JP6143931B1

JP6143931B1 - ロドスポリジウム・バブジェバエの新菌株、飲食品、飲食品の製造方法、皮膚化粧料、及び皮膚化粧料の製造方法

Info

Publication number: JP6143931B1
Application number: JP2016176109A
Authority: JP
Inventors: 直也 ▲高▼桑; 浩誠桑原; 美和岩竹
Original assignee: Maruzen Pharmaceutical Co Ltd; National Agriculture and Food Research Organization
Current assignee: Maruzen Pharmaceutical Co Ltd; National Agriculture and Food Research Organization
Priority date: 2016-09-09
Filing date: 2016-09-09
Publication date: 2017-06-07
Anticipated expiration: 2036-09-09
Also published as: JP2018038344A

Abstract

【課題】トルラロジンの製造効率に優れ、かつ安全性の高いロドスポリジウム・バブジェバエ（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍｂａｂｊｅｖａｅ）の提供。【解決手段】トマトを発酵させたときの発酵物における菌体あたりのトルラロジンの含有量が、０．１ｍｇ／ｇ菌体以上であることを特徴とするロドスポリジウム・バブジェバエ（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍｂａｂｊｅｖａｅ）である。前記ロドスポリジウム・バブジェバエが、ロドスポリジウム・バブジェバエ受託番号ＮＩＴＥＰ−０２２３７である態様が好ましい。【選択図】なし

Description

本発明は、トルラロジンの製造効率に優れる新菌株であるロドスポリジウム・バブジェバエ（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍｂａｂｊｅｖａｅ）、前記ロドスポリジウム・バブジェバエ（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍｂａｂｊｅｖａｅ）を含む、飲食品、飲食品の製造方法、皮膚化粧料、及び皮膚化粧料の製造方法に関する。

カロテノイドは、天然に存在する色素成分の総称であり、活性酸素を捕捉して抗酸化作用を示す。特に、植物由来のルテイン及び藻類由来のアスタキサンチンは、眼病疾患改善や皮膚のＵＶ防護作用が明らかになり、我が国でも需要量が伸びている。しかし、原料の大部分は中国等からの輸入に依存しており、低コストで自給するには、代替品の活用、及び効率的生産法の開発が技術的課題として挙げられている。
微生物、特に一部の酵母は、カロテノイド類のトルラロジン等を合成し、細胞内に蓄積することが知られている。また、トルラロジンは、生体内での過酸化脂質の生成を防止又は低下させ、生体内での酸化還元系の障害を防止又は抑制する作用を有することが知られている（例えば、特許文献１参照）。

トルラロジンの発酵生産法として、酵母の一種、ロドトルラ・グルチニス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａｇｌｕｔｉｎｉｓ）を培養し、培養菌体からβ-カロテンやトルラロジン等を含むカロテノイド類を採取する方法が提案されている（例えば、特許文献２参照）。
しかしながら、前記トルラロジンの発酵生産法では、バブリングによる通気培養を行うことにより、総カロテノイドに対するトルラロジンの生成割合を５５．８ｗｔ％まで高めることができるが、収量が低く、効率が良い方法ではなかった。

したがって、トルラロジンの製造効率に優れ、かつ安全性の高いトルラロジンの製造方法の開発が望まれている。

特開平８−３３３２４８号公報特開平６−２７７０９３号公報

本発明は、前記従来における諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、トルラロジンの製造効率に優れ、かつ安全性の高いロドスポリジウム・バブジェバエ（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍｂａｂｊｅｖａｅ）を提供することを目的とする。
また、本発明は、トルラロジンを高濃度で含有し、かつ安全性の高いロドスポリジウム・バブジェバエ（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍｂａｂｊｅｖａｅ）を含む飲食品、及び前記飲食品の製造方法を提供することを目的とする。
また、本発明は、トルラロジンを高濃度で含有し、かつ安全性の高いロドスポリジウム・バブジェバエ（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍｂａｂｊｅｖａｅ）を含む皮膚化粧料、及び前記皮膚化粧料の製造方法を提供することを目的とする。

前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。即ち、
＜１＞トマトを発酵させたときの発酵物における菌体あたりのトルラロジンの含有量が、０．１ｍｇ／ｇ菌体以上であることを特徴とするロドスポリジウム・バブジェバエ（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍｂａｂｊｅｖａｅ）である。
＜２＞ロドスポリジウム・バブジェバエ（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍｂａｂｊｅｖａｅ）受託番号ＮＩＴＥＰ−０２２３７である前記＜１＞に記載のロドスポリジウム・バブジェバエ（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍｂａｂｊｅｖａｅ）である。
＜３＞前記＜１＞から＜２＞のいずれかに記載のロドスポリジウム・バブジェバエ（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍｂａｂｊｅｖａｅ）を含有することを特徴とする飲食品である。
＜４＞リコペン含有物の発酵物であり、トルラロジンの含有量が０．００１ｍｇ／ｇ以上である前記＜３＞に記載の飲食品である。
＜５＞前記＜１＞から＜２＞のいずれかに記載のロドスポリジウム・バブジェバエ（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍｂａｂｊｅｖａｅ）を用いてリコペン含有物を発酵させ、トルラロジンを含有する飲食品を得ることを特徴とする飲食品の製造方法である。
＜６＞前記＜１＞から＜２＞のいずれかに記載のロドスポリジウム・バブジェバエ（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍｂａｂｊｅｖａｅ）を含有することを特徴とする皮膚化粧料である。
＜７＞前記＜１＞から＜２＞のいずれかに記載のロドスポリジウム・バブジェバエ（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍｂａｂｊｅｖａｅ）を用いてリコペン含有物を発酵させ、トルラロジンを含有する飲食品を得ることを特徴とする皮膚化粧料の製造方法である。

本発明によれば、従来における前記諸問題を解決し、トルラロジンの製造効率に優れ、かつ安全性の高いロドスポリジウム・バブジェバエ（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍｂａｂｊｅｖａｅ）の新菌株、並びにトルラロジンを高濃度で含有し、かつ安全性の高い前記ロドスポリジウム・バブジェバエ（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍｂａｂｊｅｖａｅ）を含む飲食品、及び皮膚化粧料、並びに前記ロドスポリジウム・バブジェバエ（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍｂａｂｊｅｖａｅ）を用いることにより、トルラロジンを高濃度で含有し、かつ安全性の高い飲食品の製造方法、及び皮膚化粧料の製造方法を提供することができる。

（ロドスポリジウム・バブジェバエの新菌株）
本発明のロドスポリジウム・バブジェバエ（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍｂａｂｊｅｖａｅ）は、トマトを発酵させたときの発酵物における菌体あたりのトルラロジンの含有量が、０．１ｍｇ／ｇ菌体以上である。
ここで、「トマトを発酵させたときの発酵物」は、トマトとしてトマトペーストを滅菌水により５倍希釈したもの（１００ｍＬ）、及び前培養したロドスポリジウム・バブジェバエを用い、２５℃、２００ｒｐｍで振盪した条件で、４８時間培養して発酵させることにより得ることができる。
また、トルラロジンの含有量は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）などの公知の方法により測定することができ、例えば、測定装置名：Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ（島津製作所製）により測定することができる。

本発明のロドスポリジウム・バブジェバエ（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍｂａｂｊｅｖａｅ）は、本発明者らが鋭意検討した結果、得られた新菌株ＴＹＣ−２２１４株であり、独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジーセンター特許微生物寄託センター（千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８１２２号室）に２０１６年４月１３日付けで寄託されており、その受託番号は、ＮＩＴＥＰ−０２２３７（受領番号：ＮＩＴＥＡＰ−０２２３７）である。また、国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構においても保有しており、許諾手続きを経て分譲可能である。

本発明のロドスポリジウム・バブジェバエは、トルラロジンの製造効率に優れ、トルラロジンを高濃度で製造することができる。前記トルラロジンは、リコペンから、γ−カロテン、及びトルレンを経て生合成されることが知られているが、本発明のロドスポリジウム・バブジェバエは、リコペン含有物を発酵させ、トルラロジンを高濃度で含有する発酵物を得ることができる。
なお、本発明のロドスポリジウム・バブジェバエは、本発明者らが、代替利用が期待されるカロテノイドとしてトルラロジンに着目し、トルラロジンを高濃度生産する酵母の選抜と効率的な発酵生産技術の開発を行い、鋭意検討した結果、得られた知見に基づくものであり、本発明者ら自らブドウから分離した酵母である。
本発明のロドスポリジウム・バブジェバエは、食品から分離した酵母であり、安全性が高く、また、トルラロジンを高濃度で製造することができるため、トルラロジンを高濃度で含有する飲食品、皮膚化粧料に好適である。
また、前記トルラロジンは、前記ロドスポリジウム・バブジェバエの新菌株を用いてリコペン含有物を発酵させて得られた発酵物から、抽出、精製等をすることにより、前記ロドスポリジウム・バブジェバエの新菌株と分離した状態で得ることができ、分離したトルラロジンを飲食品、皮膚化粧料等に利用してもよい。

本発明のロドスポリジウム・バブジェバエは、ロドスポリジウム属に属する酵母の一種であり、カロテノイド類を産生し、菌体内に蓄積することが知られている。
本発明のロドスポリジウム・バブジェバエは、上述の通り、トマトを発酵させたときの発酵物における前記ロドスポリジウム・バブジェバエの菌体あたりのトルラロジンの含有量が、０．１ｍｇ／ｇ菌体以上であることを指標として選択することができる。
本発明のロドスポリジウム・バブジェバエを培養する場合、使用できる培地としては、特に制限はなく、目的に応じて公知の酵母培養培地の中から適宜選択することができ、また、培養条件としては、特に制限はなく、目的に公知の酵母培養条件の中から適宜選択することができる。

（飲食品）
本発明の飲食品は、本発明のロドスポリジウム・バブジェバエを少なくとも含有し、更にトルラロジンを含有することが好ましく、必要に応じてその他の成分を含む。

前記飲食品における、本発明のロドスポリジウム・バブジェバエの含有量としては、特に制限は無く、用途等に応じて適宜選択することができ、トルラロジンを製造するのに十分な量であってもよいし、トルラロジンを製造した後の前記ロドスポリジウム・バブジェバエが残存するのみであってもよい。
前記飲食品に含有される本発明のロドスポリジウム・バブジェバエとしては、生菌であってもよく、殺菌された状態であってもよい。
前記飲食品に本発明のロドスポリジウム・バブジェバエが含有されていることを確認する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、１８ＳｒＲＮＡと５．８ＳｒＲＮＡ間のスペーサー領域（ＩＴＳ１）、及び２６ＳｒＲＮＡと５ＳｒＲＮＡ間のスペーサー領域（ＩＧＳ１）をＰＣＲ増幅後、シークエンス解析を行う方法などが挙げられる。

前記飲食品においては、本発明のロドスポリジウム・バブジェバエが製造するトルラロジンが熱に安定であり、オートクレーブ滅菌処理等を行っても安定なので、滅菌処理等の加熱処理を行うことが必要な飲食品であってもよく、前記飲食品の具体例としては、各種乳製品、各種パン、うどん等の麺類、各種惣菜、菓子類、ジュース等の清涼飲料、酒類、弁当類などが挙げられる。前記飲食品には、前記飲食品の原料、材料のほかに、目的に応じて適宜選択した、公知の食品添加物、調味料、着色料、保存料などのその他の成分を含有していてもよい。前記飲食品は、トルラロジンを高濃度で含有し、かつ安全性の高い点で、トルラロジンを含有する健康食品、機能性表示食品などの飲食品としての用途に好適である。
前記飲食品においては、本発明のロドスポリジウム・バブジェバエ以外に、本発明の効果を害しない範囲内で他の公知の食用菌を含んでいてもよいが、全菌が本発明のロドスポリジウム・バブジェバエであることが好ましい。
前記飲食品中に本発明のロドスポリジウム・バブジェバエを含有させる方法としては、特に制限はなく、前記飲食品の種類、目的等に応じて適宜選択することができる。

前記トルラロジンの前記飲食品における菌体あたりの含有量としては、特に制限は無く、用途等に応じて適宜選択することができるが、高含有量であることが好ましく、０．０５ｍｇ／ｇ菌体以上が好ましく、０．１ｍｇ／ｇ菌体以上がより好ましく、０．２ｍｇ／ｇ菌体以上が特に好ましい。
前記トルラロジンの前記飲食品における含有量としては、特に制限は無く、用途等に応じて適宜選択することができるが、高含有量であることが好ましく、０．０００１ｍｇ／ｇ以上が好ましく、０．００１ｍｇ／ｇ以上がより好ましく、０．００３ｍｇ／ｇ以上が特に好ましい。
前記飲食品における総カロテノイドに対する前記トルラロジンの含有量としては、特に制限は無く、用途等に応じて適宜選択することができるが、６０質量％以上が好ましく、６５質量％以上がより好ましい。
前記飲食品としては、リコペン含有物の発酵物であり、トルラロジンの含有量が０．００１ｍｇ／ｇ以上であることが好ましい。

（飲食品の製造方法）
本発明の飲食品の製造方法は、本発明のロドスポリジウム・バブジェバエを用いてリコペン含有物を発酵させ、トルラロジンを含有する飲食品を得ることを含み、更に必要に応じてその他の工程を含む。

前記飲食品の原材料としては、飲食に適する材料であれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、本発明のロドスポリジウム・バブジェバエの菌体における生合成により、トルラロジンを製造できる。これらの中でも、トルラロジンの製造効率を向上させる点で、トルラロジン生合成の原料となるリコペンを含有する、リコペン含有物であることが好ましい。
前記リコペン含有物としては、リコペンを含むものであれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、トマト、スイカ、柿、ピンクグレープフルーツなどが挙げられる。
前記リコペン含有物におけるリコペン含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、０．００５ｍｇ／ｇ以上が好ましく、０．０１ｍｇ／ｇ以上がより好ましく、０．０５ｍｇ／ｇ以上が特に好ましい。

前記飲食品の製造方法に使用する本発明のロドスポリジウム・バブジェバエの生菌数としては、リコペンからトルラロジンを生合成することができれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記飲食品の製造方法に使用する本発明のロドスポリジウム・バブジェバエとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前培養により調製したものが挙げられる。前記前培養の方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜公知の酵母の培養方法を選択することができ、例えば、酵母完全培地（ＹＰＤ培地）を用いて培養する方法などが挙げられる。

前記リコペン含有物を発酵させる方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記リコペン含有物に本発明のロドスポリジウム・バブジェバエを添加し、２５℃〜３５℃、２４時間〜９６時間、２００ｒｐｍ〜３００ｒｐｍの条件で振盪培養することにより実施することができる。

＜その他の工程＞
前記その他の工程としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜飲食品の製造における各種工程を選択することができ、例えば、滅菌工程、濃縮工程、乾燥工程などが挙げられる。

前記滅菌工程としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜飲食品の製造における公知の滅菌工程を選択することができ、例えば、加熱滅菌、濾過滅菌などが挙げられる。
前記濃縮工程としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜飲食品の製造における公知の濃縮工程を選択することができ、例えば、遠心濃縮、膜濃縮などが挙げられる。
前記乾燥工程としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜飲食品の製造における公知の乾燥工程を選択することができ、例えば、凍結乾燥、減圧乾燥などが挙げられる。

（皮膚化粧料）
本発明の皮膚化粧料は、本発明のロドスポリジウム・バブジェバエを少なくとも含有し、更にトルラロジンを含有することが好ましく、必要に応じてその他の成分を含む。
前記皮膚化粧料については、前記飲食品について記載した事項を目的に応じて適宜選択することができる。

（皮膚化粧料の製造方法）
本発明の皮膚化粧料の製造方法は、本発明のロドスポリジウム・バブジェバエを用いてリコペン含有物を発酵させ、トルラロジンを含有する皮膚化粧料を得ることを含み、更に必要に応じてその他の工程を含む。
前記皮膚化粧料の製造方法については、前記飲食品の製造方法について記載した事項を目的に応じて適宜選択することができる。

＜用途＞
本発明のロドスポリジウム・バブジェバエは、トルラロジンの製造効率に優れ、かつ安全性が高いため、トルラロジンを高濃度で含有し、かつ安全性の高いロドスポリジウム・バブジェバエを含む飲食品、及び皮膚化粧料に好適に利用できる。
本発明のロドスポリジウム・バブジェバエは、安全性に優れ、優れたＳＯＤ様作用、一酸化窒素（ＮＯ）産生抑制作用、ＶＩＩ型コラーゲン産生促進作用、ラミニン−５産生促進作用、エラスチン産生促進作用、表皮角化細胞増殖促進作用、及びグルタチオン産生促進作用を有するため、スーパーオキサイド消去剤、一酸化窒素（ＮＯ）産生抑制剤、ＶＩＩ型コラーゲン産生促進剤、ラミニン−５産生促進剤、エラスチン産生促進剤、表皮角化細胞増殖促進剤、及びグルタチオン産生促進剤として利用可能である。

以下、本発明の実施例を説明するが、本発明は、これらの実施例に何ら限定されるものではない。

ロドスポリジウム・バブジェバエ（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍｂａｂｊｅｖａｅ）の新菌株の分離
本発明のロドスポリジウム・バブジェバエ（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍｂａｂｊｅｖａｅ）ＴＹＣ−２２１４株（特許微生物寄託センターに寄託済、受託番号：ＮＩＴＥＰ−０２２３７、受領番号：ＮＩＴＥＡＰ−０２２３７）を以下のようにして分離した。
即ち、採取したヤマブドウをＹＰＤ液体培地を用いて４８時間培養後、培養液の一部をクロラムフェニコール含有のＹＰＤ寒天プレートへ塗布し、５日間培養し酵母様のコロニーを選別した。単一コロニーを釣菌し、ＹＰＤ寒天プレートへ塗布、培養を繰り返すことで単一株を分離し、ＴＹＣ−２２１４株を得た。
得られたＴＹＣ−２２１４株のコロニー色調は、赤色であった。ＴＹＣ−２２１４株の１８ＳｒＲＮＡと５．８ＳｒＲＮＡ間のスペーサー領域（ＩＴＳ１）をＰＣＲ増幅後、シークエンス解析を行ったところ、ロドスポリジウム・バブジェバエの標準株（ＣＢＳ７８０８）と１００％一致したことから、ロドスポリジウム・バブジェバエと同定した。さらに、株レベルの同定の指標となるＩＧＳ１（２６ＳｒＲＮＡと５ＳｒＲＮＡ間のスペーサー領域）をＰＣＲ増幅後、シークエンス解析を行ったところ、標準株との相同性は６４．４９％であり、挿入や置換などの相違があった。また、ＮＣＢＩが管理する塩基配列データベース上において、ＴＹＣ−２２１４株のＩＧＳ１と完全に一致する配列は登録されていなかった。

（実施例１）
培地として下記組成の酵母完全培地（ＹＰＤ培地）１，０００ｍＬ、及びロドスポリジウム・バブジェバエＴＹＣ−２２１４株として、少量のＹＰＤ培地を用いて前培養して得られたＴＹＣ−２２１４株を用い、２５℃、２００ｒｐｍで振盪した条件で、２日間培養して、実施例１の培養物を得た。
遠心分離（６，３００ｒｐｍ、１５分間）により得られた培養物から菌体を回収し、下記に示す測定方法により、菌体中のトルラロジン及び総カロテノイドの含有量を測定した。結果を表１に示す。

＜ＹＰＤ培地＞
前記ＹＰＤ培地は、酵母エキス１０ｇ、ペプトン２０ｇ、グルコース２０ｇ、蒸留水１Ｌを用いて調製し、オートクレーブにて滅菌後に使用した。

＜トルラロジン及び総カロテノイドの含有量の測定方法＞
回収した菌体にジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を加え、超音波破砕機により菌体を破砕した。これをメンブランフィルターを用いて濾過した後、ＨＰＬＣを用いて下記の条件にてトルラロジン及び総カロテノイド（トルラロジン、リコペン、トルレン、γ−カロテン、β−カロテンの合計量）を測定した。
カラム：ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｃｉｆｉｃ，ＳｙｎｃｒｏｎｉｓＣ１８，１５０×４．６ｍｍＩ．Ｄ．，５μｍ
カラム温度：３０℃
移動相：９０体積％アセトニトリル：酢酸エチル＝５０：５０（体積比）
流速：１ｍＬ／ｍｉｎ
測定波長：４５０ｎｍ
サンプル溶解液：ジメチルスルホキシド
標準品溶解液：ブチル化ヒドロキシトルエン含有ｔ−ブチルメチルエーテル−メタノール混合液

（実施例２）
実施例１において、ＹＰＤ培地に代えてリコペン含有物としてのトマトを用いたこと以外は、実施例１と同様にして培養を行い、実施例２の発酵物を得た。
なお、トマトとしては、トマトペースト（商品名：カゴメトマトペーストＣＢ、カゴメ株式会社製、リコペン含有量０．５６ｍｇ／ｇ）を滅菌水により５倍希釈したものを用いた。
実施例１と同様にして菌体中のトルラロジン及び総カロテノイドの含有量を測定した結果を表１に示す。

（比較例１）
特許文献２（特開平６−２７７０９３号公報）の実施例２の結果を比較例１として表１に併記した。

下記の試験例１〜７に示す通り、抗酸化（活性酸素消去）作用の評価として、ＳＯＤ様作用試験（試験例１）を行い、抗炎症作用の評価として、一酸化窒素（ＮＯ）産生抑制作用試験（試験例２）を行い、抗老化作用の評価として、ＶＩＩ型コラーゲン産生促進作用試験（試験例３）、ラミニン−５産生促進作用試験（試験例４）、エラスチン産生促進作用試験（試験例５）、表皮角化細胞増殖促進作用試験（試験例６）、及びグルタチオン産生促進作用試験（試験例７）を行った。

試験例１：スーパー・オキサイド・ディスムターゼ（ＳＯＤ）様作用試験
試験管に０．０５ｍｏｌ／Ｌ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０．２）２．４ｍＬ、３ｍｍｏｌ／Ｌキサンチン０．１ｍＬ、３ｍｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ０．１ｍＬ、１．５ｍｇ／ｍＬウシ血清アルブミン０．１ｍＬ、及び０．７５ｍｍｏｌ／Ｌニトロブルーテトラゾリウム０．１ｍＬを加え、これに被験試料溶液０．１ｍＬを添加し２５℃で１０分間放置した。キサンチンオキシダーゼ溶液０．１ｍＬを加え素早く攪拌し、２５℃で２０分間反応させた。その後、６ｍｍｏｌ／Ｌ塩化銅０．１ｍＬを加えて反応を停止させ、波長５６０ｎｍにおける吸光度を測定した。同様の方法で空試験を行い補正した。

スーパーオキサイド消去率の計算方法は以下の通りである。
消去率（％）＝｛１−（Ａ−Ｂ）／（Ｃ−Ｄ）｝×１００
Ａ：被験試料溶液の波長５６０ｎｍにおける吸光度
Ｂ：被験試料溶液ブランクの波長５６０ｎｍにおける吸光度
Ｃ：コントロール溶液の波長５６０ｎｍにおける吸光度
Ｄ：コントロール溶液ブランクの波長５６０ｎｍにおける吸光度

試験例２：一酸化窒素（ＮＯ）産生抑制作用試験
マウスマクロファージ細胞（ＲＡＷ２６４．７）を１０体積％ＦＢＳ含有ダルベッコＭＥＭを用いて培養した後、セルスクレーパーにより細胞を回収した。回収した細胞を３．０×１０^６細胞／ｍＬの濃度になるように１０％ＦＢＳ含有フェノールレッド不含ダルベッコＭＥＭで希釈した後、９６ウェルプレートに１ウェル当たり１００μＬずつ播種し、４時間培養した。培養終了後、培地を抜き、終濃度０．５体積％ＤＭＳＯを含む１０体積％ＦＢＳ含有フェノールレッド不含ダルベッコＭＥＭで溶解した被験試料を各ウェルに１００μＬ添加し、終濃度１μｇ／ｍＬで１０体積％ＦＢＳ含有フェノールレッド不含ダルベッコＭＥＭに溶解したリポポリサッカライド（ＬＰＳ、Ｅ．ｃｏｌｉ０１１１；Ｂ４、ＤＩＦＣＯ社）を１００μＬ加え、４８時間培養した。ＮＯ産生量は亜硝酸イオン（ＮＯ^２−）量を指標に測定した。培養終了後、各ウェルの培養液に、同量のグリス試薬（１質量％スルファニルアミド、０．１質量％Ｎ−１−ｎａｐｈｔｈｙｌｅｔｈｙｌｅｎｄｉａｍｉｎｅｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｐｒｉｄｅｉｎ５質量％リン酸溶液）を添加し、１０分間室温にて反応させた。反応後、波長５４０ｎｍにおける吸光度を測定した。ＮＯ^２−を指標として検量線を作製し、培養上清中のＮＯの産生量を求めた。

ＮＯ産生抑制率の計算方法は以下の通りである。
ＮＯ産生抑制率（％）＝｛（Ｂ−Ａ）／Ｂ｝×１００
Ａ：被験試料添加時のＮＯ量
Ｂ：被験試料無添加時のＮＯ量

試験例３：ＶＩＩ型コラーゲン産生促進作用試験
正常ヒト新生児表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）を正常ヒト表皮角化細胞増殖培地（ＫＧＭ）を用いて培養した後、トリプシン処理により細胞を回収した。回収した細胞を１×１０^５細胞／ｍＬの濃度になるようにＢＰＥ無添加ＫＧＭ（ＫＧＭ−ＢＰＥ）で希釈した後、２４ウェルプレートに１ウェル当たり５００μＬずつ播種し、１日間培養した。培養終了後、培地を抜き、ＫＧＭ−ＢＰＥで溶解した被験試料を各ウェルに５００μＬ添加し、４８時間培養した。培養終了後、各ウェルの培地中のＶＩＩ型コラーゲン量をＥＬＩＳＡ法により測定した。

ＶＩＩ型コラーゲン産生促進率の計算方法は以下の通りである。
ＶＩＩ型コラーゲン産生促進率（％）＝Ａ／Ｂ×１００
Ａ：被験試料添加時の波長４０５ｎｍにおける吸光度
Ｂ：被験試料無添加時の波長４０５ｎｍにおける吸光度

試験例４：ラミニン−５産生促進作用試験
正常ヒト新生児表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）を正常ヒト表皮角化細胞増殖培地（ＫＧＭ）を用いて培養した後、トリプシン処理により細胞を回収した。回収した細胞を１×１０^５細胞／ｍＬの濃度になるようにＢＰＥ無添加ＫＧＭ（ＫＧＭ−ＢＰＥ）で希釈した後、２４ウェルプレートに１ウェル当たり５００μＬずつ播種し、１日間培養した。培養終了後、培地を抜き、ＫＧＭ−ＢＰＥで溶解した被験試料を各ウェルに５００μＬ添加し、４８時間培養した。培養終了後、各ウェルの培地中のラミニン−５量をＥＬＩＳＡ法により測定した。

ラミニン−５産生促進率の計算方法は以下の通りである。
ラミニン−５産生促進率（％）＝Ａ／Ｂ×１００
Ａ：被験試料添加時の波長４０５ｎｍにおける吸光度
Ｂ：被験試料無添加時の波長４０５ｎｍにおける吸光度

試験例５：エラスチン産生促進作用試験
ヒト正常線維芽細胞（ＮＢ１ＲＧＢ）を１０体積％ＦＢＳ含有ダルベッコＭＥＭを用いて培養した後、トリプシン処理により細胞を回収した。回収した細胞を２．２×１０^５細胞／ｍＬの濃度に上記培地で希釈した後、９６ウェルマイクロプレートに１ウェル当たり１００μＬずつ播種し、一晩培養した。培養終了後、培地を抜き、０．２５体積％ＦＢＳ含有ダルベッコＭＥＭに溶解した被験試料を各ウェルに１５０μＬ添加し、５日間培養した。培養終了後、各ウェルの培養上清中のエラスチン量をＥＬＩＳＡ法により測定した。

エラスチン産生促進率の計算方法は以下の通りである。
エラスチン産生促進率（％）＝Ａ／Ｂ×１００
Ａ：被験試料添加時のエラスチン量
Ｂ：被験試料無添加時のエラスチン量

試験例６：表皮角化細胞増殖促進作用試験
ヒト正常皮膚線維芽細胞（ＮＢ１ＲＧＢ）を１０体積％ＦＢＳ含有α−ＭＥＭを用いて培養した後、トリプシン処理により細胞を回収した。回収した細胞を７．０×１０^４細胞／ｍＬの濃度に５体積％ＦＢＳ含有α−ＭＥＭで希釈した後、９６ウェルプレートに１ウェル当たり１００μＬずつ播種し、一晩培養した。培養終了後、５体積％ＦＢＳ含有α−ＭＥＭで溶解した被験試料を各ウェルに１００μＬ添加し、３日間培養した。皮膚線維芽細胞増殖作用は、ＭＴＴアッセイ法を用いて測定した。培養終了後、培地を抜き、終濃度０．４ｍｇ／ｍＬでＰＢＳ（−）に溶解したＭＴＴを各ウェルに１００μＬずつ添加した。２時間培養した後に、細胞内に生成したブルーホルマザンを２−プロパノール１００μＬで抽出した。抽出後、波長５７０ｎｍにおける吸光度を測定した。同時に濁度として波長６５０ｎｍにおける吸光度を測定し、両者の差をもってブルーホルマザン生成量とした。

皮膚線維芽細胞増殖促進率の計算方法は以下の通りである。
皮膚線維芽細胞増殖促進率（％）＝Ａ／Ｂ×１００
Ａ：被験試料添加時の細胞でのブルーホルマザン生成量
Ｂ：被験試料無添加時の細胞でのブルーホルマザン生成量

試験例７：グルタチオン産生促進作用試験（線維芽細胞）
ヒト正常皮膚線維芽細胞（ＮＢ１ＲＧＢ）を１０体積％ＦＢＳ含有α−ＭＥＭを用いて培養した後、トリプシン処理により細胞を回収した。回収した細胞を２．０×１０^５細胞／ｍＬの濃度に１０体積％ＦＢＳ含有α−ＭＥＭで希釈した後、４８ウェルプレートに１ウェル当たり２００μＬずつ播種し、一晩培養した。培養後、１体積％ＦＢＳ含有Ｄ−ＭＥＭで溶解した被験試料を各ウェルに２００μＬ添加し、２４時間培養した。培養終了後、各ウェルから培地を抜き、４００μＬのＰＢＳ（−）にて洗浄後、１５０μＬのＭ−ＰＥＲ（登録商標、ＰＩＥＲＣＥ社）を用いて細胞を溶解した。このうちの１００μＬを用いて総グルタチオンの定量を行った。すなわち、９６ウェルプレートに溶解した細胞抽出液１００μＬ、０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液５０μＬ、２ｍｍｏｌ／ＬＮＡＤＰＨ２５μＬ、及びグルタチオンレダクターゼ２５μＬ（終濃度１７．５ｕｎｉｔ／ｍＬ）を加え３７℃で１０分間加温した後、１０ｍｍｏｌ／Ｌ５，５’−ｄｉｔｈｉｏｂｉｓ（２−ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｏｉｃａｃｉｄ）２５μＬを加え、５分間後までの波長４１２ｎｍにおける吸光度を測定し、ΔＯＤ／ｍｉｎを求めた。総グルタチオン濃度は酸化型グルタチオンを用いて作成した検量線をもとに算出した。得られた値は総タンパク量当たりのグルタチオン量に補正した後、下記式に従いグルタチオン産生促進率を算出した。

グルタチオン産生促進率（％）＝Ａ／Ｂ×１００
Ａ：被験試料無添加時の細胞中における総タンパク量当たりのグルタチオン量
Ｂ：被験試料添加時の細胞中における総タンパク量当たりのグルタチオン量

本発明のロドスポリジウム・バブジェバエは、トルラロジンの製造効率に優れ、かつ安全性が高いため、トルラロジンを高濃度で含有し、かつ安全性の高いロドスポリジウム・バブジェバエを含む飲食品、及び皮膚化粧料に好適に利用できる。

ＮＩＴＥＰ−０２２３７

Claims

トマトを発酵させたときの発酵物における菌体あたりのトルラロジンの含有量が、０．１ｍｇ／ｇ菌体以上であり、ロドスポリジウム・バブジェバエ（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍｂａｂｊｅｖａｅ）受託番号ＮＩＴＥＰ−０２２３７であることを特徴とするロドスポリジウム・バブジェバエ（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍｂａｂｊｅｖａｅ）。
請求項１に記載のロドスポリジウム・バブジェバエ（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍｂａｂｊｅｖａｅ）を含有することを特徴とする飲食品。
リコペン含有物の発酵物であり、トルラロジンの含有量が０．００１ｍｇ／ｇ以上である請求項２に記載の飲食品。
請求項１に記載のロドスポリジウム・バブジェバエ（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍｂａｂｊｅｖａｅ）を用いてリコペン含有物を発酵させ、トルラロジンを含有する飲食品を得ることを特徴とする飲食品の製造方法。
請求項１に記載のロドスポリジウム・バブジェバエ（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍｂａｂｊｅｖａｅ）を含有することを特徴とする皮膚化粧料。
請求項１に記載のロドスポリジウム・バブジェバエ（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍｂａｂｊｅｖａｅ）を用いてリコペン含有物を発酵させ、トルラロジンを含有する皮膚化粧料を得ることを特徴とする皮膚化粧料の製造方法。