CN104940918A - 一种猪支原体肺炎灭活疫苗的生产方法 - Google Patents
一种猪支原体肺炎灭活疫苗的生产方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104940918A CN104940918A CN201510249922.0A CN201510249922A CN104940918A CN 104940918 A CN104940918 A CN 104940918A CN 201510249922 A CN201510249922 A CN 201510249922A CN 104940918 A CN104940918 A CN 104940918A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- vaccine
- inactivated vaccine
- strain
- mycoplasma hyopneumoniae
- culture
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Landscapes
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
本发明涉及一种猪支原体肺炎灭活疫苗的生产方法。本发明是在成功分离到一株免疫原性良好的猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae Mhp)S株作为生产菌株，通过使用高效的培养基，研究出适宜的培养方法、灭活工艺和适宜的免疫佐剂，制造出猪肺炎支原体灭活疫苗，本发明生产出的灭活疫苗具用于免疫猪后获得良好的免疫保护效力。
Description
技术领域
本发明涉及猪的一种传染病预防用灭活疫苗，本专利属于兽用生物制品技术领域。
背景技术
猪支原体肺炎(Mycoplasma pneumoniae of swine，MPS)，又称猪地方流行性肺炎(Enzootic pneumoniae of Swine，EPS)，俗称猪喘气病，是由猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae)引起的一种慢性接触性呼吸道传染病，主要症状为表现为咳嗽和气喘，生长迟缓，饲料转化率低。该病具有发病率高，死亡率低，广泛分布于世界各地，是造成全球养猪经济损失最重要的疾病之一。
猪肺炎支原体具有典型支原体的全部形态特征，无细胞壁菌体呈多种形态，在电镜下可以见到球状、环状、丝状及点状的菌体形态。在固体培养基上10～14日可见到菌落，多为圆形，边缘通常不整齐，半透明，少数中央有乳头状突起，大小在100～300μm之间。猪肺炎支原体是当前最难培养的支原体种类之一，其对培养基营养成分和培养条件要求非常苛刻，在普通培养基上难以生长。要从发病猪体内或病变组织分离猪肺炎支原体是件极其困难的事，初次分离生长非常缓慢，通常需要10～30日的培养，才能引起培养物颜色发生变化，而且培养物滴度很低，需经过持续驯化后才能达到较高的活菌滴度，培养时间可缩短为3～4日。
患病猪是该病最主要传染源，病猪和健康猪混群饲养，常引起本病的传播。各种年龄的猪均可感染本病，但幼龄仔猪易感性比成年猪高，而且发病症状也更加明显，由此引起的经济损失也较为严重。在老疫区，患病母猪往往是主要传染源，并将病原体传染给仔猪，造成该病在猪群中长期的存在。猪支原体肺炎的传播途径主要是直接接触传播和空气传播两种形式，当患病猪与健康猪直接接触，或同圈饲养的病猪咳嗽时将病原体通过呼吸道排出体外，健康猪吸入病原体而感染。Goodwin等1966年证明从患有喘气病的猪鼻腔分泌物中成功分离出猪肺炎支原体(Goodwin RF,Whittlestone P:Enzootic pneumonia of pigs:growth and behaviour of the causal mycoplasma in liquid media.Br J Exp Pathol 1966,47(5):518-524.)。
猪肺炎支原体可单独引起猪发病，也可与其他病原体引起混合感染，包括支原体(如猪鼻支原体)、细菌(如猪副嗜血杆菌、胸膜肺炎放线杆菌及败血波氏杆菌、巴氏杆菌等)、病毒(如猪蓝耳病病毒、猪瘟等)，甚至包括肺丝虫等寄生虫，在实际生产中，绝大部分表现出 典型猪喘气病的病猪都是混合感染。
对发病猪进行剖检，可发现其主要病变发生在肺脏，通常出现在尖叶、心叶、中间叶和膈叶的前缘部分，可见到暗红色的肉样病变，与正常肺组织界限清晰。肺部病变部位的病理变化是结缔组织增生硬化，与相邻正常肺组织齐平或下陷。切割时切面湿润、平滑致密，类似于鲜嫩的肌肉，气管和支气管中常伴有卡它性分泌物，肺门淋巴结和隔淋巴结常明显肿大。
该病的防治主要通过疫苗免疫，药物治疗可缓解或减轻疾病症状，降低发病率，但不能根除病原体，也不能阻止再感染，停药后往往会很快复发，极大地影响养殖的成本。当前猪支原体肺炎疫苗主要包括弱毒活疫苗和灭活疫苗两种。
截至当前，猪支原体肺炎的防治工作仍是世界上养猪业面临的一个难题。疫苗免疫是所有预防控制手段中最有效的途径，我国针对猪支原体肺炎疫苗的研究开始于上世纪60年代，直到90年代中国兽医药品监察所成功驯化出了一株免疫原性良好的猪肺炎支原体弱毒疫苗，并研制乳兔组织活疫苗和鸡胚活疫苗，本世纪初江苏农科院研制出了猪支原体肺炎活疫苗(168株)，但以上活疫苗都采用胸腔注射免疫，操作上不易被用户接受，影响其推广使用。近年来，中国兽医药品监察所又研制出采用鼻腔喷射免疫的猪支原体肺炎活疫苗(RM48株)。我国在活疫苗上研制上处于领先地位，但在灭活疫苗的研制上则起步较晚。
发明内容
本发明的目的是为将成功分离到一株免疫原性良好的猪肺炎支原体野毒株的基础上，通过使用高效的培养基，研究出适宜的培养方法、灭活工艺和适宜的免疫佐剂，制造免疫保护效力良好的猪肺炎支原体灭活疫苗的方法。
本发明的实施方案：
1.一种猪支原体灭活疫苗，其特征在于该灭活疫苗含有灭活的S株猪支原体(Mycoplasma hyopneumoniae)和兽医生物制品允许使用的佐剂；该猪肺炎支原体S株已于2014年12月1日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC No.10095。
2.如权利要求1所述一种猪支原体灭活疫苗的生产方法，其特征在于该灭活疫苗的生产为：
(1)疫苗制造用抗原的制备：将二级种子按1:20接种Lps-5培养基，在37℃培养3～6日，当pH值达到6.9左右，收获培养物，再按1:50比例以同样的方法传代培养，直到收获菌液制造疫苗；
(2)灭活：培养后菌液经β-丙内酯置灭活处理，加入硫柳汞作为防腐剂；
(3)配苗：
油剂苗 将灭活后菌液与油佐剂(法国赛比克公司)按(V/V)1:1的比例混合，使用低剪切力乳化制备水成包油包水(W/O/W)双相疫苗。
水剂苗 将灭活后菌液与水佐剂(法国赛比克公司)，按1:1的比例，搅拌均匀后制备成水剂灭活疫苗。
具体实施方式
本品系用猪肺炎支原体S株接种Lps-5培养基，收获培养物，加入适量的佐剂，乳化后制成。用于预防猪支原体肺炎(俗称猪喘气病)。
1菌种
(1)制造本品用的菌种为猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae)S株，由北京中海生物科技有限公司分离、鉴定；该猪肺炎支原体，S株，已于2014年12月1日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号CGMCC No.10095。效力检验用菌种为猪肺炎支原体JN株，由中国兽医药品监察所提供。
(2)猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae)S株生产用菌种标准
l)形态特性 菌体形态为环状、球状、丝状、杆状和点状多形态微生物，无细胞壁，革兰氏染色阴性。
2)培养特性 在Lps-5液体培养基中，置37℃下培养5～10日，培养基pH值下降0.5以上，呈现轻度混浊；在固体培养基上，置含CO2潮湿环境下37℃培养7～10日，低倍显微镜下可见支原体菌落。该菌株的菌落为灰白色支原体的菌落形态，大多数菌落边缘整齐，有少数菌落边缘不整齐，多数菌落中间没有“脐”状特征。
3)血清学特性 用代谢抑制试验鉴定。将猪肺炎支原体S株菌液用Lps培养基稀释至104或105颜色变化单位/mL(CCU/mL)后,加入等量含10％的抗猪肺炎支原体阳性兔血清(中国兽医药品监察所提供)(琼脂扩散反应效价≥1:16)的Lps-5培养基，同时设不加阳性血清的猪肺炎支原体培养物对照管，置37℃培养15日，观察培养基颜色变化。对照管pH值下降0.5以上，含阳性血清的试管培养基颜色不发生变化或pH值下降低于0.5为合格。猪肺炎支原体阳性血清能特异地抑制猪肺炎支原体对培养基中葡萄糖的代谢。
4)免疫原性 使用猪肺炎支原体S株菌种，按照本规程制备疫苗，使用7～14日龄健康子猪5头，颈部肌肉注射疫苗0.5mL，14日后再次肌肉注射0.5mL。首次免疫后21日，连同对照组5头猪一同使用猪肺炎支原体JN株肺组织毒进行气管内攻毒，5mL/头(含肺组织量0.01g)。观察28日后剖检，取猪肺脏按照附件3猪肺病变指数和保护率计算方法，病变指数 减少率应不低于60％。
5)纯粹 按现行《中国兽药典》(中国兽药典委员会编，全称《中华人民共和国兽药典》三部，二〇一〇年版，中国农业出版社，本发明以下称《中国兽药典》)附录进行检验，应纯粹。
6)基础种子代数 1～3代。
7)保存 弱毒冻干菌种–20℃以下保存，有效期为72个月。
(2)检验用强毒菌株标准
1)PCR检测 用猪肺炎支原体16s RNA的特异序列为目的片段设计引物进行扩增，猪肺炎支原体JN株肺组织毒应呈现特异性阳性反应(见附注4)。
2)毒力 将猪肺炎支原体JN株肺组织毒(含病变肺组织0.1g)用PBS(pH值7.2)1:50倍稀释，经气管途径感染30～50日龄健康敏感猪5头，5mL/头，观察28日，试验猪肺脏病变平均分达到1.0以上为合格。
3)菌种保存 强毒冻干菌种JN株–20℃以下保存，有效期72个月。
2.疫苗制造及半成品检验
(1)生产用菌种的制备
1)一级种子的繁殖 将冻干基础菌种开启后，使用Lps-5培养基溶解后，以1:10的比例接种Lps-5培养基，置37℃下培养3～10日，当培养物pH值达到6.8～7.0，收获菌液并进行纯粹检验，标明收获日期，菌种代次。检验符合规定后即可作为一级种子。
2)二级种子的繁殖 将一级种子化冻后，以1:10～20的比例接种Lps-5培养基，置37℃下培养3～7日，当培养物pH值达到6.8～7.0，收获菌液并进行纯粹检验，标明收获日期，菌种代次，置–15～–40℃冻存2个月或2～8℃保存3日内使用。检验符合规定后即可作为二级种子。
3)菌种保存 一级种子置–60～–80℃冻存，不超过6个月；二级种子置–15～–40℃冻存不超过2个月或2～8℃保存不超过5日。
4)菌种继代 从基础种子到制苗用菌液的传代代次不超过5代。
(2)培养基 Lps-5培养基(见附注6)。
(3)疫苗制造用抗原的制备
将二级种子按1:20接种Lps-5培养基，在37℃培养3～6日，当pH值达到6.9左右，收获培养物，再按1:50比例以同样的方法传代培养，直到收获菌液制造疫苗。取样进行半成品检验，其余部分置2～8℃，菌液冷却后即可进行灭活处理。
(4)灭活
将半成品菌液，加入1:4000的比例加入β-丙内酯置2～8℃灭活24h后，置37±1℃温室2h水解，加入0.001％的硫柳汞作为防腐剂，置2～8℃冷库保存。
(5)半成品检验
1)纯粹检验 按《中国兽药典》附录进行检验，应纯粹。
2)活菌计数 取灭活前的半成品菌液，以Lps-5培养基按照附件5，置37℃下培养14日，检测培养物中支原体的活菌含量，冻干前半成品的活菌数应不低于2×108CCU50/mL。
3)灭活检验 取1mL灭活后的菌液接种到20mL的Lps-5培养基，置37±1℃培养5日后，分别取0.2mL接种到3支装有1.8mL培养基的小管，置37±1℃继续培养10日，两次接种的培养基颜色均未变黄，则灭活完全。
(6)配苗及分装
油剂苗的配制 将灭活后菌液与油佐剂分别预热到31±1℃后，按1:1的比例，使用低剪切力乳化5～10min，一步法制备水包油包水(W/O/W)双相灭活疫苗。
水剂苗的配制 将灭活后菌液与水佐剂，按1:1的比例，搅拌3～5min，制备成水剂灭活疫苗。
(7)分装 对配制好的疫苗半成品按照规定头份定量分装。
3成品检验
(1)性状
1)油剂苗
外观 乳白色乳液。
剂型 水包油包水(W/O/W)型。
稳定性 吸取疫苗10mL置一次性离心管中，以3000r/min离心15min，底部析出的水相不超过0.5mL。
黏度 按现行《中国兽药典》附录进行，应不超过200mPa.s。
2)水剂苗
外观 黄色或橙色均与悬液。
(2)无菌检验 按现行《中国兽药典》附录进行检验，应纯粹。
(3)装量检查 按现行《中国兽药典》附录进行检验，应符合规定。
(4)安全检验 用7～14日龄健康敏感猪5头，双倍免疫剂量免疫后的总分均不大于4判为安全，评价方法见附件3。
(5)效力检验(两种方法仍选其一)
1)用家兔检验 使用1.2～1.5kg清洁级新西兰试验兔共10只，其中5只作为对照组， 5只各前腿部肌肉注射0.2mL，2周后后腿各肌肉注射0.2mL。免疫后14日检测猪肺炎支原体IHA抗体效价。对照组应全部阴性，免疫组试验兔应至少4只阳性(即IHA抗体不低于1/20)。IHA抗体测定方法见附注7。
2)用猪检验 用7～14日龄健康易感仔猪10头，其中5头作为对照猪，对另5头各肌肉注射疫苗1mL，14日后再次肌肉注射1mL。首免后30日，连同对照组5头猪一同使用猪肺炎支原体JN株肺组织毒进行气管内攻毒，5mL/头(含肺组织量0.1g)。观察28日后剖检，取猪肺脏按照附件2猪支原体肺炎病变指数评分标准进行评分和计算，病变指数减少率应不低于60％。
(6)汞类防腐剂残留量测定 按照现行《中国兽药典》附录进行测定，应符合规定。
4作用与用途 用于预防猪支原体肺炎(猪喘气病)，免疫期为6个月。
5用法与用量 7～35日龄仔猪肌肉注射1mL/头，14日后相同剂量加强免疫一次。
6注意事项
6.1疫苗2～8℃保存，严禁冻结，避免高温和日光直射。
6.2疫苗开启应一次用完。
6.3本疫苗只用于健康猪，并每头猪更换一次注射针头。
6.4屠宰前1个月内不应免疫本疫苗。
7贮藏与有效期2～8℃保存，有效期为18个月。
8规格10mL/瓶、20mL/瓶、50mL/瓶、100mL/瓶、250mL/瓶。
本发明涉及的微生物资源信息
猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae)S株，该菌株已于2014年12月1日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号CGMCC No.10095。效力检验用菌种为猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae)JN株，由中国兽医药品监察所提供。
本发明的积极意义
本发明涉及一种猪支原体肺炎灭活疫苗的生产方法。本发明是在成功分离到一株免疫原性良好的猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae)S株作为生产菌株，通过使用高效的培养基，研究出适宜的培养方法、灭活工艺和适宜的免疫佐剂，制造出猪肺炎支原体灭活疫苗，本发明生产出的灭活疫苗具用于免疫猪后获得良好的免疫保护效力。
附图说明
图1猪支原体肺炎的肺脏病变图颜色深的部分即为猪支原体肺炎的典型肉样病变区。
图2血清样品检测剂稀释图
图3血凝反应结果判定图
实施例
本实施例仅为对本发明作进一步说明，不对本发明的技术方案构成限定。
实施例1
——疫苗制造及半成品检验
(1)生产用菌种的制备
1)一级种子的繁殖 将冻干基础菌种开启后，使用Lps-5培养基溶解后，以1:10的比例接种Lps-5培养基，置37℃下培养3～10日，当培养物pH值达到6.8～7.0，收获菌液并进行纯粹检验，标明收获日期，菌种代次。检验符合规定后即可作为一级种子。
2)二级种子的繁殖 将一级种子化冻后，以1:10～20的比例接种Lps-5培养基，置37℃下培养3～7日，当培养物pH值达到6.8～7.0，收获菌液并进行纯粹检验，标明收获日期，菌种代次，置–15～–40℃冻存2个月或2～8℃保存3日内使用。检验符合规定后即可作为二级种子。
3)菌种保存 一级种子置–60～–80℃冻存，不超过6个月；二级种子置–15～–40℃冻存不超过2个月或2～8℃保存不超过5日。
4)菌种继代 从基础种子到制苗用菌液的传代代次不超过5代。
(2)培养基 Lps-5培养基(见附注6)。
(3)疫苗制造用抗原的制备
将二级种子按1:20接种Lps-5培养基，在37℃培养3～6日，当pH值达到6.9左右，收获培养物，再按1:50比例以同样的方法传代培养，直到收获菌液制造疫苗。取样进行半成品检验，其余部分置2～8℃，菌液冷却后即可进行灭活处理。
(4)灭活
将半成品菌液，加入1:4000的比例加入β-丙内酯置2～8℃灭活24h后，置37±1℃温室2h水解，加入0.001％的硫柳汞作为防腐剂，置2～8℃冷库保存。
(5)半成品检验
1)纯粹检验 按现行《中国兽药典》附录进行检验，为纯粹。
2)活菌计数 取灭活前的半成品菌液，以Lps-5培养基按照附件5，置37℃下培养14日，检测培养物中支原体的活菌含量，冻干前半成品的活菌数应不低于2×108CCU50/mL。
3)灭活检验 取1mL灭活后的菌液接种到20mL的Lps-5培养基，置37±1℃培养5日后，分别取0.2mL接种到3支装有1.8mL培养基的小管，置37±1℃继续培养10日，两次接种的培养基颜色均未变黄，灭活完全。
实施例2
------猪支原体肺炎灭活疫苗(S株，油佐剂)的制备与检验
1.配苗及分装
将实施例1制备成灭活后的猪肺炎支原体S株菌液与油佐剂(法国赛比克公司)分别预热到31±1℃后，按1:1的比例，使用低剪切力乳化5～10min，一步法制备水包油包水(W/O/W)双相疫苗。
分装 对乳化好的疫苗半成品按照规定头份定量分装。
2.成品检验
(1)性状
均为乳白色乳液；吸取疫苗10mL置一次性离心管中，以3000r/min离心15min，底部均无水相析出；按现行《中国兽药典》附录进行黏度测定，结果分别为45mPa.s、53mPa.s和46mPa.s。3批性状检验结果均符合规定。
(2)无菌检验 按现行《中国兽药典》附录进行检验，3批疫苗均无细菌生长，结果符合规定。
(3)装量检查 按现行《中国兽药典》附录进行检验，3批疫苗均符合规定。
(4)疫苗安全检验
1)小鼠安全检验
3批疫苗分别腹腔注射15～22g Balb/C小鼠8只，观察10日，小鼠均健活；
2)仔猪安全检验
超剂量肌肉注射仔猪，观察7日，首次免疫后4～5日仔猪体温略有升高，持续1～3日后均恢复正常，仔猪均健活，除注射部位出现轻微红肿，无其他副反应。
(5)效力检验(两种方法仍选其一)
1)用家兔检验使用1.2～1.5kg清洁级新西兰试验兔共10只，其中5只作为对照组，5只各前腿部肌肉注射0.2mL，2周后后腿各肌肉注射0.2mL。免疫后14日检测猪肺炎支原体IHA抗体效价。对照组应全部阴性，免疫组试验兔应至少4只阳性(即IHA抗体不低于1/20)。结果见表1。
表1猪支原体肺炎灭活疫苗(S株，油佐剂)家兔免疫后抗体IHA效价测定结果
2)用猪检验 用7～14日龄健康易感仔猪10头，其中5头作为对照猪，对另5头各肌肉注射疫苗1mL，14日后再次肌肉注射1mL。首免后30日，连同对照组5头猪一同使用猪肺炎支原体JN株肺组织毒进行气管内攻毒，5mL/头(含肺组织量0.1g)。观察28日后剖检，取猪肺脏按照附件猪支原体肺炎病变指数评分标准进行评分和计算，病变指数减少率应不低于60％。结果表明保护率均符合标准要求。
表2猪支原体肺炎灭活疫苗(S株，油佐剂)效力检验结果
(6)汞类防腐剂残留量测定 3批疫苗的测定结果均符合标准要求。
实施例3
------猪支原体肺炎灭活疫苗(S株，水佐剂)的制备与检验
1.配苗及分装
将将实施例1制备成灭活后的猪肺炎支原体S株菌液与水佐剂(法国赛比克公司)按1:1的比例，混合搅拌3～5min，制备成水佐剂灭活疫苗。
分装 对配制好的疫苗半成品按照规定头份定量分装。
2.成品检验
2.成品检验
(1)性状 3批疫苗均为橙色悬液，结果均符合规定。
(2)无菌检验 按现行《中国兽药典》附录进行检验，3批疫苗均无细菌生长，结果符合规定。
(3)装量检查 按现行《中国兽药典》附录进行检验，3批疫苗均符合规定。
(4)疫苗安全检验
1)小鼠安全检验
3批疫苗分别腹腔注射15～22g Balb/C小鼠8只，观察10日，小鼠均健活；
2)仔猪安全检验
超剂量肌肉注射仔猪，观察7日，首次免疫后4～5日仔猪体温略有升高，持续1～3日后均恢复正常，仔猪均健活，除注射部位出现轻微红肿，无其他副反应。
(5)效力检验
1)用家兔检验 使用1.2～1.5kg清洁级新西兰试验兔共10只，其中5只作为对照组，5只各前腿部肌肉注射0.2mL，2周后后腿各肌肉注射0.2mL。免疫后14日检测猪肺炎支原体IHA抗体效价。对照组应全部阴性，免疫组试验兔应至少4只阳性。结果见表3。
表3猪支原体肺炎灭活疫苗(S株，水佐剂)家兔免疫后抗体IHA效价测定结果
2)用猪检验 用7～14日龄健康易感仔猪10头，其中5头作为对照猪，对另5头各肌肉注射疫苗1mL，14日后再次肌肉注射1mL。首免后30日，连同对照组5头猪一同使用猪肺炎支原体JN株肺组织毒进行气管内攻毒，5mL/头(含肺组织量0.1g)。观察28日后剖检，取猪肺脏按照附件猪支原体肺炎病变指数评分标准进行评分和计算，病变指数减少率应不低于60％。结果见表4。
表4猪支原体肺炎灭活疫苗(S株)效力检验结果
(6)汞类防腐剂残留量测定 3批疫苗的测定结果均符合标准要求。
附件：1.健康敏感猪标准
2.猪肺病变指数和保护率计算方法
3.疫苗安检猪临床发病判定标准
4.猪肺炎支原体PCR检测
5.CCU50测定方法
6.Lps-5培养基配制
7.间接血凝(IH)试验方法
附件1健康敏感猪标准
1.1来源要求 母猪未免疫过猪支原体肺炎疫苗，猪场无猪喘气病发病史。
1.2健康状况 仔猪饮食正常，精神状态和发育良好，体温、呼吸、粪便正常，无任何与疾病有关的临床症状。
1.3试验猪的检测
1.3.1猪肺炎支原体抗体检测
使用市售的猪肺炎支原体抗体检测试剂盒进行检测，检验用猪血清应为猪肺炎支原体抗体阴性。
1.3.2猪繁殖与呼吸综合症的病原检测
使用市售的猪繁殖与呼吸综合症(PRRSV)RT-PCR检测试剂盒检测，结果应为阴性。
1.3.2猪伪狂犬的病原检测
使用市售的猪伪狂犬(PRV)PCR检测试剂盒检测，结果应为阴性。
附件2猪肺病变指数和保护率计算方法
2.1试验用猪 7～14日龄健康敏感猪10头。
2.2试验攻毒 将猪肺炎支原体强毒JN株肺组织毒l:50稀释后，连同对照组经气管内注射攻毒，5mL/头，观察25日后扑杀，观察、记录肺脏病变情况。
2.3病变指数的计算
本标准参照了国外常用的5.5分法评分标准，左、右尖叶出现100％病变各记1分，左、右心叶出现100％病变各记1分，左、右膈叶(与心叶相邻的三角形区域)出现100％病变各记0.5分，中间叶出现100％病变各记0.5分，病变总分为5.5分。根据肺脏出现病变的轻重程度加减分值。同一个肺叶的正反两面病变面积不一致时，取平均面积。如图1中感染猪支原体肺炎的猪肺脏评分，左尖叶病变40％，计0.4分；右尖叶病变100％，计1.0分；左心叶病变100％，计1.0分；右心叶病变100％，计1.0分；左膈叶病变100％，计0.5分，右膈叶病变100％，计0.5分；中间叶病变40％，计0.2分，则病变总分＝左尖叶+右尖叶左心叶+右心叶++左膈叶+右膈叶+中间叶＝0.4+1.0+1.0+1.0+0.5+0.5+0.2＝4.7(见附图1)。
2.4保护率的计算
保护率计算公式如下：
附件3疫苗安检猪临床发病判定标准
根据检验猪如下临床症状进行判断：呼吸困难、俯卧、呕吐、死亡和直肠温度等。发病猪临床症状评判标准见下表1。
表1猪支原体肺炎发病猪临床症状评判标准
猪安检试验中，每头试验猪症状全部累计，两次免疫单独计算不累加。两次免疫后的总分均不大于4判为安全；任何一次免疫后总分大于4判为安全检验不符合规定，按照现行《中国兽药典》兽用生物制品通则的要求进行重检。
附件4猪肺炎支原体PCR检测
4.1引物序列 上游引物为5’-GAGCCTTCAAGCTTCACCAAGA-3’(序列1)，下游引物为5’-TGTGTTAGTGACTTTTGCCACC-3’(序列2)。
4.2模板制备 用灭菌PBS(pH值7.2)稀释将待检组织匀浆液(或培养物)稀释20倍后，沸水浴10分钟后，12000g离心10分钟，取上清作为PCR检测用模板。同时设置阴阳性对照。
4.3反应条件 反应体系为：总体系20μl，其中模板DNA 1μl，10×buffer 2μl,dNTP(2.5mmol/L)2μl，上下游引物(25mmol/L)各1μl，去离子水12.5μl，Taq酶0.5μl，PCR反应条件为：95℃预变性5分钟；95℃变性40秒、60℃退火40秒、72℃延伸60秒，共35个循环；72℃延伸5min。
4.4结果判定 阳性对照出现649bp电泳条带，阴性对照无扩增条带，试验结果有效。出现约为649bp扩增条带的样品为猪肺炎支原体阳性。
附件5CCU50测定方法
先将猪肺炎支原体培养物使用Lps-5培养基(液体)进行10倍比稀释至10-9，分别从10-6、10-7、10-8、10-9管中各取0.2mL加入到装有1.8mL培养基的小管中，每个稀释度设6个重复，共计24支小管，置37℃静置培养。2周后进行结果判定，统计各个稀释度培养基变色(pH变化值≥5)的小管数量，按照Reed和Muench法计算半数变色单位(CCU50)。
三次对S株F3代培养物进行CCU50测定的结果
参照《中国兽药典》(2010版，三部)附录7的病毒半数致死量、感染量测定法，计算CCU50方法如下：
log CCU50＝高于50％变色的稀释度的对数+距离比例×稀释系数的对数；
以上表为例，高于50％变色的稀释度为-8，
log CCU50＝－8+0.75×(－1)＝－8.75；
即CCU50＝10-7.75/0.2mL，将其转换成每毫升含CCU50数2.5×108CCU50/mL。该方法相比CCU的测定结果表示更加精确，可重复性更好。
附件6.Lps-5培养基配制
6.1Lps-5培养基基础液的配制：PPLO粉、葡萄糖、水解乳蛋白(Difco)、10％MEM、25％酵母浸出液、青霉素、酚红0.002％等溶于50mL蒸馏水中，使用2mol/L NaOH调pH值至7.8～7.9，补加去离子水至总体积800mL，使用0.2μm滤器过滤除菌，分装。2～8℃保存备用。
6.2Lps-5培养基的配制，培养基基础液800mL，分别加入100mL猪血清和马血清。1mol/LNaOH调pH值至7.5～7.6，分装，按现行《中国兽药典》附录进行无菌检验，应无菌生长，2～8℃保存不超过4个月。
6.3Lps-5固体培养基制备
将7.1中除了10％MEM和青霉素外，其余成分中再加入1.5％的琼脂，115℃高压灭菌 30min后，冷却到50～60℃，分别无菌加入预热过的MEM、青霉素和血清。
附件7间接血凝(IH)试验方法
7.1检测前的准备
将抗原溶解液全部加入到猪喘气病间接血凝抗原中溶解摇匀，置2～8℃保存，并请在2周内使用完。待检血清(每头份血清量应大于0.1mL)56℃水浴灭活30分钟(灭活可减少非特异性反应)。将一次性血凝板用蒸馏水冲洗一遍，拍干即可。
7.2加稀释液
取一次性医用血凝板一块横放，从第6～7列孔间用记号笔垂直划线将血凝板一分为二(每块血凝板可检测14个样品，若只检测少量样品，请注意不要污染其它各排样孔)，在第1列和第7列孔中加入40μL稀释液，其它各孔加入25μL稀释液。如图1所示。
7.3稀释待检血清
在第1列的8个孔中分别加入1～8号猪血清各10μL；第7列的1～6个孔中分别加入9～14号猪血清各10μL；第7列的第7和8个孔分别加入阳性和阴性对照血清各10μL。阴性血清只稀释到第4孔，第5、6孔作为空白对照。
每排第1孔，用移液器吹打5～6次混匀后从该孔中取出25μL移入第2孔，混匀后取出25μL移入第3孔……直至第6孔混匀后取出25μL丢弃。此时第1排1～6孔血清的稀释度(稀释倍数)依次为1:5、1:10、1:20、1:40、1:80、1:160。其它血清样和对照血清也采用同样的稀释方法。如附图2所示。
注意！取每一份血清时，都必须更换枪头；每次稀释都应更换枪头一次。
7.4加间接血凝抗原
将间接血凝抗原充分摇匀至底部无血球沉淀，在被检血清各孔、阴性和阳性对照及空白对照各孔中分别加入间接血凝抗原25μL。
7.5振荡混匀
将血凝板置于微量振荡器上振荡30秒钟左右(如无振荡器，可轻轻振摇直至各孔红血球混合均匀为止)，装入密封袋中，室温静置1.5～2小时后判定结果。
7.6判定标准
将血凝板小心静置于白色背景上，观察检测结果。
阴性对照血清和空白对照各孔，应均无凝集(血球全部沉入孔底形成边缘整齐的小圆点)，或仅出现“+”凝集(血球大部分沉于孔底，边缘仅有少量血球)。
阳性血清对照效价应≥1:40，即至少在第1～4孔应出现“++”以上的凝集。
在对照孔均合格的前提下，再观察待检血清各孔，以呈现“++”凝集的最大稀释倍数为该份血清的抗体效价。血凝反应强度表示如下：(参考附图3)
++++ 血球在孔底形成较厚凝集层，向底部集中，卷边或锯齿状边。
+++ 血球在孔底形成均匀凝集，面积较大。
++ 血球在孔底中心形成少量血球或空心圆点，大部分血球凝集于孔底周围。
+ 血球在孔底中心形成圆点，周围均匀凝集。
－ 血球在孔底中心形成较粗圆点，周围无凝集或少量凝集。
当样品血清抗体效价＞1:10，即第2孔以上出现“++”的凝集，判为阳性；
当样品血清抗体效价＜1:5，即第1孔出现“++”以下的凝集，判为阴性。介于二者之间为可疑。
例如待检血清第1～2孔出现“+++”的凝集，第3孔出现“++”的凝集，第4孔为“+”，即血清抗体效价为1:20，大于1:10，即为猪喘气病抗体阳性。
7.7注意事项与说明
7.7.1对照用阴、阳性血清请勿多次冻融。
7.7.2猪肺炎支原体血凝抗原稀释后，2～8℃保存期间会自然沉积于瓶底，使用前振摇均匀即可使用。
Claims (3)
1.一种猪支原体灭活疫苗，其特征在于该灭活疫苗含有灭活的S株猪支原体(Mycoplasmahyopneumoniae，Mhp)和兽医生物制品允许使用的佐剂；该猪肺炎支原体S株已于2014年12月1日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC No.10095。
2.如权利要求1所述一种猪支原体灭活疫苗的生产方法，其特征在于该灭活疫苗的生产为：
(1)疫苗制造用抗原的制备：将二级种子按1:20接种Lps-5培养基，在37℃培养3～6日，当pH值达到6.9左右，收获培养物，再按1:50比例以同样的方法传代培养，直到收获菌液制造疫苗；
(2)灭活：培养后菌液经β-丙内酯置灭活处理，加入硫柳汞作为防腐剂；
(3)配苗：将灭活后菌液与油佐剂按(V/V)1:1的比例混合，使用低剪切力乳化制备水成包油包水(W/O/W)双相疫苗。
3.如权利要求1所述一种猪支原体灭活疫苗的生产方法，其特征在于该灭活疫苗的生产为：将灭活后菌液与水佐剂按(V/V)1:1的比例混合，搅拌均匀后制备水剂灭活疫苗。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510249922.0A CN104940918B (zh) | 2015-05-15 | 2015-05-15 | 一种猪支原体肺炎灭活疫苗的生产方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510249922.0A CN104940918B (zh) | 2015-05-15 | 2015-05-15 | 一种猪支原体肺炎灭活疫苗的生产方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN104940918A true CN104940918A (zh) | 2015-09-30 |
| CN104940918B CN104940918B (zh) | 2018-03-16 |
Family
ID=54156338
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201510249922.0A Active CN104940918B (zh) | 2015-05-15 | 2015-05-15 | 一种猪支原体肺炎灭活疫苗的生产方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN104940918B (zh) |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103184171A (zh) * | 2011-12-29 | 2013-07-03 | 北京大北农科技集团股份有限公司 | 猪肺炎支原体dj-166株及其应用 |
| CN103182076A (zh) * | 2011-12-29 | 2013-07-03 | 北京大北农科技集团股份有限公司 | 一种猪支原体肺炎灭活疫苗及其制备方法 |
| CN103484414A (zh) * | 2013-10-22 | 2014-01-01 | 黑龙江大学 | 一株猪肺炎支原体菌株 |
| CN104513804A (zh) * | 2015-01-27 | 2015-04-15 | 新疆天康畜牧生物技术股份有限公司 | 一种猪支原体肺炎疫苗株 |
-
2015
- 2015-05-15 CN CN201510249922.0A patent/CN104940918B/zh active Active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103184171A (zh) * | 2011-12-29 | 2013-07-03 | 北京大北农科技集团股份有限公司 | 猪肺炎支原体dj-166株及其应用 |
| CN103182076A (zh) * | 2011-12-29 | 2013-07-03 | 北京大北农科技集团股份有限公司 | 一种猪支原体肺炎灭活疫苗及其制备方法 |
| CN103484414A (zh) * | 2013-10-22 | 2014-01-01 | 黑龙江大学 | 一株猪肺炎支原体菌株 |
| CN104513804A (zh) * | 2015-01-27 | 2015-04-15 | 新疆天康畜牧生物技术股份有限公司 | 一种猪支原体肺炎疫苗株 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN104940918B (zh) | 2018-03-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Hoskins et al. | Assessment of inactivated influenza-A vaccine after three outbreaks of influenza A at Christ's Hospital | |
| Dowling et al. | Experimental induction of pneumonic pasteurellosis in calves by intratracheal infection with Pasteurella multocida biotype A: 3 | |
| Sibila et al. | Effect of sow vaccination against Mycoplasma hyopneumoniae on sow and piglet colonization and seroconversion, and pig lung lesions at slaughter | |
| CN102258776B (zh) | 猪肺炎支原体、猪鼻支原体二联灭活疫苗及其制备方法 | |
| CN103263666A (zh) | 猪圆环病毒2型、猪支原体肺炎二联灭活疫苗及其制备方法 | |
| CN108392628A (zh) | 一种猪支原体肺炎灭活疫苗及其制备方法 | |
| Ferguson-Noel et al. | The efficacy of Mycoplasma gallisepticum K-strain live vaccine in broiler and layer chickens | |
| CN102302771B (zh) | 一种预防和治疗猪萎缩性鼻炎的多价灭活疫苗 | |
| CN107513506A (zh) | 猪肺炎支原体、疫苗组合物及其应用 | |
| Hall | History of Brucella as a human pathogen | |
| CN100419073C (zh) | 猪喘气病活疫苗及其生产方法 | |
| CN103602637B (zh) | 猪支原体肺炎疫苗株 | |
| CN110124027B (zh) | 一种牛轮状病毒、牛冠状病毒二联灭活疫苗及其制备方法 | |
| CN103146654B (zh) | 一株人工弱化的鸡传染性支气管炎病毒及其应用 | |
| CN109745555B (zh) | 一种猪肺炎支原体与副猪嗜血杆菌二联灭活疫苗及其应用 | |
| CN104774796B (zh) | 禽致病性大肠杆菌灭活疫苗及其制备方法 | |
| CN104940918A (zh) | 一种猪支原体肺炎灭活疫苗的生产方法 | |
| CN104056263B (zh) | 一种预防和治疗由萎缩性鼻炎继发的呼吸系统疾病的疫苗组合物及制备方法和应用 | |
| CN103623400B (zh) | 抗猪支原体肺炎、传染性胸膜肺炎疫苗组合物及制备方法 | |
| CN103585622B (zh) | 猪支原体肺炎疫苗株的应用 | |
| CN104250623B (zh) | 一株猪鼻支原体菌株、疫苗组合物及其制备方法和应用 | |
| Stalheim | Mycoplasmas of animals | |
| CN104645324A (zh) | 一种猪支原体肺炎疫苗株的应用 | |
| CN104338128A (zh) | 一种疫苗组合物及其制备方法和应用 | |
| CN104388340A (zh) | 一株血清5型副猪嗜血杆菌及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CP01 | Change in the name or title of a patent holder | ||
| CP01 | Change in the name or title of a patent holder |
Address after: 100081 No. 8 South Street, Zhongguancun, Haidian District, Beijing Co-patentee after: Jilin and Yuan bioengineering Limited by Share Ltd Patentee after: Beijing Zhonghai Biotech Co., Ltd. Address before: 100081 No. 8 South Street, Zhongguancun, Haidian District, Beijing Co-patentee before: JILIN HEYUAN BIOENGINEERING LIMITED COMPANY Patentee before: Beijing Zhonghai Biotech Co., Ltd. |
|
| TR01 | Transfer of patent right | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20190419 Address after: 100081 No. 8 South Street, Zhongguancun, Haidian District, Beijing Co-patentee after: Jilin and Yuan bioengineering Limited by Share Ltd Patentee after: Beijing Zhonghai Biotech Co., Ltd. Co-patentee after: Zhongchong Xinnuo Biopharmaceutical Taizhou Co., Ltd. Address before: 100081 No. 8 South Street, Zhongguancun, Haidian District, Beijing Co-patentee before: Jilin and Yuan bioengineering Limited by Share Ltd Patentee before: Beijing Zhonghai Biotech Co., Ltd. |
|
| CP01 | Change in the name or title of a patent holder | ||
| CP01 | Change in the name or title of a patent holder |
Address after: 100081 No. 8 South Main Street, Haidian District, Beijing, Zhongguancun Patentee after: BEIJING ZHONGHAI BIOTECH Co.,Ltd. Patentee after: Jilin and Yuan bioengineering Limited by Share Ltd. Patentee after: Zhonghai biopharmaceutical (Taizhou) Co.,Ltd. Address before: 100081 No. 8 South Main Street, Haidian District, Beijing, Zhongguancun Patentee before: BEIJING ZHONGHAI BIOTECH Co.,Ltd. Patentee before: Jilin and Yuan bioengineering Limited by Share Ltd. Patentee before: Zhongchong Xinnuo Biopharmaceutical Taizhou Co.,Ltd. |