JP2010110248A - スーパーオキシドディスムターゼを用いるアセトアルデヒド分解方法 - Google Patents
スーパーオキシドディスムターゼを用いるアセトアルデヒド分解方法 Download PDFInfo
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Abstract
本発明の目的は、コスト面や安全面において優れた特性を有する、酵素を用いたアセトアルデヒドの除去方法を提供することである。
【解決手段】
Gluconobacter属菌由来のアセトアルデヒド分解活性を有するスーパーオキシドディスムターゼを用いることにより、コスト面や安全面において優れた分解方法が提供される。さらにカタラーゼを併存させることにより、過酸化水素を発生しないアセトアルデヒドの分解方法が提供される。
【選択図】なし
Description
本発明は、Gluconobacter属菌由来のアセトアルデヒド分解活性を有するスーパーオキシドディスムターゼ(以下、「SOD」という。)を用いるアセトアルデヒドの分解方法である。
Gluconobacter属菌
Gluconobacter属菌であって、アセトアルデヒド分解活性を有するSODを含むものであれば、何ら制限なく用いることができる。代表例として、Gluconobacter oxydans JCM7642株またはその変異株が挙げられる。変異株は、従来からよく用いられている変異剤であるエチルメタンスルホン酸による変異処理、ニトロソグアニジン、メチルメタンスルホン酸などの他の化学物質処理、紫外線照射、あるいは変異剤処理なしで得られる、いわゆる自然突然変異によって取得することも可能である。
SOD
本発明の分解方法には、アセトアルデヒド分解活性を有するSODが必須である。しかし、そのようなSODを有していれば、Gluconobacter属菌の菌体であっても、SODの酵素抽出液または精製されたSODであっても用いることができる。
アセトアルデヒドの分解
本発明のアセトアルデヒドの分解には、Gluconobacter属菌由来のアセトアルデヒド分解活性を有するSODを用いる。上述のように、本発明の分解方法にはアセトアルデヒド分解活性を有するSODが必須であるが、そのようなSODを有していればGluconobacter属菌の菌体であっても、SODの酵素抽出液または精製されたSODであっても用いることができる。
(2)分解剤
本発明は、Gluconobacter属菌由来のアセトアルデヒド分解活性を有するSODを含むアセトアルデヒド分解剤である。
(3)食品または飲料中のアセトアルデヒド濃度の低減方法
本発明は、飲食品にGluconobacter属菌由来のアセトアルデヒド分解活性を有するSODを添加することを特徴とする、飲食品中のアセトアルデヒド濃度の低減方法である。
[実施例1] Gluconobacter oxydansの培養
Gluconobacter oxydansJCM7642株をグルコン酸培地 [グルコン酸ナトリウム、20 g/L;グルコース、3 g/L;酵母エキス、3 g/L;ペプトン、2 g/L] 50 mlで30℃3日間前培養し、培養液10 mLを前培養時と同組成の培地1 Lに加え、30℃3 日間培養した。菌体は、3,000×gの遠心分離により回収した。
[実施例2] 活性測定
反応液中のアセトアルデヒド濃度はMBTH法またはヘッドスペースガスクロマトグラフ法によって測定した。
Gluconobacter oxydans JCM7642の菌体1 gを100 mM KPB (pH 7.0)に懸濁し、細胞を超音波破砕した(強度2、50サイクル、5分間)。遠心分離により上清を回収後、同緩衝液に対して4℃で十分に透析した。透析内液のタンパク濃度は3.24 mg/mLであった。アセトアルデヒド(終濃度、25μM、50μM、および100μM)、25 mMリン酸カリウム緩衝液(KPB)、酵素(タンパク量、0.1 mg)を含む反応液(500μL)を調製し、37℃で1時間反応させた。密栓した容器中で反応液を98℃で2分間加熱することにより、酵素反応を停止した。酵素非添加である以外は上と同一の組成の反応液について同じ処理を行なったものをコントロールとした。予備実験により、アセトアルデヒドは98℃で2分間の加熱処理により分解しないことは確認済である。反応液中に残存するアセトアルデヒドをヘッドスペースガスクロマトグラフ法により定量した。その結果を表1に示す。酵素添加群においてアセトアルデヒドは完全に分解されていた。
アセトアルデヒド(終濃度、 50μM)、25 mM KPB、酵素(タンパク量、0.01 mg)を含む反応液(500μL)を調製し、37℃で反応させた。反応開始1分後、3分後、5分後、1時間後に、密栓した容器中で反応液を98℃で2分間加熱することにより、酵素反応を停止した。酵素非添加である以外は上と同一の組成の反応液をコントロールとした。反応液中に残存するアセトアルデヒドをヘッドスペースガスクロマトグラフ法により定量した。その結果を図2に示す。
実施例3で記載したのと同様な方法によりGluconobacter oxydans JCM7642の細胞抽出液(タンパク濃度1.46mg/mL)を調製した。20μMピリドキサルリン酸を含む10mMリン酸カリウム緩衝液(pH 7)40μLとGluconobacter oxydansの細胞抽出液10μLを混合し、37℃で10分間インキュベートした。50μLの0.5%TFA溶液を添加し反応を停止し、ODP2-HP-4Eカラム(SHODEX社製)を用いた逆相高速液体クロマトグラフィー(移動相、50mMリン酸ナトリウム緩衝液、 pH 2;流速、0.6 mL/min;検出、280 nmにおける吸光度変化)により反応液中のピリドキサルリン酸を定量した。 反応液中のピリドキサルリン酸をGluconobacter oxydans細胞抽出液の添加系および無添加系で比較したところ、Gluconobacter oxydansの細胞抽出液の添加の有無に関わらずピリドキサルリン酸のピーク面積は全く変化せず、ピリドキサルリン酸への作用は認められなかった。
実施例3で記載したのと同様な方法により Gluconobacter oxydans JCM7642細胞抽出液(タンパク質濃度、1.0 mg/ml)を調製した。1 mM アセトアルデヒド、0.15 M NaClを含有する0.01 M KPB(pH 7.0)6.0 mLとGluconobacter oxydans 細胞抽出液0.6 mLを混合し、37℃でインキュベートした。0、 2、 5、 10、 30 分後に1.1 mLずつサンプリングし、密栓して100℃で2分間熱処理した。予備実験により、アセトアルデヒドや過酸化水素は98℃で2分間の加熱処理により分解しないことを確認済である。氷冷後、遠心分離にかけ、得られた上清のうち0.5 mLはヘッドスペースガスクロマトグラフによるアセトアルデヒド定量に供した。残りの上清0.6 mlに20 mM 2,4-ジクロロフェノール0.05 mL、 20 mM 4-アミノアンチピリン0.05 mL、水0.2 mL、10 mg/mL西洋ワサビペルオキシダーゼ0.1 mLを添加・混合し、この反応液の505 nmにおける吸光度が一定値を示すまで、室温で20分間インキュベートした。505 nmにおける吸光度の増加から反応液に含まれる過酸化水素の濃度を見積もった。なお、この方法による過酸化水素の検出限界は0.5μM(0.02 ppm)である。
本実験の結果を図3に示す。アセトアルデヒドの分解の過程で、過酸化水素の蓄積はまったく認められなかった。
実施例3で記載したのと同様な方法によりGluconobacter oxydans JCM7642細胞抽出液(タンパク質濃度、1.0 mg/mL)を調製した。0.05 mM 過酸化水素、0.15 M NaClを含有する0.01 M KPB(pH 7.0)6.0 mlとGluconobacter oxydans 細胞抽出液0.6 mLを混合し、37℃でインキュベートした。0、 2、 5、 10、 30 分後に1.1 mLずつサンプリングし、密栓して100℃で2分間熱処理した。氷冷後、遠心分離にかけ、得られた上清の0.6 mlに20 mM 2,4-ジクロロフェノール0.05 mL、 20 mM 4-アミノアンチピリン0.05 mL、水0.2 mL、10 mg/mL西洋ワサビペルオキシダーゼ0.1 mLを添加し、この反応液の505 nmにおける吸光度が一定値を示すまで、室温で20分間インキュベートした。505 nmにおける吸光度の増加から反応液に含まれる過酸化水素の濃度を見積もった。その結果、添加した過酸化水素は即座に分解され、過酸化水素添加直後以降のすべての反応液中の過酸化水素濃度は、本方法の検出限界0.5μM(0.02 ppm)以下であった。
Gluconobacter oxydans JCM7642の合計30 L分の培養を行い、湿重量約36 gの菌体を得た。培養菌体は酵素精製まで-30℃にて保存した。アセトアルデヒド分解酵素アッセイは、2 mM アセトアルデヒドを含む20 mM KPB (pH 7.0、 400 μL) 中で、30℃で20分間行った。反応液中のアセトアルデヒド濃度はMBTH法またはヘッドスペースガスクロマトグラフ法によって測定した。
精製酵素標品をSDS-PAGEに供した後、分離されたタンパクをシーケ・ブロットPVDFメンブレン (Bio-Rad) に転写した。CBBによるタンパク染色後、メンブレンを乾燥させ、22 kDaのタンパクバンドを切り出し、エドマン分解によりそのN末端アミノ酸配列を決定した。その結果、AFELPPLPYAという配列が得られた(アミノ酸一文字表記)。このアミノ酸配列を持つタンパクをGluconobacter oxydans 621H株のゲノム配列からサーチしたところ、鉄型SODと帰属されたタンパク質のみに同一配列が存在することがわかった。この酵素は202アミノ酸残基からなり、N末端にMAFELPPLPYA (下線部は今回のアミノ酸解析と一致) という配列をもつ。また一次配列(図5)から予想される分子質量は22.5 kDaであり、今回得られたタンパクの分子質量とほぼ一致した。
[発明の効果]
以上記載したように、本発明の分解方法は、以下の点で有益な方法である:1)安全性が保証された微生物由来の酵素を用いる点、および過酸化水素をはじめとする活性酸素の蓄積がまったくなく点で極めて安全な方法である;2)アルデヒド型ビタミンを分解しない;3)本発明に用いる酵素は水に可溶であり、酵素剤として製品化した際は食品中で容易に溶解し、製品中にまんべんなく行き渡り、効率的にアセトアルデヒド分解効果が現れる;4)NAD等の高価な酸化型補酵素が不要である;5)食品や唾液中のアセトアルデヒドの除去剤として従来から提案されてきたL-システインや大麦青汁とは異なり、微量で効果を発揮し、官能評価や嗜好性に大きな影響を与えない。
Claims (10)
- Gluconobacter属菌由来のアセトアルデヒド分解活性を有するスーパーオキシドディスムターゼを用いることを特徴とする、アセトアルデヒドの分解方法。
- Gluconobacter属菌由来のアセトアルデヒド分解活性を有するスーパーオキシドディスムターゼおよびカタラーゼを用いることを特徴とする、過酸化水素を発生しないアセトアルデヒドの分解方法。
- Gluconobacter属菌がGluconobacter oxydansである、請求項1または2記載の分解方法。
- Gluconobacter oxydansがGluconobacter oxydans JCM7642株またはその変異株である、請求項3記載の分解方法。
- Gluconobacter属菌由来のアセトアルデヒド分解活性を有するスーパーオキシドディスムターゼを含む、アセトアルデヒド分解剤。
- Gluconobacter属菌がGluconobacter oxydans である、請求項5の分解剤。
- Gluconobacter oxydansがGluconobacter oxydans JCM7642株またはその変異株である、請求項6記載の分解剤。
- 飲食品に、Gluconobacter属菌由来のアセトアルデヒド分解活性を有するスーパーオキシドディスムターゼを添加することを特徴とする、飲食品中のアセトアルデヒド濃度の低減方法。
- Gluconobacter属菌がGluconobacter oxydans である、請求項8記載の方法。
- Gluconobacter oxydansがGluconobacter oxydans JCM7642株またはその変異株である、請求項9記載の方法。
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