CN116286764B - 一种透明质酸裂解酶及其重组菌与应用 - Google Patents
一种透明质酸裂解酶及其重组菌与应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种透明质酸裂解酶及其重组菌与应用。本发明提供了一种来源于弗氏柠檬酸杆菌的透明质酸裂解酶，克隆了其编码基因并在大肠杆菌体系实现了重组表达，经过启动子优化后酶活为2.64×104U/mL，蛋白分子量为87kDa。酶学性质表征实验表明其为内切酶，能够在pH 5‑8范围内发挥透明质酸降解作用，最适反应pH为5.5，最适反应温度为37℃。该酶具有良好的热稳定性，pH稳定性与耐盐性，可以耐受1.5M的氯化钠溶液。该酶对透明质酸有着较高的底物特异性。本发明利用优化的培养基，在5‑L发酵罐中，重组菌产透明质酸裂解酶的最高活性在14h可达2.65×106U/mL。
Description
技术领域
本发明涉及一种透明质酸裂解酶及其重组菌与应用，属于酶工程技术领域。
背景技术
透明质酸是一类糖胺聚糖，由重复的葡萄糖醛酸和N-乙酰氨基葡萄糖二糖单位组成，其具有的亲水性、粘弹性与生物相容性使其被广泛关注并应用于医药、美妆、食品等领域。透明质酸裂解酶(HA lyase)可通过β消除断裂其β-1，4糖苷键，降解为小分子透明质酸，在透明质酸加工、医药、发酵工业等领域应用广泛。
体内和体外实验证明，透明质酸的生物活性与其链长和分子量密切相关。低分子量透明质酸一般指相对分子质量在10-50kDa之间的透明质酸，而相对分子质量小于10kDa的透明质酸片段通常被归为透明质酸寡糖。与高分子量透明质酸不同，低分子量透明质酸与透明质酸寡糖具有独特的生物活性，如促进血管生成、抗氧化、抗炎等，因此在医药领域有着潜在的应用价值。此外，随着对透明质酸寡糖研究的深入，实验发现含不同二糖单元数量的透明质酸寡糖具有不同的生物学功能，如不饱和透明质酸二糖展现出独特的抗炎活性。因此，制备特定分子量的透明质酸有着重要意义。
目前，透明质酸的降解方法主要包括物理降解、化学降解和生物酶降解。其中，通过物理处理很难将透明质酸降解至10kDa以下；化学方法能够制备透明质酸寡糖，但其弊端在于其需要苛刻的反应条件，并有可能引入不必要的副反应，如糖链中单糖残基结构的破坏。相比之下，酶降解透明质酸更环保，反应迅速且条件更温和。
当前，商品化透明质酸酶主要来自动物组织提取，存在资源有限、比活力低、稳定性差等问题。相比之下，微生物来源的透明质酸裂解酶表现出更高活力与更强的稳定性，在低分子量透明质酸与透明质酸寡糖制备中具有良好的应用潜力。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供一种透明质酸裂解酶以及表达透明质酸裂解酶的重组菌株及应用。
本发明的第一个目的是提供一种透明质酸裂解酶，所述透明质酸裂解酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明的第二个目的是提供编码所述透明质酸裂解酶的基因。
进一步地，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明的第三个目的是提供一种携带所述基因的表达载体。
进一步地，所述表达载体以质粒pET-3b(+)为载体。
本发明的第四个目的是提供一种表达所述透明质酸裂解酶的重组菌。
进一步地，所述重组菌是以大肠杆菌为宿主，将grpE启动子、fnr启动子或alsR启动子与T7启动子串联，以串联启动子调控所述透明质酸裂解酶的表达。
进一步地，所述大肠杆菌为大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)。
本发明的第五个目的是提供一种采用所述重组菌发酵生产透明质酸裂解酶的方法，包括如下步骤：
将所述重组菌接种至发酵培养基中，在发酵过程中，pH维持在7.0～8.0，溶氧维持在20％以上。
进一步地，所述发酵培养基中包括18～22g/L甘油，且其中蛋白胨与酵母粉质量比为1.5～2.5：1。
进一步地，所述发酵培养基包括18～22g/L甘油，22～26g/L蛋白胨，10～14g/L酵母粉，0.15～0.20M KH2PO4与0.70～0.75M K2HPO4，pH为7.0～8.0。
本发明的第六个目的是提供所述透明质酸裂解酶在降解透明质酸中的应用。
进一步地，所述透明质酸为高分子量透明质酸，分子量为1000～1500kDa。
进一步地，所述应用是将高分子量透明质酸降解为低分子量透明质酸或寡糖。
进一步地，降解透明质酸的条件为：反应温度25-37℃、反应pH 5-7、搅拌速度50-100rpm、透明质酸浓度15-20g/L。
本发明的有益效果是：
本发明提供了一种来源于弗氏柠檬酸杆菌的透明质酸裂解酶，克隆了其编码基因并在大肠杆菌体系实现了重组表达，经过启动子优化后酶活为2.64×104U/mL，蛋白分子量为87kDa。酶学性质表征实验表明其为内切酶，能够在pH 5-8范围内发挥透明质酸降解作用，最适反应pH为5.5，最适反应温度为37℃。该酶具有良好的热稳定性，pH稳定性与耐盐性，可以耐受1.5M的氯化钠溶液。该酶对透明质酸有着较高的底物特异性。探究了基于产透明质酸裂解酶重组菌的发酵与罐上放大工艺。优化的培养基含20g/L甘油，24g/L蛋白胨，12g/L酵母粉，0.17M KH2PO4与0.72M K2HPO4，pH为7.5。利用优化的培养基，在5-L发酵罐中，重组菌产透明质酸裂解酶的最高活性在14h可达2.65×106U/mL。
附图说明：
图1为PCR扩增透明质酸裂解酶编码基因与线性化载体pET-3b(+)的核酸电泳图谱。(a)泳道1-2为扩增得到的透明质酸裂解酶编码基因；泳道M：10,000bp DNAMarker。(b)泳道1为反向PCR扩增得到的线性化载体pET-3b(+)；泳道M：10,000bp DNAMarker。
图2为pET-3b(+)-HylC质粒构建成功后的菌落PCR验证核酸电泳图。泳道1为重组菌菌落PCR扩增得到的携带目的基因的基因片段；泳道M：5,000bp DNA Marker。
图3为重组菌E.coli BL21(DE3)/pet-3b(+)-HylC与经过纯化的透明质酸裂解酶HylC的SDS-PAGE图谱。泳道1-2：E.coli BL21(DE3)/pet-3b(+)-HylC菌株破碎上清、HylC纯酶；泳道M：蛋白标准Marker。
图4为重组质粒的启动子替换(a)、启动子串联(b)结果示意图。
图5为HylC的最适反应温度(a)、温度稳定性(b)、最适反应pH(c)、pH稳定性(d)、耐盐性(e)以及金属离子对HylC酶活的影响(f)。
图6为HylC的底物特异性(a)、对不同浓度底物的酶解曲线(b)、酶动力学参数的双倒数作图(c)。
图7为100U/mL HylC对透明质酸降解1h(a)、3h(b)、6h(c)时的透明质酸寡糖分布情况。
图8为HylC酶解透明质酸终产物的质谱与薄层色谱分析(d)，以及对降解终产物还原末端的Elson-Morgan比色法分析。
图9为对重组菌的摇瓶培养基优化效果示意图。优化条件分别为甘油浓度(a)、蛋白胨酵母粉比例(b)、初始pH(c)。(d)为优化后培养基与在LB培养基、TB培养基中的重组菌发酵结果示意图。
图10为对重组菌的5-L发酵罐放大实验结果。(a)为仅控制初始pH的分批发酵策略、(b)为全程控制pH 7.5的分批发酵策略。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
透明质酸裂解酶酶活性的测定方法
2g/L透明质酸底物的配制：将2g透明质酸溶于1L 50mM柠檬酸缓冲液中，配制成2g/L的透明质酸底物溶液。
测定方法：根据3,5-二硝基水酸(DNS)比色法测定透明质酸裂解酶酶降解透明质酸产生的还原末端含量。分别以酶液和透明质酸溶液为实验组，灭活酶液和透明质酸溶液作为对照组，37℃反应15min，加入DNS试剂，沸水浴10min终止反应，冷却后使用酶标仪在540nm处测量吸光值。制备不同浓度的葡萄糖溶液，建立葡萄糖标准曲线。
酶活计算方法：酶活单位(1U)定义为上述实验条件下，每分钟产生1μg葡萄糖还原当量所需的酶量，测定均重复3次。以此作为透明质酸裂解酶酶活标准测定方法。
培养基：
LB培养基：10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母粉，10g/L氯化钠。
TB培养基：4g/L甘油，12g/L胰蛋白胨，24g/L酵母粉，0.17M KH2PO4,0.72M K2HPO4。
优化后培养基(Optimized TB)：20g/L甘油，24g/L胰蛋白胨，12g/L酵母粉，0.17MKH2PO4，0.72M K2HPO4，pH 7.5。
实施例1：透明质酸裂解酶基因的重组表达与纯化
从NCBI数据库中获取一条弗氏柠檬酸杆菌基因组中的多糖裂解酶8家族基因，以其为模板设计扩增引物hylc-IF(5’-AAGAAGGAGATATACATATGATGGGCAGCGTACATGCAC-3’)和R1(5’-TTGTTAGCAGCCGGATCCCTAATGATGATGATGATGATGTTTATTTTTAGATAATTCAAAAGAATAACTACTGCCGCGTAG-3’)。以基因组为模板进行PCR扩增，回收扩增产物(图1)，同时用反向PCR引物线性化pET3b质粒并回收。用一步法同源重组克隆试剂盒将PCR扩增产物和线性化质粒于连接，转化到E.coli JM109中，涂布培养，取单菌落进行菌落PCR鉴定(图2)。将透明质酸裂解酶表达载体pET3b(+)-HylC转入E.coli BL21(DE3)中，摇瓶发酵8h。离心收集菌体，将菌体用pH 5.5柠檬酸缓冲液重悬，超声破碎15min，离心收集上清液，进行酶活测定和SDS-PAGE电泳分析。
结果显示，透明质酸裂解酶HylC基因长度2376bp(SEQ ID No.2)，编码氨基酸791个(SEQ ID No.1)。与NCBI数据库的其他透明质酸裂解酶比对发现HylC与来自Yersiniaenterocolitica的多糖裂解酶(GenBank ID:ALG47349.1)具有最大的相似性为75.19％；另外与同样来自Citrobacter freundii的多糖裂解酶(GenBank ID:EHU7373968.1)具有74.94％的相似性。重组菌E.coli BL21/pET3b(+)-HylC酶活达到1.10×104U/mL。利用镍离子亲和层析方法对重组蛋白进行纯化，得到电泳级纯度的HylC重组酶。SDS-PAGE结果表明HylC的蛋白大小为90kDa左右，与理论分子量87kDa接近，符合预期(图3)。
实施例2：透明质酸裂解酶的重组表达元件优化
为提升透明质酸裂解酶HylC在大肠杆菌中的表达效率，在重组质粒pET3b(+)-HylC的基础上探究了启动子替换和双启动子构建对产酶效率的影响。利用BL21(DE3)的内源性强启动子替换质粒中原有的T7启动子，构建八个启动子替换重组质粒：pET-cadA-HylC、pET-j4-HylC、pET-e10-HylC、pET-dnaKJ-HylC、pET-asnB-HylC、pET-grpE-HylC、pET-fnr-HylC、pET-alsR-HylC。将重组质粒转化至BL21(DE3)宿主，在LB培养基中摇瓶发酵8h，测定酶活。
结果显示，8个启动子替换菌株中，5个展现出了较出发菌株更高的产酶效率，其中重组菌BL21(DE3)/pET-alsR-HylC的酶活达到1.92×104U/mL(图4a)。
在启动子替换结果基础上，选择产酶水平最高的三个启动子与T7启动子串联，构建重组质粒pET-grpET7-HylC、pET-fnrT7-HylC、pET-alsRT7-HylC，并在摇瓶水平测定产酶活力。
结果显示，启动子串联策略使重组菌的产酶效率进一步提升，其中在grpET7串联启动子调控下，重组菌产酶效率提升显著，达到2.64×104U/mL。
实施例3：透明质酸裂解酶酶学性质的测定
为考察透明质酸裂解酶在不同温度下对透明质酸的降解活性，将酶活标准测定方法中的温度改为22.5℃、25℃、30℃、32℃、35℃、37℃、38℃、40℃、45℃，测定酶活获得最适温度；在45℃与50℃下孵育酶液2h，以不同温度下最初的酶活为100％，获得温度稳定性曲线。用不同pH的柠檬酸缓冲液配置透明质酸底物进行酶活测定，获得最适pH值；将酶液置于不同pH的缓冲液中室温静置2h，并取样测定残留酶活，以不同pH下的初始最高酶活为100％，获得pH稳定性曲线。为表征金属离子对酶的活性的影响，分别配制金属离子终浓度为10mmol/L的含有Ca2+、Zn2+、Ni2+、Mn2+、K+、Mg2+、Al3+和Li+的孵育体系，室温孵育酶液1h，以不加金属离子的反应作为对照进行酶活检测。分别配制0.25-3mol/L的氯化钠溶液，对透明质酸裂解酶室温孵育1h并测定酶活，以表征其耐盐性。
结果表明本研究中透明质酸裂解酶HylC的最适反应温度为37℃，在25-38℃区间内有80％以上的相对酶活(图5a)，且在45℃下孵育2h酶活力稳定(图5b)。HylC的最适pH为5.5，并在pH 5-7范围内有80％以上相对酶活(图5c)。在pH 9-12的缓冲液中孵育2h，HylC酶活快速下降；而在pH 4-8的缓冲液中孵育，其相对稳定，残余酶活变化较小(图5d)。对HylC的耐盐性进行考察，发现小于1mol/L的NaCl溶液能够提升其酶解活性，并且在2mol/L NaCl溶液中能保持约70％的残余酶活(图5e)。10mmol/L Al3+、Mn2+、Mg2+离子对HylC酶活性有不同程度的抑制作用，而Ca2+、Zn2+、Ni2+、K+、Li+离子均对HylC的酶活有着促进作用，其中10mmol/L Ni2+离子处理后，HylC的相对酶活提升至约180％(图5f)。
实施例4：透明质酸裂解酶的底物特异性与动力学参数测定
为考察透明质酸裂解酶的底物特异性，使用pH 5.5柠檬酸缓冲液配置2g/L的透明质酸、硫酸软骨素A、硫酸软骨素C溶液用于测定HylC的酶活，对透明质酸的降解活性为100％。为考察其降解透明质酸的动力学参数，使用pH 5.5柠檬酸缓冲液配置0.02-0.16g/L的一系列不同浓度透明质酸溶液并于酶液混合，通过实时检测体系中反应溶液在232nm处的吸光度绘制酶解动力学曲线，并进行双倒数作图求出Km值与Vmax值。
结果表明，HylC对透明质酸有着较高的底物特异性，对硫酸软骨素A、硫酸软骨素C仅有5％左右的相对酶活(图6a)。通过双倒数作图，计算出HylC的Km值为0.71mg/mL，Vmax值为0.98A232/min(图6b,c)。
实施例5：透明质酸裂解酶对透明质酸的降解特性表征
为了验证透明质酸裂解酶HylC对透明质酸的降解特性，用pH 5.5柠檬酸缓冲液配置2g/L的透明质酸溶液，并加入酶液至其在反应体系中浓度为100U/mL。37℃恒温条件下搅拌反应并在1，3，6h取样，通过HPLC-MS液质联用方法检测寡糖分布，通过GPC凝胶渗透色谱方法检测降解产物的平均相对分子量，并通过HPLC-MS、TLC薄层色谱以及Elson-Morgan比色法检测降解终产物。
HPLC-MS结果表明，随着反应时间的增加，产物中透明质酸4糖、6糖、8糖以及10糖逐渐积累，多种寡糖的同时释放证明HylC为一种透明质酸内切酶(图7a,b,c)。GPC结果表明，100U/mL的HylC可在1h内快速地将透明质酸平均分子量从1300kDa降至20kDa以下(表1)。对HylC降解透明质酸的终产物进行分析，其相对分子质量约为378，结合TLC结果与Elson-Morgan显色法表明终产物为还原末端为N-乙酰氨基葡萄糖的不饱和透明质酸二糖(图8a,b)。
表1不同酶解时间下透明质酸的平均分子质量
实施例6：透明质酸裂解酶重组菌的培养基优化
为了进一步提升重组菌的产透明质酸裂解酶能力，在摇瓶水平对发酵培养基进行优化。以TB培养基为基础，按顺序分别优化了甘油浓度、蛋白胨酵母粉比例、初始pH三个培养条件。重组菌在10mL LB过夜培养后以2％接种量接种至不同配方的培养基中，培养8h后收集发酵液测定酶活与菌体浓度。
结果表明，在甘油浓度为20g/L、蛋白胨酵母粉比例为2：1、初始pH为7.5时，重组菌产酶效果最好(图9a,b,c)。与在LB培养基中相比，重组菌在优化后的培养基中产酶量提升2.35倍，达到6.2×104U/mL，且菌体量也有显著提升(图9d)。
实施例7：透明质酸裂解酶重组菌的5-L发酵罐放大
基于培养基优化结果，采用两种方法对重组菌在5-L发酵罐水平进行分批发酵：方法一为仅控制初始培养基pH 7.5，发酵全程不控制pH；方法二为在发酵过程中控制发酵液pH维持7.5。发酵过程中，通过调整通气与转速使溶氧维持在20％以上，并定期取样检测酶活、菌体量与pH。
结果表明，在方法一下，重组菌在21h达到产酶高峰，酶活为1.44×106U/mL，OD600在16左右(图10a)。在方法二下，通过流加碱控制pH维持7.5，重组菌的酶活和菌体量积累均有显著提升，分别提升至2.65×106U/mL以及24左右(图10b)，其酶活是目前文献报道的微生物源透明质酸裂解酶最高水平(在相同酶活定义下)。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
Claims (10)
1.一种透明质酸裂解酶，其特征在于，所述透明质酸裂解酶的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。
2.编码权利要求1所述透明质酸裂解酶的基因。
3.根据权利要求2所述基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
4.一种携带权利要求2或3所述基因的表达载体。
5.一种表达权利要求1所述透明质酸裂解酶的重组菌。
6.根据权利要求5所述重组菌，其特征在于，所述重组菌是以大肠杆菌为宿主，将grpE启动子、fnr启动子或alsR启动子与T7启动子串联，以串联启动子调控所述透明质酸裂解酶的表达，所述串联启动子为grpET7启动子、fnrT7启动子或alsRT7启动子。
7.一种采用权利要求5所述重组菌发酵生产透明质酸裂解酶的方法，包括如下步骤：
将所述重组菌接种至发酵培养基中，在发酵过程中，pH维持在7.0～8.0，溶氧维持在20％以上。
8.根据权利要求7所述方法，其特征在于，所述发酵培养基包括18～22g/L甘油，22～26g/L蛋白胨，10～14g/L酵母粉，0.15～0.20M KH2PO4与0.70～0.75M K2HPO4，pH为7.0～8.0。
9.权利要求1所述透明质酸裂解酶在降解透明质酸中的应用。
10.根据权利要求9所述应用，其特征在于，降解透明质酸的条件为：反应温度25-37℃、反应pH 5-7、搅拌速度50-100rpm、透明质酸浓度2g/L。
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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