CN104820103B - 应用iTRAQ技术研究水稻响应稻瘟病菌侵染蛋白质组变化的方法 - Google Patents

应用iTRAQ技术研究水稻响应稻瘟病菌侵染蛋白质组变化的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种应用iTRAQ技术研究水稻响应稻瘟病菌侵染蛋白质组变化的方法，属于植物生物技术领域。本发明的方法包含以下步骤：A.植物材料与叶片蛋白的提取；B.对步骤A所得的蛋白质样品进行进一步FASP酶解、肽段标记、SCX分级及LC‑MS质谱分析；C.对上步所得的质谱鉴定结果进行数据查库、定量分析，获取水稻‑稻瘟病菌互作过程中整个蛋白质组的变化情况。本发明能快速和有效地筛选到与水稻抗病相关联的候选基因；很好的利用iTRAQ这一高通量、准确的蛋白质组学研究手段来研究与水稻抗病相关的候选基因；可广泛应用于植物抗病等性状的研究和开发并且结合转基因技术来培育抗病性强的植物新品种。

Description

应用iTRAQ技术研究水稻响应稻瘟病菌侵染蛋白质组变化的 方法
技术领域
本发明属于植物生物技术领域，具体涉及一种应用iTRAQ技术研究水稻响应稻瘟病菌侵染蛋白质组变化的方法。
背景技术
植物抗病性及抗病机制研究是当今植物病理学和植物抗病育种研究的热点和焦点。在自然情况下,植物经常处于生物胁迫或非生物胁迫之中。当受到外来病原菌侵染时,植物将通过改变自身蛋白质组的表达模式或酶类的活性等方式以抵制病原物的入侵。植物的抗病性的产生涉及到一系列复杂的信号传导过程，目前已有研究从各种植物中发现与鉴定了一些与病原物侵染相关的抗病途径被激活。
但目前多数研究集中在利用基因芯片、基因表达序列分析等技术分析植物与病原物互作过程中激活的抗病信号传导途径，由于这些技术主要是基于mRNA水平的变化，不能真实的反映蛋白水平的变化，不利于揭示植物与病原物的具体互作机制。
蛋白质是生理功能的执行者和生命现象的直接体现者，其丰度、结构、稳定性、亚细胞定位及与其他生物大分子的相互作用时刻处于动态变化之中，对整个蛋白质组进行功能分析、鉴定及其翻译后修饰的研究，能更加客观准确地揭示生命现象。蛋白质组学也很早被用于水稻与稻瘟病菌互作的研究中，但大多数还是基于2D电泳分离和质谱鉴定联合应用，属于对于一个细胞或组织的蛋白质进行的定性研究，仅能确定蛋白质的身份但不能对蛋白质的功能给出最终定论。因此，这些被鉴定出来的蛋白数量、种类有限，很少被继续深入的研究，也未能被有效的用于水稻的抗病育种中。
事实上，蛋白质在浓度上的变化对于实现其在细胞中的功能来说极其重要，这些浓度的变化往往能揭示细胞的真实生命代谢过程。因此，在蛋白质组学研究中，对蛋白质的相对和绝对浓度进行测量显得尤为重要。相对和绝对定量同位素标记(isobaric tags forrelative and absolute quantitation，iTRAQ)是由美国应用生物系统公司在2004年推出的研究蛋白质组的新技术，可以同时对1个基因组表达的全部蛋白质或1个复杂的混合体系中的所有蛋白质进行精确定量和鉴定，不仅降低了实验过程中所引入的技术误差，还克服了2-DE不能对低丰度、极大和极小、极碱性和疏水蛋白进行有效分离的问题，使得全面分析蛋白质组的变化成为可能。iTRAQ技术已成为目前蛋白质组学定量方法中一个十分重要的技术，其作用已经在许多生物体和组织研究中得到证明，但尚未见到该技术用于水稻与稻瘟病互作的差异蛋白质组学研究的报道。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术中存在的缺点与不足，提供一种应用iTRAQ技术研究水稻响应稻瘟病菌侵染蛋白质组变化的方法。用以克服现有技术的研究效果不准确的问题。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种应用iTRAQ技术研究水稻响应稻瘟病菌侵染蛋白质组变化的方法，通过定量蛋白质组学技术以较为全面、准确的分析抗、感病水稻品种响应稻瘟病侵染后的蛋白质组变化，所述定量蛋白质组学技术为iTRAQ技术。
所述的应用iTRAQ技术研究水稻响应稻瘟病菌侵染蛋白质组变化的方法，包含以下步骤：
A.植物材料与叶片蛋白的提取；
B.对步骤A所得的蛋白质样品进行进一步FASP酶解、肽段标记、SCX分级及LC-MS质谱分析；
C.对上步所得的质谱鉴定结果进行数据查库、定量分析，获取水稻-稻瘟病菌互作过程中整个蛋白质组的变化情况。
步骤A中所述植物材料与叶片蛋白的提取，具体步骤为分别取接种稻瘟病菌前后0h和24h不同时间点的抗病材料及感病材料叶片，进行液氮研磨、离心、裂解处理，并进行蛋白质量的SDS-PAGE电泳检测。
步骤B中所述步骤是在肽段定量后各组样品分别取约90μg,按照AB公司试剂盒iTRAQ Reagent-8plex Multiplex Kit(AB SCIEX)说明书进行FASP酶切、肽段标记后进行的SCX预分级，并进一步进行质谱鉴定。
步骤C中所述步骤是将经质谱分析及Mascot查库后的结果合并后以Peptide FDR≤0.01筛选过滤；对共同鉴定到的蛋白进一步进行GO聚类分析，选取差异倍数>1.2或<0.8、p-value<0.05的蛋白进行进一步分析，获取水稻-稻瘟病菌互作过程中整个蛋白质组的变化情况。
作为本发明的一种优选技术方案，步骤A的具体步骤为：
1)对抗病材料及感病材料的3.5-4叶期的水稻幼苗进行稻瘟病菌的接种，接种0h、24h后取样，迅速置于液氮中冷却后置于-80℃中保存备用；
2)取水稻组织样品，用液氮研磨成粉末并转入50ml离心管中，加入25ml提取液-20℃沉淀1h；离心10000rpm，45min，弃上清；空气干燥后按10:1体积加入SDT buffer，涡旋混匀，沸水浴5min；超声破碎后沸水浴5min，离心取上清，利用BCA法进行蛋白质定量；
3)取20μg蛋白质样品，按体积比5:1加入5×上样缓冲液，沸水浴5min，离心14000g20min，取上清进行12.5％SDS-PAGE电泳；恒流14mA，电泳90min后对胶进行考马斯亮蓝染色。
步骤2)中所述的提取液为TCA与丙酮体积比为1:9，添加有65mM DTT。
步骤2)中所述的SDT buffer的组分为4％SDS，1mMDTT，150mM Tris-HCl，pH8.0。
步骤2)中所述的超声破碎的条件为80w，超声10s，间歇15s，共10次。
作为本发明的一种优选技术方案，步骤B的具体步骤为：
(1)取400μg样品，加入65mM DTT，沸水浴5min，冷却至室温；加入200μl UA buffer混匀，转入超滤离心管，离心14000g，15min；加入200μl UA buffer离心14，000g，15min，弃滤液；加入100μl IAA，600rpm振荡1min，避光室温30min，离心14000g，10min；加入100ul UAbuffer，离心14000g，10min重复2次；加入100μl Dissolution buffer，离心14000g，10min重复2次；加入40μl Trypsin buffer，600rpm振荡1min，37℃16-18h；换新收集管，离心14000g 10min，取滤液，OD280肽段定量；
(2)肽段标记及SCX分级：
各组样品分别取约90μg，按照AB公司试剂盒iTRAQ Reagent-8plex MultiplexKit(AB SCIEX)说明书进行样品标记；将标记后的所有肽段混合，采用AKTA Purifier100(GE Healthcare)仪器进行SCX预分级，收集穿流及洗脱fraction 30份，根据SCX色谱图每组样品合并成10份，冻干后C18Cartridge(Sigma)脱盐；
(3)质谱分析鉴定：
每份样品采用纳升流速HPLC液相系统Easy nLC进行分离；缓冲液：A液为0.1％甲酸水溶液，B液为0.1％甲酸乙腈水溶液；色谱柱以95％的A液平衡；样品由自动进样器上样到上样柱Thermo scientific EASY column(2cm*100μm 5μm-C18)，再经分析柱Thermoscientific EASY column(75μm*100mm 3μm-C18)分离，流速为250nl/min；相关液相梯度如下：0min-100min，B液线性梯度从0％到35％；100min-108min，B液线性梯度从35％到100％；108min-120min，B液维持在100％；然后每份样品经毛细管高效液相色谱分离后用Q-Exactive质谱仪(Thermo Finnigan)进行质谱分析。
步骤(1)中所述的UA buffer为8M Urea，150mM Tris-HCl，pH8.0。
步骤(1)中所述的Trypsin buffer的配方为在40μl裂解液中添加4μg胰蛋白酶。
步骤(3)中所述的乙腈水溶液中乙腈为84％。
作为本发明的一种优选技术方案，步骤C的具体步骤为：
原始数据经降噪、去同位素步骤后获得峰图列表；同时建立参考蛋白序列数据库，使用蛋白质鉴定软件Mascot2.2对参考数据库进行搜素进行肽段及蛋白质的鉴定，进一步对鉴定质量评估，并对基本信息、定量信息及差异蛋白分别进行分类统计；将差异倍数>1.2倍或<0.8倍、且经统计检验其p-value<0.05的蛋白确定为差异蛋白，获取水稻-稻瘟病菌互作过程中整个蛋白质组的变化情况。
作为本发明的一种优选技术方案，对所有鉴定到的差异蛋白进行GO功能注释分析(http://www.geneontology.org)；进一步通过Pathway分析，确定蛋白参与的主要生理生化代谢途径和信号传导途径；最后对各蛋白在各样品之间的相对含量进行比较，从而获得一些感兴趣的重要蛋白。
作为本发明的一种优选技术方案，步骤C之后进一步利用RT-PCR技术对所鉴定出的差异蛋白进行验证。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
本发明能够较完整的鉴定出参与水稻-稻瘟病菌互作过程中的差异蛋白，本发明实施例利用该方法鉴定了一些水稻响应稻瘟病侵染过程中的发生变化的蛋白；本发明方法对深入揭示水稻-稻瘟病互作机制提供了一个方法借鉴；在利用转基因技术培育抗稻瘟病品种上具有重要的参考价值。其优点和效果分述一下：①能快速和有效地筛选到与水稻抗病相关联的候选基因；②本发明很好的利用iTRAQ这一高通量、准确的蛋白质组学研究手段来研究与水稻抗病相关的候选基因；③可以广泛应用于植物抗病等性状的研究和开发并且结合转基因技术来培育抗病性强的植物(作物)新品种。
附图说明
图1.水稻叶片总蛋白的质量检测图；
图2.不同处理之间差异表达蛋白比对图；其中：A为全部差异蛋白，B为上调差异蛋白，C为下调差异蛋白；
图3.定量PCR验证部分差异蛋白表达的结果图；
其中：L为中二软占、K为H4、J为接种稻瘟病菌、H为接种清水对照、0为取样时的0h、24为取样时的24h。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。本发明所使用的各种原料及各项设备均为常规市售产品，均能够通过市场购买直接获得。
实施例1
一、应用iTRAQ技术研究水稻响应稻瘟病菌侵染的蛋白质组鉴定方法
(一)样品的制备：
1.水稻材料与叶片总蛋白的提取。对抗病材料(H4)及感病材料(中二软占)的3.5-4叶期的水稻幼苗进行稻瘟病菌的接种,接种0h、24h后取样，迅速置于液氮中冷却后置于-80℃中保存备用；取水稻组织样品，用液氮研磨成粉末并转入50ml离心管中，加入25ml提取液(TCA/丙酮)-20℃沉淀1h。离心10,000rpm，45min，弃上清。空气干燥后按10:1体积加入SDT buffer(4％SDS,1mM DTT,150mM Tris-HCl pH8.0)，涡旋混匀，沸水浴5min。超声破碎(80w，超声10s，间歇15s，共10次)后沸水浴5min，离心取上清。
2.蛋白浓度的测定及质量检测。利用BCA法进行蛋白质定量。取约20μg蛋白质样品5:1(v/v)加入5X上样缓冲液，沸水浴5min，离心14,000g 20min，取上清进行12.5％SDS-PAGE电泳。恒流14mA，电泳时间90min后对胶进行考马斯亮蓝染色，6组样品经SDS-PAGE电泳分离后，蛋白质条带分布较为均一(图1)。
3.iTRAQ样品的准备。取400μg样品，加入65mM DTT，沸水浴5min，冷却至室温。加入200μl UA buffer(8M Urea,150mM Tris-HCl pH8.0)混匀，转入超滤离心管，离心14,000g,15min。加入200μl UA buffer离心14,000g,15min，弃滤液。加入100μl IAA(50mM IAA inUA)，600rpm振荡1min，避光室温30min，离心14,000g,10min。加入100ul UA buffer，离心14000g,10min重复2次。加入100μl Dissolution buffer，离心14,000g,10min重复2次。加入40μl Trypsin buffer(4μg Trypsin in 40μl Dissolution buffer)，600rpm振荡1min，37℃16-18h。换新收集管，离心14,000g 10min，取滤液，OD280肽段定量。各组样品分别取约90μg,按照AB公司试剂盒iTRAQ Reagent-8plex Multiplex Kit(AB SCIEX)说明书进行标记，如表1所示(L为中二软占、K为H4、J为接种稻瘟病菌、H为接种清水对照)。
表1 样品标记
将标记后的所有肽段混合，采用AKTA Purifier100(GE Healthcare)仪器进行SCX预分级，收集穿流及洗脱fraction约30份，根据SCX色谱图每组样品合并成10份，冻干后进行C18Cartridge(Sigma)脱盐处理。
(二)差异蛋白的质谱鉴定：每份样品采用纳升流速HPLC液相系统EasynLC进行分离。缓冲液：A液为0.1％甲酸水溶液，B液为0.1％甲酸乙腈水溶液(乙腈为84％)。色谱柱以95％的A液平衡。样品由自动进样器上样到上样柱Thermo scientific EASY column(2cm*100μm 5μm-C18)，再经分析柱Thermo scientific EASY column(75μm*100mm 3μm-C18)分离，流速为250nl/min。相关液相梯度如下：0min-100min，B液线性梯度从0％到35％；100min-108min，B液线性梯度从35％到100％；108min-120min，B液维持在100％。然后每份样品经毛细管高效液相色谱分离后用Q-Exactive质谱仪(Thermo Finnigan)进行质谱分析。原始数据经降噪、去同位素等步骤后获得峰图列表。同时建立参考蛋白序列数据库，使用蛋白质鉴定软件Mascot2.2对参考数据库进行搜素进行肽段及蛋白质的鉴定，进一步对鉴定质量评估，并对基本信息、定量信息及差异蛋白等分别进行分类统计。SCX分级脱并盐后的10个fraction经质谱分析及Mascot查库。结果合并后以Peptide FDR≤0.01筛选过滤。共同鉴定到的有3102个蛋白，可做为一下比较分析。
(三)差异蛋白统计分析
应用Mascot软件对样品间差异表达蛋白进行表达量计算，当同一蛋白在样品间的丰度比接近1时，表明该蛋白的表达量在样品间差异不显著，而当蛋白质丰度比达到1.2以上，且经统计检验P-value小于0.05时，认为此蛋白为两样品间的差异蛋白。表2表明，在无菌水处理及稻瘟病菌侵染24h后，各组差异表达蛋白数量相当(309-322个)，上调表达为137-153个，下调为161-177个。
表2差异蛋白统计
为了进一步挖掘稻瘟病菌诱导的差异蛋白的表达情况，利用venny在线作图工具对各处理之间差异蛋白进行交集比对。从图2中可以看出，在稻瘟病侵染24h后，中二软占(L)特异性表达的蛋白有62个(28个上调，34个下调)，中二软占(L)和H4(K)共同差异表达的蛋白有31个(15个上调，16个下调)，而H4(K)品系则有88个差异表达蛋白(上调50个，下调38个)。
将P-value≤0.01的GO-term定义为差异表达蛋白显著富集的GO-term，对接种稻瘟病菌24h后L和K品种特异性诱导差异表达蛋白进行生物学过程GO功能分类(表3)。结果表明，中二软占(L)特异性诱导差异表达蛋白显著富集在8条GO-term中，包括metabolism、transport及cellular physiological process等；中二软占(L)品种和H4(K)品系共同持有的差异表达蛋白显著富集在10条GO-term中，包括physiological process、response tostimulus、response to abiotic stimulus及response to stress等；H4(K)品系中差异表达蛋白则显著富集在19条GO-term中，包括metabolism、generation of precursormetabolites and energy及response to stimulus等。
表3差异表达蛋白生物学过程GO显著性富集分析
(四)部分差异表达蛋白的RT-PCR分析
为了初步验证iTRAQ筛选出的差异蛋白的可靠性，本发明进行了定量PCR验证，其结果基本上与质谱的结果相符合，结果说明iTRAQ筛选水稻抗病相关差异表达蛋白是可行的，结果可靠。定量PCR验证部分差异蛋白表达的结果图如图3所示。
上述描述仅作为本发明可实施的技术方案提出，不作为对其技术方案本身的单一限制条件。

Claims (8)

1.一种应用iTRAQ技术研究水稻响应稻瘟病菌侵染蛋白质组变化的方法，其特征在于：包含以下步骤：
A.植物材料的获取与叶片蛋白的提取；
B.对步骤A所得的蛋白质样品进行进一步FASP酶解、肽段标记、SCX分级及LC-MS质谱分析；
C.对上步所得的质谱鉴定结果进行数据查库、定量分析，获取水稻-稻瘟病菌互作过程中整个蛋白质组的变化情况；
所述步骤B的具体步骤为：
(1)取400μg样品，加入65mM DTT，沸水浴5min，冷却至室温；加入200μl UA buffer混匀，转入超滤离心管，离心14,000g，15min；加入200μl UA buffer离心14,000g，15min，弃滤液；加入100μl IAA，600rpm振荡1min，避光室温30min，离心14,000g，10min；加入100μl UAbuffer，离心14,000g，10min，操作步骤重复2次；加入100μl Dissolution buffer，离心14000g，10min，操作步骤重复2次；加入40μl Trypsin buffer，600rpm振荡1min，37℃16-18h；换新收集管，离心14,000g 10min，取滤液，OD280肽段定量；
(2)肽段标记及SCX分级：
各组样品分别取约90μg，按照AB公司试剂盒iTRAQ Reagent-8plex Multiplex Kit说明书进行样品标记；将标记后的所有肽段混合，采用AKTA Purifier100仪器进行SCX预分级，收集穿流及洗脱fraction 30份，根据SCX色谱图每组样品合并成10份，冻干后C18Cartridge脱盐；
(3)质谱分析鉴定：
每份样品采用纳升流速HPLC液相系统Easy nLC进行分离；缓冲液：A液为0.1％甲酸水溶液，B液为0.1％甲酸乙腈水溶液；色谱柱以95％的A液平衡；样品由自动进样器上样到上样柱Thermo scientific EASY column，再经分析柱Thermo scientific EASY column分离，流速为250nl/min；相关液相梯度如下：0min-100min，B液线性梯度从0％到35％；100min-108min，B液线性梯度从35％到100％；108min-120min，B液维持在100％；然后每份样品经毛细管高效液相色谱分离后用Q-Exactive质谱仪进行质谱分析。
2.根据权利要求1所述的应用iTRAQ技术研究水稻响应稻瘟病菌侵染蛋白质组变化的方法，其特征在于：步骤A中所述植物材料的获取与叶片蛋白的提取，具体步骤为分别取接种稻瘟病菌0h时和24h后不同时间点的抗病材料及感病材料叶片，进行液氮研磨、离心、裂解处理，并进行蛋白质量的SDS-PAGE电泳检测。
3.根据权利要求1所述的应用iTRAQ技术研究水稻响应稻瘟病菌侵染蛋白质组变化的方法，其特征在于：步骤C中所述步骤是将经质谱分析及Mascot查库后的结果合并后以Peptide FDR≤0.01筛选过滤；对共同鉴定到的蛋白进一步进行GO聚类分析，选取差异倍数>1.2或<0.8、p-value<0.05的蛋白进行进一步分析，获取水稻-稻瘟病菌互作过程中整个蛋白质组的变化情况。
4.根据权利要求1所述的应用iTRAQ技术研究水稻响应稻瘟病菌侵染蛋白质组变化的方法，其特征在于：步骤A的具体步骤为：
1)对抗病材料及感病材料的3.5-4叶期的水稻幼苗进行稻瘟病菌的接种，接种0h时和24h后取样，迅速置于液氮中冷却后置于-80℃中保存备用；
2)取水稻组织样品，用液氮研磨成粉末并转入50ml离心管中，加入25ml提取液-20℃沉淀1h；离心10,000rpm，45min，弃上清；空气干燥后按10:1体积加入SDT buffer，涡旋混匀，沸水浴5min；超声破碎后沸水浴5min，离心取上清，利用BCA法进行蛋白质定量；
3)取20μg蛋白质样品，按体积比5:1加入5×上样缓冲液，沸水浴5min，离心14,000g20min，取上清进行12.5％SDS-PAGE电泳；恒流14mA，电泳90min后对胶进行考马斯亮蓝染色。
5.根据权利要求4所述的应用iTRAQ技术研究水稻响应稻瘟病菌侵染蛋白质组变化的方法，其特征在于：步骤2)中所述的提取液为TCA与丙酮的混合液，所述TCA与丙酮的体积比为1:9，添加有65mM DTT；
步骤2)中所述的SDT buffer的组分为4％SDS，1mMDTT，150mM Tris-HCl，pH8.0；
步骤2)中所述的超声破碎的条件为80w，超声10s，间歇15s，共10次。
6.根据权利要求1所述的应用iTRAQ技术研究水稻响应稻瘟病菌侵染蛋白质组变化的方法，其特征在于：所述步骤B中的步骤(1)中所述的UA buffer为8M Urea，150mM Tris-HCl，pH8.0；
所述步骤B中的步骤(1)中所述的Trypsin buffer的配方为在40μl裂解液中添加4μg胰蛋白酶；
所述步骤B中的步骤(3)中所述的乙腈水溶液中乙腈为84％。
7.根据权利要求1所述的应用iTRAQ技术研究水稻响应稻瘟病菌侵染蛋白质组变化的方法，其特征在于：步骤C的具体步骤为：
原始数据经降噪、去同位素步骤后获得峰图列表；同时建立参考蛋白序列数据库，使用蛋白质鉴定软件Mascot2.2对参考数据库进行搜素进行肽段及蛋白质的鉴定，进一步对鉴定质量评估，并对基本信息、定量信息及差异蛋白分别进行分类统计；将差异倍数>1.2倍或<0.8倍、且经统计检验其p-value<0.05的蛋白确定为差异蛋白，获取水稻-稻瘟病菌互作过程中整个蛋白质组的变化情况。
8.根据权利要求1所述的应用iTRAQ技术研究水稻响应稻瘟病菌侵染蛋白质组变化的方法，其特征在于：步骤C之后进一步利用RT-PCR技术对所鉴定出的差异蛋白进行验证。
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