JP2017195807A - 酢酸菌培養液、およびその製造方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】増殖性が高く、かつアルデヒド酸化能を効率的に高められた酢酸菌培養液、およびその製造方法を提供する。【解決手段】コマガタエイバクター・ハンセニイ（Komagataeibacter hansenii）、グルコンアセトバクター・リックウェフェシエンス（Gluconacetobacter liquefaciens）、コマガタエイバクター・マルタセティ（Komagataeibacter maltaceti）、コマガタエイバクター・メデリネンシス（Komagataeibacter medellinensis）から選ばれる１種または２種以上の酢酸菌を含む酢酸菌培養液であって、前記酢酸菌培養液の波長６６０ｎｍにおける濁度（ＯＤ６６０ｎｍ）が１〜１０であり、前記酢酸菌培養液１５ｍＬあたりのアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性が４〜６０である、酢酸菌培養液。【選択図】なし
Description
本発明は、増殖能が高く、かつアルデヒド酸化能が効率的に高められた酢酸菌培養液、およびその製造方法に関する。
炭素数１〜１０のアルデヒドは、酸化力に富み、生体にとって有害であることが知られている。特に、アセトアルデヒドが、飲酒時の悪酔いを引き起こすことはよく知られている。また、多くのアルデヒドは特有の臭気を示し、特に、オクタナールやノネナールは「加齢臭」の原因物質であることが明らかにされている。
上述の不飽和アルデヒドを効果的に除去することが望まれており、アルデヒドデヒドロゲナーゼと、該アルデヒドデヒドロゲナーゼが結合している細胞膜との複合体とを有効成分とする酵素剤が報告されている（特許文献１）。
しかしながら、前記酵素剤については、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性は高く保たれているが、酢酸菌自体の増殖性については検討されておらず、十分ではなかった。
そこで、本発明の目的は、増殖能が高く、かつアルデヒド酸化能が効率的に高められた酢酸菌培養液、およびその製造方法を提供するものである。
本発明者等は、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、特定濃度のエタノールおよび酢酸を含む培養液で酢酸菌の培養を開始したところ、意外にも増殖能が高く、かつアルデヒド酸化能が効率的に高められた酢酸菌培養液が得られることを見出し、本発明を完成するに至った。
つまり、本願発明は、
（１）コマガタエイバクター・ハンセニイ（Komagataeibacter hansenii）、グルコンアセトバクター・リックウェフェシエンス（Gluconacetobacter liquefaciens）、コマガタエイバクター・マルタセティ（Komagataeibacter maltaceti）、コマガタエイバクター・メデリネンシス（Komagataeibacter medellinensis）から選ばれる１種または２種以上の酢酸菌を含む酢酸菌培養液であって、
前記酢酸菌培養液の波長６６０ｎｍにおける濁度（ＯＤ６６０ｎｍ）が１〜１０であり、
前記酢酸菌培養液１５ｍＬあたりのアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性が４〜６０である、
酢酸菌培養液、
（２）エタノール濃度０％以上３％未満、酢酸濃度０％以上１．５％未満を含む培養液で培養を開始する、
酢酸菌培養液の製造方法、
（３）（２）の酢酸菌培養液の製造方法において、
培養液中のエタノール濃度と酢酸濃度の合計が０％以上２．０％未満である、
酢酸菌培養液の製造方法、
（４）（２）又は（３）の酢酸菌培養液の製造方法において、
培養液中にグリセロール、ソルビトール、またはマンニトールから選ばれる１種または又は２種以上の糖アルコールを含む、
酢酸菌培養液の製造方法、
（５）（１）の酢酸菌培養液またはその乾燥物を含む、
アルデヒドデヒドロゲナーゼ組成物、
（６）（２）乃至（４）の酢酸菌培養液の製造方法で得られる酢酸菌培養液またはその乾燥物を含む、
アルデヒドデヒドロゲナーゼ組成物の製造方法、
である。
（１）コマガタエイバクター・ハンセニイ（Komagataeibacter hansenii）、グルコンアセトバクター・リックウェフェシエンス（Gluconacetobacter liquefaciens）、コマガタエイバクター・マルタセティ（Komagataeibacter maltaceti）、コマガタエイバクター・メデリネンシス（Komagataeibacter medellinensis）から選ばれる１種または２種以上の酢酸菌を含む酢酸菌培養液であって、
前記酢酸菌培養液の波長６６０ｎｍにおける濁度（ＯＤ６６０ｎｍ）が１〜１０であり、
前記酢酸菌培養液１５ｍＬあたりのアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性が４〜６０である、
酢酸菌培養液、
（２）エタノール濃度０％以上３％未満、酢酸濃度０％以上１．５％未満を含む培養液で培養を開始する、
酢酸菌培養液の製造方法、
（３）（２）の酢酸菌培養液の製造方法において、
培養液中のエタノール濃度と酢酸濃度の合計が０％以上２．０％未満である、
酢酸菌培養液の製造方法、
（４）（２）又は（３）の酢酸菌培養液の製造方法において、
培養液中にグリセロール、ソルビトール、またはマンニトールから選ばれる１種または又は２種以上の糖アルコールを含む、
酢酸菌培養液の製造方法、
（５）（１）の酢酸菌培養液またはその乾燥物を含む、
アルデヒドデヒドロゲナーゼ組成物、
（６）（２）乃至（４）の酢酸菌培養液の製造方法で得られる酢酸菌培養液またはその乾燥物を含む、
アルデヒドデヒドロゲナーゼ組成物の製造方法、
である。
本発明によれば、増殖能が高く、かつアルデヒド酸化能が効率的に高められた酢酸菌培養液、およびその製造方法を提供できる。
以下、本発明を詳細に説明する。なお、本発明において、「％」は「質量％」を、「部」は「質量部」を意味する。
＜本発明の特徴＞
本発明は、コマガタエイバクター・ハンセニイ（Komagataeibacter hansenii）、グルコンアセトバクター・リックウェフェシエンス（Gluconacetobacter liquefaciens）、コマガタエイバクター・マルタセティ（Komagataeibacter maltaceti）、コマガタエイバクター・メデリネンシス（Komagataeibacter medellinensis）から選ばれる１種または２種以上の酢酸菌を含む酢酸菌培養液であって、
前記酢酸菌培養液の波長６６０ｎｍにおける濁度（ＯＤ６６０ｎｍ）が１〜１０であり、
前記酢酸菌培養液１５ｍＬあたりのアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性が４〜６０である、
酢酸菌培養液である。
本発明は、コマガタエイバクター・ハンセニイ（Komagataeibacter hansenii）、グルコンアセトバクター・リックウェフェシエンス（Gluconacetobacter liquefaciens）、コマガタエイバクター・マルタセティ（Komagataeibacter maltaceti）、コマガタエイバクター・メデリネンシス（Komagataeibacter medellinensis）から選ばれる１種または２種以上の酢酸菌を含む酢酸菌培養液であって、
前記酢酸菌培養液の波長６６０ｎｍにおける濁度（ＯＤ６６０ｎｍ）が１〜１０であり、
前記酢酸菌培養液１５ｍＬあたりのアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性が４〜６０である、
酢酸菌培養液である。
＜酢酸菌＞
酢酸菌は、糖や糖アルコールを利用して生育し、エタノールを酸化して酢酸を生成する微生物の総称である。醸造酢の製造に使用される代表的な酢酸菌の種類として、アセトバクター（Acetobacter）属、グルコノバクター（Gluconobacter）属、グルコンアセトバクター（Gluconacetobacter）属、コマガタエイバクター（Komagataeibacter）属等がある。
本発明において、増殖能およびアルデヒド酸化能が効率的に高められた酢酸菌培養液が得られることから、コマガタエイバクター・ハンセニイ（Komagataeibacter hansenii）、グルコンアセトバクター・リックウェフェシエンス（Gluconacetobacter liquefaciens）、コマガタエイバクター・マルタセティ（Komagataeibacter maltaceti）、コマガタエイバクター・メデリネンシス（Komagataeibacter medellinensis）から選ばれる１種または２種以上を用いる。
酢酸菌は、糖や糖アルコールを利用して生育し、エタノールを酸化して酢酸を生成する微生物の総称である。醸造酢の製造に使用される代表的な酢酸菌の種類として、アセトバクター（Acetobacter）属、グルコノバクター（Gluconobacter）属、グルコンアセトバクター（Gluconacetobacter）属、コマガタエイバクター（Komagataeibacter）属等がある。
本発明において、増殖能およびアルデヒド酸化能が効率的に高められた酢酸菌培養液が得られることから、コマガタエイバクター・ハンセニイ（Komagataeibacter hansenii）、グルコンアセトバクター・リックウェフェシエンス（Gluconacetobacter liquefaciens）、コマガタエイバクター・マルタセティ（Komagataeibacter maltaceti）、コマガタエイバクター・メデリネンシス（Komagataeibacter medellinensis）から選ばれる１種または２種以上を用いる。
＜酢酸菌培養液＞
本発明の酢酸菌培養液とは、酢酸菌を含む培養液であればよく、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有していれば死菌でも生菌でもよい。
本発明の酢酸菌培養液とは、酢酸菌を含む培養液であればよく、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有していれば死菌でも生菌でもよい。
また、本発明の酢酸菌培養液は、培養液をそのまままたは乾燥処理して、アルデヒドデヒドロゲナーゼ組成物として使用することができる。ここで、アルデヒドデヒドロゲナーゼ組成物としては、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有する食品、化粧品、又は医薬品組成物等をいう。
＜増殖能について＞
＜濁度＞
本発明の酢酸菌培養液は、培養液を分光光度計にて波長６６０ｎｍで測定した時の濁度（ＯＤ６６０ｎｍ）が１〜１０であり、さらに２〜１０であるとよい。
＜濁度＞
本発明の酢酸菌培養液は、培養液を分光光度計にて波長６６０ｎｍで測定した時の濁度（ＯＤ６６０ｎｍ）が１〜１０であり、さらに２〜１０であるとよい。
ここで、濁度（ＯＤ６６０ｎｍ）は、菌数を表す指標として一般的に用いられ、菌数が多くなるほど濁度の値が高くなる。
＜アルデヒド酸化能について＞
＜アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性＞
本発明において、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性（以下、ＡＬＤＨ活性という。）とは、アセトアルデヒドを酸化することに伴いフェリシアン化カリウムからフェロシアン化第２鉄を生成させる場合の該フェロシアン化第２鉄の水溶液の吸光度（６６０ｎｍ）である。この時の吸光度を、以下、吸光度（ＡＬＤＨ活性）とする。
このアルデヒドヒドロゲナーゼ活性は、より具体的には、Ｗｏｏｄらによるフェリシアナイドを電子受容体とする方法（Methods in Enzymology,Volume5,1962,Page287−291）に準じて、次のように計測することができる。
＜アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性＞
本発明において、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性（以下、ＡＬＤＨ活性という。）とは、アセトアルデヒドを酸化することに伴いフェリシアン化カリウムからフェロシアン化第２鉄を生成させる場合の該フェロシアン化第２鉄の水溶液の吸光度（６６０ｎｍ）である。この時の吸光度を、以下、吸光度（ＡＬＤＨ活性）とする。
このアルデヒドヒドロゲナーゼ活性は、より具体的には、Ｗｏｏｄらによるフェリシアナイドを電子受容体とする方法（Methods in Enzymology,Volume5,1962,Page287−291）に準じて、次のように計測することができる。
＜ＡＬＤＨ活性の計測方法＞
即ち、培養停止後の培養液に遠心分離処理を行い、酢酸菌体を回収する。次に、50mMリン酸カリウムバッファー（pH6.5）で任意に希釈した酢酸菌分散液と、マックルベイン緩衝液（ｐＨ５）、アセトアルデヒド０．０２ｍｍｏｌ、フェリシアン化カリウム０．０１ｍｍｏｌを含む水溶液１ｍＬを２５℃で５分〜２０分保持することにより、酢酸菌分散液中のアルデヒドデヒドロゲナーゼをアルデヒドに反応させてアルデヒドを酸化し、この酸化の副反応として、フェリシアン化カリウムをフェロシアン化第２鉄（プルシアンブルー）に還元する。この反応を、Ｄｕｐａｎｏｌ液０．５ｍＬを加えて停止し、さらに蒸留水３．５ｍＬを加え、フェロシアン化第２鉄（プルシアンブルー）の６６０ｎｍの吸光度を計測する。この場合、ブランク試験として、酢酸菌体分散液を配合していない試料を測定する。
即ち、培養停止後の培養液に遠心分離処理を行い、酢酸菌体を回収する。次に、50mMリン酸カリウムバッファー（pH6.5）で任意に希釈した酢酸菌分散液と、マックルベイン緩衝液（ｐＨ５）、アセトアルデヒド０．０２ｍｍｏｌ、フェリシアン化カリウム０．０１ｍｍｏｌを含む水溶液１ｍＬを２５℃で５分〜２０分保持することにより、酢酸菌分散液中のアルデヒドデヒドロゲナーゼをアルデヒドに反応させてアルデヒドを酸化し、この酸化の副反応として、フェリシアン化カリウムをフェロシアン化第２鉄（プルシアンブルー）に還元する。この反応を、Ｄｕｐａｎｏｌ液０．５ｍＬを加えて停止し、さらに蒸留水３．５ｍＬを加え、フェロシアン化第２鉄（プルシアンブルー）の６６０ｎｍの吸光度を計測する。この場合、ブランク試験として、酢酸菌体分散液を配合していない試料を測定する。
＜培養液１５ｍＬあたりのＡＬＤＨ活性＞
本発明の酢酸菌培養液は、培養液１５ｍＬあたりのアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性（ＡＬＤＨ活性）が４〜６０であり、さらに１５〜６０であるとよい。
培養液１５ｍＬあたりのＡＬＤＨ活性は、前述の吸光度（ＡＬＤＨ活性）を用いて、以下の計算式（式１）により算出した。
（式１）培養液１５ｍＬあたりのアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性＝吸光度（ＡＬＤＨ活性）×希釈率
なお、希釈率は、培養液１５ｍＬ分の湿菌体を１ｍＬに溶解した場合の希釈率を１として換算したものである。
本発明の酢酸菌培養液は、培養液１５ｍＬあたりのアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性（ＡＬＤＨ活性）が４〜６０であり、さらに１５〜６０であるとよい。
培養液１５ｍＬあたりのＡＬＤＨ活性は、前述の吸光度（ＡＬＤＨ活性）を用いて、以下の計算式（式１）により算出した。
（式１）培養液１５ｍＬあたりのアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性＝吸光度（ＡＬＤＨ活性）×希釈率
なお、希釈率は、培養液１５ｍＬ分の湿菌体を１ｍＬに溶解した場合の希釈率を１として換算したものである。
＜アルデヒドデヒドロゲナーゼ比活性＞
本発明の酢酸菌培養液に含まれる酢酸菌のアルデヒドデヒドロゲナーゼ比活性は１〜１０Ｕ／ｍｇであるとよく、さらに１〜５Ｕ／ｍｇであるとよい。
本発明の酢酸菌培養液に含まれる酢酸菌のアルデヒドデヒドロゲナーゼ比活性は１〜１０Ｕ／ｍｇであるとよく、さらに１〜５Ｕ／ｍｇであるとよい。
ここで、アルデヒドデヒドロゲナーゼ比活性（以下、ＡＬＤＨ比活性という。）とは、酢酸菌由来の蛋白質１ｍｇあたりのＡＬＤＨ活性のことをいう。
ＡＬＤＨ比活性は、アセトアルデヒド1μmolが酸化されるときの、プルシアンブルーの生成による、６６０ｎｍの吸光度の変化が４であることと、前述の吸光度（ＡＬＤＨ活性）を用いて以下の計算式（式２）により算出した。
（式２）ＡＬＤＨ比活性（Ｕ／ｍｇ）=吸光度（ＡＬＤＨ活性）×4÷反応時間(分)×全容量÷サンプル量÷サンプル中のタンパク質濃度（ｍｇ／ｍＬ)
なお、ここで用いる吸光度（ＡＬＤＨ活性）は、遠心分離で酢酸菌体を回収後、50mMリン酸カリウムバッファー（pH6.5）で希釈し、フレンチプレスにて菌体を破壊し、酢酸菌体膜分散液を用いて吸光度を測定している。
ＡＬＤＨ比活性は、アセトアルデヒド1μmolが酸化されるときの、プルシアンブルーの生成による、６６０ｎｍの吸光度の変化が４であることと、前述の吸光度（ＡＬＤＨ活性）を用いて以下の計算式（式２）により算出した。
（式２）ＡＬＤＨ比活性（Ｕ／ｍｇ）=吸光度（ＡＬＤＨ活性）×4÷反応時間(分)×全容量÷サンプル量÷サンプル中のタンパク質濃度（ｍｇ／ｍＬ)
なお、ここで用いる吸光度（ＡＬＤＨ活性）は、遠心分離で酢酸菌体を回収後、50mMリン酸カリウムバッファー（pH6.5）で希釈し、フレンチプレスにて菌体を破壊し、酢酸菌体膜分散液を用いて吸光度を測定している。
＜ユビキノールオキシダーゼ比活性＞
本発明の酢酸菌培養液に含まれる酢酸菌のユビキノールオキシダーゼ比活性は１〜１０Ｕ／ｍｇであるとよく、さらに１〜５Ｕ／ｍｇであるとよい。
本発明の酢酸菌培養液に含まれる酢酸菌のユビキノールオキシダーゼ比活性は１〜１０Ｕ／ｍｇであるとよく、さらに１〜５Ｕ／ｍｇであるとよい。
ここで、ユビキノールオキシダーゼ比活性（以下、Ｑ１Ｈ２比活性という。）とは、ユビキノール-1（Ｑ１Ｈ２）のユビキノン-1（Ｑ１）への変換であり、酢酸菌由来の蛋白質１ｍｇあたりのＵ（ユニット）である。ALDHがアセトアルデヒドを酸化する際、Q1がQ1H2へと変化する。Q1H2をQ1に戻すのがユビキノールオキシダーゼであり、2つの酵素は共役して働いている。
＜Ｑ１Ｈ２比活性の計測方法＞
Ｑ１Ｈ２比活性の計測方法としては、Q1H2がQ1へと変化したときのQ1の吸収を275nmの波長で測定する。具体的には、マッキルベイン緩衝液990μL、4％Tween20 5μL、および菌体膜分散溶液5μLを混合し、ブランクの吸光度を測定する。この混合液に50mM Q1H2を1μL加え、吸光度を測定する。Ｑ１Ｈ２比活性は、以下の計算式（式３）により算出した。
（式３）Ｑ１Ｈ２比活性（Ｕ／ｍｇ）=1minあたりの吸光度変化量÷Q1 1mMあたりの吸収（12.25mM-1）×全容量(1000μL)÷サンプル量(5μL)×サンプル希釈倍率(50)÷タンパク質濃度（ｍｇ／ｍＬ）
Ｑ１Ｈ２比活性の計測方法としては、Q1H2がQ1へと変化したときのQ1の吸収を275nmの波長で測定する。具体的には、マッキルベイン緩衝液990μL、4％Tween20 5μL、および菌体膜分散溶液5μLを混合し、ブランクの吸光度を測定する。この混合液に50mM Q1H2を1μL加え、吸光度を測定する。Ｑ１Ｈ２比活性は、以下の計算式（式３）により算出した。
（式３）Ｑ１Ｈ２比活性（Ｕ／ｍｇ）=1minあたりの吸光度変化量÷Q1 1mMあたりの吸収（12.25mM-1）×全容量(1000μL)÷サンプル量(5μL)×サンプル希釈倍率(50)÷タンパク質濃度（ｍｇ／ｍＬ）
＜アルデヒドオキシダーゼ比活性＞
本発明の酢酸菌培養液に含まれる酢酸菌のアルデヒドオキシダーゼ比活性は１〜１０Ｕ／ｍｇであるとよく、さらに１〜５Ｕ／ｍｇであるとよい。
本発明の酢酸菌培養液に含まれる酢酸菌のアルデヒドオキシダーゼ比活性は１〜１０Ｕ／ｍｇであるとよく、さらに１〜５Ｕ／ｍｇであるとよい。
ここで、アルデヒドオキシダーゼ比活性（以下、オキシダーゼ比活性という。）とは、アセトアルデヒドが酸化されるにともなって還元されたユビキノンを、酸素を使って再酸化する際の酸素の消費量である。
＜アルデヒドオキシダーゼ比活性の計測方法＞
オキシダーゼ比活性の具体的な計測方法としては、酵素溶液に基質（アルデヒド）を入れた時に、酸化するために使用した酸素を測定する。
専用の小さなガラス容器を使う。外側(ジャケット)に恒温水(25℃)、内側に反応溶液を入れることができる。底をスターラ―で撹拌できる。口は酸素測定電極がぴったりはまる大きさになっている。
マッキルベイン緩衝液1400μLを容器の中に入れ、容器中の気泡を除去し、泡を入れないように電極を差し込み、ブランクの酸素消費量を測定した。
緩衝液中の酸素の総量を測定するため、ジチオナイト(薬さじ小1杯)を入れて測定した。
サンプル測定は、緩衝液に菌体膜分散溶液10μL、1Mアセトアルデヒド溶液90μLを入れて測定した。オキシダーゼ比活性は、以下の計算式（式４）により算出した。
（式４）オキシダーゼ比活性（Ｕ／ｍｇ）=25℃での溶存酸素量(498 n atom/mL)×1minあたりの酸素消費量÷緩衝液中の酸素消費量×全容量(1500μL) ÷サンプル量(10μL) ×サンプル希釈倍率(10)÷タンパク質濃度（ｍｇ／ｍＬ
オキシダーゼ比活性の具体的な計測方法としては、酵素溶液に基質（アルデヒド）を入れた時に、酸化するために使用した酸素を測定する。
専用の小さなガラス容器を使う。外側(ジャケット)に恒温水(25℃)、内側に反応溶液を入れることができる。底をスターラ―で撹拌できる。口は酸素測定電極がぴったりはまる大きさになっている。
マッキルベイン緩衝液1400μLを容器の中に入れ、容器中の気泡を除去し、泡を入れないように電極を差し込み、ブランクの酸素消費量を測定した。
緩衝液中の酸素の総量を測定するため、ジチオナイト(薬さじ小1杯)を入れて測定した。
サンプル測定は、緩衝液に菌体膜分散溶液10μL、1Mアセトアルデヒド溶液90μLを入れて測定した。オキシダーゼ比活性は、以下の計算式（式４）により算出した。
（式４）オキシダーゼ比活性（Ｕ／ｍｇ）=25℃での溶存酸素量(498 n atom/mL)×1minあたりの酸素消費量÷緩衝液中の酸素消費量×全容量(1500μL) ÷サンプル量(10μL) ×サンプル希釈倍率(10)÷タンパク質濃度（ｍｇ／ｍＬ
＜ＡＬＤＨ比活性とＱ１Ｈ２比活性の比率＞
本発明の酢酸菌培養液に含まれる酢酸菌は、ＡＬＤＨ比活性：Ｑ１Ｈ２比活性が５：１〜１：５であるとよく、さらに３：１〜１：３であるとよい。
本発明の酢酸菌培養液に含まれる酢酸菌は、ＡＬＤＨ比活性：Ｑ１Ｈ２比活性が５：１〜１：５であるとよく、さらに３：１〜１：３であるとよい。
ＡＬＤＨ比活性がいくら高くても、Ｑ１Ｈ２比活性が低ければ実際に機能するアルデヒド酸化能は伸びない。したがって、前記比率は、ＡＬＤＨ比活性およびＱ１Ｈ２比活性を特定比率に保つことで、実際に機能するアルデヒド酸化能を効率よく高めることができていることを意味する。
＜スクリーニング方法＞
また、前述のＡＬＤＨ比活性およびＱ１Ｈ２比活性を測定することで、アルデヒド酸化能が効率的に高められた酢酸菌をスクリーニングすることができる。
具体的には、下記（Ａ）および（Ｂ）の方法を特徴とする、アルデヒド酸化能が効率的に高められた酢酸菌をスクリーニングする方法である。
（Ａ）フェリシアン化カリウムのフェロシアン化第２鉄への変換活性を指標として、アルデヒドデヒドロゲナーゼ比活性が増強された酢酸菌をスクリーニングする方法。
（Ｂ）ユビキノール−１のユビキノン−１への変換活性を指標として、ユビキノンオキシダーゼ比活性が増強された酢酸菌をスクリーニングする方法。
また、前述のＡＬＤＨ比活性およびＱ１Ｈ２比活性を測定することで、アルデヒド酸化能が効率的に高められた酢酸菌をスクリーニングすることができる。
具体的には、下記（Ａ）および（Ｂ）の方法を特徴とする、アルデヒド酸化能が効率的に高められた酢酸菌をスクリーニングする方法である。
（Ａ）フェリシアン化カリウムのフェロシアン化第２鉄への変換活性を指標として、アルデヒドデヒドロゲナーゼ比活性が増強された酢酸菌をスクリーニングする方法。
（Ｂ）ユビキノール−１のユビキノン−１への変換活性を指標として、ユビキノンオキシダーゼ比活性が増強された酢酸菌をスクリーニングする方法。
＜培養条件＞
＜エタノール濃度＞
本発明の製造方法において、酢酸菌がエタノールを酢酸に変換し、酢酸を資化してエネルギーを得ることで増殖能を高められることから、培養開始時の培養液中のエタノール濃度は０％以上３％未満であり、さらに０％以上２．０％以下、０％以上０．５％以下であるとよい。一方、エタノール濃度が３％以上であると、酢酸菌の増殖が進まなくなってしまう。
＜エタノール濃度＞
本発明の製造方法において、酢酸菌がエタノールを酢酸に変換し、酢酸を資化してエネルギーを得ることで増殖能を高められることから、培養開始時の培養液中のエタノール濃度は０％以上３％未満であり、さらに０％以上２．０％以下、０％以上０．５％以下であるとよい。一方、エタノール濃度が３％以上であると、酢酸菌の増殖が進まなくなってしまう。
＜酢酸濃度＞
本発明の製造方法において、増殖能が高い酢酸菌培養液が得られることから、培養開始時の培養液中の酢酸濃度は０％以上１．５％未満であり、さらに０％以上１％以下であるとよい。酢酸濃度が１．５％以上であると、培養液中のｐＨが低下して酢酸菌の増殖が進まなくなってしまう。
本発明の製造方法において、増殖能が高い酢酸菌培養液が得られることから、培養開始時の培養液中の酢酸濃度は０％以上１．５％未満であり、さらに０％以上１％以下であるとよい。酢酸濃度が１．５％以上であると、培養液中のｐＨが低下して酢酸菌の増殖が進まなくなってしまう。
＜エタノール濃度と酢酸濃度の合計＞
本発明の製造方法において、培養液中のエタノール濃度と酢酸濃度の合計が０％以上２．０％未満であるとよい。
本発明の製造方法において、培養液中のエタノール濃度と酢酸濃度の合計が０％以上２．０％未満であるとよい。
＜糖アルコール＞
本発明の製造方法において、培養液中のｐＨの低下を抑制し、酢酸菌の増殖を促進しやすいことから、培養液中にグリセロール、ソルビトール、またはマンニトールから選ばれる１種または又は２種以上の糖アルコールを含むとよい。なお、糖アルコール濃度は特に規定しないが、例えば、０．１〜５．０％であればよく、さらに０．５〜２．０％であればよい。
本発明の製造方法において、培養液中のｐＨの低下を抑制し、酢酸菌の増殖を促進しやすいことから、培養液中にグリセロール、ソルビトール、またはマンニトールから選ばれる１種または又は２種以上の糖アルコールを含むとよい。なお、糖アルコール濃度は特に規定しないが、例えば、０．１〜５．０％であればよく、さらに０．５〜２．０％であればよい。
＜セルロース膜＞
本発明の製造方法において、増殖能が高い酢酸菌培養液が得られ易いことから、培養後に、培養液表面にセルロース膜が生成しないように培養するとよい。
本発明の製造方法において、増殖能が高い酢酸菌培養液が得られ易いことから、培養後に、培養液表面にセルロース膜が生成しないように培養するとよい。
＜ｐＨ＞
本発明の製造方法において、増殖能が高い酢酸菌培養液が得られ易いことから、酢酸菌培養液のｐＨを３〜７にするとよい。培養液のｐＨを前記範囲外にすると、酢酸菌の増殖およびアルデヒド酸化能が抑制されてしまう恐れがある。
本発明の製造方法において、増殖能が高い酢酸菌培養液が得られ易いことから、酢酸菌培養液のｐＨを３〜７にするとよい。培養液のｐＨを前記範囲外にすると、酢酸菌の増殖およびアルデヒド酸化能が抑制されてしまう恐れがある。
次に、本発明を実施例および試験例に基づき、さらに説明する。なお、本発明はこれに限定するものではない。
＜実施例１＞
３００ｍＬのバッフル付き三角フラスコに下記組成表記載の培養液１（１５ｍＬ）を添加し、酢酸菌株（Komagataeibacter hansenii NBRC14820）０．０１％を接種した。品温３０℃、回転数２３０ｒｐｍで２４時間撹拌培養後、回収して、実施例１の酢酸菌培養液を得た。この時、培養液表面にセルロース膜は生成していなかった。
３００ｍＬのバッフル付き三角フラスコに下記組成表記載の培養液１（１５ｍＬ）を添加し、酢酸菌株（Komagataeibacter hansenii NBRC14820）０．０１％を接種した。品温３０℃、回転数２３０ｒｐｍで２４時間撹拌培養後、回収して、実施例１の酢酸菌培養液を得た。この時、培養液表面にセルロース膜は生成していなかった。
前記酢酸菌培養液の濁度（ＯＤ６６０ｎｍ）は２．０であり、培養液１５ｍＬあたりのＡＬＤＨ活性は４２．７であった。なお、培養終了時の培養液のｐＨは５．６であった。
＜組成表＞
＜試験例１＞
酢酸菌の種類による増殖能およびアルデヒド酸化能に及ぼす影響を調べるため、実施例１に準じて、表１記載の培養液を用いて各種酢酸菌を培養し、酢酸菌培養液を得た。
得られた酢酸菌培養液それぞれについて、ｐＨ、培養液の濁度、および培養液１５ｍＬあたりのＡＬＤＨ活性を測定し、評価を行った。結果を表１に示す。
なお、KPJ Gluconacetobacter 2001はキユーピー醸造が保有している菌株である。
酢酸菌の種類による増殖能およびアルデヒド酸化能に及ぼす影響を調べるため、実施例１に準じて、表１記載の培養液を用いて各種酢酸菌を培養し、酢酸菌培養液を得た。
得られた酢酸菌培養液それぞれについて、ｐＨ、培養液の濁度、および培養液１５ｍＬあたりのＡＬＤＨ活性を測定し、評価を行った。結果を表１に示す。
なお、KPJ Gluconacetobacter 2001はキユーピー醸造が保有している菌株である。
評価は、下記の評価基準に従ったものである。
＜濁度（ＯＤ６６０ｎｍ）について＞
◎：５以上１０以下を◎とし、非常に増殖がよいことが示された。
〇：１以上５未満を〇とし、増殖がよいことが示された。
×：１未満を×とし、増殖が悪いことが示された。
＜濁度（ＯＤ６６０ｎｍ）について＞
◎：５以上１０以下を◎とし、非常に増殖がよいことが示された。
〇：１以上５未満を〇とし、増殖がよいことが示された。
×：１未満を×とし、増殖が悪いことが示された。
＜培養液１５ｍＬあたりのＡＬＤＨ活性について＞
◎：１５以上５０以下を◎とし、ＡＬＤＨ活性が非常に高い状態である。
〇：４以上１５未満を〇とし、ＡＬＤＨ活性が高い状態である。
×：４未満を×とし、ＡＬＤＨ活性が低い状態である。
◎：１５以上５０以下を◎とし、ＡＬＤＨ活性が非常に高い状態である。
〇：４以上１５未満を〇とし、ＡＬＤＨ活性が高い状態である。
×：４未満を×とし、ＡＬＤＨ活性が低い状態である。
＜表１＞
表１より、コマガタエイバクター・ハンセニイ（Komagataeibacter hansenii）、グルコンアセトバクター・リックウェフェシエンス（Gluconacetobacter liquefaciens）、コマガタエイバクター・マルタセティ（Komagataeibacter maltaceti）、コマガタエイバクター・メデリネンシス（Komagataeibacter medellinensis）から選ばれる１種または２種以上の酢酸菌であれば、増殖能が高く、アルデヒド酸化能が高い酢酸菌培養液が得られることが理解できる。
具体的には、培養液の波長６６０ｎｍにおける濁度（ＯＤ６６０ｎｍ）が１〜１０であり、
培養液１５ｍＬあたりのアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性が４〜６０である、
酢酸菌培養液が得られる。
培養液１５ｍＬあたりのアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性が４〜６０である、
酢酸菌培養液が得られる。
＜試験例２＞
培養開始時の培養液のエタノール濃度および酢酸濃度の影響を調べるため、実施例１に準じて、表２記載の培養液を用いて各種酢酸菌を培養し、酢酸菌培養液を得た。具体的には、培養液１に表２記載の濃度になるようにエタノールおよび酢酸を添加し、残部を清水で調製した。得られた酢酸菌培養液それぞれについて、濁度および培養液１５ｍＬあたりのＡＬＤＨ活性を計測し、評価を行った。結果を表２に示す。
培養開始時の培養液のエタノール濃度および酢酸濃度の影響を調べるため、実施例１に準じて、表２記載の培養液を用いて各種酢酸菌を培養し、酢酸菌培養液を得た。具体的には、培養液１に表２記載の濃度になるようにエタノールおよび酢酸を添加し、残部を清水で調製した。得られた酢酸菌培養液それぞれについて、濁度および培養液１５ｍＬあたりのＡＬＤＨ活性を計測し、評価を行った。結果を表２に示す。
＜表２＞
表２より、エタノール濃度０％以上３％未満、酢酸濃度１％以上１．５％未満を含む培養液で培養を開始することで、増殖能が高く、アルデヒド酸化能が高められた酢酸菌培養液が得られることが理解できる。
さらに、培養液中のエタノール濃度と酢酸濃度の合計が０％以上２．０％未満である方が、増殖能が高く、アルデヒド酸化能が高められた酢酸菌培養液が得られ易い。
＜試験例３＞
培養液中の糖アルコールの影響を調べるため、実施例１に準じて、培養液１において表２記載の炭素源（グリセロールまたはグルコース）を用いて各種酢酸菌を培養し、酢酸菌培養液を得た。得られた酢酸菌培養液それぞれについて、ｐＨ、濁度、および培養液１５ｍＬあたりのＡＬＤＨ活性を計測し、評価を行った。結果を表３に示す。
培養液中の糖アルコールの影響を調べるため、実施例１に準じて、培養液１において表２記載の炭素源（グリセロールまたはグルコース）を用いて各種酢酸菌を培養し、酢酸菌培養液を得た。得られた酢酸菌培養液それぞれについて、ｐＨ、濁度、および培養液１５ｍＬあたりのＡＬＤＨ活性を計測し、評価を行った。結果を表３に示す。
＜表３＞
表３より、本発明の製造方法において、培養液中にグリセロール、ソルビトール、またはマンニトールから選ばれる１種または又は２種以上の糖アルコールを含む方が、増殖性が高く、アルデヒド酸化能が高められた酢酸菌培養液が得られ易いことが理解できる。
＜試験例４＞
実施例１に準じて、表４記載の培養液を用いて各種酢酸菌を培養し、酢酸菌培養液を得た。得られた酢酸菌培養液それぞれについて、ＡＬＤＨ比活性、Ｑ１Ｈ２比活性、およびオキシダーゼ比活性を計測し、評価を行った。結果を表４に示す。
なお、各種活性の具体的な計測方法は、前述のとおりである。
実施例１に準じて、表４記載の培養液を用いて各種酢酸菌を培養し、酢酸菌培養液を得た。得られた酢酸菌培養液それぞれについて、ＡＬＤＨ比活性、Ｑ１Ｈ２比活性、およびオキシダーゼ比活性を計測し、評価を行った。結果を表４に示す。
なお、各種活性の具体的な計測方法は、前述のとおりである。
評価は、下記の評価基準に従ったものである。
＜ＡＬＤＨ比活性について＞
◎：５Ｕ／ｍｇ以上１０Ｕ／ｍｇ以下を◎とし、ＡＬＤＨ比活性が非常に高い状態である。
〇：１Ｕ／ｍｇ以上５Ｕ／ｍｇ未満を〇とし、ＡＬＤＨ比活性が高い状態である。
△：１Ｕ／ｍｇ未満を△とし、ＡＬＤＨ比活性がやや低い状態である。
＜ＡＬＤＨ比活性について＞
◎：５Ｕ／ｍｇ以上１０Ｕ／ｍｇ以下を◎とし、ＡＬＤＨ比活性が非常に高い状態である。
〇：１Ｕ／ｍｇ以上５Ｕ／ｍｇ未満を〇とし、ＡＬＤＨ比活性が高い状態である。
△：１Ｕ／ｍｇ未満を△とし、ＡＬＤＨ比活性がやや低い状態である。
＜Ｑ１Ｈ２比活性について＞
◎：５Ｕ／ｍｇ以上１０Ｕ／ｍｇ以下を◎とし、Ｑ１Ｈ２比活性が非常に高い状態である。
〇：１Ｕ／ｍｇ以上５Ｕ／ｍｇ未満を〇とし、Ｑ１Ｈ２比活性が高い状態である。
△：１Ｕ／ｍｇ未満を△とし、Ｑ１Ｈ２比活性がやや低い状態である。
◎：５Ｕ／ｍｇ以上１０Ｕ／ｍｇ以下を◎とし、Ｑ１Ｈ２比活性が非常に高い状態である。
〇：１Ｕ／ｍｇ以上５Ｕ／ｍｇ未満を〇とし、Ｑ１Ｈ２比活性が高い状態である。
△：１Ｕ／ｍｇ未満を△とし、Ｑ１Ｈ２比活性がやや低い状態である。
＜オキシダーゼ比活性について＞
◎：５Ｕ／ｍｇ以上１０Ｕ／ｍｇ以下を◎とし、オキシダーゼ比活性が非常に高い状態である。
〇：１Ｕ／ｍｇ以上５Ｕ／ｍｇ未満を〇とし、オキシダーゼ比活性が高い状態である。
△：１Ｕ／ｍｇ未満を△とし、オキシダーゼ比活性がやや低い状態である。
◎：５Ｕ／ｍｇ以上１０Ｕ／ｍｇ以下を◎とし、オキシダーゼ比活性が非常に高い状態である。
〇：１Ｕ／ｍｇ以上５Ｕ／ｍｇ未満を〇とし、オキシダーゼ比活性が高い状態である。
△：１Ｕ／ｍｇ未満を△とし、オキシダーゼ比活性がやや低い状態である。
＜ＡＬＤＨ比活性：Ｑ１Ｈ２比活性＞
◎：ＡＬＤＨ比活性：Ｑ１Ｈ２比活性が３：１〜１：３を◎とし、実際に機能するアルデヒド酸化能が非常に効率よく高められている状態である。
〇：ＡＬＤＨ比活性：Ｑ１Ｈ２比活性が５：１〜３：１または１：３〜１：５を〇とし、実際に機能するアルデヒド酸化能が効率よく高められている状態である。
△：ＡＬＤＨ比活性：Ｑ１Ｈ２比活性が５：１〜１：５の範囲外を△とし、実際に機能するアルデヒド酸化能がやや低い状態である。
◎：ＡＬＤＨ比活性：Ｑ１Ｈ２比活性が３：１〜１：３を◎とし、実際に機能するアルデヒド酸化能が非常に効率よく高められている状態である。
〇：ＡＬＤＨ比活性：Ｑ１Ｈ２比活性が５：１〜３：１または１：３〜１：５を〇とし、実際に機能するアルデヒド酸化能が効率よく高められている状態である。
△：ＡＬＤＨ比活性：Ｑ１Ｈ２比活性が５：１〜１：５の範囲外を△とし、実際に機能するアルデヒド酸化能がやや低い状態である。
＜表４＞
表４より、本発明の酢酸菌培養液に含まれる酢酸菌はＡＬＤＨ比活性が１〜１０、Ｑ１Ｈ２比活性が１〜１０、オキシダーゼ比活性が１〜１０である。
また、ＡＬＤＨ比活性：Ｑ１Ｈ２比活性が５：１〜１：５であることから、ＡＬＤＨ比活性が高いだけでなく、実際に機能するアルデヒド酸化能が効率よく高められていることが理解できる。
また、ＡＬＤＨ比活性：Ｑ１Ｈ２比活性が５：１〜１：５であることから、ＡＬＤＨ比活性が高いだけでなく、実際に機能するアルデヒド酸化能が効率よく高められていることが理解できる。
また、ＡＬＤＨ比活性およびＱ１Ｈ２比活性を測定することで、アルデヒド酸化能が効率よく高められた酢酸菌をスクリーニングすることができる。
Claims (6)
- コマガタエイバクター・ハンセニイ（Komagataeibacter hansenii）、グルコンアセトバクター・リックウェフェシエンス（Gluconacetobacter liquefaciens）、コマガタエイバクター・マルタセティ（Komagataeibacter maltaceti）、コマガタエイバクター・メデリネンシス（Komagataeibacter medellinensis）から選ばれる１種または２種以上の酢酸菌を含む酢酸菌培養液であって、
前記酢酸菌培養液の波長６６０ｎｍにおける濁度（ＯＤ６６０ｎｍ）が１〜１０であり、
前記酢酸菌培養液１５ｍＬあたりのアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性が４〜６０である、
酢酸菌培養液。
- エタノール濃度０％以上３％未満、酢酸濃度０％以上１．５％未満を含む培養液で培養を開始する、
酢酸菌培養液の製造方法。
- 請求項２記載の酢酸菌培養液の製造方法において、
培養液中のエタノール濃度と酢酸濃度の合計が０％以上２．０％未満である、
酢酸菌培養液の製造方法。
- 請求項２又は３記載の酢酸菌培養液の製造方法において、
培養液中にグリセロール、ソルビトール、またはマンニトールから選ばれる１種または又は２種以上の糖アルコールを含む、
酢酸菌培養液の製造方法。
- ＜用途＞
請求項１記載の酢酸菌培養液またはその乾燥物を含む、
アルデヒドデヒドロゲナーゼ組成物。
- ＜製造方法＞
請求項２乃至４記載の酢酸菌培養液の製造方法で得られる酢酸菌培養液またはその乾燥物を含む、
アルデヒドデヒドロゲナーゼ組成物の製造方法。
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| JP2006199624A (ja) * | 2005-01-20 | 2006-08-03 | Mitsukan Group Honsha:Kk | 酢酸菌体を含有する生体内抗酸化性組成物 |
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-
2016
- 2016-04-26 JP JP2016088609A patent/JP6680609B2/ja active Active
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 生物工学, vol. 90(6), JPN6020008036, 2012, pages 340 - 343, ISSN: 0004226115 * |
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