순도 정제

건조 후 crude 상태의 팔미토일-트리펩타이드(글리신-히스티딘-리신)을 0.1 % 트리플루오로아세트산이 포함된 물과 아세토니트릴을 용매로 역상 고성능액체크로마토그래피(reverse phase high performance liquid chromatography; column: Gemini C18 110A, 250Х10 ㎜, 5 ㎛)에서 정제하였다. 이와 같이 획득한 펩타이드를 HPLC를 이용하여 정제한 다음 동결건조 한 후 순도 95% 이상의 팔미토일-트리펩타이드(Palmitoyl-GHK) 15 ㎎을 얻을 수 있었다(수율 25.9 %, 순도 100.00 %, 분자량[M+H]⁺ 579.4).

1-2: Palmitoyl-GQPR 펩타이드 합성 및 정제

1) 테트라펩타이드(글리신-글루타민-프롤린-아르기닌, GQPR)의 합성

유리 반응기에서 Fmoc-Arg(Pbf)-Wang 레진(Nova Biochem, Inc) 159 ㎎(100 μmol 해당량)을 용매인 DMF 에서 2시간 동안 부풀린(swelling) 다음, 용매를 제거하고, 2 % DBU로 2회 처리하여 Fmoc를 제거하였다. Fmoc이 제거된 Arg 레진을 DMF로 3회 처리하고, HOBt 및 DIC로 활성화된 Fmoc-Pro-OH(프롤린) 용액과 실온에서 반응시켰다. 이와 같은 과정으로 글루타민, 글리신을 연속적으로 반응시켜 수득한 NH₂-보호된 펩타이드(글리신-글루타민-프롤린-아르기닌) 레진을 DMF로 3회 세척하였다.

2) 팔미토일-테트라펩타이드(글리신-글루타민-프롤린-아르기닌, GQPR)의 합성

상기 1)에서 합성된 NH₂-보호된 펩타이드(글리신-글루타민-프롤린-아르기닌)-레진을 DMF로 세척한 후 팔미트산 (Palmitic acid) 10당량과 HOBt(10당량), DIC(10당량)을 혼합하여, 실온에서 하룻밤 동안 커플링 반응시켰다. 반응이 종료된 후 DMF 3회, MC로 4회 세척한 다음 건조시켰다. 건조된 팔미토일-테트라펩타이드(글리신-글루타민-프롤린-아르기닌) 레진을 트리플루오로아세트산 : 물 : TIS (95 : 2.5 : 2.5 (v/v))의 혼합 용액으로 실온에서 2 내지 3시간 동안 반응시켜, 펩타이드를 구성하는 아미노산 잔기의 측쇄에 존재하는 작용기의 보호기인 Boc기를 제거하고 레진으로부터 팔미토일-테트라펩타이드 (글리신-글루타민-프롤린-아르기닌)을 분리시킨 다음, 차가운 디에틸에테르로 상기 펩타이드를 침전 및 건조시켰다.

3) 고순도 정제

건조 후 crude 상태의 팔미토일-테트라펩타이드(글리신-글루타민-프롤린-아르기닌)을 0.1 % 트리플루오로아세트산이 포함된 물과 아세토니트릴을 용매로 역상 고성능액체크로마토그래피에서 정제하였다. 이와 같이 획득한 펩타이드를 HPLC를 이용하여 정제한 다음 동결건조 한 후 순도 95 % 이상의 팔미토일-테트라펩타이드(Palmitoyl-GQPR) 18 ㎎을 얻을 수 있었다(수율 25.9 %, 순도 99.10 %, 분자량[M+H]⁺ 695.8).

1-3: Palmitoyl-KTTKS 펩타이드 합성 및 정제

1) 펜타펩타이드 (리신-트레오닌-트레오닌-리신-세린, KTTKS)의 합성

유리 반응기에서 2-Chlorotrityl chloride 레진(Nova Biochem, Inc) 74 ㎎(100 μmol 해당량)을 용매인 DMF에서 2시간 동안 부풀린(swelling) 다음 용매를 제거하고, Fmoc-Ser(tBu)-OH을 95.9 ㎎(250 μmol 해당량)을 N,N-Diisopropylethylamine(DIEA)로 활성화시켜 투입하였다. 4시간 후 용매를 제거하고 2 % DBU로 2회 처리하여 Fmoc를 제거하였다. Fmoc이 제거된 레진을 DMF로 3회 처리하고, HOBt 및 DIC로 활성화된 Fmoc-Lys(Boc)-OH 용액과 실온에서 반응시켰다. 이와 같은 과정으로 트레오닌, 트레오닌, 리신을 연속적으로 반응시켜 수득한 NH₂-보호된 펩타이드(리신-트레오닌-트레오닌-리신-세린) 레진을 DMF로 3회 세척하였다.

2) 팔미토일-펜타펩타이드 (리신-트레오닌-트레오닌-리신-세린, KTTKS)

상기 1)에서 합성된 NH₂-보호된 펩타이드(리신-트레오닌-트레오닌-리신-세린)-레진을 DMF로 세척한 후 팔미트산 (Palmitic acid) 10당량과 HOBt(10당량), DIC(10당량)을 혼합하여, 실온에서 하룻밤 동안 커플링 반응시켰다. 반응이 종료된 후 DMF 3회, MC로 4회 세척한 다음 건조시켰다. 건조된 팔미토일-펜타펩타이드(리신-트레오닌-트레오닌-리신-세린) 레진을 트리플루오로아세트산 : 물: TIS (95 : 2.5 : 2.5 (v/v))의 혼합 용액으로 실온에서 2 내지 3시간 동안 반응시켜, 펩타이드를 구성하는 아미노산 잔기의 측쇄에 존재하는 작용기의 보호기인 Boc기를 제거하고 레진으로부터 팔미토일-펜타펩타이드(리신-트레오닌-트레오닌-리신-세린)을 분리시킨 다음, 차가운 디에틸에테르로 상기 펩타이드를 침전 및 건조시켰다.

3) 고순도 정제

건조 후 crude 상태의 팔미토일-펜타펩타이드(리신-트레오닌-트레오닌-리신-세린)을 0.1 % 트리플루오로아세트산이 포함된 물과 아세토니트릴을 용매로 역상 고성능액체크로마토그래피에서 정제하였다. 이와 같이 획득한 펩타이드를 HPLC를 이용하여 정제한 다음 동결건조 한 후 순도 95 % 이상의 팔미토일-펜타펩타이드(Palmitoyl-KTTKS) 20 ㎎을 얻을 수 있었다(수율 24.9 %, 순도 99.07 %, 분자량[M+H]⁺ 802.6).

실시예 2: 포도 캘러스 배양 추출물 포함 배지의 발효물 제조

스크렙토코쿠스 테루모필루스(Streptococcus thermophilus)는 생물자원센터(Korean Collection for Type Cultures)로부터 분양받아 사용하였으며, 배지 조성으로 포도 캘러스 배양 추출물을 함유한 배양 배지를 사용하였다. 구체적으로, Lactobacilli MRS Broth (10 g Proteose Peptone No. 3, 10 g Beef Extract, 5 g Yeast Extract, 20 g Dextrose, 1 g Polysorbate 80, 2 g Ammonium Citrate, 5 g Sodium Acetate, 0.1 g Magnesium Sulfate, 0.05 g Manganese Sulfate, 2 g Dipotassium Phosphate) (Cat no. DF0881) 55g을 포도 캘러스 배양 추출물 1L에 넣고 혼합한 후, 121℃에서 15분 동안 가열하여 멸균 처리한 배지를 사용하였다. 이러한 배양 배지 조성물에, 스트렙토코쿠스 테르모필루스 균주를 2일 동안 전배양하고, 0.5%(v/v) 농도로 접종하여 100 rpm으로 교반하면서 37℃에서 72시간 배양하여 포도 캘러스 배양 추출물 포함 배지의 발효물을 수득하였다.

실시예 3: 기능성 펩타이드 및 포도 캘러스 배양 추출물 포함 배지의 발효물을 포함하는 조성물 제조

본 발명에 따른 조성물 제조를 위해, 실시예 1-1 내지 1-3에서 제조된 기능성 펩타이드, 즉 팔미토일 트리펩타이드-1(Pal-GHK), 팔미토일 테트라펩타이드-7(Pal-GQPR) 및 팔미토일 펜타펩타이드-4(Pal-KTTKS)와 실시예 2에서 제조된 포도 캘러스 배양 추출물 포함 배지의 발효물을 정제수에 혼합하였으며, 구체적으로 팔미토일 트리펩타이드-1 20 mg/L (0.002%), 팔미토일 테트라펩타이드-7 10 mg/L (0.001%), 팔미토일 펜타펩타이드-4 20 mg/L (0.002%) 및 포도 캘러스 배양 추출물 포함 배지의 발효물 10%를 정제수에 혼합하여 상기 조성물을 제조하였다.

실험예 1: 피부세포 배양을 통한 무자극 및 세포 증식에 의한 재생 효과 확인 시험

실시예 3에 따른 조성물이 피부 세포에서 독성에 의한 자극이 있는지 알아보기 위해, MTT assay를 진행하였다. HaCaT 세포(human keratinocyte, 각질형성세포), Detroit 세포(human fibroblast, 섬유아세포)를 10 % FBS(Fetal Bovine Serum)가 함유된 DMEM(Dubelcco's Modified Eagle's Medium) 배지와 함께 96 well plate에 분주하고 5% CO₂, 37℃의 조건인 항온기에서 24시간 배양하였다. 이후 정제수를 첨가한 대조군과 본 발명 조성물을 최종 0.1, 1, 5, 10, 20 %인 농도가 되도록 세포에 처리하고, 24시간 동안 추가 배양하였다. 이어 5 mg/mL MTT(3-(4, 5-dimethyl-2-thiazolyl)-2, 5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide) 용액을 각 well에 4 μL씩 첨가하고, 4시간 동안 배양하였다. 배양액을 제거한 다음 DMSO(Dimethyl sulfoxide) 용액 100 μL씩 첨가하여 세포를 용해시킨 후, spectrophotometer를 사용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다(표 1).

시료		농도(%)	HaCaT 세포 증식 효과(%)	Detroit 세포 증식 효과(%)
대조군	정제수	-	100	100
실시예 3 조성물	농도	0.1	99	101
		1	115	103
		5	106	103
		10	105	111
		20	102	109

그 결과, 본 발명의 조성물은 0.1 ~ 20 % 처리 농도에서 피부세포 내 독성을 일으키지 않고, 증식이 있음을 확인하였다. 따라서 상기 조성물은 피부 자극 유발 가능성이 낮고 안전한 물질임을 의미하여, 각질형성세포와 섬유아세포에 무해하며 세포를 증식시킴으로써 피부 재생 효과가 있음을 알 수 있다.

실험예 2: 피부 주름 개선 효과 시험

실시예 3에 따른 조성물의 피부 재생 및 주름 개선 효과를 살펴보기 위하여, 콜라겐 분해 관련 효소인 MMP-1(Matrix Metalloproteinase-1)와 콜라겐의 합성의 전구체인 프로콜라겐(Procollagen Type I C-Peptide, PIP)의 생합성양을 측정하였다.

2-1: MMP-1 생합성 측정

Detroit551 세포를 48 well plate에 분주한 후, 세포 배양 조건에서 24시간 배양하였다. 이 후 혈청이 함유되지 않은 DMEM 배지와 함께 본 발명의 조성물을 최종 농도 1 %이 되도록 세포에 처리하고, 48시간 동안 추가 배양하였다. 상기 과정을 통해 배양한 배지의 상층액을 희석한 일부 100 μL를 취해 MMP-1 Biotrak Activity Assay Kit(Amersham, Cat. RPN2629) 내 MMP-1 표준물질 100 μL와 함께 각각 antibody coated microtiter plate에 넣고 25 ℃에서 3시간 동안 반응시켰다. 배지를 제거하여 200 μL의 PBS로 4회 세척한 후, 각 well에 100 μL의 antiserum을 첨가하고 25 ℃에서 3시간 동안 반응시켰다. 이 후 용액을 제거하여 200 μL의 PBS로 4회 세척한 후, 100 μL의 peroxidase 표식 antibody solution을 각 well에 첨가하고, 25 ℃에서 1시간 동안 추가 반응시켰다. 또한 용액을 제거한 후, 각 well에 100 μL의 substrate solution을 첨가하고 차광한 상태에서 15분간 실온에서 반응시켰다. 이후, 100 μL stop solution (1 N H₂SO₄)을 넣은 뒤 450 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 450 nm에서 흡광도를 측정한 후 MMP-1의 표준농도곡선을 작성하여 시료 내 MMP-1 양을 산정하였다(도 1). 그 결과, 도 1에서와 같이 본 발명의 조성물이 대조군(정제수)과 비교하여 1% 처리 농도에서 MMP-1의 억제 효과가 있음을 확인하였다.

2-2: PIP 생합성 측정

Detroit551 세포를 48 well plate에 분주한 후, 세포 배양 조건에서 24시간 배양하였다. 이 후 혈청이 함유되지 않은 DMEM 배지와 함께 본 발명의 조성물을 최종 농도 1 %이 되도록 세포에 처리하고, 48시간 동안 추가 배양하였다. 상기 과정을 통해 배양한 배지의 상층액을 희석한 일부 20 μL를 취해 PIP EIA Kit(Takara, Cat. MK101) 내 PIP 표준물질 20 μL와 함께 각각 antibody coated microtiter plate에 넣고 100 μL의 peroxidase 표식 antibody solution을 또한 각 well에 첨가하여, 37 ℃에서 3시간 동안 반응시켰다. 배지를 제거하여 200 μL의 PBS로 4회 세척한 후, 각 well에 100 μL의 substrate solution을 첨가하고 차광한 상태에서 15분간 실온에서 반응시켰다. 이 후 100 μL stop solution (1 N H₂SO₄)을 첨가하고, 450 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 450 nm에서 흡광도를 측정한 후 PIP 표준농도곡선을 작성하여 시료 내 PIP 양을 산정하였다(도 2). 그 결과, 도 2에서와 같이 본 발명의 조성물이 대조군(정제수)과 비교하여 1% 처리에서 PIP의 증가 효과가 있음을 확인하였다.

실험예 3: DPPH Radical Scavenging Activity를 이용한 항산화 효과 확인 시험

본 발명 조성물의 항산화 활성 효능을 살펴보기 위하여, DPPH(2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl)에 의한 자유 라디칼 소거능을 조사하였다. 구체적으로, 에탄올 0.4 mL에 0.1 mM DPPH 용액 0.5 mL, 대조군과 본 발명의 조성물을 최종 농도 0.01 %, 1 %, 5 % 가 되도록 0.1 mL씩 첨가하였다. 각 시료들을 혼합하여 실온 암조건에서 30분간 반응시킨 후, 517 nm에서 흡광도 측정을 통하여 DPPH 라디칼 소거능을 확인하였다(표 2).

시료		농도(%)	항산화 효과(%)
대조군	정제수	-	0
실시예 3 조성물	농도	0.01	3
		1	10
		5	25

그 결과, 본 발명의 조성물은 0.01 ~ 5 % 농도에서 자유 라디칼 소거능을 나타내는바, 항산화 효과가 있음을 확인하였다.

실험예 4: Wound healing assay를 이용한 창상치유, 항노화 효과 시험

본 발명의 조성물이 세포의 증식 및 이동 촉진에 도움을 주는지 Wound healing assay를 이용하여 항노화 효능을 평가하고자 하였다. 이를 위하여 HaCaT 세포를 Wound healing assay용 insert를 첨가한 12 well plate에 분주한 후, 세포 배양 조건에서 24시간 배양하였다. 이후 insert를 제거하여 0시간대에 세포 양상을 현미경 사진으로 획득하고, 대조군과 본 발명 조성물을 최종 농도 1 %, 2 %가 되도록 세포에 처리하였다. 이때, 양성 대조군 100 ng/mL EGF도 함께 처리하였다. 각각의 처리 후 7시간 동안 추가배양 후 배지를 제거하고 500 μL fixing solution(4 % paraformaldehyde)으로 15분간 상온에서 배양하여 세포를 고정시켰다. 이후 PBS로 3번 세척한 뒤에, 7시간대에 세포 양상을 또한 현미경 사진으로 획득하였다. 창상 치유가 된 정도는 Image J라는 프로그램을 이용하여 계산하였다(도 3). 그 결과, 도 3에서와 같이 본 발명의 조성물은 대조군(정제수)과 비교하여 세포의 증식 및 이동이 촉진되어 healing area가 증가하고, 이에 따라 항노화 효과가 있음을 확인하였다.

실험예 5: 염증 유전자 활성화의 억제 효과 확인 시험

본 발명 조성물의 피부 염증 억제 효능을 살펴보기 위하여, 염증 반응에 관여하는 COX-2 (Cyclooxygenase-2), iNOS (Inducible nitric oxide synthase)의 발현양 변화를 조사하였다. 이를 위하여 HaCaT 세포를 96 well plate에 분주한 후, 세포 배양 조건에서 24시간 배양하였다. 이후 UVB 조사를 통해 염증반응을 유도하고, 대조군과 본 발명의 조성물을 최종 농도 0.1 %, 1 %, 5 %가 되도록 세포에 처리하여 24시간 동안 추가 배양하였다. COX-2, iNOS의 유전자 수준에서 확인하기 위해 Real-time PCR 법을 수행하였으며, 그 시험 순서는 다음과 같다.

RNA isolation과 cDNA합성을 위해 SuperPrep^TM cell lysis & RT Kit for qPCR (TOYOBO, Cat. SCQ-101)을 사용하였다. 배지를 제거한 세포를 PBS로 한 번 세척하고, 50 μL cell lysis mixture (gDNA remover 포함)를 넣고 5분간 반응시킨 후, stop solution을 첨가하였다. RT reaction mixture 32 μL에 추출한 mRNA 8 μL를 첨가하고 PCR을 이용하여 37 ℃ 15분, 50 ℃ 5분, 95 ℃ 5분 조건에서 cDNA를 합성분석하기 위하여 상기에서 합성한 cDNA를 template로 하고, Thunderbird^TM SYBR qPCR Mix (TOYOBO, Cat. QPS-201)를 이용하여 Real-time PCR 분석을 진행하였다. 실험에 사용한 primer는 Qiagen사의 QuantiTect　primer assays (GAPDH; Cat. QT01192646, COX-2; Cat. QT00040586, iNOS; Cat. QT01323189)이며 시료의 COX-2, iNOS의 mRNA 발현량은 GADPH로 정량화 되어 비교하였다. Real-time qPCR 조건은 먼저 95 ℃ 15분 반응 후, 1 사이클 당 94 ℃ 15초, 60 ℃ 30초, 72 ℃ 30초로 하여 총 40 사이클로 진행하였다.

UVB 처리	시료		농도(%)	상대 발현양(Fold)
				COX-2	iNOS
	대조군	정제수	-	1	1
	실시예 3 조성물	농도	0.1	1.03	1.04
			1	0.51	0.62
			5	0.44	0.56

그 결과, 표 3과 같이 본 발명의 조성물은 UVB에 의한 염증 유도 후, 증가된 COX-2와 iNOS의 발현을 감소시킴으로써 염증 억제 효과가 있음을 확인하였다.

실험예 6: 항스트레스 유전자 활성화 확인 시험

본 발명의 조성물이 세포 내 항스트레스 유전자 활성화를 통한 피부 항상성 유지에 도움을 주는지 확인하기 위하여, 이와 관련된 유전자들의 발현 양상을 확인하였다. 이를 위하여 HaCaT 세포를 96 well plate에 분주한 후, 세포 배양 조건에서 24시간 배양하였다. 이후 대조군과 본 발명의 조성물 1 %를 세포에 처리하고, 24시간 동안 추가 배양하였다. 유전자 수준에서 확인하기 위해 Real-time PCR 법을 수행하였으며, 그 시험 순서는 다음과 같다.

RNA isolation과 cDNA합성을 위해 SuperPrep^TM cell lysis & RT Kit for qPCR (TOYOBO, Cat. SCQ-101)을 사용하였다. 배지를 제거한 세포를 PBS로 한 번 세척하고, 50 μL cell lysis mixture (gDNA remover 포함)를 넣고 5분간 반응시킨 후, stop solution을 첨가하였다. RT reaction mixture 32 μL에 추출한 mRNA 8 μL를 첨가하고 PCR을 이용하여 37 ℃ 15분, 50 ℃ 5분, 95 ℃ 5분 조건에서 cDNA를 합성하였다. 유전자의 발현을 비교분석하기 위하여 상기에서 합성한 cDNA를 template로 하고, Thunderbird^TM SYBR qPCR Mix (TOYOBO, QPS-201)를 이용하여 Real-time PCR 분석을 진행하였다. 실험에 사용한 primer는 Qiagen사의 QuantiTect　primer assays (GAPDH; QT01192646, HMOX1: QT00092645, NQO1: QT00050281, ABCA12: QT00025830, FTL: QT00055860, MT2A: QT00220199, TXNRD1: QT00055902)이며 시료의 HMOX1, NQO1, ABCA12, FTL, MT2A, TXNRD1의 mRNA 발현량은 GADPH로 정량화하여 비교되었다. Real-time qPCR 조건은 먼저 95 ℃ 15분 반응 후, 1 사이클 당 94 ℃ 15초, 60 ℃ 30초, 72 ℃ 30초로 하여 총 40 사이클로 진행하였다.

시료		농도(%)	상대 발현양(Fold)
			HMOX1	NQO1	ABCA12	FTL	MT2A	TXNRD1
대조군	정제수	-	1	1	1	1	1	1
실시예 3 조성물	농도	1	7.4	3.5	2.8	3.9	4.7	3.8

그 결과, 표 4와 같이 본 발명의 조성물에 의하여 피부세포의 항상성에 관련한 유전자들(HMOX1, NQO1, ABCA12, FTL, MT2A, TXNRD1)의 발현이 유의하게 증가됨을 확인하였다.

실험예 7: 피부장벽 및 보습 개선 유전자 발현 확인 시험

본 발명 조성물의 피부 장벽 개선 및 보습 효능을 살펴보기 위하여, 수분/glycerol 수송체인 AQP3 (Aquaporin 3)와 자연보습인자로 알려진 FLG (Filaggrin)의 발현양 변화를 조사하였다. 이를 위하여 HaCaT 세포를 96 well plate에 분주한 후, 세포 배양 조건에서 24시간 배양하였다. 이후 대조군과 본 발명 조성물 1 %를 세포에 처리하고, 24시간 동안 추가 배양하였다. AQP3와 FLG의 유전자 수준에서 확인하기 위해 Real-time PCR 법을 수행하였으며, 그 시험 순서는 다음과 같다.

RNA isolation과 cDNA합성을 위해 SuperPrep^TM cell lysis & RT Kit for qPCR (TOYOBO, SCQ-101)을 사용하였다. 배지를 제거한 세포를 PBS로 한 번 세척하고, 50 μL cell lysis mixture (gDNA remover 포함)를 넣고 5분간 반응시킨 후, stop solution을 첨가하였다. RT reaction mixture 32 μL에 추출한 mRNA 8 μL를 첨가하고 PCR을 이용하여 37 ℃ 15분, 50 ℃ 5분, 95 ℃ 5분 조건에서 cDNA를 합성하였다. 유전자의 발현을 비교분석하기 위하여 상기에서 합성한 cDNA를 template로 하고, Thunderbird^TM SYBR qPCR Mix (TOYOBO, QPS-201)를 이용하여 Real-time PCR 분석을 진행하였다. 실험에 사용한 primer는 Qiagen사의 QuantiTect　primer assays (GAPDH; QT01192646, AQP3; QT00212996, FLG; QT02448138)이며 시료의 AQP3, FLG의 mRNA 발현량은 GADPH로 정량화 하여 비교되었다. Real-time qPCR 조건은 먼저 95 ℃ 15분 반응 후, 1 사이클 당 94 ℃ 15초, 60 ℃ 30초, 72 ℃ 30초로 하여 총 40 사이클로 진행하였다.

시료		농도(%)	상대 발현양(Fold)
			AQP3	FLG
대조군	정제수	-	1	1
실시예 3 조성물	농도	1	2.87	2.42

그 결과, 표 5와 같이 본 발명 조성물에 의하여 피부세포 내 AQP3, FLG 유전자 발현 증가를 확인함으로써 피부장벽 및 보습효과가 있음을 확인하였다.

실험예 8: 피부 면역 개선 및 방어력 증진 확인 시험

본 발명의 조성물이 항균 효능을 가진 펩타이드 LL37 (CAMP, Cathelicidin-related antimicrobial peptides) 및 hBD-2 (human β-Defensin-2)의 활성을 통해 피부 면역과 방어력을 증진시키는 지 확인하였다. 이를 위하여 HaCaT 세포를 96 well plate에 분주한 후, 세포 배양 조건에서 24시간 배양하였다. 이후 대조군과 본 발명 조성물 1 %를 세포에 처리하고, 24시간 동안 추가 배양하였다. LL37과 hBD-2의 유전자 수준에서 확인하기 위해 Real-time PCR 법을 수행하였으며, 그 시험 순서는 다음과 같다.

RNA isolation과 cDNA합성을 위해 SuperPrep^TM cell lysis & RT Kit for qPCR (TOYOBO, SCQ-101)을 사용하였다. 배지를 제거한 세포를 PBS로 한 번 세척하고, 50 μL cell lysis mixture (gDNA remover 포함)를 넣고 5분간 반응시킨 후, stop solution을 첨가하였다. RT reaction mixture 32 μL에 추출한 mRNA 8 μL를 첨가하고 PCR을 이용하여 37 ℃ 15분, 50 ℃ 5분, 95 ℃ 5분 조건에서 cDNA를 합성하였다. 유전자의 발현을 비교분석하기 위하여 상기에서 합성한 cDNA를 template로 하고, Thunderbird^TM SYBR qPCR Mix (TOYOBO, QPS-201)를 이용하여 Real-time PCR 분석을 진행하였다. 실험에 사용한 primer는 Qiagen사의 QuantiTect　primer assays (GAPDH; QT01192646, LL37; QT00010458, hBD-2; QT00204617)이며 시료의 LL37, hBD-2의 mRNA 발현량은 GADPH로 정량화 하여 비교되었다. Real-time qPCR 조건은 먼저 95 ℃ 15분 반응 후, 1 사이클 당 94 ℃ 15초, 60 ℃ 30초, 72 ℃ 30초로 하여 총 40 사이클로 진행하였다.

시료		농도(%)	상대 발현양(Fold)
			LL37	hBD-2
대조군	정제수	-	1 ± 0.05	1 ± 0.01
실시예 3 조성물	농도	1	1.87 ± 0.05	2.78 ± 0.11

그 결과, 본 발명의 조성물은 피부세포에서 LL37과 hBD-2의 발현을 증가시켜 피부 면역과 방어력 증진에 도움을 주는 것을 확인하였다.

실험예 9: 자가 포식 활성 발현 확인 시험

본 발명의 조성물의 자가 포식 활성 효능을 살펴보기 위하여, 오토파지 형성에 관여하는 LC-3 (Microtubule-associated protein 1A/1B-light chain 3)의 발현양 변화를 조사하였다. 이를 위하여 HaCaT 세포를 96 well plate에 분주한 후, 세포 배양 조건에서 24시간 배양하였다. 이후 대조군과 본 발명 조성물 1 %를 세포에 처리하고, 24시간 동안 추가 배양하였다. LC-3의 유전자 수준에서 확인하기 위해 Real-time PCR 법을 수행하였으며, 그 시험 순서는 다음과 같다.

RNA isolation과 cDNA합성을 위해 SuperPrep^TM cell lysis & RT Kit for qPCR (TOYOBO, SCQ-101)을 사용하였다. 배지를 제거한 세포를 PBS로 한 번 세척하고, 50 μL cell lysis mixture (gDNA remover 포함)를 넣고 5분간 반응시킨 후, stop solution을 첨가하였다. RT reaction mixture 32 μL에 추출한 mRNA 8 μL를 첨가하고 PCR을 이용하여 37 ℃ 15분, 50 ℃ 5분, 95 ℃ 5분 조건에서 cDNA를 합성하였다. 유전자의 발현을 비교분석하기 위하여 상기에서 합성한 cDNA를 template로 하고, Thunderbird^TM SYBR qPCR Mix (TOYOBO, QPS-201)를 이용하여 Real-time PCR 분석을 진행하였다. 실험에 사용한 primer는 Qiagen사의 QuantiTect　primer assays (GAPDH; QT01192646, LC-3; QT00055069)이며 시료의 LC-3의 mRNA 발현량은 GADPH로 정량화 하여 비교되었다. Real-time qPCR 조건은 먼저 95 ℃ 15분 반응 후, 1 사이클 당 94 ℃ 15초, 60 ℃ 30초, 72 ℃ 30초로 하여 총 40 사이클로 진행하였다.

시료		농도(%)	LC-3 발현양(Fold)
대조군	정제수	-	1
실시예 3 조성물	농도	0.1	2.5
		1	4.4
		5	4.9

그 결과, 표 7과 같이 본 발명의 조성물은 피부 세포에서 LC-3 발현을 증가시켜 자가 포식 활성화에 도움을 주는 것을 확인하였다.

실험예 10: Blue Light(청색광)에 의한 피부세포 보호 효과 시험

본 발명의 조성물의 Blue Light 조사로부터 피부세포를 보호하는지 알아보고자, 460 nm 파장을 방출하는 Ultraviolet Crosslinker CL-1000을 사용하였다. 이를 위하여 HaCaT 세포를 96 well plate에 분주한 후, 세포 배양 조건에서 24시간 배양하였다. 이후 460 nm 파장을 10 mJ/cm²로 조사하고, 대조군과 본 발명 조성물을 최종 농도 0.1 %, 1 %, 5 %가 되도록 세포에 처리하여 24시간 동안 추가 배양하였다. 이어 피부세포의 생존률을 측정하기 위해 MTT assay를 진행하였다.

시료		농도(%)	Blue Light	세포 보호 효과(%)
대조군	정제수	-	-	100
			+	50
실시예 3 조성물	농도	0.1	+	49
		1	+	77
		5	+	80

그 결과, 표 8과 같이 본 발명의 조성물은 가시광선 영역대인 Blue Light 영역대의 빛을 특이적으로 반사시켜 차단하는 것이 가능하여 피부를 보호할 수 있음을 확인하였다.

실험예 11: 피부 에너지 활성 증진 효과 시험

본 발명의 조성물의 피부 에너지 활성 증진 효과를 살펴보기 위하여, 세포의 에너지 (ATP)의 활성 정도를 측정하였다. 이를 위하여 Detroit 세포를 12 well plate에 분주한 후, 세포 배양 조건에서 24시간 배양하였다. 이후 대조군과 본 발명 조성물을 처리하고, 24시간 동안 추가 배양하였다. 상기 과정을 통해 배양한 세포의 용해물을 희석한 일부 50 μL를 취해 ATP assay Kit(Abcam, Cat. ab83355) 내 ATP 표준물질 50 μL와 함께 각각 96 well plate에 넣고 50 μL의 ATP reaction mix 용액을 또한 각 well에 첨가하여 차광한 상태에서 30분간 실온 반응시켰다. 이후, 570 nm에서 흡광도를 측정한 후 ATP 표준농도곡선을 작성하여 시료 내 ATP 양을 산정하였다.

시료		농도(%)	에너지 활성 효과(%)
대조군	정제수	-	0
실시예 3 조성물	농도	0.1	4.01
		1	53.04
		5	44.07

그 결과, 표 9와 같이 본 발명의 조성물은 특히 1 % 농도에서 피부 에너지 활성 증진 효과가 우수함을 확인하였다.

실험예 12: 피부 활력 증진 효과 시험

본 발명의 조성물의 피부 활력 증진 효과를 살펴보기 위하여, BMI(Body Mass Index)가 21 ~ 27인 20 ~ 45세의 여성 피험자 20명에게 본 발명 조성물을 12주 동안 하루 1회 샤워 후 마사지와 함께 사용하게 하였으며, 사용 전과 사용 12주 후를 비교한 효과 여부를 판단하였다. 평가 항목은 설문평가를 하여 피부 세포 활성화 및 피부 활력 증진에 대해 효과를 느꼈다고 응답한 피험자 수를 조사하였다(표 10).

시료		농도(%)	피부 세포 활성화	피부 활력
대조군	정제수	-	1	0
실시예 3 조성물	농도	1	11	12
		5	12	15

그 결과, 사용감 평가에서 응답자의 대부분이 대조군의 경우 12주 동안 사용한 후 피부 세포 활성화 및 피부 활력 증진 효과를 거의 느끼지 못했으나, 본 발명의 조성물에 의하여 피부 세포 활성화와 피부 활력 증진을 느꼈다고 응답함을 확인하였다.

실험예 13: 외부 환경 스트레스에 의한 LEA 단백질 발현 확인 시험

본 발명의 조성물이 여러 외부 환경 스트레스에 의한 방어 효능이 있는지 알아보고자 LEA (Late embryogenesis abundant) 단백질의 활성 정도를 알아보았다. LEA 발현 정도가 높을수록 스트레스에 대한 내성이 증가하여 세포를 손상으로부터 보호하는 것을 의미한다. 이를 위하여 Detroit 세포를 96 well plate에 분주한 후, 세포 배양 조건에서 24시간 배양하였다. 이후 스트레스원에 세포를 6시간 동안 노출시켰다(UV, 먼지, 황사, 담배연기, 매연). 이때 스트레스 물질 부여 조건은 아래와 같다:

- UV: UV-A 파장 350 nm, 강도 3 J/㎠

- 먼지: Asian sand dust(건조된 고비사막 dust, 입자직경 10~50 um) 20 μg/mL

- 황사: Asian sand dust(건조된 고비사막 dust, 입자직경 10 um이하) 20 μg/mL

- 담배연기: Cigarette Smoke Condensate(CSC, 담배연기응축물) 150 μg/mL, 니코틴 10 μg/mL

- 매연: Diesel Exhaust Particles(DEP) 10 μg/mL

스트레스 반응이 유도된 세포에 대조군과 본 발명 조성물 1 %를 세포에 처리하고, 24시간 동안 추가 배양한 후, LEA 단백질 발현량을 측정하기 위해 In-Cell ELISA Colorimetric Detection Kit를 사용하였다. 배양이 끝난 세포의 배지를 제거하고, 100 μL fixing solution(4 % paraformaldehyde)으로 15분간 상온에서 배양하여 세포를 고정시켰다. 이후 PBS로 세척하고, 100 μL의 Permeabilization solution을 넣고 15분간 상온에서 반응시켰다. 이후 PBS로 세척하고, 100 μL Quenching solution을 넣고 20분간 상온에서 반응시켰다. 이후 PBS로 세척하고, 100 μL Blocking solution을 넣고 30분간 상온에서 반응시켰다. 용액을 제거하고 LEA 1차 항체 50 μL를 첨가하여 4 ℃에서 24시간 반응시켰다. 항체 제거 후 PBS로 세척하고, HRP conjugated 2차 항체 50 μL를 첨가하여 1시간 동안 반응시켰다. 이후 항체 제거하여 PBS로 세척을 한 뒤, 100 μL의 TMB substrate solution을 첨가하고 차광한 상태에서 15분간 실온에서 반응시켰다. 이후 100 μL stop solution (1 N H₂SO₄)을 첨가하고, 450 nm에서의 흡광도를 측정하였다.

그 결과, 아래 표 11에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 조성물에 의하여 UV, 먼지, 황사, 담배연기, 매연의 스트레스원 노출시 대조군에 비해 LEA 단백질의 발현양이 증가하여 세포 보호 효과가 있음을 확인하였다.

시료		스트레스원	농도(%)	LEA 단백질 발현(%)
대조군	정제수	UV	-	48.87
실시예 3 조성물	농도		1	62.21
대조군	정제수	먼지	-	48.73
실시예 3 조성물	농도		1	68.73
대조군	정제수	황사	-	60.31
실시예 3 조성물	농도		1	83.65
대조군	정제수	담배연기	-	63.05
실시예 3 조성물	농도		1	76.38
대조군	정제수	매연	-	64.56
실시예 3 조성물	농도		1	74.56

실험예 15: 발모 관련 단백질 발현 시험

본 발명 조성물의 발모 개선 효과를 살펴보기 위하여, 모유두 세포의 증식과 관련된 단백질인 Akt와 ERK의 발현 효과를 조사하였다. 이를 위해, 모유두 세포를 2Х10⁵개/ml의 농도로 하여 60mm dish에 접종하였다. 다음 날 Supplement Mix free 배지로 교체하여 Starvation을 하루 동안 실시하였다. 본 발명에 의한 조성물 0.5 %가 함유된 Supplement Mix free 배지로 교체하여 0분, 5분, 10분, 30분, 60분 추가로 배양하였다. 배양 후, 배지를 제거하고 부착되어 있는 세포에 Pro-Prep(intron)를 이용해 전체 단백질을 추출하였다. Bradford 용액으로 정량을 한 뒤 동량의 단백질 시료를 10% SDS-PAGE gel에 전기영동 하여 단백질을 분리하고, PVDF 막에 이동시켰다. 다음으로 이 막을 5% non-fat milk로 blocking 시키고, 1차 항체 (ERK, p-ERK, Akt, p-Akt, α-Tubulin)를 5% non-fat milk에 희석하여 4℃에서 하룻밤 동안 반응시켰다. 다음날 0.1% TBS-T로 10분간 3번 세척한 뒤 HRP conjugated 2차 항체를 5% non-fat milk에 희석하여 1시간 동안 반응시켰다. 이후 0.1% TBS-T로 10분간 3번 세척을 한 뒤 ECL 용액으로 발색 반응을 시키고, Chemi Documentation Imaging System을 통해서 발현된 단백질 밴드를 촬영하였다. 각 단백질의 발현양은 α-Tubulin 단백질 발현에 대한 각 단백질 발현 정도로 나타내었다(도 4).

그 결과, 인간 유래 모유두 세포 증식 및 활성과 관련된 상위 메커니즘의 인자인 p-Akt 는 10 min에서 증가하기 시작하여 30 min에서 최대로 증가하는 것을 확인할 수 있었고, 마찬가지로 p-ERK는 5 min에서 증가하여 30 min까지 지속되는 경향을 보였다. 이로부터 본 발명에 의한 조성물이 인간 유래 모유두 세포 증식 및 활성에 유의한 효과를 보이는 것을 확인하였다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (9)

1. 팔미토일 트리펩타이드-1(Pal-GHK), 팔미토일 테트라펩타이드-7(Pal-GQPR), 팔미토일 펜타펩타이드-4(Pal-KTTKS) 및 이의 조합으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 기능성 펩타이드 및 유산균 발효물을 유효성분으로 포함하는, 피부 개선용 화장료 조성물.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 유산균은 스트렙토코쿠스 테루모필루스(Streptococcus thermophilus)인, 화장료 조성물.
   
3. 제1항에 있어서, 상기 유산균 발효물은 식물 캘러스 배양 추출물을 포함하는 배지에서 유산균을 발효시킨 발효물인 것을 특징으로 하는, 화장료 조성물.
   
4. 제3항에 있어서, 상기 식물 캘러스 배양 추출물은 포도 캘러스 배양 추출물인, 화장료 조성물.
   
5. 제1항에 있어서, 상기 피부 개선은 피부 주름 개선, 항산화, 항노화, 항염, 항스트레스, 피부장벽 개선, 보습, 피부 면역 개선, 피부세포 보호, 피부 에너지 활성 증진 및 발모 촉진으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것인, 화장료 조성물.
   
6. 팔미토일 트리펩타이드-1(Pal-GHK), 팔미토일 테트라펩타이드-7(Pal-GQPR), 팔미토일 펜타펩타이드-4(Pal-KTTKS) 및 이의 조합으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 기능성 펩타이드 및 유산균 발효물을 유효성분으로 포함하는, 피부 개선용 의약외품 조성물.
   
7. 제6항에 있어서, 상기 유산균 발효물은 식물 캘러스 배양 추출물을 포함하는 배지에서 유산균을 발효시킨 발효물인 것을 특징으로 하는, 의약외품 조성물.
   
8. 제6항에 있어서, 상기 피부 개선은 피부 주름 개선, 항산화, 항노화, 항염, 항스트레스, 피부장벽 개선, 보습, 피부 면역 개선, 피부세포 보호, 피부 에너지 활성 증진 및 발모 촉진으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것인, 의약외품 조성물.
   
9. 식물 캘러스 배양 추출물을 포함하는 배지에 유산균을 접종하여 발효시키는 단계; 및
   상기 발효에 의해 얻어진 유산균 발효물 및 기능성 펩타이드를 혼합하는 단계를 포함하는, 제1항의 피부 개선용 화장료 조성물의 제조방법.

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