KR102460456B1 - 구실잣밤나무 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는 피부 주름 또는 탄력 개선용 조성물 - Google Patents

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신현재
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양승화
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Abstract

본 발명은 피부 주름 또는 탄력 개선용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 구실잣밤나무 추출물 또는 이의 분획물을 포함함으로써 우수한 항산화 효과, 콜라게나아제 효소 저해 효과, 엘라스타아제 효소 저해 효과 또는 콜라겐 생합성 효과를 나타낼 수 있고, 궁극적으로 피부 노화, 주름 또는 탄력 개선효과를 나타낼 수 있다.

Description

구실잣밤나무 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는 피부 주름 또는 탄력 개선용 조성물 {Composition for skin wrinkle or elasticity improvement comprising an extract or a fraction of Castanopsis sieboldii}
본 발명은 피부 주름 개선 또는 탄력 개선용 조성물에 관한 것이다.
피부 세포의 노화는 유전적 요인이 관여되는 자연 노화와 외부 환경에 의해 나타나는 노화로 분류될 수 있다. 자연 노화는 유전적 요인 등이 관여되어 제어가 쉽지 않아, 환경적 요인을 제어하여 피부 노화를 억제하기 위한 연구가 대다수를 이루고 있다. 환경적 요인에 의한 노화는 주로 진피층에 포함된 콜라겐 단백질, 엘라스틴 단백질 등의 파괴나 변성에 의해 나타날 수 있다. 환경적 요인 중 하나인 자외선은 피부 세포를 산화시키고, 엘라스틴의 생성 저하 및 파괴를 일으킨다. 구체적으로, 자외선 등에 의해 피부 내에 엘라스틴 분해효소가 발현되면 이 효소가 피부 내의 정상적인 엘라스틴을 분해하여 피부 탄력 저하를 가져오게 된다. 또한, 상기 환경적 요인에 의해 양산된 활성 산소는 산화 작용에 의해 피부 세포 내의 단백질 파괴, 당의 산화, 유전자 변형 등을 일으켜 피부에 노화 및 주름을 유발할 수 있다.
한편, 최근 소득이 증가함에 따라 생활수준이 향상되어 자신의 이미지를 제고시키기 위한 제품에 많은 투자를 하게 되고, 노령인구가 증가함에 따라 노화방지, 주름개선, 미백, 자외선차단 등에 관련된 기능성 제품에 대한 관심과 수요가 증가하고 있다. 특히, 화학성분이 다량 포함된 제품의 사용으로 여러 부작용과 피부 손상에 의한 문제점이 대두되면서, 각종 식물, 과일 또는 한약재 등에서 추출된 추출물을 이용한 피부 개선 제품을 제조하려는 시도가 있어 왔다.
한국등록특허 제2300581호
본 발명은 피부 주름 또는 탄력 개선용 화장료 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 피부 주름 또는 탄력 개선용 의약외품 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 피부 주름 또는 탄력 개선용 식품 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
1. 구실잣밤나무(Castanopsis sieboldii) 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는 피부 주름 또는 탄력 개선용 화장료 조성물.
2. 위 1에 있어서, 상기 추출물은 구실잣밤나무의 가지 추출물인, 화장료 조성물.
3. 위 1에 있어서, 상기 추출물은 C1 내지 C4의 알코올 또는 C1 내지 C4의 알코올 수용액으로 추출된 것인, 화장료 조성물.
4. 위 3에 있어서, 상기 추출물은 에탄올 또는 에탄올 수용액으로 추출된 것인, 화장료 조성물.
5. 위 1에 있어서, 상기 분획물은 상기 추출물을 에틸 아세테이트로 분획한 것인, 화장료 조성물.
6. 위 1에 있어서, 상기 피부 주름 또는 탄력 개선은 항산화, 콜라게나아제 효소 저해, 엘라스테아제 효소 저해 및 콜라겐 합성 촉진으로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나에 의해 나타나는 것인, 화장료 조성물.
7. 구실잣밤나무 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는 피부 주름 또는 탄력 개선용 의약외품 조성물.
8. 구실잣밤나무 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는 피부 주름 또는 탄력 개선용 식품 조성물.
본 발명의 구실잣밤나무 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는 조성물은 항산화 효과, 콜라게나아제 효소 저해 효과, 엘라스타아제 효소 저해 효과 또는 콜라겐 생합성 효과를 나타낼 수 있고, 궁극적으로 피부 노화, 주름 또는 탄력 개선효과를 나타낼 수 있다.
본 발명의 구실잣밤나무 추출물 또는 이의 분획물은 분획되기 전의 추출물에 비해 우수한 항산화 효과, 콜라게나아제 효소 저해 효과, 엘라스타아제 효소 저해 효과 또는 콜라겐 생합성 효과를 나타낼 수 있다.
도 1은 구실잣밤나무 추출물의 분획 단계를 나타낸 도식이다.
도 2는 구실잣밤나무 추출물 및 이의 분획물의 콜라게나아제 효소 억제 효과를 나타낸다.
도 3은 구실잣밤나무 추출물 및 이의 분획물의 엘라스타아제 효소 저해 효과를 나타낸다.
도 4는 구실잣밤나무 가지에서 콜라겐 함량을 측정한 결과를 나타낸다.
도 5는 구실잣밤나무 추출물 및 이의 분획물의 타입 I 콜라겐 합성 결과를 나타낸다.
본 발명은 구실잣밤나무(Castanopsis sieboldii) 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는 피부 주름 또는 탄력 개선용 화장료 조성물을 제공한다.
구실잣밤나무는 참나무과에 속하는 상록활엽 교목으로, 이의 천연, 잡종, 또는 변종을 포함한다.
용어 "추출물"은 추출 처리에 의하여 얻어지는 추출액, 상기 추출액의 희석액이나 농축액, 상기 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 상기 추출액의 조정제물이나 정제물, 또는 이들의 혼합물 등, 추출액 자체 및 추출액을 이용하여 형성 가능한 모든 제형의 추출물을 포함한다.
본 발명의 추출물을 얻기 위해 추출하는 방법은 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 방법에 따라 추출할 수 있다. 상기 추출 방법의 비제한적인 예로는, 열수 추출법, 초음파 추출법, 여과법, 환류 추출법 등을 들 수 있으며, 이들은 단독으로 수행되거나 2 종 이상의 방법을 병용하여 수행될 수 있다.
구실잣밤나무 추출물은 구실잣밤나무의 잎, 가지, 꽃, 뿌리, 또는 껍질 추출물일 수 있다. 구체적으로, 구실잣밤나무 추출물은 구실잣밤나무의 가지를 추출한 추출물일 수 있다.
용어 “가지”는 나무나 풀의 원줄기에서 뻗어 나온 줄기를 의미한다.
구실잣밤나무 추출물은 물, C1 내지 C4의 저급알코올 또는 이들의 혼합 용매(예컨대, C1 내지 C4의 저급알코올 수용액)로 추출된 것일 수 있다. 상기 저급알코올은 메탄올, 에탄올, 또는 프로판올일 수 있다.
상기 C1 내지 C4의 저급알코올 수용액은 C1 내지 C4의 저급알코올과 물이 혼합된 혼합물로, C1 내지 C4의 알코올 수용액은 10%이상 내지 100%(v/v)미만, 20%이상 내지 100%(v/v)미만, 30%이상 내지 100%(v/v)미만, 40%이상 내지 100%(v/v)미만, 50% 이상 내지 100%(v/v)미만, 60%이상 내지 100%(v/v)미만, 70%이상 내지 100%(v/v)미만, 10%이상 내지 90%(v/v)미만, 20%이상 내지 90%(v/v)미만, 30%이상 내지 90%(v/v)미만, 40%이상 내지 90%(v/v)미만, 50%이상 내지 90%(v/v)미만, 60%이상 내지 90%(v/v)미만 또는 65%이상 내지 85%(v/v)미만의 C1 내지 C4의 저급알코올 수용액일 수 있다. 일 실시예에 따르면, 구실잣밤나무 추출물은 구실잣밤나무의 가지를 건조하여 70% 에탄올 수용액으로 추출한 것일 수 있다.
용어 "분획물"은 여러 다양한 구성 성분들을 포함하는 혼합물로부터 특정 성분 또는 특정 성분 그룹을 분리하기 위하여 분획을 수행하여 얻어진 결과물을 의미한다.
구실잣밤나무 추출물의 분획물은 상기 구실잣밤나무 추출물을 용매로 상분리하여 얻은 물질일 수 있으며, 구체적으로 상기 구실잣밤나무 추출물을 헥산, 클로로포름, 에틸 아세테이트, 또는 부탄올로 이루어지는 군에서 선택된 적어도 하나의 용매로 분획한 분획물일 수 있다.
예컨대 구실잣밤나무 추출물의 분획물은 구실잣밤나무 추출물을 헥산, 클로로포름, 에틸 아세테이트, 및 부탄올로 순차적으로 분획하여 용매 분획물을 제조하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 보다 구체적으로, 구실잣밤나무 추출물의 분획물은 구실잣밤나무 에탄올 또는 에탄올 수용액 추출물을 에틸 아세테이트로 분획한, 구실잣밤나무 에탄올 또는 에탄올 수용액 추출물의 에틸 아세테이트 분획물일 수 있다.
일 실시예에서는, 에탄올 수용액으로 구실잣밤나무 추출물을 얻은 후, 이를 비극성 용매부터 순차적으로 헥산, 클로르포름, 에틸아세이트, 부탄올, 증류수를 사용하여 순차적으로 분획하여 총 5개의 용매 분획층인 헥산, 에틸 아세테이트, 클로로포름, 부탄올, 잔여 물층의 분획물을 제조하였고, 이들 중 에틸 아세테이트 분획물의 항산화 효과가 가장 우수한 것을 확인하였다.
본 발명의 구실잣밤나무 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는 조성물은 항산화, 콜라게나아제 효소 저해, 엘라스테아제 효소 저해 및/또는 콜라겐 합성을 촉진하여, 피부 노화 방지, 피부 탄력을 개선 또는 피부 주름 개선 효과를 나타낼 수 있다.
용어 "개선"은 상태의 완화 또는 치료와 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미한다.
용어 "주름 개선"은 본 발명의 조성물을 이용하여 개체의 피부 주름의 증상을 완화시키는 것을 의미한다.
용어 "탄력 개선"은 본 발명의 조성물을 이용하여 개체의 피부 탄력을 높이는 것을 의미한다.
일 실시예에서 구실잣밤나무의 에탄올 수용액 추출물이 항산화, 콜라게나아제 효소 저해, 엘라스테아제 효소 저해 및 콜라겐 합성 촉진 활성을 나타내는 것을 확인하였다. 또한, 구실잣밤나무의 에탄올 수용액 추출물 중에서 에틸 아세테이트 분획물이 가장 항산화 할성이 높은 것을 확인하였다. 반면, 구실잣밤나무의 에탄올 수용액 추출물의 헥산 분획물이나, 클로로포름 분획물, 부탄올 분획물, 물 분획물의 경우, 항산화 활성이 상당히 낮은 것을 확인하여, 항산화 활성을 나타내는 유용성분은 구실잣밤나무의 에탄올 수용액 추출물의 에틸 아세테이트 분획물에 다량 포함되어 있는 것을 예상할 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물은 용액, 외용 연고, 크림, 폼, 영양 화장수, 유연 화장수, 향수, 팩, 유연수, 유액, 메이크업 베이스, 에센스, 비누, 액체 세정료, 입욕제, 선 스크린 크림, 선 오일, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 로션, 파우더, 비누, 계면 활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션, 패취 및 스프레이로 구성된 군으로부터 선택되는 제형으로 제조할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 화장료 조성물은 일반 피부 화장료에 배합되는 화장품학적으로 허용 가능한 담체를 1 종 이상 추가로 포함할 수 있으며, 통상의 성분으로 예를 들면 유분, 물, 계면활성제, 보습제, 저급 알콜, 증점제, 킬레이트제, 색소, 방부제, 향료 등을 적절히 배합할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 화장품학적으로 허용 가능한 담체는 제형에 따라 다양하다.
또한, 본 발명은 구실잣밤나무 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는 피부 주름 또는 탄력 개선용 의약외품 조성물을 제공한다.
구실잣밤나무 추출물, 분획물, 피부 주름 또는 탄력 개선에 대해서는 전술한 바 있어 구체적인 설명은 생략한다.
용어 “의약외품”은 사람이나 동물의 질병을 진단, 치료, 개선, 경감, 처치 또는 예방할 목적으로 사용되는 물품들 중 의약품보다 작용이 경미한 물품들을 의미하는 것으로, 예를 들어 약사법에 따르면 의약외품이란 의약품의 용도로 사용되는 물품을 제외한 것으로, 사람 또는 동물의 질병 치료나 예방에 쓰이는 제품, 인체에 대한 작용이 경미하거나 직접 작용하지 않는 제품 등이 포함된다.
의약외품 조성물은 코팅제, 물티슈, 바디 클렌저, 폼, 비누, 마스크, 연고제, 크림, 로션, 에센스 및 스프레이로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
의약외품 조성물은 경구 또는 비경구의 여러가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다.
또한, 본 발명은 구실잣밤나무 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는 피부 주름 또는 탄력 개선용 식품 조성물을 제공한다.
구실잣밤나무 추출물, 분획물, 피부 주름 또는 탄력 개선에 대해서는 전술한 바 있어 구체적인 설명은 생략한다.
본 발명의 식품 조성물은 구실잣밤나무 추출물 또는 이의 분획물 이외에 식품학적으로 허용 가능한 식품보조첨가제를 더 포함할 수 있다. "식품보조첨가제"란 식품에 보조적으로 첨가될 수 있는 구성요소를 의미하며, 각 제형의 식품을 제조하는데 첨가되는 것으로 당업자가 적절히 선택하여 사용할 수 있다. 식품보조첨가제의 예로 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 충진제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등이 존재하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
식품 조성물의 형태에는 제한이 없으며 통상적인 의미의 식품을 모두 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 구실잣밤나무 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는 주름 또는 탄력 개선용 약학 조성물을 제공한다.
구실잣밤나무 추출물, 분획물, 피부 주름 또는 탄력 개선에 대해서는 전술한 바 있어 구체적인 설명은 생략한다.
본 발명의 약학 조성물은 단일제제로도 사용할 수 있고, 피부 탄력 증가 및 주름 개선 효과를 가진다고 알려진 약물을 추가로 포함하여 복합제제로 제조하여 사용할 수 있으며, 약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다.
상기 약학 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여할 수 있다. 상기 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.
또한, 본 발명은 구실잣밤나무 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 피부 주름 또는 탄력 개선 방법을 제공한다.
구실잣밤나무 추출물, 분획물, 피부 주름 또는 탄력 개선에 대해서는 전술한 바 있어 구체적인 설명은 생략한다.
용어 "투여"는 적절한 방법으로 환자에게 본 발명의 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 상기 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 예컨대, 상기 투여는 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 국소 투여 또는 비내 투여일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 본 발명의 조성물이 피부 탄력 및 주름 개선에 효과가 있는 특성상, 상기 조성물의 투여 경로는 피부에 도포하는 것일 수 있다.
용어 "개체"는 피부 탄력 감소 또는 피부 주름 발생한 개체이거나, 발생할 수 있는 개체를 의미하며, 인간을 포함한 쥐, 생쥐, 가축 등의 모든 동물을 포함한다. 구체적으로, 상기 개체는 인간을 포함한 포유동물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
이하, 실시예를 들어 본 발명의 구성 및 효과를 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 아래 실시예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위해 예시의 목적으로만 제공된 것일 뿐 본 발명의 범주 및 범위가 그에 의해 제한되는 것은 아니다.
제조예 1: 구실잣밤나무 추출물 제조
전라남도 완도 수목원에서 수급받은 구실잣밤나무(Castanopsis sieboldii) 가지를 사용하였다. 먼저, 구실잣밤나무 가지를 건조한 후 2kg을 70% 에탄올 20L에 2주동안 침지하여 2회 반복 추출하는 과정을 통해 구실잣밤나무 가지의 에탄올 추출물(이하, 70% EtOH 추출물 또는 제조예 1에서 제조된 구실잣밤나무 추출물)을 수득하였다.
제조예 2: 구실잣밤나무 추출물의 분획물 제조
제조예 1에서 제조된 구실잣밤나무 추출물을 유기용매를 사용하여 상분리를 진행하였다. 상분리에 사용한 용매는 hexane, chloroform, ethyl acecate (EtOAc), buthanol, water이었으며, 각 용매별로 분획을 진행하였다 (도 1 참조).
구체적으로, 제조예 1에서 제조된 구실잣밤나무 추출물 0.71g을 50% 메탄올 100mL에 용해시키고 비극성 용매인 헥산(hexane) 200mL로 3회 추출하여 핵산 분획물을 추출하였다. 그 후 얻어진 수층을 물 100 mL에 용해시키고 비극성 용매인 클로로포름(chloroform) 200mL로 3회 추출하여 클로로포름 분획물을 얻었다. 그 후 얻어진 수층을 물 100 mL에 용해시키고 비극성 용매인 에틸 아세테이트(ethyl acetate) 200mL로 3회 추출하여 에틸 아세테이트 분획물을 얻었다. 그 후 얻어진 수층을 물 100 mL에 용해시키고 비극성 용매인 부탄올(butanol) 200mL로 1회 추출하여 부탄올 분획물을 얻었다.
실험예 1: 구실잣밤나무 추출물 또는 분획물의 항산화 활성 확인
구실잣밤나무 추출물 및 이의 분획물의 항산화 활성을 확인하기 위하여 DPPH radical 소거능과 ABTS radical 소거능을 확인하였다.
먼저, DPPH free radical 소거능은 천연 추출물의 항산화 활성 측정하는 방법으로 널리 사용되는 방법이다. 본 실험에서는 항산화 활성 측정방법 중 Blois의 방법을 변형하여 시료의 radical 소거능을 측정하였다 [Blois, M. S. (1958) Antioxidant determinations by the use of a stable free radical. Nature 181: 1199-1200.]. Methanol에 용해시킨 0.1 mM DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl, Sigma, USA) 800 μL와 각 샘플(추출물 및 분획물 각각) 200 μL을 E.P tube에 넣고 voltexing하여 암실에서 15분간 반응 시켰다. 남아 있는 radical의 농도를 UV-Visible spectrophotometer (SCINCO, Seoul, Korea)를 사용하여 517 nm에서 측정하였다. 양성 대조군으로는 ascorbic acid (Sigma, USA)를 사용하였고, 추출물의 DPPH에 대한 소거능 (IC50)은 용매만을 사용한 대조군의 흡광도를 50% 감소시키는데 필요한 농도로 나타내었다(하기 수학식 1 참조).
[수학식 1]
Figure 112021129606843-pat00001
또한, ABTS radical scavenging은 친수성 및 소수성 시료의 radical 소거 활성을 모두 측정 할 수 있어 적용 범위가 넓은 장점을 가지고 있다. 본 실험에서는 Jeong 등의 방법을 변형하여 소거능을 측정하였다 [Jeong, C. H., G. Choi, J. Kim, J. Kwak, H. Heo, K. H. Shim, B. R. Cho, Y. I. Bae, and J. S. Choi (2009) In vitro antioxidative activities and phenolic composition of hot water extract from different parts of Cudrania tricuspidata. J. Food Sci. Nutr. 14: 283-289.]. 증류수에 용해한 7 mM의 ABTS 용액과 2.45 mM potassium persulfate를 1:1로 넣어 12-16시간 동안 암소에 방치하였다. Radical stock solution을 흡광도 값이 0.70 ±0.02이 되도록 PBS (pH 7.4)로 희석하였다. 희석된 용액 800 μL에 제조된 시료(추출물 및 분획물 각각) 200 μL씩을 가하여 암실에서 15분 동안 반응 후 흡광도를 측정하였다. 양성 대조군으로는 ascorbic acid (Sigma, USA)를 사용하였고, 추출물의 ABTS에 대한 소거능(IC50)은 용매만을 사용한 대조군의 흡광도를 50% 감소시키는데 필요한 농도로 나타내었다(하기 수학식 2 참조).
[수학식 2]
Figure 112021129606843-pat00002
실험결과 DPPH free radical activity, ABTS radical acitivity 모두에서 구실잣밤나무 추출물의 에틸 아세테이트 분획물이 가장 높은 활성을 나타내었다(아래 표 1 참조).
구분 DPPH IC 50 (μg/mL) ABTS IC 50 (μg/mL)
70% EtOH 추출물 356.61±13.07 125.83±4.09
n-Hexane 분획물 2,038.59±43.88 1,443.51±12.74
Chloroform 분획물 366.90±4.28 176.35±5.09
EtoAc 분획물 77.77±1.79 57.43±0.40
BuOH 분획물 434.72±1.24 300.63±1.36
Water 분획물 483.58±2.17 313.20±1.44
제조예 1 및 2에서 얻은 추출물 및 분획물들 중 상대적으로 높은 수율을 나타내고 우수한 DPPH, ABTS radical acitivity 결과를 나타낸 구실잣밤나무 추출물(70% EtOH 추출물)과 구실잣밤나무 추출물의 에틸 아세테이트 분획물을 이용하여 아래의 주름 개선 및 탄력 개선 활성 실험을 수행하였다.
실험예 2: 구실잣밤나무 추출물 또는 이의 에틸 아세테이트 분획물의 콜라게나아제 효소 억제 활성 확인
콜라겐 효소의 기질인 Azocoll(Azo dye-impregnated collagen, A4341, Sigma) 1 mg에 완충용액인 0.1 M Tris-HCl (pH 7.0)을 900 μL 첨가하여 균질화 한 후 구실잣밤 가지 추출물과 에틸아세테이트 분획물 시료 200 μL를 첨가한 다음 200 units/mL의 농도로 제조한 콜라게나아제 type I 효소(C0130, Sigma) 용액 100 μL를 첨가하여 총 반응액이 1.2 mL이 되도록 하였다. 43℃에서 1시간 동안 반응시킨 후 반응이 완료되면 3000 rpm에서 10분 동안 원심분리 시켜 분해되지 않은 콜라겐은 침전시키고 분해된 콜라겐을 함유하는 상등액을 취하여 550 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군으로서 효소액 대신 반응완충액을 효소와 동량 첨가하여 흡광도를 측정하였으며 시료자체의 값도 측정하여 효소 활성 계산 시 보정하였다.
그 결과 70% EtOH 추출물의 IC50은 697.07μg/mL로 확인되었고, 에틸 아세테이트 분획물의 IC50은 319.30μg/mL로 확인되었다(도 2 참조). 양성 대조군으로 사용한 올레익산(oleic acid)의 IC50은 498.90μg/mL로, 70% EtOH 추출물 및 에틸 아세테이트 분획물은 양성 대조군과 유사한 효능을 나타내는 것으로 확인되었다.
실험예 3: 구실잣밤나무 추출물 또는 이의 에틸 아세테이트 분획물의 엘라스타아제 효소 저해 활성 확인
시험관에 50 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0) 200 μL 와 50-1000 μg/mL 농도로 제조된 구실잣밤 가지 70% EtOH 추출물 및 이의 에틸 아세테이트 분획물 100 μL, elastase (Sigma, USA) 0.5 unit 100 μL, N-Succinyl-Ala-Ala-Ala-p-nitroanilide (Sigma, USA) 200 μL을 넣고 상온에서 8분간 반응 시켰다. 410 nm에서 흡광값을 측정하였다.
그 결과 70% EtOH 추출물의 IC50은 524.73μg/mL로 확인되었고, 에틸 아세테이트 분획물의 IC50은 380.94μg/mL로 확인되었다(도 3 참조). 양성 대조군으로 사용한 올레익산의 IC50은 444.41μg/mL로, 70% EtOH 추출물 및 에틸 아세테이트 분획물은 양성 대조군과 유사한 효능을 나타내는 것으로 확인되었다.
실험예 4: 구실잣밤나무 가지에 함유된 콜라겐의 함량 측정
구실잣밤 가지에 함유된 콜라겐 양을 측정하기 위하여 Hydroxyproline 분석 (Colorometric assay)을 사용하였다. 10 g의 구실잣밤 가지 분쇄물을 취하여 100 mL 6N HCl을 넣고 섞은 다음 100 ℃에서 24시간동안 완전히 가수분해 시켰다. trans-4-hydroxy-L-proline으로 0~5 mg/mL의 범위의 Stock solution을 제조하였다. 표준용액과 가수분해한 시료를 유리관에 1.6 mL씩 분주하였다. 각 유리관에 900uL의 2 N NaOH 용액을 넣고 혼합하였다. 900 uL Chloramine-T (6.00 g Chloramine-T hydrate in 125mL DW)을 넣고 상온에서 30 분간 반응시켰다. 700 uL Ehrlich reagent (p-dimethyl-aminobenzaldehyde + 75 mL 1-propanol + 32.5 mL 70 % perchloric acid + 17.5 mL DW) 을 첨가한 다음 60 ~ 65 ℃ 에서 40 분간 반응시킨 다음 냉각하였다. 550nm에서 흡광도를 측정하여 hydroxyproline의 함량을 계산하였다. 콜라겐 중 hydroxyproline의 이론적인 함량이 13.5 %이므로 아래 수학식 3에 따라 콜라겐의 함량을 구하였다.
[수학식 3]
Figure 112021129606843-pat00003
콜라겐 함량 측정 결과 구실잣밤나무 가지에서 46.56 mg/g 의 hydroxyproline 함량이 확인되었다(도 4 참조).
실험예 5: 구실잣밤나무 추출물 또는 이의 에틸 아세테이트 분획물의 콜라겐 생합성 효과 확인
구실잣밤나무 추출물 또는 이의 에틸 아세테이트 분획물의 콜라겐 생합성능을 알아보기 위하여 사람 섬유아세포인 CCD-986SK 세포주를 한국세포주은행으로부터 분양받아 배양하고 96 well-plate에 1×104 cells/well씩 분주하여 10% FBS/DMEM 배지로 24 시간 배양시킨 다음, 새로운 serum-free 배지와 희석하여 가시오가피 추출물을 200 μg/mL의 농도로 첨가하여, 다시 48시간동안 CO2 incubator에서 배양하였다. 배양액을 가지고 procollagen Type I C-peptide EIA kit(MK101, Takara Bio Inc., Shiga, Japan)를 이용하여 콜라겐 양을 측정하였다. 콜라겐 측정키트에 포함된 표준용액을 희석한 후 450 nm에서 흡광도를 측정하여 표준농도 곡선을 작성하고 콜라겐 생성량을 산정하였다.
콜라겐 생합성능 측정 결과 대조군의 콜라겐 생성량을 100%로 볼 때 구실잣밤나무 가지 70% EtOH 추출물은 대조군에 비해 144.5%의 콜라겐 생성 증가율을 보였다. 또한, 상기 70% EtOH 추출물의 에틸 아세테이트 분획물은 대조군에 비해 196.4%의 증가율로 유의적인 콜라겐 생성을 나타내었으며, 이는 70% EtOH 추출물보다 약 50% 높은 값으로 콜라겐을 생성하였다 (도 5 참조).

Claims (9)

  1. 구실잣밤나무(Castanopsis sieboldii) 가지의 에탄올 추출물의 에틸 아세테이트 분획물을 포함하는 피부 주름 또는 탄력 개선용 화장료 조성물.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 피부 주름 또는 탄력 개선은 콜라게나아제 효소 저해 및 콜라겐 합성 촉진으로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나에 의해 나타나는 것인, 화장료 조성물.
  7. 삭제
  8. 구실잣밤나무 가지의 에탄올 추출물의 에틸 아세테이트 분획물을 포함하는 피부 주름 또는 탄력 개선용 식품 조성물.
  9. 청구항 1에 있어서, 상기 에탄올은 70%(v/v) 에탄올인, 화장료 조성물.
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