KR101039887B1

KR101039887B1 - 녹용 발효에 활성을 갖는 코디셉스 속의 균주 및 이를 이용한 녹용 발효추출물의 제조방법

Info

Publication number: KR101039887B1
Application number: KR1020090066961A
Authority: KR
Inventors: 박철수; 우문제; 이상훈; 김진수
Original assignee: 광동제약 주식회사
Priority date: 2009-07-22
Filing date: 2009-07-22
Publication date: 2011-06-09
Also published as: KR20110009520A

Abstract

본 발명은 녹용 발효에 활성을 갖는 코디셉스 속의 균주인 코디셉스 밀리타리스(Cordyceps militaris) KCTC 11455BP에 관한 것이며, 또한, 본 발명은 상기 신규의 균주를 이용한 녹용 발효추출물의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명에 따른 신규의 코디셉스 밀리타리스(Cordyceps militaris) KCTC 11455BP 균주는 버섯의 한 종류인 코디셉스 밀리타리스(Cordyceps militaris)로부터 분리되며, 녹용 발효에 활성을 나타낸다.

또한, 본 발명의 균주에 의해 제조된 녹용 발효추출물은 녹용의 유효성분을 다량 함유하여 녹용의 효과로 알려져 있는 조골세포 성장 촉진, 파골세포 억제, 골다공증 예방 효과, 관절염 치료, 기억력과 학습능력 증진 세포의 신경 전달계의 작용에 유용하게 이용될 수 있을 뿐만 아니라, 종래에 공지된 균주로부터 얻어진 녹용 발효추출물에 비해 우수한 항산화 효과를 갖는다.

코디셉스 밀리타리스, 녹용, 발효

Description

녹용 발효에 활성을 갖는 코디셉스 속의 균주 및 이를 이용한 녹용 발효추출물의 제조방법{Cordyceps.sp having fermentation activity of cervi parvum cornu and process for the preparation of fermentation extraction of cervi parvum cornu using this}

본 발명은 녹용 발효에 활성을 갖는 신규의 코디셉스 속의 균주 및 이를 이용한 녹용 발효추출물의 제조방법에 관한 것이다.

녹용(antler, Cornu cerivi parvum)은 매년 재생되는 연골조직으로, 우리나라를 비롯한 중국 및 일본 등의 동양권 국가들에서 오래 전부터 중요한 한약 재료로 활용(Fennessy, 1989) 되고 있는 양록산업의 주 생산물로 오래 전부터 동양의학에서 주로 이용되어 왔다.

녹용은 cervidae에 속하는 사슴의 대각으로서 중국을 비롯하여 한국에서 가장 고귀한 보혈 강장제 등으로 널리 사용되어 왔으며, 녹용의 성상과 효능에 관해 본초강목과 동의보감 등에 기재되어 있다. 사슴의 뿔로 각질화 되지 않은 것은 녹 용이고, 각질화 된 것은 녹각이라 한다.

녹용 또는 녹각은 대부분 수입에 의존하고 있으며, 2000년에 의약용으로 녹용 159톤을 수입하여 1,600만 달러가 지출되었고, 국내 생산 생녹용은 75 kg에 불과한 실정이며, 전세계에서 한국이 가장 많이 수입하고 있고, 대부분 국내에서 소비되고 있다. 녹용의 수입은 주로 뉴질랜드, 중국, 러시아 등으로부터 수입되고 있으며, 산지에서 채취한 녹용은 건조 후 수입하여 사용하기 전에 적당히 세절한다.

예부터 녹용은 주로 강정, 강장의 목적으로 사용되어 오고 있다. 녹용의 약리효과 실험 결과 흰쥐의 성장촉진작용, 조혈작용, 단백질 합성 촉진작용, 콜레스테롤 저하작용 및 면역활성 증가 등의 작용을 가지고 있는 것으로 보고(Wang 등, 1988a; 신국현 등, 1989)되어 있으며, 그 외에도 모노아민 옥시다아제(monoamine oxidase) 활성 억제(Wang 등, 1988b), in vivo와 in vitro에서 녹용 추출물이 지질 과산화의 방어효과(Wang 등, 1988c), 추출물의 반복투여 시 노화에 미치는 영향 등이 보고되어 있다.

지금까지의 녹용에 관한 연구는 한방에서 임상적인 효과를 규명하고, 양방에서 녹용의 생리학적인 성장기작을 밝히는 정도에 국한되어 있었다. 최근들어 녹용의 생리활성 성분에 대한 활발한 연구가 진행되고 있는데, 녹용은 추출물 수준에서 면역기능 증진, 항산화, 항 피로, 항 혈전, 항노화, 혈압강하, 항염증작용 등 매우 다양한 효능이 있는 것으로 보고되고 있다(Cho 등, 2005).

그러나, 녹용은 설사 등의 부작용이 있어, 한방에서 수렴작용이 있는 한약과 병용하여 사용하게 되는데, 이 경우 기대했던 효과가 상실되거나 감소될 수 있다. 또한, 한방의 유용한 자원인 녹용은 한약에 이용하기 위해 알코올에 담근 후, 이를 세절하여 사용하게 되는데, 이 과정에서 녹용의 많은 유효성분이 소실되고 있다.

한편, 지금까지 녹용을 코디셉스 밀리타리스 속 곰팡이 균주를 이용하여 발효시킨 경우는 찾아볼 수 없다.

따라서, 본 발명은 다양한 생리활성을 지닌 발효녹용의 유효성분 효율을 높이고 아울러 새로운 약리효과를 기대하기 위해 녹용을 발효시킬 수 있는 코디셉스 속 미생물을 분리하고자 본 연구를 수행한 결과 버섯 자실체로부터 새롭게 분리한 버섯 곰팡이 균주를 사용하여 녹용을 발효시킬 경우, 종래의 균주에 비해 유효성분의 함량을 크게 높일 수 있을 뿐만 아니라, 얻어지는 녹용 발효 추출물이 우수한 항산화 효과를 갖는다는 것을 발견하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 버섯 자실체로부터 분리되며, 녹용 발효 활성을 갖는 코디셉스 속의 신규의 균주를 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 신규의 균주를 이용한 녹용 발효 추출물의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 녹용 발효 활성을 갖는 신규의 코디셉스 밀리타리스(Cordyceps militaris) KCTC 11455BP 균주를 제공한다.

본 발명에 의한 녹용 발효 활성을 갖는 신규의 코디셉스 밀리타리스(Cordyceps militaris) KCTC 11455BP 균주는 버섯의 한 종류인 코디셉스 밀리타리스(Cordyceps militaris)로부터 얻을 수 있다.

야생 채집균은 2~3% Sodium hypochloride로 소독한 자실체를 petri dish 뚜껑에 멸균테이프로 고정 후 water agar(WA) 배지상에 떨어진 하기 표 1에 기재된 버섯의 자낭포자를 분리하여 각각 감자한천배지(Potato dextrose agar, PDA)에서 정치배양하여 균주를 분리하였다.

또한, 본 발명은 ⒜ 녹용분말 또는 녹용 추출물을 함유하는 고체배지 중에서 코디셉스 밀리타리스(Cordyceps militaris) KCTC 11455BP 균주를 가하여 발효시키는 단계; 및 ⒝ 얻어진 발효액을 농축 또는 원심분리하는 단계를 포함하는 녹용 발효추출물의 제조방법을 제공한다.

본 발명에서 이용된 녹용분말 함유 고체배지는 녹용분말에 증류수를 가하여 현탁 후 agar를 가하여 121℃에서 15분간 고압 멸균하여 Petri-dish에 담아 고체 배지로 사용할 수 있으며, 녹용 추출물을 함유한 고체배지는 녹용에 증류수를 가하여 100℃에서 3시간 환류 추출한 다음 원심분리하여 추출액을 회수하여 얻은 농축액에 증류수와 agar를 가하여 121℃에서 15분간 고압 멸균하여 Petri-dish에 담아 고체 배지로 사용할 수 있다.

녹용에 함유되어 있는 유효성분인 S-GAG(Sulfated-glycosaminglycan) 성분은 조골세포 성장 촉진, 파골세포 억제, 골다공증 예방 효과, 관절염 치료제의 지표물질로 관심이 증대된 물질이고, Sialic acid는 Gangliosides 의 종류를 결정하는 주요 지표 성분이다. Gangliosides는 기억력과 학습능력 증진 세포의 신경 전달계에 매우 중요한 역할을 한다.

본 발명은 하기 실험예에서 밝힌 바와 같이 종래 공지 균주인 코디셉스 밀리 타리스(Cordyceps militaris) KCTC 6472와는 다른 성질을 지닌 신규한 균주로서, 이를 이용하여 제조되는 녹용 발효추출물은 높은 함량의 유효성분을 함유하며 우수한 항산화 효과를 나타낸다.

본 발명은 버섯의 한 종류인 코디셉스 밀리타리스(Cordyceps militaris)로부터 녹용 발효 활성을 갖는 신규의 균주인 코디셉스 밀리타리스(Cordyceps militaris) KCTC 11455BP 균주를 제공한다.

또한, 본 발명에 따른 상기 균주는 녹용의 유효성분인 Total sugar, S-GAG량 및 sialic acid를 높은 함량으로 함유되는 녹용 발효추출물의 제조를 가능하게 하여 조골세포 성장 촉진, 파골세포 억제, 골다공증 예방 효과, 관절염 치료제, 기억력과 학습능력 증진 세포의 신경 전달계에 매우 유용하게 이용될 수 있을 뿐만 아니라, 상기 균주에 의해 제조되는 녹용 발효추출물은 항산화 효과의 약리활성을 나타낸다.

이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 코디셉스 밀리타리스(Cordyceps militaris) KCTC 11455BP 분리

1. 야생 버섯 5종의 균주로부터 성장이 좋은 균주 검정

가. 야생 버섯으로부터 균주의 분리

나. 균주의 배양

나-1. 녹용 분말 고체배지에서의 배양

녹용분말 4 g에 증류수 200 ml를 가하여 현탁 후 agar 4 g을 가하여 121℃에서 15분간 고압 멸균하여 Petri-dish에 담아 고체 배지로 사용하여 상기 분리된 균주를 각각 도말하여 25℃에서 5일간 배양하면서 균주의 성장여부를 확인하였다.

나-2. 녹용 추출물 함유 고체배지에서의 배양

녹용 10 g에 증류수 200 ml를 가하여 100℃에서 3시간 환류 추출하였다. 원심분리하여 추출액을 회수하였으며, 원심분리에 의해 얻은 침전에 증류수 150 ml를 가하여 2차 환류 추출하였다. 원심분리에 의한 얻은 2차 환류 추출액과 1차 추출액과 혼합 농축하여 농축액(7.5 brix) 80 ml을 얻었다. 농축 추출액 80 ml에 증류수 120 ml과 agar 4 g을 가하여 121℃에서 15분간 고압 멸균하여 Petri-dish에 담아 고체 배지로 사용하여 상기 분리된 균주를 각각 도말하여 25℃에서 5일간 배양하면서 균주의 성장여부를 확인하였다.

다. 성장정도 측정 및 균주 선정

상기의 녹용분말 고체배지와 녹용 추출물 고체배지에서 성장 정도에 따라 균주의 성장여부를 측정하여 각각 표 1 및 표 2에 나타내었다.

균주 성장이 매우 왕성 : +++,

균주 성장이 왕성 : ++,

균주 성장이 보통 : +,

균주 성장이 약함 : -+,

전혀 성장하지 않음 : -

라. 균주의 동정

상기 표 1 및 표 2 모두에서 성장이 매우 왕성한 코디셉스 밀리타리스(Cordyceps militaris)로부터 균주를 선정·분리하고 genomic DNA preparation Kit(SGD62 S120, Solgent Co. Ltd., Korea)을 이용하여 genomic DNA를 추출한 다음 유니버셜 프라이머(universal primer) ITS 1 (5'-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3')과 ITS 4 (5'-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3'), EF-Taq (SEF16 R250, Solgent Co. Ltd., Korea)으로 PCR (Applied Biosystem 9700, CA, USA)을 실시하여 증폭시켰다. 아세테이트와 70% 에탄올을 이용하여 정제한 다음 시퀀싱 키트 (Big dye terminator cycle sequencing ready reaction kit)와 ABI Prism 3730XL DNA analyzer(Applied Biosystems, CA, USA)로 염기서열을 결정하였다. 분리균주의 18S rRNA 염기서열은 EMBL/DDBJ/PDB/GenBank 시퀀스 데이터베이스로부터 얻은 유연균주의 서열과 정렬시키고 상동성을 비교하여 표 3에 나타내었으며, 그 결과 녹용분말 고체배지와 녹용 추출물 고체배지 모두 성장이 매우 왕성한 균주는 코디셉스 밀리타리스(Cordyceps militaris)였다. 상기 코디셉스 밀리타리스(Cordyceps militaris) 균주를 2009년 1월 16일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC)에 기탁번호 KCTC 11455BP로 기탁하였다.

마. 분리 균주의 균학적 특성

본 발명에 따른 코디셉스 밀리타리스(Cordyceps militaris) KCTC 11455BP 균주는 곰팡이 균주이므로 일반적인 세균의 균학적 성질을 규명하는 것과는 다르게 기존 공지된 코디셉스 밀리타리스(Cordyceps militaris)속 균주와 탄소원에 대한 영양요구성을 대비하여 균학적 특성을 비교실험 하였다.

한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC)에서 분양이 가능한 코디셉스 밀리타리스속 균주는 약 3가지 정도에 불과하고, 그 중에서도 식물자원으로부터 유래된 코디셉스 밀리타리스(Cordyceps militaris) 균주는 KCTC 6472(IFO 30377) 하나에 불과하며 분양이 가능한 균주이므로 하기 실험에서는 생물자원센터에서 분양받은 코디셉스 밀리타리스(Cordyceps militaris) KCTC 6472를 공지균주로 비교실험을 실시하였다.

본 발명에 따른 코디셉스 밀리타리스(Cordyceps militaris) KCTC 11455BP 균주와 코디셉스 밀리타리스(Cordyceps militaris) KCTC 6472 균주를 균학적 특성을 비교하기 위해 하기 방법을 통해 탄소원에 대한 영양요구도을 측정하였다.

Lily 배지(Maltose 9.5g/l, Asparagine 2.0g/l, KH₂PO₄ 1.0g/l, MgSO₄7H₂0 0.5g/l, Agar 20.0g/l)를 기본배지로 사용하여 탄소원(10 g/L)에 대한 두 균주의 영양요구도을 측정하였다. 배지를 121℃에서 20분간 고압멸균 후 상기 균주들을 5 mm cork borer를 사용하여 균총을 떼어내어 접종하였다. 접종균은 25℃ 배양기에서 15일간 정치배양한 후 colony직경 및 균사밀도를 측정하여 표 4에 나타내었다.

상기 표 4에서 알 수 있는 바와 같이, 각 탄소원에 코디셉스 밀리타리스 KCTC 11455BP 및 코디셉스 밀리타리스 KCTC 6472의 균사체를 같은 조건에서 배양한 결과 여러 탄소원에 대한 균사체 성장정도는 유사하였으며, 아라비노스에서 코디셉스 밀리타리스 KCTC 6472는 균사체의 성장정도가 본 발명에 따른 코디셉스 밀리타리스 KCTC 11455BP보다 높았으나, 균사체가 자란 밀도는 오히려 본 발명에 따른 코디셉스 밀리타리스 KCTC 11455BP가 훨씬 높았다.

이상의 결과에서 본 발명에 따른 코디셉스 밀리타리스 KCTC 11455BP와 공지균주인 코디셉스 밀리타리스 KCTC 6472는 아라비노스에 첨가시 탄소원에 대한 이용도가 상이함을 알 수 있어 양 균주는 균학적 특성이 다른 것을 확인할 수 있다.

< 실시예 2> 본 발명에 따른 코디셉스 밀리타리스 KCTC 11455 BP 에 의한 녹용 발효

PDB(potato dextrose broth) 배지 20 ml를 이용하여 상기 실시예 1에서 분리된 코디셉스 밀리타리스(Cordyceps militaris) KCTC 11455BP 균주를 25℃에서 5일 배양한 것을 전 배양으로 하였다.

녹용분말 4g에 50mM phosphate buffer (pH 6.0) 30 ml을 가하여 121℃에서 15분간 고압 멸균하여 25℃로 냉각한 후 상기 코디셉스 밀리타리스(Cordyceps militaris) KCTC 11455BP 균주의 전 배양액 1 ml를 가하여 25℃에서 5일간 배양하였다. 배양액에 증류수 60 ml를 가하여 100℃에서 3시간 환류 추출 후 원심분리하여 녹용 발효추출물을 얻었다.

<비교예 1> 코디셉스 밀리타리스 KCTC 6472에 의한 녹용 발효

상기 실시예 2와 동일한 방법으로 공지 균주인 코디셉스 밀리타리스(Cordyceps militaris) KCTC 6472 균주를 이용하여 녹용 발효추출물을 제조하여 비교예 1로 하였다.

<실험예 1> 녹용 추출물의 수율 비교

상기 실시예 2 및 비교예 1에서 제조된 녹용추출물의 수율을 측정하여 표 5에 나타내었다.

상기 표 5에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따른 코디셉스 밀리타리스(Cordyceps militaris) KCTC 11455BP 균주에 의한 녹용 발효추출물의 수율은 공지의 코디셉스 밀리타리스속 균주에 의한 녹용 발효추출물의 수율보다 2배 정도의 수율이 향상되었음을 알 수 있다.

<실험예 2> 녹용발효 추출물의 유효성분 함량 비교

녹용의 유효성분인 S-GAG(Sulfated-glycosaminglycan) 성분은 조골세포 성장 촉진, 파골세포 억제, 골다공증 예방 효과, 관절염 치료제의 지표물질로 관심이 증대된 물질이며, Sialic acid는 Gangliosides 의 종류를 결정하는 주요 지표 성분이고, Gangliosides는 기억력과 학습능력 증진 세포의 신경 전달계에 매우 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있어, 상기 실시예 2 및 비교예 1에서 제조된 녹용 발효추출물의 유효성분 함량을 비교하기 위하여 다음과 같은 실험을 실시하였다.

녹용 발효추출물에 대한 유효성분의 분석은 아래와 같은 방법으로 측정하였다. Total sugar 는 phenol-sulfuric acid 법(Omran 등1989)으로 측정하였으며, Sulfated-glycoaminoglycan(S-GAG) 측정은 Dimethyl-methylene blue dye binding 방법(Farndale 등, 1982)에 의해 540 ㎚에서 측정하였고, Sialic acid 측정은 80℃에서 1시간 동안 0.1 N 황산으로 가수 분해한 후에 Warren 방법(Warren, 1959)에 의해서 549 ㎚에서 측정하여 표 6에 나타내었다.

녹용 발효추출물의 유효성분 함량을 분석한 결과 표 6에서 알 수 있는 바와 같이, 유효성분인 Total sugar, S-GAG의 함량 및 sialic acid 함량은 발효전과 공지의 코디셉스 밀리타리스속 균주에 의한 녹용 발효추출물에서 유사하였으나, 본 발명에 따른 코디셉스 밀리타리스(Cordyceps militaris) KCTC 11455BP 균주에 의한 녹용 발효추출물에서 현저히 증가하는 것을 확인하였다.

그러므로 본 발명에 따른 코디셉스 밀리타리스(Cordyceps militaris) KCTC 11455BP 균주에 의한 녹용 발효추출물은 조골세포 성장 촉진, 파골세포 억제, 골다공증 예방 효과, 관절염 치료제, 기억력과 학습능력 증진 세포의 신경 전달계에 매우 유용하게 이용될 수 있다.

<실험예 3> 녹용 발효추출물의 항산화 효과

본 발명에 의한 실시예 2 및 비교예 1에서 제조된 녹용 발효추출물의 항산화 활성효과를 알아보기 위해서 하기 시험을 실시하였다.

항산화 활성은 DPPH 라디칼에 대한 소거활성 및 ABTS 소거활성 두가지를 측정하였다. DPPH 라디칼에 대한 소거활성은 Blois(1958)의 방법으로 측정하였다. 에탄올 적정량에 시료 0.2 mL와 4×10^-4 M DPPH 용액 0.8 mL을 가하여 10초간 혼합하고 10분간 방치 후 525 nm에서 흡광도를 측정하여 대조군과 비교하였다.

ABTS 소거활성은 Arnao 등(Arano et al. 2001)의 방법을 변형하여 측정하였다. 1.0 mM의 AAPH(2,2'-azobis(2-amodino-propane)dihydrochloride)은 100mM PBS buffer에 녹인 2.5mM의 ABTS(2,2'-azino-bis 3-ethylbenzenothiazolin-6-sulfonic acid)와 혼합한 후 68℃의 항온조에서 12분 동안 반응시켰다. ABTS 용액의 농도는 734nm에서 0.650±10.2가 되도록 조정하였다. 여러 가지 농도의 시료 20㎕와 980㎕ ABTS 용액을 37℃ water bath에서 10분간 반응시키면서 734nm에서 감소하는 흡광도 정도를 측정하였다. 이때 라디칼 50% 소거하는 추출물의 양의 농도(IC₅₀)를 구하였다.

상기 DPPH 라디칼에 대한 소거활성과 ABTS 소거활성을 측정 결과는 표 7에 나타내었다.

상기 표 7에서 알 수 있듯이, 녹용 발효추출물의 라디칼 소거능의 정도를 표시한 IC₅₀값은 ABTS라디칼 소거능 및 DPPH 라디칼 소거능 모두에서 본 발명에 따른 녹용 발효추출물이 기존 공지의 균주로부터 얻어진 녹용 발효추출물보다 약 2~3배의 항산화 활성 효과가 현저히 우수함을 확인 할 수 있었다.

Claims

녹용 발효 활성을 갖는 코디셉스 밀리타리스(Cordyceps militaris) KCTC11455BP.
녹용분말 또는 녹용 추출물을 함유하는 고체배지 중에서 코디셉스 밀리타리스(Cordyceps militaris) KCTC 11455BP를 가하여 발효시키는 단계; 및

얻어진 발효액을 농축 또는 원심분리하는 단계를 포함하는 녹용 발효추출물의 제조방법.
제 2 항에 있어서, 상기 발효시키는 단계에서 발효는 상온에서 1~5일 동안 수행되는 것을 특징으로 하는 녹용발효 추출물의 제조방법.
제 2 항에 기재된 방법에 의해 제조되는 녹용 발효추출물을 함유하는 항산화제.