CN114276424B

CN114276424B - 一种通过过表达基因hmg提高鸡枞菌菌丝生长的方法

Info

Publication number: CN114276424B
Application number: CN202111669479.4A
Authority: CN
Inventors: 龙雁华; 赵玉; 周琳琳; 李夏雨; 桂昊; 张晨; 张勇; 杨云秋
Original assignee: Anhui Agricultural University AHAU
Current assignee: Anhui Agricultural University AHAU
Priority date: 2021-12-31
Filing date: 2021-12-31
Publication date: 2024-03-01
Anticipated expiration: 2041-12-31
Also published as: CN114276424A

Abstract

本发明公开了一种通过过表达基因hmg提高鸡枞菌菌丝生长的方法，属于基因工程以及微生物工程技术领域。本发明通过在鸡枞菌中过表达基因hmg，显著提高了鸡枞菌菌丝体生长的能力；将利用本发明的方法制备得到的重组鸡枞菌菌株接种到PDA培养基上培养发现，相对于野生型菌株，重组菌株中hmg基因的表达量均上调了1.17‑3.83倍；此外，菌丝显微镜观察发现，hmg基因过表达菌丝直径均明显大于野生型；菌落观察发现hmg基因过表达菌株的菌丝比野生型更浓密，菌丝缠绕更加紧实，菌丝表面颜色更深，说明过表达鸡枞菌hmg基因对鸡枞菌菌丝体的生长、成熟以及形态都有一定的影响。

Description

一种通过过表达基因hmg提高鸡枞菌菌丝生长的方法

技术领域

本发明涉及一种通过过表达基因hmg提高鸡枞菌菌丝生长的方法，属于基因工程领域。

背景技术

鸡枞菌(Termitomyces clypeatus)属于离褶伞科(Lyophyllanceae)、蚁巢伞属(Termitomyces)，是一种著名的与白蚁共生的野生蘑菇，主要分布在非洲和亚洲。在自然界，大白蚁亚科昆虫构筑蚁巢的同时也培养大量鸡枞菌菌丝体，形成一个共生系统。蚁巢是白蚁与鸡枞菌共生的生态环境。蚁巢多建于地下10-100厘米处，体积从0.1-1.0立方米不等，之间有蚁道相互连接，为白蚁与鸡枞菌共生提供良好的生态系统。

鸡枞菌肉厚肥硕，质细丝白，味道鲜甜香脆，清香鲜美，营养丰富，含丰富的蛋白质及多糖、脂类、皂苷和麦角甾醇等活性物质，具有降血糖、降血脂、抗氧化、护肝以及镇痛、抗炎等药理作用。因此，在每年的出菇阶段，市场消费者对该食用菌的需求极大，但鸡枞菌的自然资源显得十分稀有和珍贵，导致市场价格较为昂贵。

食用菌增产方式主要包括优化营养条件和遗传育种。营养条件的优化包括添加促增产物质、优化栽培料配方以及改良栽培方式。基因工程育种为选育更优良性状的食用菌菌种带来了曙光，这一技术需要基于子实体发育调控基因的深入研究。随着分子生物学在食用菌中的应用，逐渐可见一些关于调控食用菌子实体发育基因的报道。通过从基因水平研究裂褶菌(Schizophyllum commune)、柄孢壳菌(Podospora anserina)、金针菇(Flammulina velutipes)、草菇(Volvariella volvacea)、香菇(Lentinula edodes)等真菌的菌丝生长和子实体形成的相关基因，以提高真菌的菌丝生长。

目前，现有技术中多是通过优化营养条件以提高鸡枞菌生长发育，如专利CN109328863A、CN108293589A中通过优化鸡枞菌的培养基以提高鸡枞菌菌丝生长，但从基因水平研究鸡枞菌生长发育的文章鲜有报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是如何在分子水平上促进鸡枞菌菌丝的生长，为鸡枞菌选育提供一个方向。

为了解决上述技术问题，本发明首先提供了来源于鸡枞菌的HMG-box蛋白在调控鸡枞菌菌丝生长的应用。

在一种实施方式中，所述HMG-box蛋白为如下(a)或(b)的蛋白质：

(a)氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的蛋白质；

(b)将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代或缺失或添加得到的具有相同功能的蛋白质。

本发明还提供了与HMG-box蛋白相关的生物材料在调控鸡枞菌菌丝生长的应用。

在一种实施方式中，所述生物材料包括编码HMG-box蛋白的核酸分子，或含有编码HMG-box蛋白的核酸分子的表达盒或重组载体，或含有HMG-box蛋白的核酸分子、编码HMG-box蛋白的核酸分子的表达盒或重组载体的微生物细胞。

在一种实施方式中，核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

在一种实施方式中，所述编码HMG-box蛋白的核酸分子的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。

在一种实施方式中，所述重组载体包括质粒、噬菌体或病毒载体。

在一种实施方式中，所述微生物细胞包括酵母、真菌或细菌。

在一种实施方式中，所述微生物细胞包括农杆菌。

本发明还提供了一种促进鸡枞菌菌丝生长的方法，所述方法为提高鸡枞菌中HMG-box蛋白的表达量和/或活性，得到转基因鸡枞菌。

在一种实施方式中，所述提高鸡枞菌中HMG-box蛋白的表达量和/或活性的方法是通过对鸡枞菌中的HMG-box蛋白的编码基因进行过表达。

在一种实施方式中，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供了一种筛选菌丝生长快的鸡枞菌的方法，所述方法为测定待测鸡枞菌的hmg基因的表达量。

在一种实施方式中，所述hmg基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

有益效果：

(1)本发明通过在鸡枞菌菌丝块中过量表达HMG-box转录因子基因hmg，得到了9株菌丝生长速度显著提高的重组鸡枞菌hmg#1～hmg#9。hmg基因过表达菌株hmg#1～hmg#9的菌丝比野生型更浓密，菌丝缠绕更加紧实，菌丝表面颜色更深，且老化更快，有效缩短菌丝生长周期。

(2)取28℃培养20d的野生型菌株和hmg基因过表达菌株hmg#1～hmg#9，显微镜观察到hmg基因过表达菌株hmg#1～hmg#9的菌丝直径均明显大于野生型。28℃恒温培养28d，除过表达菌株hmg#9以外，hmg基因过表达菌株hmg#1～hmg#8在生长28天后的直径是野生型菌株1.12～1.38倍。

生物保藏证明

鸡枞菌(Termitomyces clypeatus)Tc01，分类命名为Termitomyces clypeatus，已于2021年12月29日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号，保藏编号为CCTCC M 20211695。

附图说明

图1：重组质粒plasmid1-hmg。

图2：重组质粒plasmid1-hmg的酶切验证；M:DL8000 DNAMarker,1:重组质粒plasmid 1-hmg,2:重组质粒plasmid 1-hmg双酶切,3:hmg,4:hyg。

图3：拟转化子潮霉素PCR产物检测，M:DL2000 DNAMarker,1-9:拟转化子,W:野生型菌株,P:plasmid1-hmg阳性对照。

图4：hmg基因过表达载体特异序列PCR产物检测，M:DL2000 DNAMarker,1-9:拟转化子,W:野生型菌株,P:plasmid1-hmg阳性对照)。

图5：hmg基因过表达菌株的qRT-PCR鉴定，w:野生型菌株；1-9:hmg基因过表达菌株。

图6：野生型和hmg基因过表达菌株在培养基上的菌丝生长结果。A:野生型菌株；B-J:hmg基因过表达菌株hmg#1～hmg#9。

图7：野生型和hmg基因过表达菌株在培养基上的菌丝生长结果。A:野生型菌株；B-J:hmg基因过表达菌株hmg#1～hmg#9。

图8：野生型和hmg基因过表达菌株在培养基上的菌丝生长结果。A:野生型菌株；B-J:hmg基因过表达菌株hmg#1～hmg#9。

图9：40×显微镜观察野生型和hmg基因过表达菌株在培养基上的菌丝生长结果。A:野生型菌株；B-J:hmg基因过表达菌株hmg#1～hmg#9。

具体实施方式

下述实施例中涉及的反转录试剂盒、PCR产物纯化试剂盒、质粒小提试剂盒以及荧光定量PCR试剂盒均购自康润生物有限公司，型号分别为：A2214、D205、D201、A301；下述实施例中涉及的RNA提取试剂盒购自MP生物医疗公司，型号为116035-050；下述实施例中涉及的DNA提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司，型号为DP305；下述实施例中涉及的大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α和根癌农杆菌GV3101均购自上海唯地生物技术有限公司；

下述实施例中涉及的plasmid1质粒由福建农林大学谢宝贵教授和陈炳智老师惠赠(陈炳智，李凌，陈天赐，邱铭锰，吴敏文，谢宝贵，江玉姬.草菇MADS-box转录因子Vvrin1基因过表达转化子菌株的构建及其生长速度的初步差异分析[J/OL].菌物学报.https://doi.org/10.13346/j.mycosystema.200044)。

下述实施例中的鸡枞菌均为鸡枞菌Tc01，来源于安徽农业大学生命科学学院微生物与昆虫互作研究团队。

下述实施例中涉及的培养基如下：

LB培养基：胰蛋白胨10g/L、酵母浸出粉5g/L、氯化钠10g/L。自然pH，121℃高压蒸汽灭菌20min，加入1.3％的琼脂粉可得到LB固体培养基。

PDA培养基：土豆200g/L(煮熟并过滤后留提取液备用)，葡萄糖20g/L。自然pH，115℃高压蒸汽灭菌30min，加入1.3％的琼脂粉可得到PDA固体培养基。

IM培养基：K₂HPO₄10 mM、KH₂PO₄10 mM、葡萄糖10mM、NaCl 2.5mM、(NH₄)₂SO₄ 2mM、MgSO₄·7H₂O 2mM、CaCl₂0.7 mM、FeSO₄·7H₂O(过滤除菌)9μM、50％甘油1％、乙酰丁香酮(AS)(用DMSO溶解，过滤除菌)200μM、MES(过滤除菌)40mM。上述培养基除有特殊说明外，都是121℃高压蒸汽灭菌20min。

Co-IM培养基(Co-cultivation medium)：在IM培养基中加入1.3％的琼脂粉成为固体培养基。

初筛培养基：含有浓度为400μg/mL的头孢噻肟钠霉素(Cef)和20μg/mL的潮霉素(Hyg)的PDA培养基。

复筛培养基：含有浓度为400μg/mL的头孢噻肟钠霉素(Cef)和30μg/mL的潮霉素(Hyg)的PDA培养基。

实施例1：编码HMG-box蛋白的基因的克隆

具体步骤如下：

将鸡枞菌菌株接种于PDA平板上，28℃培养20d；收集菌丝，使用RNA提取试剂盒提取总RNA；根据反转录试剂盒的说明将RNA反转录成cDNA；以cDNA为模板，使用基因hmg的特异性引物hmg-F和hmg-R(表1)，通过PCR反应扩增hmg基因；PCR反应结束，得到扩增产物，对扩增产物进行纯化后通过1％琼脂糖凝胶电泳(电泳条件：100V，35min)验证扩增产物条带大小，凝胶成像仪中成像验证条带为801bp左右，条带单一且大小正确，获得hmg基因；将获得的hmg先按照PCR产物纯化试剂盒的要求进行纯化，获得hmg纯化产物，置于冰箱-20℃保存。

PCR反应体系包含：上下游引物各1μL、cDNA 1μL、ddH₂O 10μL、2×SuperStar PlusPCR Mix 10μL；

PCR反应条件为：98℃，30s；(98℃，10s；52℃，30s；72℃，1min)循环35次；72℃，10min；4℃，保存。

表1引物序列

实施例2：重组质粒plasmid1-hmg的构建

具体步骤如下：

设计hmg基因的酶切引物SpeⅠ-hmg-F和ApaⅠ-hmg-R(表3)，以实施例1中得到的hmg纯化产物为模板，通过PCR反应在基因两端加上酶切位点，得到基因片段SpeⅠ-hmg-Apa Ⅰ；用限制性内切酶Spe Ⅰ和Apa Ⅰ分别酶切质粒plasmid 1和SpeⅠ-hmg-Apa Ⅰ基因片段，然后经过琼脂糖凝胶电泳切胶回收前者大片段和后者小片段，并用T4 DNA连接酶将两个回收片段连接，具体连接体系如表2，得到重组质粒plasmid 1-hmg(重组质粒结构如图1所示)。将重组质粒plasmid 1-hmg转入大肠杆菌DH5α，涂布于LB平板，37℃过夜培养后，挑取阳性单菌落进行菌落PCR验证，结果显示hmg片段长度为801bp，载体上的抗性基因hyg片段长度为860bp，与预期片段大小一致(如图2所示)，测序验证结果表明连接成功。将PCR验证为阳性的菌落扩大培养，提质粒并进行双酶切验证，结果显示，质粒被SpeⅠ和ApaⅠ双酶切成两个片段(hmg片段和大片段)，且大小与预期相符(如图2所示)。

PCR反应体系和反应条件：同实施例1。

表2连接体系

表3引物序列

实施例3：hmg基因过表达菌株的构建

具体步骤如下：

(1)将实施例2中构建得到的重组质粒plasmid 1-hmg通过冻融法转入农杆菌GV3101，得到重组农杆菌菌株，将其接种至LB固体平板上(含Kan 50μg/mL和Rif50μg/mL)，28℃暗培养2d。待长出单菌落后，接种单菌落至5mL的LB液体培养基(含Kan 50μg/mL和Rif50μg/mL)中扩大培养，28℃，200rpm，振荡培养2d。取1mL扩大培养的重组农杆菌菌液加入到100mL LB液体培养基中(含Kan 50μg/mL和Rif50μg/mL)，200rpm，28℃，培养10～15h。收集菌液，4000rpm离心10min，去上清后，用100mL IM培养基重悬，添加乙酰丁香酮(AS)至终浓度为200μmol/L，于200rpm，28℃，暗培养6h，诱导农杆菌毒力。

(2)将鸡枞菌菌丝块放入上述步骤(1)中得到的农杆菌菌液中浸泡30min，用无菌镊子夹取单个鸡枞菌菌丝块，在无菌滤纸上稍微吸干表面菌液，然后置于IM固体培养基中，22～28℃共培养1～3d(黑暗条件)。

(3)将共培养后的鸡枞菌菌丝块接种到初筛培养基上，28℃培养至初筛菌丝萌发，挑取新生菌丝转移到复筛培养基上，28℃培养20d左右。将经过复筛后的拟转化子分别接种于PDA固体培养基上，经28℃恒温培养20d后收集菌丝，提取菌丝体中的DNA，再对各个拟转化子进行潮霉素hyg序列和基因过表达载体的特异序列进行PCR验证。经PCR验证并测序成功的菌株即为hmg基因过表达菌株hmg#1～hmg#9(如图3和图4所示)。其中，扩增潮霉素hyg序列的引物见实施例2中的表3，扩增基因过表达载体的特异序列所用引物见表4。

表4

PCR反应体系和反应条件：同实施例1。

实施例4：hmg基因过表达菌株的qRT-PCR鉴定

将实施例3获得的hmg基因过表达菌株hmg#1～hmg#9和野生型菌株分别接种于PDA固体培养基上，28℃恒温培养20d后收集菌丝体，分别提取hmg基因过表达菌株和野生型菌丝体的总RNA，用反转录试剂盒反转录总RNA获得cDNA，通过qRT-PCR法检测hmg基因过表达菌株和野生型菌株中基因hmg的相对表达水平。结果显示，所有重组菌株中hmg基因表达量均显著高于野生型菌株，且相对于野生型菌株，重组菌株中hmg基因的表达量均上调了1.17-3.83倍(如图5所示)，进一步说明hmg基因得到了过表达。

实施例5：野生型菌株及hmg基因过表达菌株生长速度测定

将野生型菌株和hmg基因过表达菌株hmg#1～hmg#9取相同直径，分别接种于PDA固体培养基中央，置于28℃恒温培养28d，每7d测量一次菌落直径。除hmg基因过表达菌株#9以外，hmg基因过表达菌株hmg#1～hmg#8在生长28天后的直径是野生型菌株1.12～1.38倍，说明这8个hmg基因过表达菌株的生长速度均比野生型菌株快(如图6所示)。

此外，通过对hmg基因过表达菌株菌落的观察，可以发现hmg基因过表达菌株hmg#1～hmg#9的菌丝比野生型更浓密，菌丝缠绕更加紧实，菌丝表面颜色更深，且老化更快，有效缩短菌丝生长周期(如图7所示)，说明过表达鸡枞菌hmg基因对鸡枞菌菌丝体的生长、成熟以及形态都有一定的影响。

另外，取生长时间相同28℃培养20d的野生型菌株和hmg基因过表达菌株hmg#1～hmg#9，显微镜观察并拍照记录菌丝生长情况。在40×视野中，观察到hmg基因过表达菌株hmg#1～hmg#9的菌丝直径均明显大于野生型，且可以观察到部分hmg基因过表达菌株hmg#3和hmg#4的菌丝不断分裂，说明菌丝生长仍处于旺盛阶段(如图8和图9所示)，进一步说明过表达hmg基因对鸡枞菌菌丝体的生长具有明显的促进作用。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 安徽农业大学

<120> 一种通过过表达基因hmg提高鸡枞菌菌丝生长的方法

<130> BAA211582A

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 266

<212> PRT

<213> 鸡枞菌

<400> 1

Met Ser Val Leu Ala Phe Leu Arg Ile Ala Ala Arg Arg Val Tyr Thr

1 5 10 15

Val Ser Thr Pro Thr Arg Arg Ala Gly Gly Ser Phe Arg Leu Val Ser

20 25 30

Asn Thr Leu Thr Arg Ser Phe Ile Thr Ser Val Gly Arg Ala Glu Pro

35 40 45

Ala Ser Ala Lys Pro Lys Thr Thr Ser Asn Thr Lys Lys Ser Glu Lys

50 55 60

Gly Ser Thr Lys Lys Thr Val Lys Ala Lys Ala Lys Thr Lys Val Lys

65 70 75 80

Glu Val Val Lys Lys Gln Ala Lys Lys Ala Thr Lys Pro Ala Glu Lys

85 90 95

Val Thr Ile Pro Lys Ser Ile Lys Ile Pro Pro Arg Gly Ile Ser Ser

100 105 110

Phe Leu Tyr Phe Leu Thr Lys Ile Phe Lys Pro Glu Leu Pro Arg Thr

115 120 125

Lys Glu Asn Leu Pro Glu Val Thr Arg Leu Gly Ala Glu Ala Trp Asn

130 135 140

Asn Leu Ser Glu Ala Glu Lys Gln Lys Phe Ile Glu Met Ser Ser Ala

145 150 155 160

Thr Arg Ile Lys Ala Asn Arg Glu Arg Gln Asp Tyr Ile Asn Ala Leu

165 170 175

Glu Pro Lys Ile Ile Leu Glu Leu Asn Arg Arg Arg Val Ala Leu Gly

180 185 190

Lys Lys Lys Leu His Arg Lys Met Gly His Thr Ile Met Asn Pro Tyr

195 200 205

Leu Met Trp Ile Glu Glu Phe Arg Ala Ser His Pro Gly Gln Tyr Gly

210 215 220

Gly Ile Gln Ser Val Thr Arg Leu Gly Gln Ile Trp Ser Gly Met Ser

225 230 235 240

Asp Glu Glu Lys Gln Pro Tyr Arg Asp Arg Tyr Asn Ala Ala Lys Val

245 250 255

Leu Ala Lys Glu Asn Leu Glu Thr Gln Ala

260 265

<210> 2

<211> 801

<212> DNA

<213> 鸡枞菌

<400> 2

atgtccgttc ttgctttcct gcgtattgca gctcgtcgcg tctatacagt ctctacgcct 60

actcgtcgag caggagggag cttcagattg gtttccaaca cgctaacacg ctcattcatc 120

acgagtgtcg gacgcgctga gcctgcaagc gctaagccaa aaactacttc caacaccaag 180

aaatcagaga aaggaagtac aaagaaaact gtgaaagcaa aggcaaaaac aaaggtgaag 240

gaggttgtaa aaaagcaggc gaaaaaagct acgaaacccg ccgagaaagt cacaatccct 300

aagagtatta aaattcctcc ccgtggcatc tcttctttcc tttatttctt gacaaaaatc 360

ttcaagcccg agctccctcg aaccaaagaa aatttaccag aagtcaccag gctgggcgct 420

gaggcgtgga acaacttgtc ggaagccgag aaacagaaat tcattgagat gagcagtgca 480

actcgtatca aggcaaatcg ggaacgtcag gactatatca atgctctgga gccgaaaatc 540

attctggaat tgaaccgtcg tagggttgca cttggaaaaa agaaattaca cagaaagatg 600

ggtcacacga taatgaatcc atacttaatg tggattgagg agttccgtgc atcgcatcct 660

ggacaatacg gtggaattca atcggtaacc cgtcttggcc agatttggag tggtatgagc 720

gatgaggaga agcagcctta ccgcgatcga tacaacgccg ctaaggtgtt agctaaagag 780

aatctcgaaa cgcaagcatg a 801

Claims

1.HMG-box蛋白在调控鸡枞菌菌丝生长的应用，其特征在于，所述HMG-box蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.与权利要求1所述HMG-box蛋白相关的生物材料在调控鸡枞菌菌丝生长的应用，其特征在于，所述生物材料包括编码HMG-box蛋白的核酸分子，或含有编码HMG-box蛋白的核酸分子的表达盒或重组载体，或含有HMG-box蛋白的核酸分子、编码HMG-box蛋白的核酸分子的表达盒或重组载体的微生物细胞。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述核酸分子是DNA或RNA。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述编码HMG-box蛋白的核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述重组载体包括质粒、噬菌体或病毒载体。

6.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述微生物细胞包括真菌或细菌。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述微生物细胞包括农杆菌。

8.一种促进鸡枞菌菌丝生长的方法，其特征在于，所述方法为提高鸡枞菌中权利要求1所述HMG-box蛋白的表达量和/或活性，得到转基因鸡枞菌。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述方法是通过对鸡枞菌中的权利要求1所述HMG-box蛋白的编码基因进行过表达。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述HMG-box蛋白的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。