CN104012302A

CN104012302A - 一株高产脑苷脂类化合物的鸡枞菌菌种及其菌丝体培养方法

Info

Publication number: CN104012302A
Application number: CN201410252645.4A
Authority: CN
Inventors: 缪冶炼; 花卫俊; 陈玲; 袁丽红
Original assignee: Nanjing Tech University
Current assignee: Jinzhu Manjiang Agriculture Co ltd
Priority date: 2014-06-09
Filing date: 2014-06-09
Publication date: 2014-09-03
Anticipated expiration: 2034-06-09
Also published as: CN104012302B

Abstract

本发明涉及一株高产脑苷脂类化合物的鸡枞菌菌种Termitomyces sp.CTM-1，其菌种保藏号是CCTCC NO：M2014185。本发明还涉及培养上述的鸡枞菌菌种的方法。本发明通过对鸡枞菌菌种的液体培养，可获得菌丝体干物产量15.90g/L，菌丝体中脑苷脂A和B的含量分别达到0.29％,d.b.、0.11％,d.b.，含量大大高于野生鸡枞菌，可实现鸡枞菌的人工培养以及工业化生产，克服了野生鸡枞菌子实体资源稀少、采收季节性强、价格昂贵、脑苷脂A和B含量低等问题。本发明所涉及的菌种制备和菌丝体培养方式同样适合于以其他食用菌为原料、通过液体培养生产富含脑苷脂的菌丝体。

Description

一株高产脑苷脂类化合物的鸡枞菌菌种及其菌丝体培养方法

技术领域

本发明属于微生物领域，涉及一株高产脑苷脂类化合物的鸡枞菌菌种及其菌丝体培养方法。

背景技术

疼痛是临床上最常见的症状之一。疼痛困扰着人们的健康和生活质量，长期的剧烈疼痛(如癌性疼痛、顽固性疼痛等)是一种难以忍受的折磨。世界上，慢性疼痛的患病率高达35.5％，美国至少有一亿以上的疼痛患者，中国约有2亿多的疼痛患者，但是约有85％患者的疼痛并没有得到及时缓解。目前临床镇痛药存在的问题包括：1麻醉性镇痛药和解热镇痛药能减轻患者的痛苦，但仍有为数不少的疼痛不能得到有效的控制；2目前临床的镇痛药存在不容忽视的副作用—毒性、成瘾性、耐受性；3镇痛药不仅要减轻和消除疼痛，也需要能保护神经系统，以阻止疼痛应激-疼痛病理性反应之间形成的恶性循环；4疼痛的病理机制复杂，因此需要研发多靶点、多效应和叠加效应的镇痛药物。脑苷脂类化合物是单糖或低聚糖与神经酰胺末端羟基结合所形成的苷，是细胞膜/壁的结构成分。陈玲等(专利申请号201210242213.6提供的脑苷类化合物在制备镇痛药物中的应用，专利申请号201310272349.6提供的脑苷类化合物在制备镇痛药物中的应用)发现脑苷脂A和B具有显著的镇痛作用。脑苷脂A和B作为新型镇痛药物的特点是：对神经性疼痛和炎性疼痛的镇痛作用强、持续时间长，无明显副作用，也没有药物成瘾和药物耐受反应。此外，脑苷脂A和B通过腹腔注射、口服、皮肤涂抹等途径给药，都显示有明显的镇痛作用，生物利用度高达46.7％。

中国的脑卒中发病率排名世界第一，比美国高出一倍。我国第三次国民死亡调查结果表明，脑卒中已经升为中国第一位死亡病因。据世界卫生组织“多国心血管病趋势和决定因素监测”统计,1991～1999年间上海地区35～74岁年龄组脑卒中平均年发病率为168.2/10万，脑卒中发病率呈上升趋势。但是，目前没有脑卒中的有效治疗药。脑苷脂A和B对脑卒中的神经细胞死亡有保护作用(Chi S,Cai W,Liu P,Zhang Z,ChenX,Gao L,Chen L,Qi Z.Baifuzi reduces transient ischemic brain damage through aninteraction with the STREX domain of BKCa channels.Cell Death and Disease,2011,1(1):e13.PMID:21364615；LiL,Yang R,Sun K,Bai Y,Zhang Z,Zhou L,Qi Z,Qi J,Chen L.Cerebroside-A provides potent neuroprotection after cerebral ischemia throughreducing glutamate release and Ca²⁺influx of NMDA receptors.The International Journalof Neuropsychopharmacology,2011,4:1-11.)。脑苷脂A和B能通过血脑屏障，减小缺血后的脑梗塞面积和神经细胞死亡，减轻脑水肿。脑苷脂A和B促进脑卒中后运动和认知功能的恢复，降低脑卒中的死亡率。由于脑苷脂A和B对神经保护作用的多靶点特性，使得脑苷脂A和B治疗脑卒中的有效时间窗≥26小时(专利号ZL200910024861.2提供的一种保护缺血性脑损伤的白附子脂溶性成分提取物；专利号ZL200910154675.0提供的一种脑苷脂类化合物的应用；专利号ZL201110324561.3提供的一种脑苷脂B化合物的应用)。因此，脑苷脂A和B治疗脑卒中的疗效高、特异性强、有效窗口期长、多分子靶点。

脑苷类化合物存在于动物、植物、真菌和海洋生物。由于全世界疯牛病的不断发生，脑苷类化合物来源需要从动物脑转向植物、食用菌等。鸡枞菌是一种肉质细嫩，气味浓香，味道鲜美，营养丰富的野生珍稀食药用菌，主要分布于非洲热带、亚洲热带、南太平洋岛屿和亚洲的亚热带地区，中国只有贵州、云南、四川等省的山区能够生长。中国发明专利(专利号ZL200910154675.0提供的一种脑苷脂类化合物的应用)的新工艺能快速、简便、得率高地从鸡枞菌子实体中提取、分离和纯化，获得纯度在99.0％以上的脑苷脂A和B。但是另一方面，由于鸡枞菌与白蚁共生,其子实体仅能在白蚁巢上生长，至今还没有实现鸡枞菌子实体人工培养的产业化。野生鸡枞菌子实体资源稀少、采收季节性强、价格昂贵，并且鸡枞菌子实体中脑苷脂A、B的含量仅有百万分之几(Qi J H,Ojika M,Sakagami Y.Termitomycesphins A-D,novel neuritogeniccerebrosides from the edible chinese mushroom Termitomyces albuminosus[J].Tetrahedron,2000,56:5835-5841)。这些问题是脑苷脂A、B成药的瓶颈。

因此，如何实现人工培养鸡枞菌子实体以提取脑苷脂A和B亟待解决。

发明内容

本发明的目的是提供一株高产脑苷脂类化合物的鸡枞菌菌种，克服野生鸡枞菌子实体中脑苷脂A和B含量较低的问题。

本发明的第二目的是提供培养上述富含脑苷脂类化合物的鸡枞菌菌种的方法。

本发明通过以下技术方案来实现：

一、一株高产脑苷脂类化合物的鸡枞菌菌种Termitomyces sp.CTM-1，其菌种保藏号是CCTCC NO：M2014185。

本发明的鸡枞菌菌种是从野生鸡枞菌子实体中筛选出来的，野生鸡枞菌子实体于2013年8月从云南省红河州建水县山区采集，编号，置于4-10℃冰箱保存。

将采集到的野生鸡枞菌子实体清洗、消毒，用手术刀取子实体的组织，切成约0.1cm³的小块。将组织块(共86块)分别接入装有斜面培养基的试管，置于25℃恒温培养箱中培养5-16d，诱发出各组织的菌丝。斜面培养基按以下方法制备。配方(g/L)：马铃薯浸出粉15，葡萄糖20，琼脂20，酵母浸粉2，pH5；121℃灭菌20min；室温条件下冷却至约60℃，倒制斜面。

选择从子实体诱发出来的3株菌51-S_M-2、51-S_T-1、51-P-3为对象，取100μL菌液至平板培养基，用灭菌涂布棒将菌液涂布均匀，于25℃恒温培养箱中倒置培养5-6d后，选取边缘整齐、菌丝浓白的单菌落。纯化操作共重复3次，得到菌株51-S_M-2/P2、51-S_T-1/P1、51-P-3/P1。平板培养基按以下方法制备。配方(g/L)：马铃薯浸出粉15，葡萄糖20，琼脂20，酵母浸粉2，pH5；121℃灭菌20min；室温条件下冷却至约60℃，倒平板。

1、菌体培养

以菌株51-S_M-2/P2、51-S_T-1/P1、51-P-3/P1为对象进行菌种筛选。

尽量选取长势相同的菌落，用孔径5mm的无菌打孔器在平板菌落边缘部打孔，取出直径为5mm的圆形菌落薄片，接种至新的平板培养基(配方(g/L):马铃薯浸出粉15，葡萄糖20，琼脂20，酵母浸粉2，pH5)。每个菌株接6个平板培养基，每个平板培养基上接3个菌块。28℃恒温培养，定期测量菌落直径，观察菌落颜色形态和长势。

图1表示各菌株在平板培养过程中菌落直径的变化。平板培养27d前，菌株51-S_M-2/P2、51-S_T-1/P1、51-P-3/P1的菌落直径无显著差异。生长后期，菌落生长速度降低，菌株51-M-2/P2、51-T-1/P1、51-P-3/P1的菌落直径之间产生差异。表1表示平板培养34d时的菌落直径比较。菌株51-S_M-2/P2与菌株51-S_T-1/P1的菌落直径无显著差异，菌株51-P-3/P1的菌落直径显著小于菌株51-S_M-2/P2和51-S_T-1/P1的菌落直径(P<0.05)。

表1平板培养34d时的菌落直径比较

然后进行液体培养，液体培养基配方(g/L)：葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，硫酸镁0.75g/L，磷酸二氢钾1.5g/L，pH5。

种子培养：用孔径5mm的无菌打孔器取平板菌落边缘菌丝，每瓶液体培养基中(500mL三角瓶装液体培养基200mL)接入3块菌块。28℃、150rpm培养3d，作为种子液。

扩大培养：将种子液按10％接种量(v/v)接入装有30mL液体培养基的150三角瓶中，共接种20瓶。28℃、150rpm培养10d。从第2天开始每天取出两瓶培养物，抽滤收集菌丝体，105℃干燥至恒重，测量菌体干重。以培养时间为横坐标、菌丝体浓度为纵坐标，作鸡枞菌在液体培养基中的生长曲线，计算对数期平均生长速度。对数期平均生长速度由下式计算：

&upsi; = \frac{m_{2} - m_{1}}{t_{2} - t_{1}}

(1)

式中：υ为对数期平均生长速度，g/(L·d)；m₂为对数期终点的菌丝体浓度，g/L；m₁为对数期起点的菌丝体浓度，g/L；t₂为对数期终点时间，d；t₁为对数期起点时间，d。

图2表示各菌株在液体培养中的生长曲线。该图中，菌丝体浓度用对数坐标表示。菌株51-S_M-2/P2、51-S_T-1/P1、51-P-3/P1的延滞期不明显，种子液接入液体培养基后菌体生长迅速进入对数期。确定生长曲线对数期的始点和终点，按照式(1)计算对数期的平均生长速度，结果如表2所示。

表2对数期起止时间、菌丝体浓度及平均生长速度

菌株51-S_M-2/P2、51-S_T-1/P1、51-P-3/P1的对数期平均生长速度分别为0.444、0.539、0.340g/(L·d)。菌株51-S_T-1/P1的对数期平均生长速度高于菌株51-S_M-2/P2和51-P-3/P1的对数期平均生长速度。

2、菌丝体中脑苷脂含量的测定

以液体培养得到的菌丝体为试样，采用LC-MS/MS法测定脑苷脂A和B的含量。

称取1.0g试样，3.0g石英砂置于研钵中，加入5mL甲醇，冰浴下研磨10分钟后转移到试管中，加入10mL甲醇与10mL二氯甲烷，室温下超声2h后静置过夜，过滤，滤液浓缩得粗品。粗品用适当体积的二氯甲烷/甲醇(1:1)溶解后，取样1mL，稀释适当倍数，作为测试液。

液相色谱：Shimadzu LC-10AD，岛津公司；色谱柱：Agela Venusil XBP C8(L)(2.1*50mm5um,150A)；柱温：室温；流动相A：10mMNH₄FA-0.1％FA；流动相B：0.1％FA-100％MeOH；梯度洗脱程序见表3；进样量：10uL。

表3液相色谱洗脱程序

质谱仪：API3000，AB Sciex公司；离子喷雾电压：3000V；离子源温度：400℃；离子源：电喷雾离子源(ESI)；电离模式：正离子模式；扫描方式：多反应监测(MRM)。

图3和图4分别表示脑苷脂A、B测定的标准曲线。各菌株的脑苷脂A、B含量如表4所示。菌株51-S_M-2/P2、51-S_T-1/P1、51-P-3/P1的脑苷脂A含量分别为0.178％,d.b.、0.152％,d.b.、0.118％,d.b.。菌株51-S_M-2/P2、51-S_T-1/P1、51-P-3/P1的脑苷脂B含量分别为0.091％,d.b.、0.066％,d.b.、0.048％,d.b.。

表4菌丝体的脑苷脂含量

根据菌丝体生长速度、脑苷脂A和B含量，选出效果最好的菌株51-S_T-1/P1为菌种，其编号定为CTM-1，进行菌种保藏。

二、培养上述的鸡枞菌菌种的方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：

(1)取鸡枞菌菌丝接种于种子培养基中，28℃、150rpm培养3d，种子培养基配方为葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，硫酸镁0.75g/L，磷酸二氢钾1.5g/L，pH5；

(2)将种子液按体积比为10％的接种量接入扩大培养基中，28℃、150rpm培养6d，扩大培养基配方组成为：小麦全粒粉浓度20-40g/L、米糠浓度20-40g/L、培养基pH4.0-6.0。

进一步的，扩大培养基配方组成为：小麦全粒粉浓度32.5g/L、米糠浓度31.4g/L、培养基pH5.0，以期使得鸡枞菌菌种得到脑苷脂A和B的最高产量。

采用上述技术方案的积极效果：本发明通过对鸡枞菌菌种Termitomyces sp.CTM-1的液体培养，可获得菌丝体干物产量15.90g/L，菌丝体中脑苷脂A和B的含量分别达到0.29％,d.b.、0.11％,d.b.，含量大大高于野生鸡枞菌，可实现鸡枞菌的人工培养以及工业化生产，克服了野生鸡枞菌子实体资源稀少、采收季节性强、价格昂贵、脑苷脂A和B含量低等问题；整个过程没有外源基因的引入，能够保证食品药品安全；本发明所涉及的菌种制备和菌丝体培养方式同样适合于以其他食用菌为原料、通过液体培养生产富含脑苷脂的菌丝体。

附图说明

图1表示各菌株在平板培养过程中菌落直径的变化；

图2表示各菌株在液体培养中的生长曲线；

图3是脑苷脂A测定的标准曲线；

图4是脑苷脂B测定的标准曲线；

图5是菌种CTM-1的孢子和菌丝体，a为孢子，b为菌丝体；

图6是基于18S rRNA序列及邻接法构建的系统进化树；

图7是小麦全粒粉浓度和米糠浓度对菌丝体产量的影响；

图8是小麦全粒粉浓度和pH对菌丝体产量的影响；

图9是米糠浓度和pH对菌丝体产量的影响。

本发明所涉及的鸡枞菌菌种Termitomyces sp.CTM-1，于2014年5月6日在中国专利局或国际专利组织承认的保藏中心进行了专利程序保藏，保藏单位全称为中国典型培养物保藏中心，简称为CCTCC，保藏单位地址：中国.武汉.武汉大学，保藏编号：CCTCC NO：M2014185。

具体实施方式

下面结合实施例和对比例对本发明的技术方案做进一步说明，但不应理解为对本发明的限制：

实施例1

本实施例说明菌丝体诱发和菌株纯化。

1、野生鸡枞菌子实体采集

鸡枞菌子实体于2013年8月从云南省红河州建水县山区采集，编号，置于4-10℃冰箱保存。

2、菌丝诱发

3、菌株纯化

选择从子实体Fruiting body-5诱发出来的3株菌51-S_M-2、51-S_T-1、51-P-3为对象，取100μL菌液至平板培养基，用灭菌涂布棒将菌液涂布均匀，于25℃恒温培养箱中倒置培养5-6d后，选取边缘整齐、菌丝浓白的单菌落。纯化操作共重复3次，得到菌株51-S_M-2/P2、51-S_T-1/P1、51-P-3/P1。平板培养基按以下方法制备。配方(g/L)：马铃薯浸出粉15，葡萄糖20，琼脂20，酵母浸粉2，pH5；121℃灭菌20min；室温条件下冷却至约60℃，倒平板。

实施例2

本实施例说明菌种的筛选。

1、菌体培养。

以菌株51-S_M-2/P2、51-S_T-1/P1、51-P-3/P1为对象进行菌种筛选。

表1平板培养34d时的菌落直径比较

&upsi; = \frac{m_{2} - m_{1}}{t_{2} - t_{1}}

(1)

表2对数期起止时间、菌丝体浓度及平均生长速度

2、菌丝体中脑苷脂含量的测定。

液相色谱：Shimadzu LC-10AD，岛津公司；色谱柱：Agela Venusil XBPC8(L)(2.1*50mm5um,150A)；柱温：室温；流动相A：10mMNH₄FA-0.1％FA；流动相B：0.1％FA-100％MeOH；梯度洗脱程序见表3；进样量：10uL。

表3液相色谱洗脱程序

表4菌丝体的脑苷脂含量

根据菌丝体生长速度、脑苷脂A和B含量，选出效果最好的菌株51-S_T-1/P1为菌种，其编号定为CTM-1。

实施例3

本实施例说明菌种鉴定。

1、形态鉴定。

菌种CTM-1的分生孢子呈卵圆形，大小为5-10μm×10-15μm。菌丝体分支较少，有横隔膜，未见锁状联合，菌丝直径约5-7μm；。该菌种的菌丝体和分生孢子特征与鸡枞菌Termitomyces albuminosus(聂晓东，鸡枞菌丝体及其皂甙的深层发酵条件的优化[D].江南大学,2009)一致。如图5所示。

2、分子生物学鉴定。

菌丝诱发用子实体原料(Fruiting body-5)的18SrRNA序列如下：

菌种CTM-1的18S rRNA序列如下：

采用序列局部相似性查询系统BLAST(美国国立生物技术信息中心)，将菌丝诱发用子实体原料(Fruiting body-5)、菌种(Strain CTM-1)的18S rRNA序列与GenBank数据库(美国国立生物技术信息中心)中的所有序列进行比较，找出序列相似的菌种，并用MEGA4.1软件进行匹配排列，用邻接法构建系统进化树(图6)。

由图6可见，Fruiting body-5、Strain CTM-1与鸡枞菌属Termitomyces sp.有99％的同源性，另外Fruiting body-5与Strain CTM-1之间也有99％的同源性。因此判断，Fruitingbody-5)和Strain CTM-1均为鸡枞菌属Termitomyces sp.。

实施例4

本实施例说明鸡枞菌的培养。

1、种子培养。

用孔径5mm的无菌打孔器取平板菌种边缘菌丝，每瓶种子培养基中(500mL三角瓶装种子培养基100mL)接入3块菌块。28℃、150rpm培养3d。种子培养基配方(g/L)：葡萄糖20，蛋白胨10，硫酸镁0.75，磷酸二氢钾1.5，pH5，115℃灭菌30min。

2、扩大培养。

将种子液按10％接种量(v/v)接入装有30mL的扩大培养基的150mL三角瓶中，28℃、150rpm培养6d。抽滤，105℃干燥菌丝体至恒重。

为了优化扩大培养基配方，以小麦全粒粉浓度、米糠浓度、培养基pH为因素，以菌丝体产量(g/L)为响应值，进行3因素3水平响应面实验。实验因素及水平见表5。0水平代表实验中心值，-1和1水平分别表示各因素在实验中的最低值和最高值。

表5响应面实验因素与水平

利用Design-Expert8.0.6软件中Box-Behnken Design(BBD)方法进行的3因素3水平响应面实验设计及实验结果如表6所示。

表6BBD实验设计与实验结果

利用统计分析软件Design-Expert8.0.6对表6中的实验数据进行二次多项式回归拟合，建立二次多元回归方程，该方程的回归及方差分析结果见表7。得到的拟合方程为：

Y＝15.78+1.29A+0.91B-0.25C+0.50AB+0.22AC+1.06BC-2.75A²

-3.48B²-0.90C²

(R²＝0.9781) (2)

式中，Y为菌丝体浓度(g/L)，A、B、C分别为小麦全粒粉浓度(g/L)、米糠浓度(g/L)、培养基pH。

由表7可知，回归方程式(2)的P＝0.0013(<0.01)，表明该模型极显著；失拟项P＝0.1490(＞0.05)，表明该模型不存在失拟因素；R²＝0.9781，说明该模型与实验值拟合良好。此外，A、A²、B²对响应值的影响极为显著(P<0.01)；B、BC、C²对响应值的影响显著(P<0.05)。

表7响应面实验数据的方差分析结果

各因素对菌丝体产量的交互影响如图7、8、9所示。

由方程式(2)可知，在小麦全粒粉浓度、米糠浓度、pH分别为32.47g/L、31.45g/L、4.98的最佳培养基条件下，菌丝体产量的预测值为16.00g/L。在此最佳条件下进行三次平行验证试验，得到菌丝体产量的测定值为15.90g/L。预测值与测定值基本一致，表明方程式(2)的可信度较高。

在此培养基条件下生产的菌丝体中，脑苷脂A含量为0.29％，脑苷脂B含量为0.12％，大大高于野生鸡枞菌，可实现鸡枞菌的人工培养以及工业化生产，克服了野生鸡枞菌子实体资源稀少、采收季节性强、价格昂贵、脑苷脂A和B含量低等问题。

Claims

1.一株高产脑苷脂类化合物的鸡枞菌菌种Termitomyces sp.CTM-1，其菌种保藏号是CCTCC NO：M2014185。

2.培养权利要求1所述的鸡枞菌菌种的方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：扩大培养基配方组成为：小麦全粒粉浓度32.5g/L、米糠浓度31.4g/L、培养基pH5.0。