KR101090657B1 - 녹용 발효에 활성을 갖는 바실러스 속의 균주 및 이를 이용한 녹용 발효추출물의 제조방법 - Google Patents

녹용 발효에 활성을 갖는 바실러스 속의 균주 및 이를 이용한 녹용 발효추출물의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 녹용 발효에 활성을 갖는 바실러스 속의 균주인 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) KCTC 11454BP에 관한 것이며, 또한, 본 발명은 상기 신규의 균주를 이용한 녹용 발효추출물의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 신규의 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) KCTC 11454BP 균주는 된장으로부터 분리되며, 녹용 발효에 활성을 나타낸다.
또한, 본 발명의 균주에 의해 제조된 녹용 발효추출물은 녹용의 유효성분을 다량 함유하여 녹용의 효과로 알려져 있는 조골세포 성장 촉진, 파골세포 억제, 골다공증 예방 효과, 관절염 치료, 기억력과 학습능력 증진 세포의 신경 전달계의 작용에 유용하게 이용될 수 있을 뿐만 아니라, 종래에 공지된 균주로부터 얻어진 녹용 발효추출물에 비해 우수한 항산화 효과를 갖는다.
바실러스 서브틸러스, 녹용, 발효

Description

녹용 발효에 활성을 갖는 바실러스 속의 균주 및 이를 이용한 녹용 발효추출물의 제조방법{Bacillus.sp having fermentation activity of cervi parvum cornu and process for the preparation of fermentation extraction of cervi parvum cornu using this}
본 발명은 녹용 발효에 활성을 갖는 신규의 바실러스 속의 균주 및 이를 이용한 녹용 발효추출물의 제조방법에 관한 것이다.
녹용(antler, Cornu cerivi parvum)은 매년 재생되는 연골조직으로, 우리나라를 비롯한 중국 및 일본 등의 동양권 국가들에서 오래 전부터 중요한 한약 재료로 활용(Fennessy, 1989) 되고 있는 양록산업의 주 생산물로 오래 전부터 동양의학에서 주로 이용되어 왔다.
녹용은 cervidae에 속하는 사슴의 대각으로서 중국을 비롯하여 한국에서 가장 고귀한 보혈 강장제 등으로 널리 사용되어 왔으며, 녹용의 성상과 효능에 관해 본초강목과 동의보감 등에 기재되어 있다. 사슴의 뿔로 각질화 되지 않은 것은 녹 용이고, 각질화 된 것은 녹각이라 한다.
녹용 또는 녹각은 대부분 수입에 의존하고 있으며, 2000년에 의약용으로 녹용 159톤을 수입하여 1,600만 달러가 지출되었고, 국내 생산 생녹용은 75 kg에 불과한 실정이며, 전세계에서 한국이 가장 많이 수입하고 있고, 대부분 국내에서 소비되고 있다. 녹용의 수입은 주로 뉴질랜드, 중국, 러시아 등으로부터 수입되고 있으며, 산지에서 채취한 녹용은 건조 후 수입하여 사용하기 전에 적당히 세절한다.
예부터 녹용은 주로 강정, 강장의 목적으로 사용되어 오고 있다. 녹용의 약리효과 실험 결과 흰쥐의 성장촉진작용, 조혈작용, 단백질 합성 촉진작용, 콜레스테롤 저하작용 및 면역활성 증가 등의 작용을 가지고 있는 것으로 보고(Wang 등, 1988a; 신국현 등, 1989)되어 있으며, 그 외에도 모노아민 옥시다아제(monoamine oxidase) 활성 억제(Wang 등, 1988b), in vivo와 in vitro에서 녹용 추출물이 지질 과산화의 방어효과(Wang 등, 1988c), 추출물의 반복투여 시 노화에 미치는 영향 등이 보고되어 있다.
지금까지의 녹용에 관한 연구는 한방에서 임상적인 효과를 규명하고, 양방에서 녹용의 생리학적인 성장기작을 밝히는 정도에 국한되어 있었다. 최근들어 녹용의 생리활성 성분에 대한 활발한 연구가 진행되고 있는데, 녹용은 추출물 수준에서 면역기능 증진, 항산화, 항 피로, 항 혈전, 항노화, 혈압강하, 항염증작용 등 매우 다양한 효능이 있는 것으로 보고되고 있다(Cho 등, 2005).
그러나, 녹용은 설사 등의 부작용이 있어, 한방에서 수렴작용이 있는 한약과 병용하여 사용하게 되는데, 이 경우 기대했던 효과가 상실되거나 감소될 수 있다. 또한, 한방의 유용한 자원인 녹용은 한약에 이용하기 위해 알코올에 담근 후, 이를 세절하여 사용하게 되는데, 이 과정에서 녹용의 많은 유효성분이 소실되고 있다.
한편, 녹용을 바실러스 속 균주 등을 이용하여 발효시킬 경우 항피로, 간장보호 및 설사억제 효과가 우수한 녹용 발효물이 얻어질 수 있다는 것이 공지된 바 있다.
대한민국 특허등록 제206,182호는 동물의 장내용물 또는 신선한 변으로부터 분리된 녹용분해 활성을 갖는 바실러스 속 Py-92균주(KCTC 0049 BP)를 개시한 바 있다(생약학회지 1994; 25: 233-237, 약학회지 12994; 38: 795-799). 또한, 대한민국 특허등록 제329,365호는 녹용(또는 녹각)을 계내금과 함께 발효시킴으로써 그 흡수율을 증가시킨 녹용제제 및 그의 제조방법을 개시한 바 있다. 또한, 대한민국 특허공개 제10-2006-0128117호는 녹용 중량의 약 10 내지 60배 분량의 증류수에 분쇄한 녹용을 넣어 멸균하여 만든 녹용배지에 바실러스 P-92균주를 이식하여 5 내지 7일간 배양한 후 멸균 및 여과하는 과정에 의해 수득되는 발효 녹용 추출물을 유효성분으로 함유하는 면역증강, 장기능 강화와 암예방 및 치료용 약학 조성물을 개시 한 바 있다. 또한, 대한민국 특허등록 제808,060호는 녹용발효에 활성을 갖는 바실러스 리케포르미스(Bacillus licheniformis) KCCM 10885P 및 상기 균주를 이용한 녹용발효물의 제조방법을 개시한 바 있다. 기타, 대한민국 특허등록 제753,776호는 녹용 엑기스를 첨가하여 제조한 발효식품 및 그 제조방법을 개시한 바 있다.
그러나, 종래의 방법, 예를 들어 동물의 장내용물 또는 신선한 변으로부터 분리된 바실러스 속 Py-92균주(KCTC 0049 BP) 혹은 정선한 계내금을 사용하여 녹용을 발효시킬 경우, 얻어지는 녹용 발효물의 유효성분이 낮고, 녹용 발효물의 약리활성이 만족스럽지 못한 단점이 있다.
따라서, 본 발명은 다양한 생리활성을 지닌 발효녹용의 유효성분 효율을 높이고 아울러 새로운 약리효과를 기대하기 위해 녹용을 발효시킬 수 있는 바실러스 속 미생물을 분리하고자 본 연구를 수행한 결과 된장으로부터 새롭게 분리한 균주를 사용하여 녹용을 발효시킬 경우, 종래의 균주에 비해 유효성분의 함량을 크게 높일 수 있을 뿐만 아니라, 얻어지는 녹용 발효 추출물이 우수한 항산화 효과를 갖는다는 것을 발견하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 된장으로부터 분리되며, 녹용 발효 활성을 갖는 바실러스 속의 균주를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 신규의 균주를 이용한 녹용 발효 추출물의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 녹용 발효 활성을 갖는 신규의 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) KCTC 11454BP 균주를 제공한다.
본 발명에 의한 녹용 발효 활성을 갖는 신규의 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) KCTC 11454BP 균주는 된장으로부터 분리한 것이다.
상기 본 발명에 의한 균주는 된장을 일반 배지(Nutrient agar) 및 선택 배지(Nutrient agar 배지에 NaCl을 첨가하여 선택배지를 만들어 배양)에 각각 도말하여 배양한 다음 Colony 성상 별로 분리하여 하기 기재된 방법에 의해 분리된다.
또한, 본 발명은 ⒜ 녹용분말 또는 녹용 추출물을 함유하는 고체배지 중에서 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) KCTC 11454BP를 가하여 발효시키는 단계; 및 ⒝ 얻어진 발효액을 농축 또는 원심분리하는 단계를 포함하는 녹용 발효추출물의 제조방법을 제공한다.
본 발명에서 이용된 녹용분말 함유 고체배지는 녹용분말에 증류수를 가하여 현탁 후 agar를 가하여 121℃에서 15분간 고압 멸균하여 Petri-dish에 담아 고체 배지로 사용할 수 있으며, 녹용 추출물을 함유한 고체배지는 녹용에 증류수를 가하여 100℃에서 3시간 환류 추출한 다음 원심분리하여 추출액을 회수하여 얻은 농축액에 증류수와 agar를 가하여 121℃에서 15분간 고압 멸균하여 Petri-dish에 담아 고체 배지로 사용할 수 있다.
녹용에 함유되어 있는 유효성분인 S-GAG(Sulfated-glycosaminglycan) 성분은 조골세포 성장 촉진, 파골세포 억제, 골다공증 예방 효과, 관절염 치료제의 지표물질로 관심이 증대된 물질이고, Sialic acid는 Gangliosides 의 종류를 결정하는 주요 지표 성분이다. Gangliosides는 기억력과 학습능력 증진 세포의 신경 전달계에 매우 중요한 역할을 한다.
본 발명은 하기 실험예에서 밝힌 바와 같이 종래 공지의 균주인 바실러스 속 Py-92균주(KCTC 0049BP), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) KCTC 1325 및 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) ATCC 9372 균주와는 다른 균학적 성질을 지닌 신규한 균주로서, 이를 이용하여 제조되는 녹용 발효추출물은 높은 함량의 유효성분을 함유하며 우수한 항산화 효과를 나타낸다.
본 발명은 된장으로부터 녹용 발효 활성을 갖는 신규의 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) KCTC 11454BP 균주를 제공한다.
또한, 본 발명에 따른 상기 균주는 녹용의 유효성분인 Total sugar, S-GAG량 및 sialic acid를 높은 함량으로 함유되는 녹용 발효추출물의 제조를 가능하게 하여 조골세포 성장 촉진, 파골세포 억제, 골다공증 예방 효과, 관절염 치료제, 기억력과 학습능력 증진 세포의 신경 전달계에 매우 유용하게 이용될 수 있을 뿐만 아니라, 상기 균주에 의해 제조되는 녹용 발효추출물은 항산화 효과의 약리활성을 나타낸다.
이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> 바실러스 서브틸리스 ( Bacillus subtilis ) KCTC 11454 BP 분리
1. 활성이 좋은 균주 검정
가. 된장으로부터 균주의 분리
된장을 일반 배지(Nutrient agar) 및 선택 배지(Nutrient agar 배지에 NaCl을 첨가하여 선택배지를 만들어 배양)에 각각 도말하여 배양한 다음 Colony 성상 별로 분리하여 하기 기재된 방법에 의해 분리한다.
나. 균주의 배양
나-1. 녹용 분말 고체배지에서의 배양
녹용분말 4 g에 증류수 200 ml를 가하여 현탁 후 agar 4 g을 가하여 121℃에서 15분간 고압 멸균하여 Petri-dish에 담아 고체 배지로 사용하여 상기 된장으로부터 분리한 바실러스 속 14종의 균주들을 각각 도말하여 30℃에서 2일간 배양하면서 균주의 성장여부를 확인하였다.
나-2. 녹용 추출물 함유 고체배지에서의 배양
녹용 10 g에 증류수 200 ml를 가하여 100℃에서 3시간 환류 추출하였다. 원심분리하여 추출액을 회수하였으며, 원심분리에 의해 얻은 침전에 증류수 150 ml를 가하여 2차 환류 추출하였다. 원심분리에 의한 얻은 2차 환류 추출액과 1차 추출액과 혼합 농축하여 농축액(7.5 brix) 80 ml을 얻었다. 농축 추출액 80 ml에 증류수 120 ml과 agar 4 g을 가하여 121℃에서 15분간 고압 멸균하여 Petri-dish에 담아 고체 배지로 사용하여 상기 된장으로부터 분리한 바실러스 속 14종의 균주들을 각각 도말하여 30℃에서 2일간 배양하면서 균주의 성장여부를 확인하였다.
다. 성장정도 측정 및 균주 선정
상기의 녹용 분말 고체배지와 녹용 추출물 고체배지에서 성장 정도에 따라 균주의 성장여부를 측정하여 각각 표 1 및 표 2에 나타내었다.
균주 성장이 매우 왕성 : +++,
균주 성장이 왕성 : ++,
균주 성장이 보통 : +,
균주 성장이 약함 : -+,
전혀 성장하지 않음 : -
Figure 112009044790007-pat00001
Figure 112009044790007-pat00002
라. 균주의 동정
상기 표 1 및 표 2 모두에서 성장이 매우 왕성한 균주인 7(임의로 지정한 숫자임)를 선정·분리하였다.
genomic DNA preparation Kit(SGD62 S120, Solgent Co. Ltd., Korea)을 이용하여 genomic DNA를 추출한 다음 유니버셜 프라이머(universal primer) 27F(5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3')와 1492R(5'-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3'), EF-Taq (SEF16 R250, Solgent Co. Ltd., Korea)으로 PCR을 실시하여 증폭시켰다. 아세테이트와 70% 에탄올을 이용하여 정제한 다음 시퀀싱 키트(Big dye terminator cycle sequencing ready reaction kit)와 ABI Prism 3730XL DNA analyzer(Applied Biosystems, CA, USA)로 염기서열을 결정하였다.
이러한 분리균주의 16S rRNA 염기서열은 EMBL/DDBJ/PDB/GenBank 시퀀스 데이터베이스로 부터 얻은 유연균주의 서열과 정렬시키고 상동성을 비교하여 표 3에 나타내었으며, 그 결과 녹용분말 고체배지와 녹용 추출물 고체배지 모두 성장이 매우 왕성한 균주는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)였다.
상기 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 균주를 2009년 1월 16일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC)에 기탁번호 KCTC 11454BP로 기탁하였다.
Figure 112009044790007-pat00003
마. 분리 균주의 균학적 특성
본 발명에 따른 바실러스 서브틸리스 KCTC 11454BP 균주의 균학적 특성을 조사하여 도 1 및 표 4에 나타내었다.
Figure 112009044790007-pat00004
도 1에서 알 수 있는 바와 같이 본 발명에 따른 바실러스 서브틸리스 KCTC 11454BP 균주는 간균이었다.
표 4로부터 본 발명에 따른 바실러스 서브틸리스 KCTC 11454BP 균주는 운동성이 있으며, 호기성(catalase 함유)이고, 그람 양성균이었으며 포자를 형성하는 것으로 관찰되었다. 또한, 본 발명에 따른 바실러스 서브틸리스 KCTC 11454BP 균주는 생육시 gelatin과 casein에 대하여 protease 활성이 매우 높은 것으로 나타나 fibrin 분해능이 우수하다는 것을 확인할 수 있었으나, 생육시 전분 분해력은 다소 약한 것으로 나타났다.
바. 균학적 특성의 비교
본 발명에 따른 바실러스 서브틸리스 KCTC 11454BP 균주와 공지의 균주인 바실러스 속 Py-92균주(KCTC 0049BP), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) KCTC 1325 및 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) ATCC 9372 균주의 탄소원 이용여부로 균학적 특성을 비교하여 그 결과를 표 5에 나타내었다.
Figure 112011040004970-pat00010
표 5에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따른 바실러스 서브틸리스 KCTC 11454BP 균주와 공지균주 ATCC 9372는 Inulin 및 Trehalose의 탄소원 이용에서 차이를 보였고, Bacillus subtilis PY-92(KCTC 0049BP), Bacillus subtilis KCTC1325와는 D-Xylose, Inulin 및 Trehalose 이용성에서 각각 차이를 보였다.
이상의 결과에서 알 수 있듯이, 본 발명에 따른 바실러스 서브틸리스 KCTC 11454BP 균주는 공지균주와 상이한 신규한 균주로 판단된다.
<실시예 2> 본 발명에 따른 바실러스 서브틸리스 KCTC 11454BP에 의한 녹용 발효
LB(tryptone 10 g/liter NaCl 10 g/liter yeast extract 5 g/liter) 배지 20 ml를 이용하여 상기 실시예 1에서 분리된 바실러스 서브틸리스 KCTC 11454BP 균주를 30℃에서 1일 배양한 것을 전 배양으로 하였다.
녹용분말 4 g에 50 mM phosphate buffer (pH 6.0) 30 ml을 가하여 121℃에서 15분간 고압 멸균하여 30℃로 냉각한 후 본 발명에 따른 바실러스 서브틸리스 KCTC 11454BP 균주의 전 배양액 1 ml를 가하여 30℃에서 3일간 배양하였다. 배양액에 증류수 60 ml를 가하여 100℃에서 3시간 환류 추출 후 원심분리하여 녹용 발효추출물을 얻었다.
< 비교예 1 내지 3> 바실러스 속의 공지균주에 의한 녹용 발효
상기 실시예 2와 동일한 방법으로 공지 균주인 바실러스 속 Py-92균주(KCTC 0049BP), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) KCTC 1325 및 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) ATCC 9372 균주를 이용하여 녹용 발효추출물을 제조하여 각각 비교예 1, 비교예 2 및 비교예 3으로 하였다.
<실험예 1> 녹용 추출물의 수율 비교
상기 실시예 2 및 비교예 1 내지 3에서 제조된 녹용 발효추출물의 수율을 측정하여 표 6에 나타내었다.
Figure 112009044790007-pat00006
상기 표 6에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따른 바실러스 서브틸리스 KCTC 11454BP 균주에 의한 녹용 발효추출물의 수율은 공지의 바실러스 속 균주에 의한 녹용 발효추출물의 수율보다 2~3배 정도의 높은 수율로 녹용 발효추출물이 생성되었다.
<실험예 2> 녹용발효 추출물의 유효성분 함량 비교
녹용의 유효성분인 S-GAG(Sulfated-glycosaminglycan) 성분은 조골세포 성장 촉진, 파골세포 억제, 골다공증 예방 효과, 관절염 치료제의 지표물질로 관심이 증대된 물질이며, Sialic acid는 Gangliosides 의 종류를 결정하는 주요 지표 성분이고, Gangliosides는 기억력과 학습능력 증진 세포의 신경 전달계에 매우 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있어, 상기 실시예 2 및 비교예 1 내지 3에서 제조된 녹용 발효추출물의 유효성분 함량을 비교하기 위하여 다음과 같은 실험을 실시하였다.
녹용 발효추출물에 대한 유효성분의 분석은 아래와 같은 방법으로 측정하였다. Total sugar 는 phenol-sulfuric acid 법(Omran 등1989)으로 측정하였으며, Sulfated-glycoaminoglycan(S-GAG) 측정은 Dimethyl-methylene blue dye binding 방법(Farndale 등, 1982)에 의해 540 ㎚에서 측정하였고, Sialic acid 측정은 80℃에서 1시간 동안 0.1 N 황산으로 가수 분해한 후에 Warren 방법(Warren, 1959)에 의해서 549 ㎚에서 측정하여 표 7에 나타내었다.
Figure 112009044790007-pat00007
녹용 발효추출물의 유효성분 함량을 분석한 결과 표 7에서 알 수 있는 바와 같이, 비교예 1 내지 3의 공지의 바실러스 속 균주에 의한 녹용 발효추출물에서 유효성분인 Total sugar, S-GAG의 함량 및 sialic acid 함량은 발효전보다 오히려 감소하였으나, 본 발명에 따른 바실러스 서브틸리스 KCTC 11454BP 균주에 의한 녹용 발효추출물에서 현저히 증가하는 것을 확인하였다.
그러므로 본 발명에 따른 바실러스 서브틸리스 KCTC 11454BP 균주에 의한 녹용 발효추출물은 조골세포 성장 촉진, 파골세포 억제, 골다공증 예방 효과, 관절염 치료제, 기억력과 학습능력 증진 세포의 신경 전달계에 매우 유용하게 이용될 수 있다.
<실험예 3> 녹용 발효추출물의 항산화 효과
본 발명에 의한 실시예 2 및 비교예 1 내지 3에서 제조된 녹용 발효추출물의 항산화 활성효과를 알아보기 위해서 하기 시험을 실시하였다.
항산화 활성은 DPPH 라디칼에 대한 소거활성과 ABTS 소거활성을 측정하였다. DPPH 라디칼에 대한 소거활성은 Blois(1958)의 방법으로 측정하였다. 에탄올 적정량에 시료 0.2 mL와 4×10-4 M DPPH 용액 0.8 mL을 가하여 10초간 혼합하고 10분간 방치 후 525 nm에서 흡광도를 측정하여 대조구와 비교하였다.
ABTS 소거활성은 Arnao 등(2001)의 방법을 변형하여 측정하였다. 1.0 mM의 2,2'-azobis(2-amodino-propane) deihydrochloride (AAPH)은 100 mM PBS buffer에 녹인 2.5 mM의 ABTS (2,2'-azino-bis 3-ethylbenzenothiazolin-6-sulfonic acid)와 혼합한 후 68℃의 항온조에서 12분 동안 반응시켰다. ABTS 용액의 농도는 734 nm에서 0.650±10.2가 되도록 조정하였다. 여러 가지 농도의 시료 20 ㎕와 980 ㎕ ABTS 용액을 37℃ water bath에서 10분간 반응시키면서 734 nm에서 감소하는 흡광도 정도를 측정하였다. 이때 라디칼 50% 소거하는 추출물의 양의 농도(IC50)를 구하였다.
상기 DPPH 라디칼에 대한 소거활성과 ABTS 소거활성을 측정 결과는 표 8에 나타내었다.
Figure 112009044790007-pat00008
상기 표 8에서 알 수 있듯이, 녹용 발효추출물의 라디칼 소거능의 정도를 표시한 IC50값은 ABTS라디칼 소거능 및 DPPH 라디칼 소거능 모두에서 본 발명에 따른 녹용 발효추출물이 기존 공지의 균주로부터 얻어진 녹용 발효추출물보다 약 2~3배의 항산화 활성 효과가 현저히 우수함을 확인 할 수 있었다.
도 1은 바실러스 서브틸릴스(Bacillus subtilis) KCTC 11454BP 균주의 현미경 사진이다.

Claims (5)

  1. 하기 균학적 성질을 나타내며 녹용 발효 활성을 갖는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) KCTC 11454 BP.
    (1) 디-자이로스(D-Xylose) 이용성 : 음성
    (2) 이눌린(Inulin) 분해능 : 양성
    (3) 트레할로스(Trehalose) 분해능 : 음성
  2. 삭제
  3. 녹용분말 또는 녹용 추출물을 함유하는 고체배지 중에서 청구항 제1항에 기재된 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) KCTC 11454BP를 가하여 발효시키는 단계; 및
    얻어진 발효액을 농축 또는 원심분리하는 단계를 포함하는 녹용 발효추출물의 제조방법.
  4. 삭제
  5. 삭제
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