CN103880950A - 离子液体双水相体系提取藻蓝蛋白的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种离子液体双水相体系提取藻蓝蛋白的方法，特别设及一种从螺旋藻中提取藻蓝蛋白的方法。将螺旋藻原料进行机械粉碎，加入适量磷酸氢二钾水溶液浸泡后，放入超声波破碎机中对螺旋藻细胞进行破壁处理。利用离子液体、磷酸氢二钾及水形成的离子液体双水相体系萃取螺旋藻蓝蛋白的粗提液。萃取后，含有藻蓝蛋白的离子液体相采用柱层析分离纯化，即可得到藻蓝蛋白精粉。
Description
技术领域
本发明涉及一种用离子液体双水相体系提取藻蓝蛋白的方法，特别涉及一种从螺旋藻中提取藻蓝蛋白的方法。
背景技术
螺旋藻是一种富含蛋白质、维生素、必需氨基酸、矿物质和必需脂肪酸的丝状微藻，螺旋藻植物蛋白质含量高达50-75％，相当于大豆的1.7倍、鸡肉的3.1倍、蛋类的4.6倍、全脂奶粉的2.9倍，且所含的蛋白质均属于优质蛋白质，易于吸收，其所含人体必需氨基酸的种类齐全，比例与最佳蛋白质氨基酸组成比例吻合，是人类最理想的蛋白源。螺旋藻脂肪含量仅4-6％，所含的饱和脂肪酸很少，不饱和脂肪酸的含量高达1.7％。螺旋藻含有12种矿物质、8种维生素和多种生物活性物质。螺旋藻纤维素含量为2-4％，其细胞壁是由胶原纤维和蛋白组成的，吸收率高达95％。
藻蓝蛋白是从螺旋藻中提取出来的一种胆蛋白质，它是螺旋藻的重要成分，藻蓝蛋白在螺旋藻中主要以藻胆蛋白体的形式存在，藻胆蛋白体由多种藻胆蛋白及连接蛋白或多肽组成。藻胆蛋白是强荧光的色素-蛋白络合物，能捕获光能，也是其颜色的主要来源。
在活细胞中，藻蓝蛋白能够有效抵抗紫外线和其他电离射线辐射，显著抑制血细胞的减少，而造血干细胞的损伤或修复在造血功能型辐射疾病中有至关重要的作用。藻蓝蛋白是一种有效的抗氧化剂，具有清除自由基和抗炎症的功效，对大肠炎、关节炎、葡萄糖氧化酶诱导的炎症以及急慢性组织器官炎症都有显著抑制作用。藻蓝蛋白也能作为一种强效抗氧化剂及能抑制活性氧参与的脂质体过氧化反应。越来越多的研究表明，藻蓝蛋白对肿瘤细胞有细胞毒性作用，在人类防癌抗癌的斗争中藻蓝蛋白的药用价值会进一步体现。藻蓝蛋白包含了一个蛋白和一个发色团，从机体中分离纯化后的藻蓝蛋白具有高度的荧光性，可以用做作为荧光标记物，在生物标记等方面有广阔的应用前景。藻蓝蛋白作为一种天然色素，可以安全应用于食品、化妆品等领域。
从目前文献报道来看，从螺旋藻及其他藻类原料中分离纯化藻蓝蛋白大多采用盐析、离心、透析和色谱柱层析等工艺，在实际生产过程中存在步骤繁琐、能耗高、产率低、操作周期长等缺点，导致高纯度藻蓝蛋白的价格极其昂贵，制约了藻蓝蛋白的应用。因此，探索一种工艺简化、条件温和、便于工业放大的藻蓝蛋白提取方法，对于藻蓝蛋白的开发应用具有重要的意义。
传统蛋白质大分子的分离、纯化采用的是传统有机溶剂，但由于有机溶剂毒性大、环境污染严重、容易导致大分子变性等缺点而其应用受到限制。双水相萃取技术是20世纪50年代后期开发的一种高效而温和的生物分离技术。当两种聚合物(或一种聚合物与一种盐)溶于同一溶液时，由于聚合物溶液之间(或聚合物溶液与盐溶液之间)的不相 溶性，使得当聚合物(或盐浓度)达到一定值时，就会形成互不相溶的两相，由于这两相中水的含量都很高，因此称为双水相系统。70年代以后，众多科学家发展了双水相萃取技术在生物分离过程中的应用。双水相萃取技术是一种操作简单、易于放大的分离方法，传统的双水相体系(高聚物/高聚物或高聚物/无机盐体系)已广泛应用于多种蛋白质产品的分离纯化过程。离子液体双水相萃取技术是近年来兴起的新的生物质分离技术，该体系一般是由亲水性离子液体、无机盐(如磷酸盐、碳酸盐、氢氧化物等)和水形成的双水相体系，它综合了离子液体和双水相体系的优点。作为一种高效的新型绿色分离体系，离子液体双水相具有分相时间短、粘度低、萃取过程不易乳化、萃取率高、分离条件温和、并可借助传统溶剂萃取的相关理论和经验，不存在有机溶剂残留问题，特别适用于生物物质的分离和提纯。
本发明以螺旋藻为原料，采用离子液体、磷酸氢二钾和水构成的双水相体系对螺旋藻中的藻蓝蛋白进行分离和纯化，以期建立一种简便、快捷、高效的分离纯化藻蛋白的路线。
发明内容
本发明是为解决常规螺旋藻蛋白粗提过程中，萃取剂对酶选择性较差，分离效率低、分离周期长等缺点，提出采用离子液体、磷酸氢二钾和水构成的双水相体系高效选择性的萃取螺旋藻中的藻蓝蛋白。该技术生产方法简单易行，分离效率高，并且适合大量富集藻蓝蛋白的工厂生产过程。
本发明的技术方案由以下部分组成。
1)螺旋藻细胞的破碎处理。对干燥螺旋藻原料进行机械粉碎，藻粉中加入10-20倍质量的0.05mol/L的K2HPO4水溶液中，温度为18-32℃时浸泡2-6h。浸泡结束后，将其放入超声波破碎机中，超声波频率为40kHz，功率为1000-10000W，保持温度低于40℃，开启超声对螺旋藻细胞进行破壁处理15-30min。将破碎的螺旋藻细胞悬浊液于10000r/min，离心20min，倾倒上清液可得到藻蓝蛋白的粗提液。
2)离子液体双水相萃取。计算上述藻蓝蛋白的粗提液中的K2HPO4的浓度，将适量固体K2HPO4、离子液体按比例加入藻蓝蛋白的粗提液中，充分搅拌使固体K2HPO4和离子液体能够迅速溶解在粗提液中，并有效的形成双水相体系，30-90min萃取过程结束。静置分层，其上层为含有藻蓝蛋白的离子液体层。
3)藻蓝蛋白的分离。将含有藻蓝蛋白的离子液体溶液采用DEAE-Sephadex A-25柱，以0.05mol/L、0.15mol/L、0.35mol/L和0.5mol/L的pH为7.0的磷酸盐缓冲溶液逐渐增加浓度进行梯度洗涤，收集不同时间的缓冲洗脱液，将含藻蓝蛋白部分的洗脱液合并浓缩。
4)藻蓝蛋白的纯化。将收集的藻蓝蛋白洗脱液采用Sephadex G-150凝胶柱子层析分离，以0.02mol/L的pH为7.0的磷酸盐缓冲溶液洗涤。收集到的层析液采用聚乙二醇(PEG-20000)浓缩后，在40℃进行真空干燥，得藻蓝蛋白精粉。
上述的离子液体为的阳离子部分为季铵盐衍生物，阴离子部分为羟基羧酸衍生物，其结构式如式1所示。
式中R1，R2和R3为-CH3，-CH2CH2，-CH2CH2CH3，-CH2CH2OH，-CH2CH2CH2OH，-CH2CHOHCH2OH，R1，R2和R3的结构可以相同，也可以不同；n＝8-14；x+y＝3，其中y＝0-2。
上述离子液体、磷酸氢二钾和水构成的双水相体系的构成为离子液体的质量浓度为13-22％，磷酸氢二钾的质量浓度为16-22％。
本发明所采用的离子液体双水相体系萃取干燥螺旋藻粉中的藻蓝蛋白，藻蓝蛋白的萃取率约为18-24.6％，在离子液体相的分配系数超过6.5，藻蓝蛋白能够快速进入离子液体层，相比传统的包含了沉淀、离心和透析这三个操作环节，离子液体双水相体系萃取法富集分离螺旋藻藻蓝蛋白具有节省操作时间、简化操作过程、降低操作成本和能耗以及易于工艺放大等优点。
下面结合实例对本发明内容进行描述。
具体实施例
实施例1
1)螺旋藻细胞的破碎处理。取100g干燥钝顶螺旋藻藻粉中加入1.5L的0.05mol/L的K2HPO4水溶液中，温度为20℃时浸泡4h。浸泡结束后，将其放入超声波破碎机中，超声波频率为40kHz，功率为1000W，保持温度为30℃，开启超声对螺旋藻细胞进行破壁处理15min。
2)离子液体双水相萃取。将225g离子液体、75g K2HPO4加入藻蓝蛋白的粗提液中，充分搅拌使固体K2HPO4和离子液体能够迅速溶解在粗提液中，并有效的形成双水相体系，萃取90min萃取过程结束。萃取过程结束。过滤分离去除固体，液体部分进行静置分层，其上层为含有藻蓝蛋白的离子液体层。
3)藻蓝蛋白的分离。将含有藻蓝蛋白的离子液体溶液采用DEAE-Sephadex A-25柱，以0.05mol/L、0.15mol/L、0.35mol/L和0.5mol/L的pH为7.0的磷酸盐缓冲溶液逐渐增加浓度进行梯度洗涤，收集不同流出时间，不同颜色的缓冲洗脱液，将颜色为浅蓝、深蓝、浅蓝色部分(含藻蓝蛋白)的洗脱液合并浓缩。
4)藻蓝蛋白的纯化。将收集的藻蓝蛋白洗脱液采用Sephadex G-150凝胶柱子层析分离，以0.02mol/L的pH为7.0的磷酸盐缓冲溶液洗涤。收集到的层析液采用聚乙二醇(PEG-20000)浓缩后，在40℃进行真空干燥，得藻蓝蛋白精粉。
采用上述方法从干燥钝顶螺旋藻藻粉萃取藻蓝蛋白的萃取率约为16.7％。所提取 的藻蓝蛋白在pH为7的溶液中的吸收光谱如说明书附图图1所示。
附图说明：
图1藻蓝蛋白的吸收光谱
实施例2
1)螺旋藻细胞的破碎处理。取1kg新鲜钝顶螺旋藻进行机械破碎，加入2kg的0.05mol/L的K2HPO4水溶液，将其放入频率为40kHz，功率为5000W超声波破碎机中，保持温度为30℃，开启超声对螺旋藻细胞进行破壁处理30min。将破碎的螺旋藻细胞悬浊液于10000r/min，离心20min，倾倒上清液可得到藻蓝蛋白的粗提液。
2)离子液体双水相萃取。将300g离子液体、225g K2HPO4加入藻蓝蛋白的粗提液中，充分搅拌使固体K2HPO4和离子液体能够迅速溶解在粗提液中，加入到藻蓝蛋白的粗提液中，搅拌萃取60min，当体系出现明显分层时，萃取过程结束。液体部分进行静置分层，下层为含有蛋白质的离子液体层。
3)藻蓝蛋白的分离。将含有藻蓝蛋白的离子液体溶液采用DEAE-Sephadex A-25柱，以0.05mol/L、0.15mol/L、0.35mol/L和0.5mol/L的pH为7.0的磷酸盐缓冲溶液逐渐增加浓度进行梯度洗涤，收集不同流出时间，不同颜色的缓冲洗脱液，将颜色为浅蓝、深蓝、浅蓝色部分(含藻蓝蛋白)
4)藻蓝蛋白的纯化。将收集的藻蓝蛋白洗脱液采用Sephadex G-150凝胶柱子层析分离，以0.02mol/L的pH为7.0的磷酸盐缓冲溶液洗涤。收集到的层析液采用聚乙二醇(PEG-20000)浓缩后，在40℃进行真空干燥，得藻蓝蛋白精粉。
采用上述方法从新鲜钝顶螺旋藻中萃取藻蓝蛋白的萃取率约为4.9％。
实施例3
1)螺旋藻细胞的破碎处理。取50g干燥钝顶螺旋藻藻粉中加入500mL的水，温度为20℃时浸泡4h。浸泡结束后，将其放入频率为40kHz，功率为1000W超声波破碎机中，保持温度为30℃，开启超声对螺旋藻细胞进行破壁处理30min。将破碎的螺旋藻细胞悬浊液于4000r/min，离心20min，倾倒上清液可得到藻蓝蛋白的粗提液。
2)离子液体双水相萃取。将0.66kg离子液体、0.36kgK2HPO4加入到藻蓝蛋白的粗提液，搅拌萃取45min，当体系出现明显分层时，萃取过程结束。液体部分进行静置分层，下层为含有蛋白质的离子液体层。
3)藻蓝蛋白的分离。将含有藻蓝蛋白的离子液体溶液采用DEAE-Sephadex A-25柱，以0.05mol/L、0.15mol/L、0.35mol/L和0.5mol/L的pH为7.0的磷酸盐缓冲溶液逐渐增加浓度进行梯度洗涤，收集不同流出时间，不同颜色的缓冲洗脱液，将颜色为浅蓝、深蓝、浅蓝色部分(含藻蓝蛋白)
4)藻蓝蛋白的纯化。将收集的藻蓝蛋白洗脱液采用Sephadex G-150凝胶柱子层析分离，以0.02mol/L的pH为7.0的磷酸盐缓冲溶液洗涤。收集到的层析液采用聚乙二醇 (PEG-20000)浓缩后，在40℃进行真空干燥，得藻蓝蛋白精粉。
采用上述方法从钝顶螺旋藻藻粉中萃取藻蓝蛋白的萃取率约为24.6％。
Claims (2)
1.离子液体双水相体系提取藻蓝蛋白的方法，其特征在于离子液体、磷酸氢二钾及水形成双水相体系用于提取螺旋藻中的藻蓝蛋白，其中离子液体具有式(1)所示结构
式中R1，R2和R3为-CH3，-CH2CH2，-CH2CH2CH3，-CH2CH2OH，-CH2CH2CH2OH，-CH2CHOHCH2OH，R1，R2和R3的结构可以相同，也可以不同；n=8-14；x+y=3，其中y=0-2。
2.根据权利要求1所述的离子液体双水相体系提取藻蓝蛋白的方法，其特征在于离子液体双水相体系的构成为离子液体的质量浓度为13-22％，磷酸氢二钾的质量浓度为16-22％。
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