CN108663449A - 一种煤工尘肺患者血清中蛋白参数分析方法 - Google Patents

一种煤工尘肺患者血清中蛋白参数分析方法 Download PDF

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CN108663449A CN201810461249.0A CN201810461249A CN108663449A CN 108663449 A CN108663449 A CN 108663449A CN 201810461249 A CN201810461249 A CN 201810461249A CN 108663449 A CN108663449 A CN 108663449A
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柴红修
韩颖
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Abstract

本发明属于蛋白参数分析领域并公开了一种煤工尘肺患者血清中蛋白参数分析方法，包括血清蛋白细胞的采集、血清细胞内蛋白的提取、蛋白参数液相质谱法分析；本发明方法先通过采集血清蛋白细胞，然后提取出血清细胞内蛋白，最后通过液相色谱法测试血清细胞内蛋白的参数，将血清细胞内蛋白的参数准确、定量、定性的测试出来，本发明方法检测，测试的结果准确，具有十分可靠的指导意义，有效对煤矿工人进行尘肺病预防诊断。

Description

一种煤工尘肺患者血清中蛋白参数分析方法
技术领域
本发明涉及蛋白参数分析技术领域，具体涉及一种煤工尘肺患者血清中蛋白参数分析方法。
背景技术
尘肺病的规范名称是肺尘埃沉着病，该病是由于在职业活动中长期吸入生产性粉尘、灰尘，并在肺内潴留而引起的以肺组织弥漫性纤维化为主的全身性疾病。而煤矿工人由于其工作特殊原因，长时间接触煤矿粉尘，极易引发尘肺病。而尘肺病无特异的临床表现，其临床表现多与合并症有关,如①咳嗽:早期尘肺患者咳嗽多不明显，但随着病程的进展，患者多合并慢性支气管炎，晚期患者多合并肺部感染，均可使咳嗽明显加重。咳嗽与季节、气候等有关。②咳痰：咳痰主要是呼吸系统对粉尘的不断清除所引起的。一般咳痰量不多，多为灰色稀薄痰。如合并肺内感染及慢性支气管炎，痰量则明显增多，痰呈黄色黏稠状或块状，常不易咳出。③胸痛：尘肺患者常常感觉胸痛，胸痛和尘肺临床表现多无相关或平行关系。部位不一，且常有变化，多为局限性。一般为隐痛，也可胀痛、针刺样痛等。④呼吸困难：随肺组织纤维化程度的加重，有效呼吸面积减少，通气/血流比例失调，呼吸困难也逐渐加重。合并症的发生可明显加重呼吸困难的程度和发展速度。⑤咯血：较为少见，可由于呼吸道长期慢性炎症引起黏膜血管损伤，痰中带少量血丝；也可能由于大块纤维化病灶的溶解破裂损及血管而使咯血增多。⑥除上述呼吸系统症状外，可有程度不同的全身症状，常见有消化功能减退。
尘肺病患者如不及时进行体检发现，极易引起身体的很多不良症状，严重威胁煤工的身体健康。因此国家职业健康部门要求煤工每年都需要进行职业健康体检。而目前尘肺病的检测方法都是采用CT照射，通过影像资料进行判断有无尘肺病；而此种方法需要进行X射线照射且需要医生肉眼观察辨别，对于尘肺病初期较难观察分辨出来，只有当尘肺病症状较明显时才能分辨出来，而此时往往已经错过了最佳的治疗时期，而通过当患有尘肺病时，尘肺对肺部的侵染会侵蚀到患者的血液中，血液中很多成分会相应的进行改变以对尘肺作为异物进行排斥。因此，尘肺病患者的血液中成分较正常人会有特殊的变化。鉴于此，如何提供一种快捷、方便且能在尘肺病患病初期即能进行分辨出来的煤工尘肺患者血清中蛋白参数分析方法是本领域技术人员需要解决的技术问题。
发明内容
本发明针对现有技术中进行X射线照射且需要医生肉眼观察辨别，对于尘肺病初期较难观察分辨出来，只有当尘肺病症状较明显时才能分辨出来，而此时往往已经错过了最佳的治疗时期的难题，而提供一种煤工尘肺患者血清中蛋白参数分析方法。
本发明为解决上述技术问题，采用以下技术方案来实现：
设计一种煤工尘肺患者血清中蛋白参数分析方法，包括如下步骤：
步骤一、血清蛋白细胞的采集：首先，采集确诊煤工尘肺患者的
静脉血清样本8-10ml；然后将采集的血清样本在2000-6000rpm、3-5℃条件下进行离心2-5min，收集下层细胞；接着用去离子水清洗收集到的下层细胞，在2000-6000rpm、3-5℃条件下再次离心2-5min；最后，将收集到的下层细胞在-60- -80℃深冷环境下冷冻干燥2-8h获得经冷冻后的血清蛋白细胞；
步骤二、血清细胞内蛋白的提取：①首先，将经过步骤一处理后的血清蛋白细胞样本置于离心管中，加入0.4-1.2mL的细胞裂解液，混匀；然后，加入4-20μL质量比为2-6:1的脱氧核糖核酸核酸内切酶I和内切核糖核酸酶混合溶液，混匀，3-5℃温度下静置反应10-30min；接着，加入5-15μL浓度为70-130mmol/L的苯甲磺酰氟异丙醇溶液，3-5℃温度下静置1-3h；最后，在8000-10000rpm下离心40-60min，取上清液，得到蛋白溶液；
②测定蛋白浓度：采用考马斯蓝染色法得到所述的蛋白溶液蛋白的浓度；
③沉淀蛋白：在步骤二②中的蛋白溶液中加入蛋白溶液体积4-6倍温度为的-10℃- -50℃的二甲基酮水溶液，沉淀10-24h；再离心，弃上清液，沉淀液温度用温度为-10℃- -50℃体积浓度为70%-85%的二甲基酮水溶液洗涤；最后冷冻干燥，-80℃贮存得到干燥蛋白；
④蛋白还原及酶解：首先，向步骤二③所得的干燥蛋白中添加20-60μL浓度为40-60mmol/L的甲基三乙基碳酸氢铵水溶液溶解蛋白；然后，加入1-4μL的2-羧乙基磷酸在50-60℃反应1h，进行还原化处理；接着，加入2-4μL的甲基硫代磺酸甲酯反应10-15min；最后，继续加入浓度为0.2-0.3μg/μL的蛋白酶水溶液20-30μL，36-38℃反应10-20小时，进行蛋白酶解；
⑤肽标记：在蛋白酶解液中加入用60-80μL乙醇溶解后的iTRAQ标记试剂，室温反应1h，得到酶解反应混合物；
步骤三、蛋白参数分析：将步骤二⑤中得到的酶解反应混合物加入到液相质谱分析仪的电喷雾单元中，电喷雾单元将酶解反应混合物雾化通过喷嘴喷至检测器中；液相质谱分析仪使用一道激光光束来照射经雾化的酶解反应混合物，使得经雾化的酶解反应混合物中至少一个待测物接收由激光光束所传递的能量而被解吸后沿着一个与该电荷移转路径相交的飞行路径飞行，经雾化的酶解反应混合物会因电荷移转而被电离，并在该电位差引导下，朝向质量分析器移动并被质量分析器接收，以进行质谱定性和定量分析，得到血清蛋白参数分析结果。
优选的，所述的血清蛋白细胞的收集需空腹条件下采集。
优选的，所述的液相质谱分析仪的检测条件为：离子化方式：正离子电喷雾模式；电压：1200-2000V；离子源温度：120-180℃；扫描范围：80-3000m/z。
优选的，所述的考马斯蓝染色法包括：①将100mg考马斯亮蓝G-250溶于50ml浓度为95%的乙醇，再加入100ml浓度为85%的磷酸；然后，用蒸馏水补充至1000ml，在3-5℃条件下放置时间不低于6个月；②将标准牛血清蛋白溶液由低浓度到高浓度依次加入考马斯亮蓝G-250溶液得到标准曲线蛋白质样本得到标准曲线蛋白质样本；③将待测样本溶于缓冲溶液中，然后按1：5比例用蒸馏水稀释，如出现沉淀，应过滤除去；④每个标准曲线蛋白质样本中加5ml稀释的染料结合溶液，反应5-30min，染液与蛋白质结合后，将由红色变为蓝色，在595nm波长下测定其吸光度；⑤根据标准曲线计算待测样本的浓度。
优选的，所述的细胞裂解液包括：8mol/L的尿素，质量浓度为4%的3-[(3－胆酰胺丙基)－二乙胺]-丙磺酸，40mmol/L的三羟甲基氨基甲烷，余量为去离子。
优选的，所述的iTRAQ标记试剂进行肽标记时，血清的含量不小于500µL。
本发明提出的一种煤工尘肺患者血清中蛋白参数分析方法，有益效果在于：
（1）本发明方法先通过采集血清蛋白细胞，然后提取出血清细胞内蛋白，最后通过液相色谱法测试血清细胞内蛋白的参数，将血清细胞内蛋白的参数准确、定量、定性的测试出来，本发明方法检测，测试的结果准确，具有十分可靠的指导意义，有效对煤矿工人进行尘肺病预防诊断；
（2）本发明方法的血清蛋白细胞的采集首先采集确诊煤工尘肺患者的静脉血清样本，然后将采集的血清样本进行离心收集下层细胞，并将下层细胞在深冷环境下冷冻干燥获得经冷冻后的血清蛋白细胞，经冷冻后的血清蛋白细胞与其他成分剥离开，便于血清细胞内蛋白的提取；
（3）本发明方法通过测定蛋白浓度采用考马斯蓝染色法进行，具有方法简单、测试结果准确，成本低廉、测试时间短的有益效果；同时，测试的蛋
白浓度为后续蛋白还原及酶解提供了参考依据；
（4）本发明方法中的蛋白还原及酶解首先采用甲基三乙基碳酸氢铵水溶液溶解蛋白；然后加入2-羧乙基磷酸进行还原化处理；接着，加甲基硫代磺酸甲酯反应；最后，加入蛋白酶水溶液进行蛋白酶解，具有法简单、测试结果准确，成本低廉、测试时间短的有益效果，同时经还原及酶解后的蛋白有利于后续的液相质谱分析。
附图说明
下面结合附图中的实施例对本发明作进一步的详细说明，但并不构成对本发明的任何限制。
图1是本发明方法的流程示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
实施例一
参阅附图1所示，本发明的一种煤工尘肺患者血清中蛋白参数分析方法，包括如下步骤：
步骤一、血清蛋白细胞的采集：首先，采集确诊煤工尘肺患者的静脉血清样本8ml；然后将采集的血清样本在2000rpm、3℃条件下进行离心2min，收集下层细胞；接着用去离子水清洗收集到的下层细胞，在2000rpm、3℃条件下再次离心2min；最后，将收集到的下层细胞在-60℃深冷环境下冷冻干燥2h获得经冷冻后的血清蛋白细胞；
步骤二、血清细胞内蛋白的提取：①首先，将经过步骤一处理后的血清蛋白细胞样本置于离心管中，加入0.4mL的细胞裂解液，混匀；然后，加入4μL质量比为2:1的脱氧核糖核酸核酸内切酶I和内切核糖核酸酶混合溶液，混匀，3℃温度下静置反应10min；接着，加入5μL浓度为70mmol/L的苯甲磺酰氟异丙醇溶液，℃温度下静置1h；最后，在8000rpm下离心40min，取上清液，得到蛋白溶液；
②测定蛋白浓度：采用考马斯蓝染色法得到所述的蛋白溶液蛋白的浓度；
③沉淀蛋白：在步骤二②中的蛋白溶液中加入蛋白溶液体积4倍温度为的-10℃℃的二甲基酮水溶液，沉淀10h；再离心，弃上清液，沉淀液温度用温度为-10℃℃体积浓度为70%的二甲基酮水溶液洗涤；最后冷冻干燥，-80℃贮存得到干燥蛋白；
④蛋白还原及酶解：首先，向步骤二③所得的干燥蛋白中添加20μL浓度为40mmol/L的甲基三乙基碳酸氢铵水溶液溶解蛋白；然后，加入1μL的2-羧乙基磷酸在50℃反应1h，进行还原化处理；接着，加入2μL的甲基硫代磺酸甲酯反应10min；最后，继续加入浓度为0.2μg/μL的蛋白酶水溶液20μL，36℃反应10h，进行蛋白酶解；
⑤肽标记：在蛋白酶解液中加入用60μL乙醇溶解后的iTRAQ标
记试剂，室温反应1h，得到酶解反应混合物；
步骤三、蛋白参数分析：将步骤二⑤中得到的酶解反应混合物加入到液相质谱分析仪的电喷雾单元中，电喷雾单元将酶解反应混合物雾化通过喷嘴喷至检测器中；液相质谱分析仪使用一道激光光束来照射经雾化的酶解反应混合物，使得经雾化的酶解反应混合物中至少一个待测物接收由激光光束所传递的能量而被解吸后沿着一个与该电荷移转路径相交的飞行路径飞行，经雾化的酶解反应混合物会因电荷移转而被电离，并在该电位差引导下，朝向质量分析器移动并被质量分析器接收，以进行质谱定性和定量分析，得到血清蛋白参数分析结果。
优选的，所述的血清蛋白细胞的收集需空腹条件下采集。
优选的，所述的液相质谱分析仪的检测条件为：离子化方式：正离子电喷雾模式；电压：1200V；离子源温度：120℃；扫描范围：80m/z。
优选的，所述的考马斯蓝染色法包括：①将100mg考马斯亮蓝G-250溶于50ml浓度为95%的乙醇，再加入100ml浓度为85%的磷酸；然后，用蒸馏水补充至1000ml，在3℃条件下放置时间不低于6个月；②将标准牛血清蛋白溶液由低浓度到高浓度依次加入考马斯亮蓝G-250溶液得到标准曲线蛋白质样本得到标准曲线蛋白质样本；③将待测样本溶于缓冲溶液中，然后按1：5比例用蒸馏水稀释，如出现沉淀，应过滤除去；④每个标准曲线蛋白质样本中加5ml稀释的染料结合溶液，反应5min，染液与蛋白质结合后，将由红色变为蓝色，在595nm波长下测定其吸光度；⑤根据标准曲线计算待测样本的浓度。
优选的，所述的细胞裂解液包括：8mol/L的尿素，质量浓度为4%的3-[(3－胆酰胺丙基)－二乙胺]-丙磺酸，40mmol/L的三羟甲基氨基甲烷，余量为去离子；
优选的，所述的iTRAQ标记试剂进行肽标记时，血清的含量不小于500µL。
实施例二
参阅附图1所示，本发明的一种煤工尘肺患者血清中蛋白参数分析方法，包括如下步骤：
步骤一、血清蛋白细胞的采集：首先，采集确诊煤工尘肺患者的静脉血清样本9ml；然后将采集的血清样本在4000rpm、4℃条件下进行离心4min，收集下层细胞；接着用去离子水清洗收集到的下层细胞，在4000rpm、4℃条件下再次离心4min；最后，将收集到的下层细胞在-70℃深冷环境下冷冻干燥5h获得经冷冻后的血清蛋白细胞；
步骤二、血清细胞内蛋白的提取：①首先，将经过步骤一处理后的血清蛋白细胞样本置于离心管中，加入0.8mL的细胞裂解液，混匀；然后，加入12μL质量比为4:1的脱氧核糖核酸核酸内切酶I和内切核糖核酸酶混合溶液，混匀，4℃温度下静置反应20min；接着，加入10μL浓度为100mmol/L的苯甲磺酰氟异丙醇溶液，4℃温度下静置2h；最后，在9000rpm下离心50min，取上清液，得到蛋白溶液；
②测定蛋白浓度：采用考马斯蓝染色法得到所述的蛋白溶液蛋白的浓度；
③沉淀蛋白：在步骤二②中的蛋白溶液中加入蛋白溶液体积5倍温度为的-30℃的二甲基酮水溶液，沉淀17h；再离心，弃上清液，沉淀液温度用温度为-30℃体积浓度为80%的二甲基酮水溶液洗涤；最后冷冻干燥，-80℃贮存得到干燥蛋白；
④蛋白还原及酶解：首先，向步骤二③所得的干燥蛋白中添加40μL浓度为50mmol/L的甲基三乙基碳酸氢铵水溶液溶解蛋白；然后，加入2μL的2-羧乙基磷酸在55℃反应1h，进行还原化处理；接着，加入3μL的甲基硫代磺酸甲酯反应10-15min；最后，继续加入浓度为0.25μg/μL的蛋白酶水溶液25μL，37℃反应15小时，进行蛋白酶解；
⑤肽标记：在蛋白酶解液中加入用70μL乙醇溶解后的iTRAQ标记试剂，室温反应1h，得到酶解反应混合物；
步骤三、蛋白参数分析：将步骤二⑤中得到的酶解反应混合物加入到液相质谱分析仪的电喷雾单元中，电喷雾单元将酶解反应混合物雾化通过喷嘴喷至检测器中；液相质谱分析仪使用一道激光光束来照射经雾化的酶解反应混合物，使得经雾化的酶解反应混合物中至少一个待测物接收由激光光束所传递的能量而被解吸后沿着一个与该电荷移转路径相交的飞行路径飞行，经雾化的酶解反应混合物会因电荷移转而被电离，并在该电位差引导下，朝向质量分析器移动并被质量分析器接收，以进行质谱定性和定量分析，得到血清蛋白参数分析结果。
优选的，所述的血清蛋白细胞的收集需空腹条件下采集。
优选的，所述的液相质谱分析仪的检测条件为：离子化方式：正离子电喷雾模式；电压：1600V；离子源温度：120-180℃；扫描范围：80-3000m/z。
优选的，所述的考马斯蓝染色法包括：①将100mg考马斯亮蓝G-250溶于50ml 95%乙醇，再加入100ml浓度为85%的磷酸；然后，用蒸馏水补充至1000ml，在4℃条件下放置时间不低于6个月；②将标准牛血清蛋白溶液由低浓度到高浓度依次加入考马斯亮蓝G-250溶液得到标准曲线蛋白质样本得到标准曲线蛋白质样本；③将待测样本溶于缓冲溶液中，然后按1：5比例用蒸馏水稀释，如出现沉淀，应过滤除去；④每个标准曲线蛋白质样本中加5ml稀释的染料结合溶液，反应18min，染液与蛋白质结合后，将由红色变为蓝色，在595nm波长下测定其吸光度；⑤根据标准曲线计算待测样本的浓度。
优选的，所述的细胞裂解液包括：8mol/L的尿素，质量浓度为4%的3-[(3－胆酰胺丙基)－二乙胺]-丙磺酸，40mmol/L的三羟甲基氨基甲烷，余量为去离子；
优选的，所述的iTRAQ标记试剂进行肽标记时，血清的含量不小于500µL。
实施例三
参阅附图1所示，本发明的一种煤工尘肺患者血清中蛋白参数分析方法，包括如下步骤：
步骤一、血清蛋白细胞的采集：首先，采集确诊煤工尘肺患者的静脉血清样本10ml；然后将采集的血清样本在6000rpm、5℃条件下进行离心2-5min，收集下层细胞；接着用去离子水清洗收集到的下层细胞，在6000rpm、5℃条件下再次离心5min；最后，将收集到的下层细胞在-80℃深冷环境下冷冻干燥8h获得经冷冻后的血清蛋白细胞；
步骤二、血清细胞内蛋白的提取：①首先，将经过步骤一处理后的血清蛋白细胞样本置于离心管中，加入1.2mL的细胞裂解液，混匀；然后，加入20μL质量比为6:1的脱氧核糖核酸核酸内切酶I和内切核糖核酸酶混合溶液，混匀，5℃温度下静置反应30min；接着，加入15μL浓度为130mmol/L的苯甲磺酰氟异丙醇溶液，5℃温度下静置3h；最后，在10000rpm下离心60min，取上清液，得到蛋白溶液；
②测定蛋白浓度：采用考马斯蓝染色法得到所述的蛋白溶液蛋白的浓度；
③沉淀蛋白：在步骤二②中的蛋白溶液中加入蛋白溶液体积6倍温度为的-50℃的二甲基酮水溶液，沉淀24h；再离心，弃上清液，沉淀液温度用温度为 -50℃体积浓度为85%的二甲基酮水溶液洗涤；最后冷冻干燥，-80℃贮存得到干燥蛋白；
④蛋白还原及酶解：首先，向步骤二③所得的干燥蛋白中添加60μL浓度为60mmol/L的甲基三乙基碳酸氢铵水溶液溶解蛋白；然后，加入4μL的2-羧乙基磷酸在60℃反应1h，进行还原化处理；接着，加入4μL的甲基硫代磺酸甲酯反应15min；最后，继续加入浓度为0.3μg/μL的蛋白酶水溶液30μL，38℃反应20小时，进行蛋白酶解；
⑤肽标记：在蛋白酶解液中加入用80μL乙醇溶解后的iTRAQ标记试剂，室温反应1h，得到酶解反应混合物；
步骤三、蛋白参数分析：将步骤二⑤中得到的酶解反应混合物加入到液相质谱分析仪的电喷雾单元中，电喷雾单元将酶解反应混合物雾化通过喷嘴喷至检测器中；液相质谱分析仪使用一道激光光束来照射经雾化的酶解反应混合物，使得经雾化的酶解反应混合物中至少一个待测物接收由激光光束所传递的能量而被解吸后沿着一个与该电荷移转路径相交的飞行路径飞行，经雾化的酶解反应混合物会因电荷移转而被电离，并在该电位差引导下，朝向质量分析器移动并被质量分析器接收，以进行质谱定性和定量分析，得到血清蛋白参数分析结果。
优选的，所述的血清蛋白细胞的收集需空腹条件下采集。
优选的，所述的液相质谱分析仪的检测条件为：离子化方式：正离子电喷雾模式；电压：2000V；离子源温度：180℃；扫描范围：3000m/z。
优选的，所述的考马斯蓝染色法包括：①将100mg考马斯亮蓝G-250溶于50ml浓度为95%的乙醇，再加入100ml浓度为85%的磷酸；然后，用蒸馏水补充至1000ml，在5℃条件下放置时间不低于6个月；②将标准牛血清蛋白溶液由低浓度到高浓度依次加入考马斯亮蓝G-250溶液得到标准曲线蛋白质样本得到标准曲线蛋白质样本；③将待测样本溶于缓冲溶液中，然后按1：5比例用蒸馏水稀释，如出现沉淀，应过滤除去；④每个标准曲线蛋白质样本中加5ml稀释的染料结合溶液，反应30min，染液与蛋白质结合后，将由红色变为蓝色，在595nm波长下测定其吸光度；⑤根据标准曲线计算待测样本的浓度。
优选的，所述的细胞裂解液包括：8mol/L的尿素，质量浓度为4%的3-[(3－胆酰胺丙基)－二乙胺]-丙磺酸，40mmol/L的三羟甲基氨基甲烷，余量为去离子。
优选的，所述的iTRAQ标记试剂进行肽标记时，血清的含量不小于500µL。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种煤工尘肺患者血清中蛋白参数分析方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一、血清蛋白细胞的采集：首先，采集确诊煤工尘肺患者的静脉血清样本8-10ml；然后将采集的血清样本在2000-6000rpm、3-5℃条件下进行离心2-5min，收集下层细胞；接着用去离子水清洗收集到的下层细胞，在2000-6000rpm、3-5℃条件下再次离心2-5min；最后，将收集到的下层细胞在-60- -80℃深冷环境下冷冻干燥2-8h获得经冷冻后的血清蛋白细胞；
步骤二、血清细胞内蛋白的提取：①首先，将经过步骤一处理后的血清蛋白细胞样本置于离心管中，加入0.4-1.2mL的细胞裂解液，混匀；然后，加入4-20μL质量比为2-6:1的脱氧核糖核酸核酸内切酶I和内切核糖核酸酶混合溶液，混匀，3-5℃温度下静置反应10-30min；接着，加入5-15μL浓度为70-130mmol/L的苯甲磺酰氟异丙醇溶液，3-5℃温度下静置1-3h；最后，在8000-10000rpm下离心40-60min，取上清液，得到蛋白溶液；
②测定蛋白浓度：采用考马斯蓝染色法得到所述的蛋白溶液蛋白的浓度；
③沉淀蛋白：在步骤二②中的蛋白溶液中加入蛋白溶液体积4-6倍温度为的-10℃- -50℃的二甲基酮水溶液，沉淀10-24h；再离心，弃上清液，沉淀液温度用温度为-10℃- -50℃体积浓度为70%-85%的二甲基酮水溶液洗涤；最后冷冻干燥，-80℃贮存得到干燥蛋白；
④蛋白还原及酶解：首先，向步骤二③所得的干燥蛋白中添加20-60μL浓度为40-60mmol/L的甲基三乙基碳酸氢铵水溶液溶解蛋白；然后，加入1-4μL的2-羧乙基磷酸在50-60℃反应1h，进行还原化处理；接着，加入2-4μL的甲基硫代磺酸甲酯反应10-15min；最后，继续加入浓度为0.2-0.3μg/μL的蛋白酶水溶液20-30μL，36-38℃反应10-20h，进行蛋白酶解；
⑤肽标记：在蛋白酶解液中加入用60-80μL乙醇溶解后的iTRAQ标记试剂，室温反应1h，得到酶解反应混合物；
步骤三、蛋白参数分析：将步骤二⑤中得到的酶解反应混合物加入到液相质谱分析仪的电喷雾单元中，电喷雾单元将酶解反应混合物雾化通过喷嘴喷至检测器中；液相质谱分析仪使用一道激光光束来照射经雾化的酶解反应混合物，使得经雾化的酶解反应混合物中至少一个待测物接收由激光光束所传递的能量而被解吸后沿着一个与该电荷移转路径相交的飞行路径飞行，经雾化的酶解反应混合物会因电荷移转而被电离，并在该电位差引导下，朝向质量分析器移动并被质量分析器接收，以进行质谱定性和定量分析，得到血清蛋白参数分析结果。
2.根据权利要求1所述的一种煤工尘肺患者血清中蛋白参数分析方法，其特征在于，所述的血清蛋白细胞的收集需空腹条件下采集。
3.根据权利要求1所述的一种煤工尘肺患者血清中蛋白参数分析方法，其特征在于，所述的液相质谱分析仪的检测条件为：离子化方式：正离子电喷雾模式；电压：1200-2000V；离子源温度：120-180℃；扫描范围：80-3000m/z。
4.根据权利要求1所述的一种煤工尘肺患者血清中蛋白参数分析方法，其特征在于，所述的考马斯蓝染色法包括：①将100mg考马斯亮蓝G-250溶于50ml浓度为95%的乙醇，再加入100ml浓度为85%的磷酸；然后，用蒸馏水补充至1000ml，在3-5℃条件下放置时间不低于6个月；②将标准牛血清蛋白溶液由低浓度到高浓度依次加入考马斯亮蓝G-250溶液得到标准曲线蛋白质样本得到标准曲线蛋白质样本；③将待测样本溶于缓冲溶液中，然后按1：5比例用蒸馏水稀释，如出现沉淀，应过滤除去；④每个标准曲线蛋白质样本中加5ml稀释的染料结合溶液，反应5-30min，染液与蛋白质结合后，将由红色变为蓝色，在595nm波长下测定其吸光度；⑤根据标准曲线计算待测样本的浓度。
5.根据权利要求1所述的一种煤工尘肺患者血清中蛋白参数分析方法，其特征在于，所述的细胞裂解液包括：8mol/L的尿素，质量浓度为4%的3-[(3－胆酰胺丙基)－二乙胺]-丙磺酸，40mmol/L的三羟甲基氨基甲烷，余量为去离子。
6.根据权利要求1所述的一种煤工尘肺患者血清中蛋白参数分析方法，其特征在于，所述的iTRAQ标记试剂进行肽标记时，血清的含量不小于500µL。
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