CN101703515A

CN101703515A - 一种脑苷脂类化合物的应用

Info

Publication number: CN101703515A
Application number: CN200910154675A
Authority: CN
Inventors: 陈玲; 戚建华; 戚智; 白银阳; 孙恺悦; 张卓; 高丽娟
Original assignee: Xiamen University; Zhejiang University ZJU; Nanjing Medical University
Current assignee: Nanjing University; Xiamen University; Zhejiang University ZJU; Nanjing Medical University
Priority date: 2009-11-23
Filing date: 2009-11-23
Publication date: 2010-05-12
Anticipated expiration: 2029-11-23
Also published as: CN101703515B

Abstract

本发明提供一种从鸡枞菌中提取制备的脑苷脂类化合物(脑苷脂A和脑苷脂B)在制备治疗脑缺血后脑损伤药物中的应用。本发明通过药理实验证实所述的脑苷脂类化合物对缺血性脑损伤具有显著治疗作用，能透过血脑屏障，减小脑缺血导致的脑梗塞面积和减轻脑水肿，并减少神经细胞死亡，同时促进脑卒中后运动和认知功能的恢复，降低脑卒中的死亡率。本发明开拓了脑苷脂类化合物新的药物用途，为治疗脑卒中疾病提供新的治疗药物。

Description

一种脑苷脂类化合物的应用

技术领域

本发明属于天然药物化学领域。主要涉及从鸡枞菌中提取的脑苷脂类化合物在制备治疗缺血后脑损伤药物中的应用。

背景技术

脑缺血性疾病是临床最常见的疾病之一，具有发病率、致残率和病死率高的特点，严重威胁着人类的健康。随着全世界人口逐步老龄化，缺血性脑损伤的发病有逐年增加趋势，但是迄今在国内外仍然缺乏有效的预防和治疗措施。中枢神经细胞对缺氧伤害的高敏感性和缺乏再生能力的特征被认为是导致脑卒中后遗症的主要原因。缺血性脑损伤主要包括(1)局部脑血管闭塞(脑梗塞)和(2)心源性休克以及心肌梗塞等原因造成的全脑血流量的减少或中断，它们都能引起神经细胞的死亡。因此，如何阻止或减轻脑缺血和再灌流后的神经细胞死亡一直是神经科学研究和神经疾病药理学研究的焦点。

鸡枞菌(Termitomyces albuminosus)属担子菌纲，伞菌目，口蘑科，蚁巢伞属，其生态类型极为特殊，与黑翅大白蚁共生，子实体仅能生长在白蚁巢上，是一种珍贵的野生食用菌。该菌为宝贵的药用菌，以子实体入药。明代李明珍的《本草纲目》中就有记载：“益胃清神，治痔”的功效^[1]。有文献报导其有降血脂，抗氧化，消炎及镇痛作用^[2，3]。

脑苷类化合物(cerebrosides)是存在于动物、植物、真菌和海洋生物的一类含量很低而活性很强的内源性物质。它与神经节糖苷(gangliosides)、鞘磷脂(sphingomyelins)共同组成为鞘脂类化合物(sphingolipids)。脑苷和神经节苷脂属于糖脂，鞘磷脂属于磷脂。它们都是由一个极性头(D-半乳糖、葡萄糖、多糖和磷酰胆碱)和两条非极性尾(鞘氨醇及其衍生物和脂肪酰长链)组成。

鞘脂类化合物最初是在1876年，由德国内科医生J.L.W.Tudichum发现的，他是从脑的乙醇提取物经分步结晶，然后经水解得到鞘氨醇(命名为sphingosine)、糖和脂肪酸。但其结构是由Carter于1947年阐明的。脑苷脂化合物、神经酰胺、鞘磷脂的命名都是延续当年Tudichum的命名。1942年，EmstKlenk发现患有黑蒙痴呆(amauroticidiocy)病人脑中有一种酸性鞘脂类化合物，他就将其命名为神经节苷脂，其中的酸性部分命名为神经氨酸(neuraminicacid)。

天然存在的鞘脂类化合物含量很低，脑苷脂化合物更是如此，到目前为止虽经历了百余年，发现的天然脑苷类化合物还不太多。再加上其结构类似，给分离纯化带来了很大的困难。但这类化合物一直认为与人类脑部疾病和生理过程中的信号传导有关。

据报道脑苷脂A具有抑制处于复制DNA状态的聚合酶的活性^[4]、抗炎活性^[5]、止痛作用^[6]。脑苷脂B具有抑制处于复制DNA状态的聚合酶的活性^[4]

发明内容

本发明的目的在于提供一种从鸡枞菌中提取制备的脑苷脂类化合物(脑苷脂A和脑苷脂B)在制备治疗脑缺血后脑损伤药物中的应用.主要在制备治疗全脑缺血和局灶性脑缺血药物中的应用.

本发明所述的脑苷脂类化合物为脑苷脂A和脑苷脂B，具有如下结构：

脑苷脂A

脑苷脂B

本发明所述的脑苷脂类化合物通过以下步骤实现：

(1)粉碎：将干燥的鸡枞菌粉碎至100～10目；

(2)溶剂浸提：用甲醇浸提，得到鸡枞菌浸提物；随后对浸提物用90％的甲醇水溶液和正已烷进行溶剂分配，将得到的90％的甲醇水溶液减压浓缩后用水和正丁醇进行溶剂分配，得到正丁醇层溶液，将正丁醇层溶液经减压浓缩后得到正丁醇层样品；

(3)分离和纯化：正丁醇层样品用ODS开口柱(溶剂系统按体积比为MeOH∶H₂O＝90∶10，95∶5，100∶0)分离；然后，含目标化合物(95％aq.MeOH流分)的样品用Silica gel开口柱(溶剂系统为CHCl₃∶MeOH＝100∶0，95∶5，90∶10，0∶100)进行进一步分离；最后，含目标化合物的样品(CHCl₃∶MeOH＝90∶10流分)用HPLC[Develosil ODS-10)纯化得到脑苷脂A和B，[溶剂系统：MeOH/H₂O(98∶2)，流速：8毫升/分钟，检测波长：205nm]。

本发明所述的提取方法中的甲醇浸提方法包括震荡法浸提或回流法浸提。

本发明的有益效果在于：

(1)本发明方法克服以往因结构类似、天然脑苷类化合物不能分离纯化的困难，解决了从鸡枞菌中提取、分离和纯化获得两种脑苷脂类化合物，本发明方法具有快速、简便、得率高、纯度高(脑苷脂A和B的含量均在99.0％以上)等特点。

(2)本发明方法获得的脑苷脂类化合物，通过系统的动物药理学实验，证明所述的脑苷脂A和脑苷脂B对缺血性脑损伤具有显著治疗作用，具体的说，鸡枞菌脑苷脂A(JNGZ-A)和鸡枞菌脑苷脂B(JNGZ-B)腹腔注射能透过血脑屏障，减小脑缺血导致的脑梗塞面积和减轻脑水肿，并减少神经细胞死亡，同时促进脑卒中后运动和认知功能的恢复，降低脑卒中的死亡率。

(3)本发明制备方法设计合理，操作简便。并开拓了脑苷脂类化合物新的药物用途，为治疗脑卒中疾病提供新的治疗药物。

附图说明

图1JNGZ-A和JNGZ-B能透过血脑屏障调节神经系统功能的分析。

图2JNGZ-A和JNGZ-B对局灶性缺血性脑梗死的作用。

图3JNGZ-A和JNGZ-B对局灶性缺血后脑水肿的作用。

图4JNGZ-A和JNGZ-B对局灶性脑缺血后运动功能损伤的作用。

图5JNGZ-A和JNGZ-B对全脑缺血引起神经细胞死亡的作用。

图6JNGZ-A和JNGZ-B对全脑缺血后记忆力损伤的作用。

图7JNGZ-A和JNGZ-B对脑卒中(局灶性脑缺血)死亡率的影响。

具体实施方式

本发明结合附图和实施例作进一步的详细说明。

实施例1

从鸡枞菌中制备脑苷脂A和脑苷脂B的方法，具体步骤为：

(1)粉碎：将干燥的鸡枞菌样品(1.5kg)(四川省盐源县)粉碎至100～10目；

(2)溶剂浸提：将粉碎后的鸡枞菌装入15升的容器中，用甲醇(7.5升)在震荡器中震荡浸提3天，得到鸡枞菌浸提物(151.3g)；随后对浸提物用90％aq.MeOH和正已烷进行溶剂分配，将得到的90％aq.MeOH溶液浓缩后用水和正丁醇进行溶剂分配，正丁醇溶液经减压浓缩后得到正丁醇层样品(16.0g)；

(3)分离和纯化：正丁醇层样品用ODS开口柱(溶剂系统为MeOH∶H₂O＝90∶10，95∶5，100∶0)分离；然后，含目标化合物(95％aq.MeOH流分，1.3g)的样品用Silica gel开口柱(溶剂系统为CHCl₃∶MeOH＝100∶0，95∶5，90∶10，0∶100)进行进一步分离；最后，含目标化合的样品(CHCl₃∶MeOH＝90∶10流分，300mg)用HPLC纯化(ODS-UG-5，98％aq.MeOH，φ20×250mm，流速：8ml/min，检测波长：205nm)得到鸡枞菌脑苷脂A(120.0mg，保留时间：39min)和鸡枞菌脑苷脂B(63.0mg，保留时间：55min)。脑苷脂A是发明人于2001年首次从鸡枞菌的浸提物中用上述制备方法纯化得到，使用核磁共振、质谱及分解反应等方法确定了其化学结构^[7]。通过文献查阅发现为已知结构化合物^[8，9]。

实施例2

对实施例1得到的脑苷脂A和脑苷脂B的理化特征及化学结构的定性鉴定：

脑苷脂A的理化性质：[α]²⁵ _D+4.5(c 0.46，MeOH)；红外光谱(KBr)值：3371，2921，2853，1643，1536，1468，和1081cm-1；m/z 728(M+H)+；、化学位移值：C(150MHz，DMSO+2％D2O)：173.91，135.08，131.26，131.05，123.61，103.56，77.00，76.63(76.62，CH-OD)，73.49(73.46)，71.20(71.17)，70.81(70.71)，70.25(70.20)，68.86，61.33(61.21)，53.04(53.00，CH-ND-)，39.90，34.53，32.23，31.36，29.10，28.98，28.74，27.49，27.38，24.61，22.14，15.83，and 13.95。

脑苷脂B：使用与确定脑苷脂A的化学结构同样的方法确定了脑苷脂B的化学结构，发现脑苷脂B与A结构(包括立体结构)上的区别只在于B在脂肪链上比A多了二个亚甲基。脑苷脂B的理化性质：[α]²⁵ _D+2.0(c 0.46，MeOH)，m/z 756(M+H)+，红外光谱值、化学位移值与脑苷脂A完全相同。

实施例3

本发明所述的脑苷脂A(JNGZ-A)和脑苷脂B(JNGZ-B)进行的动物药理学实验，以证明其在制备治疗缺血后脑损伤药物中的应用。

由于不同形式的脑缺血所造成的神经损伤程度有所不同。大脑中动脉闭塞主要的病理表现是纹状体、大脑皮层和海马等脑区组织的梗死和脑水肿，具有非常高的死亡率和致残率。全脑缺血则选择性地损伤对缺氧敏感的中枢神经细胞(如海马CA1区神经细胞)，出现记忆力减退。因此，本发明将分别采用经典的大脑中动脉阻塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)手术来摸拟脑卒中，用椎动脉和颈总动脉夹闭的手术建立全脑缺血的动物模型，来观察腹腔注射JNGZ-A和JNGZ-B对缺血性脑损伤的保护作用。

实施例1制备的JNGZ-A和JNGZ-B具有较难溶于水的特点。因此，先将提取的JNGZ-A和JNGZ-B溶解于99.5％乙醇中，然后再用生理盐水将母液稀释到治疗所需浓度(以保持乙醇的最终浓度在1％以下)，得到本发明所述的药物制剂。

Sprague-Dawley(SD)大鼠(体重200g～250克，购自江苏省实验动物中心)接受JNGZ-A和JNGZ-B(0.5毫克/公斤体重)腹腔注射后，与注射生理盐水的对照组(呼吸：50～60次/分钟，心率：305～400次/分钟，平均动脉压：90～110毫米汞柱)相比均未出现明显的毒性反应(昏睡、狂躁、呼吸/心率/血压的改变)和副作用(运动行为异常等)。

实验1：JNGZ-A和JNGZ-B能透过血脑屏障对神经系统功能调节的分析

实验主要材料：Sprague-Dawley(SD)大鼠(雄性和雌性各10只)，体重200g～250克，购自江苏省实验动物中心。

其中，实验操作A：10％水合氯醛腹腔麻醉，取出全脑，制作海马脑片。电刺激Schaffer collateral侧枝连续记录海马CA1区兴奋性突触后膜电位(EPSP)。黑色横棒：JNGZ-A和JNGZ-B的给药时间。

其中，实验操作B：10％水合氯醛腹腔麻醉，记录电极按照前囟后3.8毫米，旁开2.3毫米，深度3.0毫米的坐标插入海马CA1区锥体细胞层，记录神经细胞放电频率(平均放电频率是42.71±5.6次/分钟)。基础值稳定记录20分钟后，JNGZ-A和JNGZ-B腹腔注射(5和10微摩尔)，连续记录1～2小时。

实验结果：JNGZ-A和JNGZ-B腹腔注射(0.5毫克/公斤体重)能快速透过血脑屏障，能减弱海马CA1突触传递功能和降低神经细胞的兴奋性。

结果参见图1，图1-A：表示JNGZ-A和JNGZ-B直接脑片给药对海马CA1区神经突触传递的影响(脑片的场电位记录)；图1-B：表示JNGZ-A和JNGZ-B腹腔注射后海马CA1区神经细胞兴奋性的改变(在体脑的胞外记录)，且*和**分别表示P＜0.05和P＜0.0(与对照组相比)。

实验2：JNGZ-A和JNGZ-B对局灶性脑缺血(MCAO)后脑梗死的作用

实验主要材料：昆明小鼠，体重25g～30克，购自江苏省实验动物中心。

实验操作：10％水合氯醛腹腔麻醉，结扎右侧颈总动脉与颈外动脉，用动脉夹夹闭颈内动脉远心端，将渔线插入颈内动脉远端，实施大脑中动脉60分钟阻塞(大脑中动脉阻塞在图中简称MCAO)，制备局灶性脑缺血小鼠模型(用电热毯以保持实验动物肛门温度在37±0.5度).在脑缺血后4小时，按每公斤体重0.5、1.0毫克剂量进行JNGZ-A腹腔注射，或0.05、0.5、1.0、5.0毫克剂量进行JNGZ-B腹腔注射，共给药两次(间隔8小时).脑缺血后24小时取出全脑，放置-20度冷冻10分钟，做全脑2毫米厚冠状连续切片.用2％TTC染色后，进行imageJ软件处理图像分别测出每张脑片梗死区及非梗死区的面积.计算脑梗死体积的百分比：(梗死区体积平均值/非缺血侧大脑半球体积平均值)×100％.各实验组均是雄性和雌性各4只小鼠.

实验结果：60分钟的大脑中动脉阻塞引起大约26.8％脑梗死(白色组织区面积，P＜0.01)。JNGZ-A和JNGZ-B治疗能有效地减少脑梗死的体积(P＜0.05，P＜0.01)，提示脑苷脂能减轻缺血后脑梗死。JNGZ-A的神经保护作用呈现“U”型的剂量相关性，而相比之下JNGZ-B的神经保护作用呈典型的浓度依赖性。说明JNGZ-A和JNGZ-B的作用可能通过不同的机制。

结果参见图2，图中，##表示P＜0.01(与假手术组相比)；*和**分别表示P＜0.05和P＜0.0(与脑缺血组相比)。

实验3：JNGZ-A和JNGZ-B对局灶性脑缺血(MCAO)后脑水肿的作用

实验主要材料：同实验2。

实验操作：脑缺血小鼠模型制备与实验2相同。在脑缺血后4小时，按每公斤体重0.5、1.0毫克剂量进行JNGZ-A腹腔注射，或0.05、0.5、1.0、5.0毫克剂量进行JNGZ-B腹腔注射，共给药两次(间隔8小时)。脑缺血24小时后，快速断头取出全脑，采用干湿相对密度法测定左右半脑含水量，并且按照Elliott公式[(WW-DW)/WW]×100％计算脑含水量，推出脑水肿的程度。各实验组均是雄性和雌性各4只小鼠。

实验结果：脑缺血引起脑含水量13.5％的增加(P＜0.05)，提示有脑水肿的发生。脑缺血后JNGZ-A和JNGZ-B治疗能减少缺血脑的含水量(P＜0.05)。

结果参见图3，图中，#表示P＜0.05(与假手术组相比)；*表示P＜0.05(与脑缺血组相比)。

实验4：JNGZ-A和JNGZ-B对局灶性脑缺血(MCAO)后运动功能损伤的作用

实验主要材料：与实验2相同。

实验操作：脑缺血小鼠模型制备与实验2相同。脑缺血后4～8天，进行转轮实验，检测脑缺血后小鼠的运动功能。转轮实验的最大转速是30转/分钟，持续200秒钟。各实验组均是雄性和雌性各4只小鼠。

实验结果：脑缺血能明显减少小鼠在转轮上的运动时间(P＜0.01)。脑缺血后JNGZ-A或JNGZ-B治疗能显著延长试验小鼠的转轮上的运动时间(P＜0.05，P＜0.01)，提示脑苷脂治疗能改善脑卒中后的运动功能障碍。

结果参见图4，图中，假手术不给药组在转轮上的运动时间作为100％；##表示P＜0.01(与假手术组相比)；*和**分别表示P＜0.05和P＜0.01(与脑缺血组相比)。

实验5：JNGZ-A和JNGZ-B对全脑缺血(4VO)引起神经细胞死亡的作用

实验主要材料：Sprague-Dawley(SD)大鼠，体重200g～250g，购自江苏省实验动物中心。

实验操作：10％水合氯醛腹腔麻醉，电凝双侧椎动脉，用微动脉夹夹闭双侧颈总动脉20min(四血管阻断法，图中简称：4VO)，制备短暂性(20分钟)全脑缺血大鼠模型(用电热毯以保持实验动物肛门温度在37±0.5度).在脑缺血后4小时按每公斤体重0.05、0.5、1或5毫克剂量进行JS-CB腹腔注射，共给药两次(间隔8小时).脑缺血后第8天，用4％多聚甲醛经左心室灌注固定脑组织.石蜡包埋后，做海马连续切片.1％甲苯胺蓝染色后，测量海马CA1区存活锥体细胞的密度(锥体细胞层每毫米长度中细胞数).各实验组均是雄性和雌性各4只大鼠.

实验结果：20分钟全脑缺血引起大约60％的神经元死亡(P＜0.01)。脑缺血后JNGZ-A或JNGZ-B治疗能剂量依赖地减少脑缺血引起的神经细胞死亡(P＜0.05，P＜0.01)，提示脑苷脂能阻止缺血引起的神经细胞死亡。JNGZ-A的神经保护作用呈现“U”型的剂量相关性，而相比之下JNGZ-B的神经保护作用呈典型的浓度依赖性。进一步说明JNGZ-A和JNGZ-B的作用可能通过不同的分子机制。

结果参见图5，图中，4VO：四血管阻断(全脑缺血)；##表示P＜0.01(与假手术组相比)；*和**分别表示P＜0.05和P＜0.01(与脑缺血组相比)。

实验6：JNGZ-A和JNGZ-B对全脑缺血(4VO)后记忆力损伤的作用

实验主要材料：同实验5。

实验操作：全脑缺血大鼠模型制备和JNGZ-A或JNGZ-B给药与实验5相同。在脑缺血后的第3～7天内进行“Morris”水迷宫测试，检查大鼠的空间记忆功能。记录大鼠的登台潜伏期。各实验组均是雄性和雌性各4只大鼠。

实验结果：20分钟全脑缺血引起逃避潜伏期延长(P＜0.01)，提示空间认知功能降低。JNGZ-A或JNGZ-B治疗能部分减少脑缺血造成的逃避潜伏期延长(P＜0.05，P＜0.01)，提示脑苷脂能改善脑卒中后的认知功能减退。

结果参见图6，图中，##表示P＜0.01(与假手术组相比)；*和**分别表示P＜0.05和P＜0.01(与脑缺血组相比)。

实验7：JNGZ-A和JNGZ-B对局灶性脑缺血(MCAO)后死亡率的影响

实验主要材料：与实验2相同。

实验操作：脑缺血小鼠模型制备与实验2相同。综合比较上诉脑缺血动物(MCAO)的死亡。各实验组均是40只小鼠。

实验结果：60分钟的大脑中动脉阻塞后的死亡率高达60％(P＜0.01)。脑缺血后4小时开始进行JNGZ-A(0.5毫克剂量)或JNGZ-B(1.0毫克剂量)治疗能降低脑卒中小鼠的死亡率到20-30％(P＜0.05，P＜0.01)。

结果参见图7，图中，##表示P＜0.01(与假手术组相比)；*和**分别表示P＜0.05和P＜0.01(与脑缺血组相比)。

本发明涉及的参考文献

[1]李明珍本草纲目(校点本)[M]第1版第1次印刷北京市崇文区天坛西里10号1982：1719-1719.

[2]王一心，杨桂芝.狄勇鸡枞菌降血脂作用的实验研究[J].中华临床医学研究杂志，2003，8：185-186.

[3]王一心，狄勇，杨桂芝.鸡枞菌在大鼠高胆固醇血症中的抗氧化作用[J].ChinPrev Med，2005，6：10-12.

[4]Mizushina Y.；Hanashima L.；Yamaguchi T.Biochemical and biophysicalresearch communications 1998，249，17-22.

[5]Cheng S.；Wen Z.；Chiou S.J.Nat.Prod.2009，72，465-468.

[6]Koyama K.；Akiba M.；Imaizumi T.Planta Med 2002，68，284-285.

[7]Qi J.；Ojika M.；Sakagami Y.Bioorganic & Medicinal Chemistry 2001，9，2171-2177.

[8]Sitrin R.D.；Chan G.；Dingerdissen J.；Debrosse C.；Mehta R.；Roberts G.；Rottschaefer S.；Staiger D.；Valenta J.；Snader K.M.；Stedman R.J.；Hoover J.R.E.J.Antibiot.1988，41，469-480.

[9].Toledo M.S.；Levery S.B.；Straus A.H.；Suzuki E.；Momany M.；GlushkaJ.，Moulton J.M.；Takahashi H.K.Biochemistry 1999，38，7294-7306.

Claims

1.一种脑苷脂类化合物在制备治疗脑缺血后脑损伤药物中的应用，所述的脑苷脂类化合物为脑苷脂A和脑苷脂B，具有如下结构：

脑苷脂A

脑苷脂B。

2.根据权利要求1所述的一种脑苷脂类化合物在制备治疗脑缺血后脑损伤药物中的应用，其特征在于，在制备治疗全脑缺血和局灶性脑缺血药物中的应用。