CN102697777A - 附子灵的制备方法及其新用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及附子灵及其可药用酸加成盐的制备方法及其用途，本发明附子灵具有式(I)结构，其可作为预防或治疗心律失常及心力衰竭药物中的应用。

Description

附子灵的制备方法及其新用途

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及附子灵及其可药用酸加成盐的制备方法及其在制备抗心律失常、抗心力衰竭药物中的应用。

背景技术

心力衰竭是各种心脏疾病导致心功能不全的一种综合症，绝大多数是指心肌收缩力下降使心排血量不能满足机体代谢的需要，器官、组织灌注不足，同时出现肺循环和体循环淤血的表现。心力衰竭可并发各种心律失常，房性或室性心律失常都很常见。反之，心律失常又可诱发心力衰竭，加重病情并影响预后。因此，人们一直致力于寻找有效的治疗药物，使心力衰竭、心律失常患者减轻症状，降低死亡率。

附子是毛莨科植物乌头子根的加工品，其性大热，味辛、甘，有毒，入心、脾、肾，通行十二经，具有回阳救逆、补火助阳、散寒止痛的功效。而附子灵是从附子的生物碱部位分离得到的一种C19型二萜类化合物，结构如式I所示。虽然国内外已见附子在抗心律失常、抗心力衰竭和镇痛的活性以及用途，但是，目前关于其天然提取物附子灵在抗心律失常和抗心力衰竭方面的用途还未见报道。

式I

发明内容

本发明的目的是提供附子灵或其可药用酸加成盐在制备预防和治疗心律失常和心力衰竭疾病药物中的应用。

其中所述附子灵是从毛莨科乌头属植物附子的生物碱部位分离得到的一种C19型二萜类化合物，具有如式I所示的分子结构，白色固体，熔点202-204℃，分子量453，IR(KBr)3459，2929，1112，1098cm^-1。

其中所述心律失常为过早搏动、阵发性室上性心动过速、预激综合征、心房扑动和颤动、病态窦房结综合征或室性心动过速等各类快速性及缓慢性心律失常。

所述心力衰竭为急性、慢性的各类心力衰竭。

所述药用酸加成盐是与盐酸、硫酸、磷酸、硝酸、硼酸、氢卤酸、卤酸、次卤酸、羧酸、磺酸、亚磺酸、甲酸、酒石酸或草酸形成的盐。

本发明的另一目的是提供含有附子灵或其可药用酸加成盐的药物制剂，如口服固体制剂、口服半固体制剂、口服液体制剂或注射剂；

所述口服固体制剂可为片剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、丸剂、滴丸剂、固体分散剂、散剂、颗粒剂、微颗粒剂、微丸剂、微囊剂、微球剂、或者其他药学上可接受的口服固体制剂；

所述口服液体制剂可为口服液或者其他药学上可接受的口服液体制剂；

所述注射剂可为注射液、注射用冻干制剂、注射用无菌分装制剂、葡萄糖注射液、氯化钠注射液或者其他药学上可接受的注射剂。

上述药物制剂中可以加入一种或多种药学上可接受的辅料，所述辅料包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、润滑剂、吸收促进剂、表面活性剂、润滑剂、稳定剂等，必要时还可以加入香味剂、甜味剂、矫味剂及色素等。

本发明的又一目的是提供附子灵或其可药用酸加成盐的制备方法，具体包括如下方法：

方法一：

a.取生附片，粉碎，用有机溶剂提取，将提取液减压浓缩至浸膏，加水溶解，加酸调pH至2～5，用乙酸乙酯萃取1～4次，优选3次，合并萃取液并减压浓缩干得油脂部位，再加碱调pH至7～12，优选pH至9～11，用乙酸乙酯萃取1～4次，优选3次，合并萃取液并减压浓缩干得总生物碱部位；

b.将总生物碱部位的浸膏过中性氧化铝柱、碱化硅胶柱或制备柱色谱反复分离并重结晶，或者将总生物碱部位的浸膏用高速逆流色谱分离。

方法二：

a.取生附片，粉碎，用酸水提取，浸提2～4次，每次1.5～2.5天，优选浸提3次，每次2天，过滤，合并滤液，减压浓缩至适量体积，用乙酸乙酯萃取1～4次，优选3次，合并萃取液并减压浓缩干得油脂部位，再加碱调pH至7～12，优选pH至9～11，用乙酸乙酯萃取1～4次，优选3次，合并萃取液并减压浓缩干得总生物碱部位；

b.将总生物碱部位的浸膏过中性氧化铝柱、碱化硅胶柱或制备柱色谱反复分离并重结晶，或者将总生物碱部位的浸膏用高速逆流色谱分离。

方法三：

a.取生附片，粉碎，用有机溶剂提取，将提取液减压浓缩至浸膏，加水溶解，加酸调pH至2～5，用乙酸乙酯萃取1～4次，优选3次，合并萃取液并减压浓缩干得油脂部位，再加碱调pH至7～12，优选pH至9～11，用乙酸乙酯萃取1～4次，优选3次，合并萃取液并减压浓缩干得总生物碱部位；

b.利用多缓冲纸层析富集碱性不同的生物碱的原理，将总生物碱部位过中性氧化铝柱后所得的总浸膏通过不同pH梯度萃取从而达到富集附子灵的目的，

①总浸膏用酸水溶解后调不同酸度pH，采用乙酸乙酯或极性与其相近的溶剂进行萃取；

②用碱水调节步骤①萃取后的酸水液的pH值至不同碱度，采用乙酸乙酯或极性与其相近的溶剂进行萃取，合并萃取液，浓缩后通过重结晶可得附子灵。

所述有机溶剂为乙醇、甲醇、丙酮、异丙醇、乙酸乙酯、石油醚或乙醚；

所述酸化溶剂为盐酸、硝酸、硫酸、磷酸、甲酸、醋酸、丁酸或其混合物；

所述碱化试剂为氨水、氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸钠、碳酸钾或其混合物。

本发明通过动物急性毒性实验和药效实验表明，附子灵的LD₅₀较大，安全剂量范围较大。并且对于对抗乌头碱、氯仿所致大鼠心律失常，普鲁帕酮、戊巴比妥钠所致大鼠急性心力衰竭具有显著的效果。可作为预防和治疗心律失常和心力衰竭疾病的药物。

以下通过实验数据说明本发明所述附子灵或其可药用酸加成盐在预防和治疗心律失常和心力衰竭疾病方面的有益效果。

实验一、静脉给药小鼠急性毒性实验

(1)药品

附子灵(盐酸盐)，分子量489.5，由本发明方法获得(纯度＞95％)。

(2)方法与结果

小鼠按体重随机分组，每组10只，雌雄各半。小鼠禁食6h后，静脉给药。分组情况和给药剂量见表1。给药体积为0.4mL/20g，观察并累计一次给药后14天内动物死亡数，记录，用Bliss法计算LD₅₀及95％可信限，结果见表1。

中毒小鼠给药后1小时开始出现自发活动减少、弓肩、缩背、竖毛、抽搐、最后呼吸困难而死亡，死亡发生在给药后5天之内。对死亡小鼠立即进行解剖，肉眼观察各脏器未见明显病变。

表1小鼠半数致死剂量LD₅₀测定(Bliss法)

因LD₅₀越大，表明其安全范围越大，由上表可知，附子灵的安全剂量范围较大。

实验二、附子灵对乌头碱所致大鼠心律失常的影响

(1)药品

同实验一

(2)方法与结果

取清洁级大鼠40只，体重180～210g，按体重随机分为4组，每组10只，雌雄各半。分组情况及给药剂量见表2，给药体积为0.5mL/100g。

大鼠用乌拉坦1.2g/kg，10mL/kg腹腔麻醉，记录正常II导联心电图，然后尾静脉注射给药，给药后立即由股静脉恒速输入乌头碱溶液，每分钟(0.8μg/200g)0.1mL/200giv，记录大鼠发生室性早搏(VP)、室性心动过速(VT)、心室颤动(VF)时的时间以及乌头碱的用量，并进行组间t检验比较，结果见表2、表3。

表2对乌头碱所致大鼠室性早搏(VP)、室性心动过速(VT)、心室颤动(VF)出现时间的影响(n＝10，

)

注：*P＜0.05，**P＜0.01，与模型组比较；#P＜0.05，与可达龙组比较

由表2可见，对于室性早搏出现时间，与模型组相比，可达龙组可显著延长大鼠室性早搏出现时间(P＜0.05)。附子灵组和阳性药组可极显著延长大鼠室性早搏出现时间(P＜0.01)；与可达龙相比，附子灵组可显著延长大鼠室性早搏出现时间(P＜0.05)。

对于室性心动过速出现时间，与模型组相比，可达龙组、阳性药组和附子灵组可极显著延长大鼠室性心动过速出现时间(P＜0.01)。

表3对乌头碱所致大鼠室性早搏(VP)、室性心动过速(VT)、心室颤动(VF)时乌头碱用量的影响(n＝10，

)

注：*P＜0.05，**P＜0.01与模型组比较

由表3可见，对室性早搏时乌头碱用量，与模型组相比，可达龙组大鼠室性早搏时所需乌头碱量显著增多(P＜0.05)；阳性药组和附子灵组大鼠室性早搏时所需乌头碱量极显著增多(P＜0.01)。

对室性心动过速时乌头碱用量，与模型组相比，可达龙组、阳性药组和附子灵组大鼠室性心动过速时所需乌头碱量极显著增多(P＜0.01)。

实验三、附子灵对氯仿所致大鼠心律失常的影响

(1)药品

同实验一

(2)方法与结果

取清洁级小鼠40只，体重18-22g，按体重随机分为4组，每组10只，雌雄各半。分组情况及给药剂量见表4，给药体积为0.4mL/20g。

将小鼠逐一放入含有滴加3～4mL氯仿的棉球(以后每换一只小鼠加入1mL氯仿)的倒置600mL烧杯内至小鼠呼吸停止，立即处死，迅速剖开胸腔，肉眼观察心室颤动发生率，直至心脏停搏。数据分组进行x²检验，结果见表4。

表4对氯仿诱发小鼠室颤模型的影响(n＝10)

注：**P＜0.01，与模型组比较

由表4可见，与模型组比较，可达龙、阳性药、附子灵可极显著降低小鼠心室颤动发生率(P＜0.01)。

实验四、附子灵对普鲁帕酮所致大鼠急性心力衰竭的影响

(1)药品

同实验一

(2)方法与结果

取清洁级大鼠24只，体重180～250g，按体重随机分为3组，每组8只，雌雄各半。分组及给药剂量见表5，给药体积为0.5mL/100g。

大鼠用乌拉坦1.2g/kg，10mL/kg腹腔麻醉，仰位固定，分离右侧颈总动脉，经颈总动脉插入表面涂有液体石蜡、内径1mm充满肝素心导管至左心室，另一端经换能器与Medlab生物信号采集处理系统相连观察记录血流动力学指标。手术完毕，稳定10min后，股静脉快速推注0.35％普鲁帕酮注射液3mL/kg(药液须在3～5s内推注完毕)，待动物左室内压上升最大速率(左心室最大收缩速率)下降至给药前的20％～40％后，静脉注射各受试化合物。观察记录给药后1min内的心率、左心室最大收缩速率(+dp/dtmax)和左心室最大舒张速率(-dp/dtmax)，以给药后与给药前比值的百分率进行组间t检验比较，结果见表5。

表5本发明化合物对普鲁帕酮所致大鼠急性心力衰竭的影响(n＝8，

)

由表5可见，与模型组相比，西地兰组和附子灵组可极显著升高大鼠心率、左心室最大收缩速率和左心室最大舒张速率(P＜0.01)。

实验五、附子灵对戊巴比妥钠所致大鼠急性心力衰竭的影响

(1)药品

同实验一

(2)方法与结果

取清洁级大鼠24只，体重180～250g，按体重随机分为3组，每组8只，雌雄各半。分组情况及给药剂量见表6，给药体积为0.5mL/100g。

大鼠用乌拉坦1.2g/kg，10mL/kg腹腔麻醉，仰位固定，分离右侧颈总动脉，经颈总动脉插入表面涂有液体石蜡、内径1mm充满肝素心导管至左心室，另一端经换能器与Medlab生物信号采集处理系统相连，观察记录血流动力学指标。手术完毕，稳定10min后，股静脉恒速注射1.0％戊巴比妥纳(2.5mL/h·100g^-1)，待动物左室内压上升最大速率下降至给药前的20％～40％后，静脉注射各受试化合物。观察记录给药后1min内的心率、左心室最大收缩速率(+dp/dtmax)和左心室最大舒张速率(-dp/dtmax)，以给药后与给药前比值的百分率进行组间t比较。结果见表6。

表6本发明化合物对戊巴比妥钠所致大鼠急性心力衰竭的影响(n＝8，

)

注：*P＜0.05，**P＜0.01，与模型组比较

由表6可见，与模型组相比，西地兰组可极显著升高大鼠心率变化率、左心室最大收缩速率和左心室最大舒张速率(P＜0.01)；附子灵组可极显著升高大鼠左心室最大收缩速率和左心室最大舒张速率变化率(P＜0.01)，可显著升高大鼠心率(P＜0.05)。

通过上述实验可得出以下结论：

(1)急性毒性实验中，附子灵的安全剂量范围较大；

(2)药效实验中，附子灵对药物所致大鼠心律失常和心力衰竭具有很好的治疗效果。

综上证明，附子灵可作为安全、有效的预防或治疗心律失常、心力衰竭的药物。

具体实施方式

通过以下不同方法制备得到的附子灵及其各种制剂均具有上述抗心律失常和心力衰竭等治疗效果。

实施例1

a.取生附片30kg，粉碎，用95％乙醇提取，浸提3次(每次2天)，过滤，合并滤液，减压回收乙醇得浸膏。用浓盐酸调pH至3，用乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液并减压浓缩干得油脂部位。再用氨水调pH至9，用乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液并减压浓缩干得总生物碱部位(约128g)；

b.将总生物碱部位的浸膏过中性氧化铝柱，用乙酸乙酯洗脱，分去结晶状样品，将粘稠状样品合并在一起，得总浸膏；

c.将总浸膏过碱化硅胶柱，用石油醚-乙酸乙酯(1∶1)、纯乙酸乙酯进行洗脱，收集乙酸乙酯洗脱液，进行重结晶可得附子灵(2088mg)。

实施例2

a.取生附片35kg，粉碎，用95％乙醇提取，浸提4次(每次2.5天)，过滤，合并滤液，减压回收乙醇得浸膏。用浓盐酸调pH至5，用乙酸乙酯萃取2次，合并萃取液并减压浓缩干得油脂部位。再用氨水调pH至11，用乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液并减压浓缩干得总生物碱部位(约145g)；

b.将总生物碱部位的浸膏过中性氧化铝柱，用乙酸乙酯洗脱，分去结晶状样品，将粘稠状样品合并在一起，得总浸膏；

c.将总浸膏过碱化硅胶柱，用石油醚-乙酸乙酯(1∶1)、纯乙酸乙酯进行洗脱，收集乙酸乙酯洗脱液，进行重结晶可得附子灵(2406mg)。

实施例3

a.取生附片20kg，粉碎，用酸水提取，浸提3次(每次2天)，过滤，合并滤液，减压浓缩至适量体积，用乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液并减压浓缩干得油脂部位。用氨水调pH至9，用乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液并减压浓缩干得总生物碱部位(约80g)；

b.将总生物碱部位的浸膏过中性氧化铝柱，用乙酸乙酯洗脱，分去结晶状样品，将粘稠状样品合并在一起，得总浸膏；

c.将总浸膏过碱化硅胶柱，用石油醚-乙酸乙酯(1∶1)、纯乙酸乙酯进行洗脱，收集乙酸乙酯洗脱液，进行重结晶可得附子灵(1220mg)。

实施例4

a.取生附片25kg，粉碎，用酸水提取，浸提4次(每次2.5天)，过滤，合并滤液，减压浓缩至适量体积，用乙酸乙酯萃取4次，合并萃取液并减压浓缩干得油脂部位。用氨水调pH至11，用乙酸乙酯萃取2次，合并萃取液并减压浓缩干得总生物碱部位(约98g)；

b.将总生物碱部位的浸膏过中性氧化铝柱，用乙酸乙酯洗脱，分去结晶状样品，将粘稠状样品合并在一起，得总浸膏；

c.将总浸膏过碱化硅胶柱，用石油醚-乙酸乙酯(1∶1)、纯乙酸乙酯进行洗脱，收集乙酸乙酯洗脱液，进行重结晶可得附子灵(1530mg)。

实施例5

a.取生附片20kg，粉碎，用95％乙醇提取，浸提3次(每次2天)，过滤，合并滤液，减压回收乙醇得浸膏。加水溶解，加盐酸调pH至3，用乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液并减压浓缩干得油脂部位。再用氨水调pH至9，用乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液并减压浓缩干得总生物碱部位(约80g)；

b.先将总生物碱部位过中性氧化铝柱，用乙酸乙酯洗脱，得结晶部分和浸膏部分(约60g)，再将浸膏部分用弱酸水调pH至6，用乙酸乙酯萃取3次，得碱性大的部分生物碱成分，再用氨水调pH至9，用乙酸乙酯萃取3次，然后通过重结晶可得附子灵(1500mg)。

实施例6

a.取生附片25kg，粉碎，用酸水提取，浸提4次(每次2.5天)，过滤，合并滤液，减压浓缩至适量体积，用乙酸乙酯萃取4次，合并萃取液并减压浓缩干得油脂部位。用氨水调pH至11，用乙酸乙酯萃取1次，合并萃取液并减压浓缩干得总生物碱部位(约98g)；

b.先将总生物碱部位过中性氧化铝柱，用乙酸乙酯洗脱，得结晶部分和浸膏部分(约70g)，再将浸膏部分用弱酸水调pH至6，用乙酸乙酯萃取3次，得碱性大的部分生物碱成分，再用氨水调pH至9，用乙酸乙酯萃取3次，然后通过重结晶可得附子灵(1620mg)。

实施例7

a.取生附片10kg，粉碎，用丙酮回流提取3～5次，合并提取液，减压回收丙酮得浸膏。用浓盐酸调pH至3，用乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液并减压浓缩干得油脂部位。再用氨水调pH至9，用乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液并减压浓缩干得总生物碱部位(约50g)；

b.将总生物碱部位的浸膏过中性氧化铝柱，用乙酸乙酯洗脱，分去结晶状样品，将粘稠状样品合并在一起，得总浸膏；

c.将总浸膏过碱化硅胶柱，用石油醚-乙酸乙酯(1∶1)、纯乙酸乙酯进行洗脱，收集乙酸乙酯洗脱液，进行重结晶可得附子灵(600mg)。

实施例8

a.取生附片15kg，粉碎，用丙酮回流提取3～5次，合并提取液，减压回收丙酮得浸膏。用浓盐酸调pH至4，用乙酸乙酯萃取2次，合并萃取液并减压浓缩干得油脂部位。再用氨水调pH至11，用乙酸乙酯萃取4次，合并萃取液并减压浓缩干得总生物碱部位(约72g)；

b.将总生物碱部位的浸膏过中性氧化铝柱，用乙酸乙酯洗脱，分去结晶状样品，将粘稠状样品合并在一起，得总浸膏；

c.将总浸膏过碱化硅胶柱，用石油醚-乙酸乙酯(1∶1)、纯乙酸乙酯进行洗脱，收集乙酸乙酯洗脱液，进行重结晶可得附子灵(850mg)。

实施例9

a.取生附片20kg，粉碎，用酸水提取，浸提3次(每次2天)，过滤，合并滤液，减压浓缩至适量体积，用乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液并减压浓缩干得油脂部位。用氨水调pH至9，用乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液并减压浓缩干得总生物碱部位(约80g)；

b.先将总生物碱部位过中性氧化铝柱，用乙酸乙酯洗脱，得结晶部分和浸膏部分(约60g)，再将浸膏部分用弱酸水调pH至6，用乙酸乙酯萃取3次，得碱性大的部分生物碱成分，再用氨水调pH至9，用乙酸乙酯萃取3次，然后通过重结晶可得附子灵(1500mg)。

实施例10

a.取生附片20kg，粉碎，用酸水提取，浸提2次(每次1.5天)，过滤，合并滤液，减压浓缩至适量体积，用乙酸乙酯萃取4次，合并萃取液并减压浓缩干得油脂部位。用氨水调pH至8，用乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液并减压浓缩干得总生物碱部位(约76g)；

b.先将总生物碱部位过中性氧化铝柱，用乙酸乙酯洗脱，得结晶部分和浸膏部分(约57g)，再将浸膏部分用弱酸水调pH至5.5，用乙酸乙酯萃取3次，得碱性大的部分生物碱成分，再用氨水调pH至10，用乙酸乙酯萃取3次，然后通过重结晶可得附子灵(1390mg)。

实施例11

称取附子灵25g、乳糖250g、淀粉75g，混合均匀，过100目筛3次，加入适量8％聚维酮K30水溶液制软材，20目筛制粒，烘干，加入硬脂酸镁2g混匀，压片，测含量，定片重，得附子灵片剂1000片。

实施例12

称取附子灵25g、乳糖250g、淀粉75g，混合均匀，过100目筛3次，加入适量8％聚维酮K30水溶液制软材，20目筛制粒，烘干，加入硬脂酸镁4g混匀，测含量，定装量，装入胶囊中，得到附子灵胶囊剂1000粒。

实施例13

称取附子灵盐酸盐27g，加入甘露醇1.25g，蒸馏水适量，混合均匀后，超滤，冷冻干燥，分装，即得附子灵注射用冻干制剂。

实施例14

称取附子灵盐酸盐25g，加入325g聚乙二醇6000，混合均匀，加热至温度60℃，化料40分钟后，移至罐温保持在90℃的滴丸机中滴罐中。药液滴至8℃甲基硅油中，取出滴丸，除油，筛网选丸，制成1000粒滴丸剂。

实施例15

称取附子灵盐酸盐25g、乳酸250g、淀粉75g，混合均匀，过100目筛3次，加入适量8％聚维酮K30水溶液制软材，20目筛制粒，烘干，20目整粒，测含量，定重，即得附子灵颗粒剂。

实施例16

称取附子灵盐酸盐25g，加入蒸馏水500ml，加入甜菊苷适量，搅拌均匀后，粗滤、精滤、分装、密封，灭菌，即得附子灵口服液。

实施例17

称取附子灵25g、乳糖250g、淀粉75g，混合均匀，过100目筛3次，测含量，定装量，即得附子灵固体分散剂。

Claims (12)

1.附子灵或其可药用酸加成盐在制备预防和治疗心律失常或心力衰竭药物中的应用。

2.权利要求1所述的应用，其特征在于所述心律失常为过早搏动、阵发性室上性心动过速、预激综合征、心房扑动和颤动、病态窦房结综合征或室性心动过速等各类快速性及缓慢性心律失常。

3.权利要求1所述的应用，其特征在于所述心力衰竭为急性、慢性的各类心力衰竭。

4.权利要求1所述的应用，其特征在于药用酸加成盐是与盐酸、硫酸、磷酸、硝酸、硼酸、氢卤酸、卤酸、次卤酸、羧酸、磺酸、亚磺酸、甲酸、酒石酸或草酸形成的盐。

5.权利要求1～4任一项所述的应用，其特征在于所述的药物剂型为口服固体制剂、口服半固体制剂、口服液体制剂或注射剂；

所述口服固体制剂可为片剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、丸剂、滴丸剂、固体分散剂、散剂、颗粒剂、微颗粒剂、微丸剂、微囊剂、微球剂、或者其他药学上可接受的口服固体制剂；

所述口服液体制剂可为口服液或者其他药学上可接受的口服液体制剂；

所述注射剂可为注射液、注射用冻干制剂、注射用无菌分装制剂、葡萄糖注射液、氯化钠注射液或者其他药学上可接受的注射剂。

6.权利要求1所述的应用，其特征在于所述附子灵或其可药用酸加成盐是按照如下方法制备的：

a.取生附片，粉碎，用有机溶剂提取，将提取液减压浓缩至浸膏，加水溶解，加酸调pH至2～5，用乙酸乙酯萃取1～4次，合并萃取液并减压浓缩干得油脂部位，再加碱调pH至7～12，用乙酸乙酯萃取1～4次，合并萃取液并减压浓缩干得总生物碱部位；

b.将总生物碱部位的浸膏过中性氧化铝柱、碱化硅胶柱或制备柱色谱反复分离并重结晶，或者将总生物碱部位的浸膏用高速逆流色谱分离。

7.权利要求6所述的应用，其特征在于所述附子灵或其可药用酸加成盐是按照如下方法制备的：

a.取生附片，粉碎，用有机溶剂提取，将提取液减压浓缩至浸膏，加水溶解，加酸调pH至2～5，用乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液并减压浓缩干得油脂部位，再加碱调pH至9～11，用乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液并减压浓缩干得总生物碱部位；

b.将总生物碱部位的浸膏过中性氧化铝柱、碱化硅胶柱或制备柱色谱反复分离并重结晶，或者将总生物碱部位的浸膏用高速逆流色谱分离。

8.权利要求1所述的应用，其特征在于所述附子灵或其可药用酸加成盐是按照如下方法制备的：

a.取生附片，粉碎，用酸水提取，浸提2～4次，每次1.5～2.5天，过滤，合并滤液，减压浓缩至适量体积，用乙酸乙酯萃取1～4次，合并萃取液并减压浓缩干得油脂部位，再加碱调pH至7～12，用乙酸乙酯萃取1～4次，合并萃取液并减压浓缩干得总生物碱部位；

b.将总生物碱部位的浸膏过中性氧化铝柱、碱化硅胶柱或制备柱色谱反复分离并重结晶，或者将总生物碱部位的浸膏用高速逆流色谱分离。

9.权利要求8所述的应用，其特征在于所述附子灵或其可药用酸加成盐是按照如下方法制备的：

a.取生附片，粉碎，用酸水提取，浸提3次，每次2天，过滤，合并滤液，减压浓缩至适量体积，用乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液并减压浓缩干得油脂部位，再加碱调pH至9～11，用乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液并减压浓缩干得总生物碱部位；

b.将总生物碱部位的浸膏过中性氧化铝柱、碱化硅胶柱或制备柱色谱反复分离并重结晶，或者将总生物碱部位的浸膏用高速逆流色谱分离。

10.权利要求1所述的应用，其特征在于所述附子灵或其可药用酸加成盐是按照如下方法制备的：

a.取生附片，粉碎，用有机溶剂提取，将提取液减压浓缩至浸膏，加水溶解，加酸调pH至2～5，用乙酸乙酯萃取1～4次，合并萃取液并减压浓缩干得油脂部位，再加碱调pH至7～12，用乙酸乙酯萃取1～4次，合并萃取液并减压浓缩干得总生物碱部位；

b.将总生物碱部位过中性氧化铝柱后所得的总浸膏通过不同pH梯度萃取富集，

①总浸膏用酸水溶解后调不同酸度pH，采用乙酸乙酯或极性与其相近的溶剂进行萃取；

②用碱水调节步骤①萃取后的酸水液的pH值至不同碱度，采用乙酸乙酯或极性与其相近的溶剂进行萃取，合并萃取液，浓缩，重结晶。

11.权利要求10所述的应用，其特征在于所述附子灵或其可药用酸加成盐是按照如下方法制备的：

a.取生附片，粉碎，用有机溶剂提取，将提取液减压浓缩至浸膏，加水溶解，加酸调pH至2～5，用乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液并减压浓缩干得油脂部位，再加碱调pH至9～11，用乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液并减压浓缩干得总生物碱部位；

b.将总生物碱部位过中性氧化铝柱后所得的总浸膏通过不同pH梯度萃取富集，

①总浸膏用酸水溶解后调不同酸度pH，采用乙酸乙酯或极性与其相近的溶剂进行萃取；

②用碱水调节步骤①萃取后的酸水液的pH值至不同碱度，采用乙酸乙酯或极性与其相近的溶剂进行萃取，合并萃取液，浓缩，重结晶。

12.权利要求6～11任一项所述的应用，其特征在于：

所述有机溶剂为乙醇、甲醇、丙酮、异丙醇、乙酸乙酯、石油醚或乙醚；

所述酸化溶剂为盐酸、硝酸、硫酸、磷酸、甲酸、醋酸、丁酸或其混合物；

所述碱化试剂为氨水、氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸钠、碳酸钾或其混合物。