CN108048364A - 一种金黄色葡萄球菌及含该菌的海洋哺乳动物疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种金黄色葡萄球菌及含该菌的海洋哺乳动物疫苗，金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus DCS5菌株保藏号为CGMCC No.15124。本发明还公开了一种海洋哺乳动物疫苗，所述疫苗包括抗原液，所述抗原液为金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus DCS5菌株的灭活浓缩菌液，菌液浓度≥4×10⁹个细菌/mL。本发明提供的疫苗具有高效、安全和稳定等优点，为全面有效预防金黄色葡萄球菌感染性海洋哺乳动物疾病提供了有力保证。

Description

一种金黄色葡萄球菌及含该菌的海洋哺乳动物疫苗

技术领域

本发明属于疫苗技术领域，具体地，本发明涉及一种金黄色葡萄球菌以及将其灭活后制备得到的海洋哺乳动物疫苗。

背景技术

随着人民生活水平的提高，物质需求向精神需求的转变，促进了国内水族馆行业飞速发展，对海洋哺乳动物资源的需求随之越来越多，尤其是具有展演展示天赋的鲸类动物，如瓶鼻海豚、白鲸等，在国内各水族馆饲养的数量不断攀升。据不完全统计全国海洋哺乳动物拥有总量达2560头，每年可创造巨大的经济产值。

然而，虽然国内水生哺乳动物医疗保健水平在不断的提升，但是每年仍有大量的鲸类动物出现死亡。在死亡的众多原因中，肺炎占死亡比例的80％以上。其中美国海军对海洋哺乳动物海豚进行研究表明50％(21/42)患有肺炎。其中细菌感染性肺炎占到总感染的42.9％，而金黄色葡萄球菌的感染又占到细菌性疾病的19％，表明金黄色葡萄球菌是细菌性肺炎的重要原因。目前，海洋哺乳动物金黄色葡萄球菌感染常用的治疗方法为抗生素治疗，而金黄色葡萄球菌的耐药问题在临床中愈来愈突出。因此，研制出一种能够提升海洋哺乳动物免疫力的高效金黄色葡萄球菌疫苗显得势在必行。通过金黄色葡萄球菌疫苗的免疫接种，可使馆养鲸类动物获得外源性免疫刺激，进而提升对疾病的抵抗能力。

发明内容

本发明的目的是提供一种金黄色葡萄球菌以及将其灭活得到的海洋哺乳动物疫苗。本发明提供的疫苗具有高效、安全和稳定等优点，本发明为安全、高效、全面有效预防金黄色葡萄球菌感染性海洋哺乳动物疾病提供了有力保证。

为达到上述目的，本发明采用了如下的技术方案：

一种金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus DCS5菌株，菌种保藏号为CGMCCNo.15124。

本发明中，所述DCS5菌株为从海洋哺乳动物中分离得到，所述海洋哺乳动物为海豚、海鲸、海狮或海象。

本发明还提供了一种海洋哺乳动物疫苗，所述疫苗包括抗原液，所述抗原液为权利要求1所述金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus DCS5菌株的灭活浓缩菌液，菌液浓度≥4×10⁹个细菌/mL。

进一步地，所述疫苗还包括疫苗佐剂，抗原液：疫苗佐剂的质量比为70：30～60：40。

本发明中，所述疫苗的剂型为皮下注射剂或肌肉注射剂。本领域技术人员还可以根据需要制备其他剂型。

优选地，所述灭活浓缩菌液的制备方法包括如下步骤：

1)从海洋哺乳动物的气孔喷出物中分离出金黄色葡萄球菌，通过培养、纯化、分子生物学和生化鉴定符合金黄色葡萄球菌的特征，命名为金黄色葡萄球菌 Staphylococcusaureus DCS5菌株；

2)对分离纯化得到的金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus DCS5菌株进行扩大培养、灭活、浓缩得到灭活浓缩菌液。

本发明进一步提供了一种海洋哺乳动物疫苗的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：

将抗原液和疫苗佐剂按照比例进行搅拌乳化，即得到海洋哺乳动物疫苗。

优选地，所述将抗原液和疫苗佐剂按照比例进行搅拌乳化具体为：

将疫苗佐剂倒入容器中，以1000rpm/min的转速进行搅拌10s～60s，再将抗原液缓慢加入疫苗佐剂中后将转速增加到5000～10000rpm/min，保持3～20min。

本发明还提供了一种金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus DCS5菌株在制备海洋哺乳动物疫苗中的应用。

本发明保护菌株DCS5菌株在制备海洋哺乳动物动物疫苗中的应用。所述DCS5 菌株可为海洋哺乳动物海豚中分离的金黄色葡萄球菌菌株。

本发明还保护一种海洋哺乳动物疫苗，其活性成分为灭活后的菌株DCS5株，按照一定比例加入佐剂乳化后得到。具体来说，所述灭活后的菌株DCS5株的浓度可为 4×10⁹CFU/mL。

本发明“灭活后的菌株”可通过将所述菌株进行甲醛灭活得到。所述“灭活后的菌株”具体通过如下方法得到：取菌液加入37％-40％甲醛溶液并使甲醛浓度为0.4％ (体积比)，37℃、150rpm/min振荡孵育36-48h，离心(离心参数具体可为：4℃、 6500rpm/min离心15min收集菌体)收集菌体，用灭菌后的PBS缓冲液洗涤菌体，然后用灭菌后的PBS缓冲液悬浮菌体，得到“灭活后的菌株”(至少含细菌4×10⁹CFU/mL)。

本发明所述佐剂为Seppic公司Montanide^TM ISA 763AVG佐剂或铝胶佐剂。本领域技术人员还可以根据需要使用其他佐剂。

本发明提供的菌株DCS5株全称为金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)DCS5菌株。该DCS5菌株已于2017年12月25日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所)，保藏号为CGMCC No.15124。

附图说明

图1为实施例1中细菌活菌数与时间对应关系的生长曲线；

图2为实施例1中细菌OD₅₄₀值与时间对应关系的生长曲线；

图3为实施例1中金黄色葡萄球菌对小鼠的致病性试验攻毒后小鼠的存活率的生长曲线。

具体实施方式

下面以附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂公司购买得到的。

Montanide^TM ISA 763A VG佐剂：是一种油基佐剂，研制用于生产油包水乳剂。它含可注射降解的油(不含矿物油)以及从甘露醇中精炼和纯化植物来源油酸的乳化剂和一种从来源于植物的甘露醇和纯油酸中提取并特别精炼的乳化剂，购于Seppic 公司。

Balb/C小鼠(5周龄)：购自军事医学科学院实验动物中心。

新西兰兔(1.5Kg)：购于北京芳元缘养殖场。

实施例1、菌株的获得和保藏

一、采集12只海洋哺乳动物的气孔喷出物于无菌塑料小瓶中，观察发现部分动物气孔喷出物中存在白色或灰色黏液。从海洋哺乳动物气孔喷出物中分离纯化金黄色葡萄球菌菌株。金黄色葡萄球菌的菌落形态特征(37℃，培养24-72h)：(1)脑心浸液琼脂培养基：形成光滑湿润隆起的边缘整齐不透明有黄色色素的圆形菌落，直径约1-2mm。(2)血琼脂平板(新鲜脱纤维绵羊血)：在血平板上形成较大的光滑凸起湿润菌落，菌落周围形成完全透明β溶血环。(3)Baird-parker培养基：菌落直径为 2mm-3mm，颜色呈黑色，边缘为淡色，周围有一周浑浊带，外围有一层透明圈，用接种针接触菌落有似奶油至树胶样的硬度。

金黄色葡萄球菌的鉴定结果表明，(1)待检菌株能与兔血浆37℃培养后发生血浆凝固的现象，血浆凝固酶阳性。(2)待检菌液接种于甘露醇发酵管中结果甘露醇由紫色变为黄色，表明待检菌株可分解利用甘露醇。(3)将待检菌株的BHI培养物用接种环划线刺种于甲苯胺兰-DNA平板，在刺种线周围出现淡粉色，表明耐热核酸酶试验阳性。(4)高盐生长试验结果为阳性，(5)氧化酶试验结果为阳性，(6)明胶液化试验结果为阴性(7)硝酸盐产气试验结果为阴性(8)取菌落，进行革兰氏染色，可见革兰氏阳性呈葡萄串状排列的球菌。将菌株命名为金黄色葡萄球菌 Staphylococcus aureus DCS5株。

二、菌株的扩大培养

1、将金黄色葡萄球菌DCS5株(原代菌株)按照一定比例接种至BHI液体培养基，于37℃，150rpm/min振荡培养5～18小时，然后在培养后的菌液中加入灭菌后的甘油使其终浓度为20％～30％之间，分装于冻存管(定义为P1代)，-20℃以下保存。

2、取步骤1得到的冻存菌液，室温解冻，按照一定比例接种至BHI液体培养基，于37℃，150rpm/min振荡培养5～18小时，然后在培养后的菌液中加入灭菌后的甘油使其终浓度为20％～30％之间，分装于冻存管(定义为P2代)，-20℃以下保存。

3、取步骤2得到的冻存管，室温解冻，按照一定比例接种至BHI液体培养基，于 37℃，150rpm/min振荡培养5～18小时，然后在培养后的菌液中加入灭菌后的甘油使其终浓度为20％～30％之间，分装于冻存管(定义为P3代)，-20℃以下保存。

三、基因序列测定及结果分析

将实施例1的步骤二中的3得到的冻存菌液室温解冻，按照一定比例接种于BHI 液体培养基，37℃培养5～18小时后，通过煮沸法提取细菌的基因组DNA。用16S rRNA通用引物和Nuc基因引物进行序列扩增。通用引物采用细菌的16S rRNA通用引物，上游引物F27(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)，下游引物R1492 (5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’)。鉴别引物根据已发表的葡萄球菌耐热核酸酶基因Nuc基因序列设计，上游引物Sta-Nuc-F 5’-CACAAACAGATAATGGCG-3’，下游引物Sta-Nuc-R 5’-AGCCTTGACGAACTAAAG-3’。

按如下的顺序加样进行PCR反应Promega GoTaq(Mix)12.5μL；ddH₂O 9.5μL；上游引物1μL；下游引物1μL；TemPlate 1μL。混匀后，稍微离心迅速置于冰上，进行下列循环反应：94℃反应3min使模板变性。循环为30个，在每一循环中，94℃变性30s，55℃复性30s，72℃延伸1min，循环结束后，72℃终延伸10min。产物交由ThermoFisher Scientific公司测序，测序结果通过NCBI Blast和DNAStar软件进行序列的比对和同源性分析。

对分离株进行PCR扩增，用16S rRNA通用引物的扩增出1500bp左右的片段，用Nuc基因引物扩增出400bp左右的片段，与预期一致。将PCR产物回收后测序，并将测序结果与NCBI上的金黄色葡萄球菌的序列用DNAStar软件进行比对分析，结果表明DCS5株16S rRNA保守基因和耐热核酸酶Nuc基因和发表的金黄色葡萄球菌相应序列间的同源性超过95％，表明该菌株为金黄色葡萄球菌。

四、细菌的生长曲线的测定

将实施例1的步骤二中的3得到的冻存菌液室温解冻，按照一定比例接种于BHI 液体培养基，37℃培养5～18小时，此菌液即为种子培养液。将培养后的种子液按照 5％的比例接种100mL BHI液体培养基中，取样测定OD₅₄₀值。将接种后菌液置于恒温培养振荡器上37℃，170rpm/min培养，并于培养后每小时取样测定菌液的OD₅₄₀值，直至接种后9小时。记录每次测得的数据。分别以测定的时间为横坐标轴，OD₅₄₀值为纵坐标绘制金黄色葡萄球菌的生长曲线，如图2所示。并以细菌数对数为纵坐标，时间为横坐标，作图绘制生长曲线，如图1所示。取对数生长期中的一段按照代时公式计算世代时间。

如图1所示，用活菌计数法测定金黄色葡萄球菌DCS5株的生长曲线，并计算细菌的世代时间为56min。由于种子液活化后接种到培养基中，在很短的时间内即可进入对数生长期，对数生长期维持时间为4～5h。如图2所示，在培养5小时后，活菌数即可达到2×10⁹CFU/mL以上，OD₅₄₀值可达到1.7～1.8之间。通过生长曲线能够更好的判断菌株的生长情况，为选择活力高和活菌数高的细菌生长时期提供依据。

五、菌株的致病性鉴定

将实施例1的步骤二中的3得到的冻存菌液室温解冻，按照一定比例接种于BHI 液体培养基，37℃培养5～18小时后得到P4代菌液，分别用5×10⁸CFU，5×10⁷CFU的菌液注射4-5周龄BALB/c小鼠(每只通过腹腔注射0.5mL)，观察DCS5株对小鼠的致病情况，分组和死亡率结果如表1所示，小鼠的生存曲线如图3所示。

表1 金黄色葡萄球菌对小鼠的致病性

*i.p.表示腹腔注射

从表1和图3可以看出，观察表征发现菌株DCS5株可使BALB/c小鼠发病，有些甚至在1周内死亡；分别取发病小鼠的肝脏和肺脏等器官进行病原菌重分离，将重分离得到的菌株进行细菌鉴定和16S rRNA测序，均鉴定为金黄色葡萄球菌感染。

六、菌株的保藏

菌株DCS5株全称为金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)DCS5株。P3代菌株DCS5株已于2017年12月25日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(简称 CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所)，保藏号为15124。

实施例2、疫苗的制备

将实施例1的步骤二的3得到的冻存菌液室温解冻，将P3代菌株进行如下步骤：

一、抗原的制备

1、取P3代DCS5株冻存菌液，室温解冻，按照1％～10％的体积比接种BHI液体培养基，于37℃，150rpm/min振荡培养5～18小时。取上述活化的菌液按照1％～10％的比例接种BHI培养基，于37℃，150rpm/min振荡培养5～18小时，进行革兰氏染色对菌液进行鉴定，并用活菌计数的方法计算活菌数。

2、将上述培养后的菌液加入37-40％甲醛溶液并使甲醛浓度为0.2％～0.5％(体积比，37℃、150rpm/min振荡孵育36h-48h)，然后4℃、6500rpm/min离心15min收集菌体，用灭菌后的PBS缓冲液洗涤菌体，然后用灭菌后的PBS缓冲液悬浮菌体(使得悬浮后菌液浓度高于4×10⁹CFU/mL)。灭活后抗原无菌检验和灭活检验结果均合格。

二、疫苗的制备

将步骤一的2得到的抗原液和Montanide^TM ISA 763A VG佐剂按照70：30的质量比例进行乳化得到疫苗Ⅰ，具体步骤如下：将佐剂按照比例倒入烧杯中，在乳化机上以1000rpm/min的转速进行搅拌10s～60s，并将抗原液缓慢加入佐剂中后将转速增加到 5000～10000rpm/min，保持3～20min。

将步骤一的2得到的抗原液，绿脓杆菌抗原液和海豚链球菌的抗原液按照1：1： 1的质量比例进行混合后即为三联苗的抗原液。将抗原液和Montanide^TM ISA 763 A VG佐剂按照60：40的质量比例进行乳化得到疫苗Ⅱ，具体步骤如下：将佐剂按照比例倒入烧杯中，在乳化机上以1000rpm/min的转速进行搅拌10s～60s，并将抗原液缓慢加入佐剂中后将转速增加到5000～10000rpm/min，保持3～20min。

实施例3、疫苗的检验

一、剂型

取一支1ml一次性移液管，吸取少量实施例2制备的各个疫苗滴于装在90mm一次性平皿的冷水表面，除第一滴外，均应不扩散。

二、疫苗的稳定性

取实施例2制备的各个疫苗10mL加入到10mL离心管，3500r/min离心15分钟，管底析出的水相应不多于0.5mL。取实施例2制备的各个疫苗于2-8℃放置24个月、37℃放置1个月或25℃放置3个月无变色，分层和破乳等现象。

三、疫苗的无菌检验

1、将实施例2制备的各个疫苗分别接种至50mL硫乙醇酸盐培养基(流式)，35～37℃培养3日。

2、吸取步骤1得到的培养物，接种TG小管2支，每支0.2mL，1支置35～37℃培养， 1支置23～25℃培养，另取0.2mL，接种1支TSB小管，置23～25℃培养，均培养7日，应无菌生长。

实施例4、疫苗的安全性试验

一、溶血性试验

1、取体重为350g左右的豚鼠，采集新鲜血液1mL，分离血细胞。

2、用PBS缓冲液洗涤血细胞，然后用PBS缓冲液制备细胞悬液(血细胞与 PBS缓冲液的体积比为2:98)。

3、用PBS缓冲液分别制备实施例2制备的各个疫苗的2倍稀释液、4倍稀释液和8倍稀释液。

4、将1体积份步骤2得到的细胞悬液和1体积份步骤3得到的疫苗稀释液混合，室温静置8小时，然后进行判定(完全溶血：溶液澄明、红色、管底无细胞残留；部分溶血：溶液澄明、红色或棕色、管底有部分红细胞残留；无溶血：红细胞完全沉淀，上层液体颜色澄明)。结果显示：均未发生血球破裂，无溶血现象。

二、急性毒性试验

体重为12～18g Balb/C小鼠：单次腹腔注射实施例2制备的各个疫苗，每只小鼠0.5mL，连续2周观察小鼠的活动状态、体重变化和存活率，14天后处死进行解剖检查；小鼠全部存活，没有出现竖毛、精神萎靡、行动迟缓等不良症状，体重呈现增加，未见脏器有病理改变。

三、超剂量安全性试验

取新西兰兔：单次肌肉注射实施例2制备的各个疫苗，每只兔子5ml，连续观察兔子的活动状态，体重变化和存活率。14天后处死进行解剖检查；兔子全部存活，无精神萎靡，拉稀粪等不良症状，体重呈现增加，未见脏器有病理性变化。

实施例5、疫苗的免疫原性

一、兔子实验

采用新西兰兔，分成3组，每组5只，分组免疫如下(肌肉注射)：

第一组：实验第1天和实验第15天各免疫一次疫苗Ⅰ，每次免疫1.5毫升；

第二组：实验第1天和实验第15天各免疫一次疫苗Ⅱ，每次免疫1毫升；

第三组(阴性对照)：实验第1天和实验第15天各免疫一次PBS缓冲液，每次免疫1毫升。

实验第29天，耳静脉取血并分离血清。通过抗原凝集方法检测血清抗体的效价。

通过抗原凝集检测血清抗体效价取血清0.1mL加入1.9mL的PBS中，即为血清稀释成20倍为第1管，再倍比稀释至第9管，第10管为无血清对照管，于各管中加入等量的0.5mL菌液(为100℃隔水煮沸30min的DCS5株菌悬液，菌液浓度相当于9亿/mL) 摇匀后置于37℃，24h观察结果，观察方法同肥达氏反应，结果如表2所示。第一组实验动物得到的血清的金黄色葡萄球菌效价为1：832，第二组实验动物得到的血清的金黄色葡萄球菌效价为1：704，第三组实验动物得到的血清的金黄色葡萄球菌效价为1：44。

表2 制备的疫苗对新西兰兔的免疫原性抗体统计表

三、海洋哺乳动物试验

馆养海豚，分成3组，每组2只，分组免疫如下(肌肉注射)：

第一组：实验第1天和实验第28天各免疫一次疫苗Ⅰ，每次免疫1毫升；

第二组：实验第1天和实验第28天各免疫一次疫苗Ⅱ，每次免疫1毫升；

第三组(阴性对照)：实验第1天和实验第28天各免疫一次PBS缓冲液，每次免疫1毫升。

实验第42天，尾静脉取血并分离血清。用抗原凝集方法检测血清抗体的效价。

通过抗原凝集检测血清抗体效价取血清0.1mL加入1.9mL的PBS中，即为血清稀释成20倍为第1管，再倍比稀释至第9管，第10管为无血清对照管，于各管中加入等量的0.5mL菌液(为100℃隔水煮沸30min的DCS5株菌悬液，菌液浓度相当于9亿/mL) 摇匀后置于37℃，24h观察结果，观察方法同肥达氏反应，结果如表3所示。第一组实验动物得到的血清的效价为1：960，第二组实验动物得到的血清的效价为1：960，第三组实验动物得到的血清的效价为1：50。

表3 制备的疫苗对海洋哺乳动物的免疫原性(血清学方法)

最后所应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制。尽管参照实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应该理解，对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，都不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (10)

1.一种金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus DCS5菌株，菌种保藏号为CGMCCNo.15124。

2.根据权利要求1所述的金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus DCS5菌株，其特征在于，所述DCS5菌株为从海洋哺乳动物中分离得到。

3.根据权利要求2所述的金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus DCS5菌株，其特征在于，所述海洋哺乳动物为海豚、海鲸、海狮或海象。

4.一种海洋哺乳动物疫苗，其特征在于，所述疫苗包括抗原液，所述抗原液为权利要求1所述金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus DCS5菌株的灭活浓缩菌液，菌液浓度≥4×10⁹个细菌/mL。

5.根据权利要求4所述的海洋哺乳动物疫苗，其特征在于，所述疫苗还包括疫苗佐剂，抗原液：疫苗佐剂的质量比为70：30～60：40。

6.根据权利要求4所述的海洋哺乳动物疫苗，其特征在于，所述疫苗的剂型为皮下注射剂或肌肉注射剂。

7.根据权利要求4所述的海洋哺乳动物疫苗，其特征在于，所述灭活浓缩菌液的制备方法包括如下步骤：

1)从海洋哺乳动物的气孔喷出物中分离出金黄色葡萄球菌，通过培养、纯化、分子生物学和生化鉴定符合金黄色葡萄球菌的特征，命名为金黄色葡萄球菌Staphylococcusaureus DCS5菌株；

2)对分离纯化得到的金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus DCS5菌株进行扩大培养、灭活、浓缩得到灭活浓缩菌液。

8.权利要求5所述海洋哺乳动物疫苗的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：

将抗原液和疫苗佐剂按照比例进行搅拌乳化，即得到海洋哺乳动物疫苗。

9.根据权利要求8所述海洋哺乳动物疫苗的制备方法，其特征在于，所述将抗原液和疫苗佐剂按照比例进行搅拌乳化具体为：

将疫苗佐剂倒入容器中，以1000rpm/min的转速进行搅拌10s～60s，再将抗原液缓慢加入疫苗佐剂中后将转速增加到5000～10000rpm/min，保持3～20min。

10.权利要求1所述金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus DCS5菌株在制备海洋哺乳动物疫苗中的应用。