CN107569543A - 一种单酯型乌头总生物碱的制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种从川乌或草乌中提取总生物碱并将提取物中的双酯型生物碱降解为单酯型生物碱的方法及其应用。将干燥川乌或草乌粉碎，用乙酸乙酯(含氨水)渗漉提取，合并渗漉液，浓缩，用0.5％的HCl酸化至pH＝1～2，乙酸乙酯萃取，水层再用0.5％的NaOH碱化至pH＝11～12，乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯层合并，减压回收，得乌头总生物碱。将乌头总生物碱加入到体积百分比浓度为40％‑80％的1，4‑二氧六环水溶液中，加热回流5‑8小时，得到单酯型乌头总生物碱，得到的单酯型乌头总生物碱具有抗癌作用。

Description

一种单酯型乌头总生物碱的制备方法及其应用

技术领域

本发明属于天然药物化学研究领域，涉及一种单酯型乌头总

生物碱的制备方法及其医药用途。

技术背景

川乌为毛茛科植物乌头Aconitum carmichaelii Debx.的母根，附子为为毛茛科植物乌头Aconitum carmichaelii Debx.的子根，草乌为毛茛科植物北乌头Aconitumkusnezoffii Reichb.的干燥块根，三者民间药用历史悠久，常被用于治疗风湿、麻痹、寒疝、疼痛等症状，主要含有生物碱、黄酮和多糖类成分。

国内外学者已从乌头属植物中分离鉴定了400多种生物碱类化合物，主要为二萜类生物碱，其中普遍存在且含量较高的是乌头碱、新乌头碱和次乌头碱。研究结果显示，这三种生物碱是乌头属植物中主要的药效成分，具有抗炎、镇痛等活性。同时这三种生物碱也是毒性成分。文献指出这三种双酯型生物碱易发生水解，生成单酯型乌头碱和乌头原碱，单酯型乌头碱仍具有抗炎镇痛活性，但毒性大大降低。因此将双酯型生物碱转化为单酯型生物碱显得尤为有意义，中医主要通过川乌、草乌或附子的炮制来实现(包括蒸制、煮制、砂烫法和加入辅料法等)将双酯型生物碱转化为单酯型生物碱，但这些方法重现性较差，不规范，转化效率不高，而且容易将单酯型生物碱进一步降解生成乌头原碱使其药理活性大大降低。

发明内容

本发明的目的是要提供一种能够从川乌或草乌中快速高效提取生物碱，并将其中有活性但毒性大的双酯型生物碱降解为毒性低的单酯型生物碱的制备方法以及它的医药用途。

本发明的方法如下：

将干燥川乌或草乌或附子粉碎，用乙酸乙酯、甲醇、乙醇、氯仿、二氯乙烷等有机溶剂，其中有机溶剂中含1％-3％氨水或二乙胺，渗漉提取时间，32-36小时，合并渗漉液，浓缩，用盐酸、硫酸、硝酸等酸化至pH＝1～2，乙酸乙酯、石油醚、环己烷等低级性有机溶剂萃取3-5次，水层再用氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙等碱化至pH＝11～12，用乙酸乙酯、石油醚、环己烷、二氯甲烷、氯仿等有机溶剂萃取3-5次，合并有机溶剂层，减压回收有机溶剂，得乌头总生物碱。将乌头总生物碱加入到体积百分比浓度为40％-80％的1，4-二氧六环水溶液中，加热回流进行水解，水解液浓缩后用盐酸、硫酸、硝酸等酸化至pH＝1～2，用乙酸乙酯、石油醚、环己烷等有机溶剂萃取3-5次，水层再用氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙等碱化至pH＝11～12，用、石油醚、环己烷、二氯甲烷、氯仿等有机溶剂萃取，合并有机溶剂层，减压回收有机溶剂，得单酯型乌头总生物碱。

具体实施方式

实施例1

取1kg干燥川乌粉末，装入渗漉装置，用10L乙酸乙酯(氨水2％)渗漉提取32小时，渗漉液减压回收乙酸乙酯，得200ml浓缩液，用0.5％的HCl酸化至pH＝2，乙酸乙酯萃取3次，水层再0.5％的NaOH碱化至pH＝12，乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯层，浓缩，得乌头总生物碱6g。将乌头总生物碱加入到体积百分比为40％的1，4-二氧六环中，加热回流5小时，水解液浓缩后用0.5％的HCl酸化至pH＝2，乙酸乙酯萃取，水层再用0.5％的NaOH碱化至pH＝12，乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯层合并，减压回收乙酸乙酯，得单酯型乌头总生物碱3.7g，转化率62％。HPLC含量测定结果，其中苯甲酰乌头碱、苯甲酰新乌头碱和苯甲酰次乌头碱的含量之和为53.6％，乌头碱、新乌头碱和次乌头碱的含量之和为0.9％。

实施例2

取1kg干燥草乌粉末，用甲醇(氨水2.5％)浸渍草乌粉末，装入渗漉装置，用12L甲醇(氨水2.5％)渗漉提取32小时，渗漉液减压回收甲醇，得300ml浓缩液。用1.0％的硫酸酸化至pH＝1，石油醚萃取3次，水层再用0.8％的KOH碱化至pH＝12，石油醚萃取3次，合并石油醚层，浓缩，得乌头总生物碱7g。将乌头总生物碱加入到体积百分比为50％的1，4-二氧六环中，加热回流5小时，水解液浓缩后用0.5％的硫酸酸化至pH＝2，石油醚萃取，水层再用0.5％的KOH碱化至pH＝12，石油醚萃取，石油醚合并，减压回收石油醚，得单酯型乌头总生物碱4.5g，转化率65％。HPLC含量测定结果，其中苯甲酰乌头碱、苯甲酰新乌头碱和苯甲酰次乌头碱的含量之和为62.6％，乌头碱、新乌头碱和次乌头碱的含量之和为0.5％。

实施例3

取8kg干燥川乌粉末，用乙醇(含乙二胺2.5％)浸渍川乌粉末，装入渗漉装置，用75L乙醇(含乙二胺2.5％)渗漉提取32小时，渗漉液减压回收乙醇，得960ml浓缩液，用0.5％的硝酸酸化至pH＝1，环己烷萃取3次，水层再0.5％的氢氧化钙碱化至pH＝12，环己烷萃取3次，合并环己烷层，浓缩，得乌头总生物碱51g。将乌头总生物碱加入到体积百分比为60％的1，4-二氧六环中，加热回流7小时，水解液浓缩后用0.5％的硝酸酸化至pH＝1～2，环己烷萃取，水层再用0.5％的氢氧化钙碱化至pH＝11～12，环己烷萃取，环己烷层合并，减压回收环己烷，得单酯型乌头总生物碱35g，转化率69％。HPLC含量测定结果，其中苯甲酰乌头碱、苯甲酰新乌头碱和苯甲酰次乌头碱的含量之和为52.3％，乌头碱、新乌头碱和次乌头碱的含量之和为0.1％。

实施例4

取8kg干燥草乌粉末，用二氯甲烷(含二乙胺1％)浸渍草乌粉末，装入渗漉装置，用80L二氯甲烷(含二乙胺1％)渗漉提取32小时，渗漉液减压回收二氯甲烷，得1100ml浓缩液。用0.5％的HCl酸化至pH＝1，乙酸乙酯萃取3次，水层再用0.5％的NaOH碱化至pH＝12，二氯甲烷萃取3次，合并二氯甲烷层，浓缩，得乌头总生物碱55g。将乌头总生物碱加入到体积百分比为65％的1，4-二氧六环中，加热回流6小时，水解液浓缩后用0.5％的HCl酸化至pH＝2，二氯甲烷萃取，水层再用0.5％的NaOH碱化至pH＝12，二氯甲烷萃取，二氯甲烷层合并，减压回收二氯甲烷，得单酯型乌头总生物碱38g，转化率71％。HPLC含量测定结果，其中苯甲酰乌头碱、苯甲酰新乌头碱和苯甲酰次乌头碱的含量之和为53.5％，乌头碱、新乌头碱和次乌头碱的含量之和为0.3％。

实施例5对人肿瘤细胞系的体外细胞毒性测试

材料和方法

人肿瘤细胞系A549(肺癌)、HCT-15(结肠癌)和MCF-7(乳腺癌)已从国家癌症研究所(Rockville，MD，USA)的发展治疗组获得。依惯例，将细胞在补充有10％胎牛血清的RPMI1640培养基中生长，培养基和胎牛血清都自Biochrom AG(Berlin，Germany)获得。在37℃下、含有5％CO2的潮湿气氛下，在培养皿(Nunc，Denmark)中生长细胞。每4天复制细胞，并且在其间更换培养基一次。

对在测试物质存在情况下生长24小时的指数生长细胞评估细胞毒性。简单地说，在具有200μl完全培养基的96孔板中接种4000个细胞；24小时后，对培养基补充一系列不同浓度的化合物，并维持该接触24小时。将化合物溶于纯水中，并使用0.22μm的聚碳酸酯膜滤器(Millipore，Molsheim，France)灭菌。然后，使细胞再生长48小时；通过用MTT染料((1-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-3，5-二苯甲臜)，Sigma-Aldrich Chimie，Saint-Quentin-Fallavier，France)着色定量估计存活的和代谢活性的细胞。使细胞数量50％减少的物质的量表现出细胞毒性，并表示化合物的IC₅₀。

表1总结下列物质的IC₅₀值(μM)和两种主要的抗癌药，如它们在国家癌症研究所的发展治疗组(Development Therapeutic Program)的数据库中存在的，其为5-氟尿嘧啶(即5-FU)，顺铂。对下列细胞系上进行测试A549，HCT-15和MCF-7人肿瘤细胞系。

表1

对A459、HCT-15和MCF-7人肿瘤细胞系测试的数种化合物的IC₅₀值(μM)。

从表1可观察到根据本发明的所有组合物示出抑制作用。对于实施例1-4观察到最好结果。

实施例6化学物B(按照实施例4方法未进行酸碱处理的乌头总生物碱)的急性经口毒性试验

一、试验目的

检测化学物B对实验动物的急性经口毒性作用和强度，并依据半数致死剂量(LD₅₀)进行急性毒性分级。

二、试验材料

1.受试物

化学物B

2.动物

ICR小鼠，SPF级，体重20±2g，雌雄各半，共60只。辽宁长生生物技术有限公司，动物合格证号：SCXK(辽)2015-0001。

三、试验方法

1.受试物的配制

根据给药剂量及给药体积，用蒸馏水配置成相应的浓度。定溶前用2％盐酸调pH值至4-5。

2.剂量设置

根据预试验结果，共设6个剂量组，每组10只动物，雌雄各半。各组的染毒剂量见表1。

3.实验动物的染毒

采用灌胃方式经口染毒，染毒体积为0.2mL/20g体重。所有动物染毒前禁食8小时，染毒后继续禁食2小时，禁食期间饮水正常。

4、观察指标

染毒后观察动物的一般状况，中毒症状和死亡情况及体重变化。试验期间死亡的动物及试验结束时存活的动物，大体解剖肉眼观察，有异常改变时，进一步进行组织病理学的检查。观察期限为14天。

5、LD₅₀的计算

采用Bliss统计软件计算。

四、试验结果

各组小鼠经口灌胃给予化学物B后，出现短暂的呼吸困难，1小时后逐渐恢复正常。动物死亡多发生在染毒后的2小时内，高剂量组的少量动物死亡发生在染毒后的2-24小时之内。死亡前的主要表现为身体翻转、痉挛、角弓反张。实验动物的死亡情况见表1。染毒后1周及2周时，各组存活动物的体重均增加。死亡动物及试验结束时存活动物大体解剖肉眼观察未见异常。

表1化学物A的剂量设置及实验动物死亡情况

采用Bliss法计算半数致死剂量。化学物B的小鼠经口半数致死剂量(LD₅₀)为26.2mg/kg，LD₅₀(Feiller校正)95％的可信限为20.3mg/kg—43.8mg/kg。

五、结论

化学物B的小鼠经口半数致死剂量(LD₅₀)为26.2mg/kg，LD₅₀(Feiller校正)95％的可信限为20.3—43.8mg/kg。依据WHO化学物的急性毒性分级标准化学物B的急性毒性分级为高毒。

实施例7化学物A(按照实施例4方法获得的单酯型乌头总生物碱)的急性经口毒性试验

一、试验目的

检测化学物A对实验动物的急性经口毒性作用和强度，并依据半数致死剂量(LD₅₀)进行急性毒性分级。

二、试验材料

1.受试物

化学物A

2.动物

ICR小鼠，SPF级，体重20±2g，雌雄各半，共50只。辽宁长生生物技术有限公司，动物合格证号：SCXK(辽)2015-0001。

三、试验方法

1.受试物的配制

根据给药剂量及给药体积，用蒸馏水配置成相应的浓度。定溶前用2％盐酸调pH值至4-5。

2.剂量设置

根据预试验结果，共设5个剂量组，每组10只动物，雌雄各半。各组的染毒剂量见表1。

3.实验动物的染毒

采用灌胃方式经口染毒，染毒体积为0.4mL/20g体重。所有动物染毒前禁食8小时，染毒后继续禁食2小时，禁食期间饮水正常。

4、观察指标

染毒后观察动物的一般状况，中毒症状和死亡情况及体重变化。试验期间死亡的动物及试验结束时存活的动物，大体解剖肉眼观察，有异常改变时，进一步进行组织病理学的检查。观察期限为14天。

5、LD₅₀的计算

采用Bliss统计软件计算。

四、试验结果

各组小鼠经口灌胃给予化学物A后，出现短暂抑制，活动减少，1小时后逐渐恢复正常。动物死亡均发生在染毒后的1小时内，死亡前的主要表现为身体翻转、尾部发紫、震颤。实验动物的死亡情况见表1。染毒后1周及2周时，各组存活动物的体重均增加。死亡动物及试验结束时存活动物大体解剖肉眼观察未见异常。

表1化学物A的剂量设置及实验动物死亡情况

采用Bliss法计算半数致死剂量。化学物A的小鼠经口半数致死剂量(LD₅₀)为775.8mg/kg，LD₅₀(Feiller校正)95％的可信限为681.2mg/kg—896.2mg/kg。

五、结论

化学物A的小鼠经口半数致死剂量(LD₅₀)为775.8mg/kg，LD₅₀(Feiller校正)95％的可信限为681.2—896.2mg/kg。依据WHO化学物的急性毒性分级标准化学物A的急性毒性分级为低毒。

Claims (6)

1.一种单酯型乌头总生物碱制备方法，其特征在于

(1)将干燥川乌或草乌粉碎

(2)有机溶剂提取32-36小时

(3)提取液浓缩后用0.5％的HCl酸化至pH＝1～2，乙酸乙酯萃取，水层再用0.5％的NaOH碱化至pH＝11～12，乙酸乙酯萃取，合并乙酸乙酯层，减压回收，得乌头总生物碱

(4)将乌头总生物碱加入到1，4-二氧六环水溶液中进行水解

(5)水解液回收溶剂后用0.5％的HCl酸化至pH＝1～2，乙酸乙酯萃取，水层再用0.5％的NaOH碱化至pH＝11～12，乙酸乙酯萃取，合并乙酸乙酯层，减压回收，得单酯型乌头总生物碱。

2.权利要求1所述的制备方法，其特征在于获得的单酯型乌头总生物碱中苯甲酰乌头碱、苯甲酰新乌头碱和苯甲酰次乌头碱的含量之和大于50％，乌头碱、新乌头碱和次乌头碱的含量之和小于1％。

3.权利要求1所述的制备方法，其特征在于有机溶剂提取为渗漉提取，提取溶剂为含2-3％氨水的乙酸乙酯。

4.权利要求1所述的制备方法，其特征在于乌头总生物碱与1，4-二氧六环水溶液比例为1:10-1:20。

5.权利要求1所述的制备方法，其特征在于水解方式为加热回流5-8小时。

6.权利要求1所述的制备方法获得的单酯型乌头总生物碱在制备抗癌药物中的应用。