CN106591410A - 一种从虾蟹加工废弃物中制备多肽与虾青素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于农副产品综合利用领域,具体涉及一种从虾蟹加工废弃物中制备多肽与虾青素的方法,具体为:以虾蟹加工废弃物为原料,清洗粉碎,酸化浸泡,酶解离心后,上清液经膜分离浓缩后,获得多肽;离心沉淀物干燥后,通过亚临界萃取、柱层析分离后,获得虾青素。相对于传统的碱法提取,本发明方法具有原料利用率高,生产过程节能绿色,产品纯度高且附加值高的优点。本发明推动虾蟹资源的综合利用,丰富虾青素与多肽的来源,具有积极经济价值。
Description
技术领域
本发明属于农产品综合加工技术领域,具体涉及一种从虾蟹加工废弃物中制备多肽与虾青素的方法,该方法通过酶法水解、亚临界萃取、膜分离等工序制备多肽与虾青素。
背景技术
中国是水产大国,虾蟹等甲壳类资源丰富,以虾类为例,中国虾类年总产量为250万吨左右,占世界总产量的37%,居世界第一。近年随着虾蟹加工产业的蓬勃发展给从业者带来丰厚收益的同时, 产生大约有40-50 %的加工下脚料,受国内加工技术水平落后的影响,这些加工废弃物利用率低,除部分作为饲料使用外,大部分被废弃,造成资源浪费与环境污染问题。
虾青素(Astaxanthin)是一种天然β-胡萝卜素的衍生物,呈鲜红色,是一种优质色素和超级抗氧化剂,一种具有邻羟基酮结构的类胡萝卜素,其化学名称为3,3-二羟基-4,4-二酮基-酮基-,-胡萝卜素,纯虾青素是暗红棕色晶体,熔点224℃,不溶于水,能溶于大多数有机溶剂。分子式为C40H52O4,相对分子量为596.84。虾青素分子中存在较长的共轭双键,极易捕获电子,是单线态氧的淬灭剂,具有清除自由基的能力和超级抗氧化活性,其生物活性主要有预防动脉硬化、抑制癌细胞生长、增强免疫、改善视力、维护中枢神经系统健康等作用。虾蟹蛋白中必需氨基酸含量丰富且比例均衡,营养价值高;加之肌基质蛋白相对较少使质构松软鲜嫩,容易被人体消化吸收,是一类优质蛋白。研究表明,通过酶解虾蟹蛋白生产多肽除了可以提高溶解性,促进消化吸收以外,某些多肽还具有抗氧化、调节血压等生理功能。因此,虾青素在食品、医药、化妆品、保健品和饲料等行业具有非常大的应用潜力,市场前景广阔,制备虾青素和虾蟹多肽蕴含丰富的开发利用潜力。
目前,虽有从虾蟹加工废弃物中制备多肽或提取虾青素的报道,但对多肽与虾青素多单独加工利用,如采用酶解或酸解制备多肽,利用碱法或溶剂提取虾青素,这造成原料利用率低,增加了生产成本。同时,当采用碱法或有机溶剂提取虾青素时,碱法提取会产生废水,且碱法处理会降低虾青素的品质与产率;而溶剂提取时,多采用二氯甲烷、氯仿等有机溶剂,上述溶剂毒性大,增加产品安全隐患,且需要增加溶剂回收与治理的成本。因此,为提高原料利用率和产品品质,减少治污成本,有必要将生物、物理、生物学科发展的最新成果运用于综合从虾蟹加工废弃物中制备虾青素与多肽的方法。
发明内容
本发明目的在于克服现有碱法提取和溶剂提取的技术缺陷,提供一种从虾蟹加工废弃物中同时制备多肽与虾青素的方法,该方法还具有原料利用率高,生产过程条件温和可控、节能环保,产品品质好等优点。
为实现上述目的,本发明采用以下技术方案:
一种从虾蟹加工废弃物中制备多肽与虾青素的方法,其包括如下步骤:
1)原料预处理:
虾蟹加工的废弃物(包括但不限于头、壳、尾等废弃物)清洗除杂后,粉碎打浆,过筛,将浆液pH调节到0-5,搅拌3-12h,离心,收集沉淀a,备用;
其中,清洗除杂是除去虾蟹加工废弃物中泥沙、发霉组织、藻类等。清洗虾蟹加工废弃物的水可以是自来水、井水、去离子水。过筛所采用的筛孔为40-100目。离心采用平板离心机,采用滤布目数为100-1000目,离心速度为2000-3500r/min。调节浆液的pH所用的试剂为电生功能水的酸水与盐酸的混合溶液,其活性氯浓度在1%以下。
2)物料酶解:
将沉淀a加入溶液中,调节pH8-11,加入蛋白酶酶解,酶解结束后,离心,分别收集上清液a与沉淀b;
其中,沉淀a与溶液的比例(m/V)为1:6-1:20。酶解时,搅拌速度为100-600r/min。
3)多肽制备:
上清液a的pH调节到3-4,离心,分别收集上清液b与沉淀c,中和上清液b,经膜分离处理后,干燥,获得多肽粉;
其中膜分离由微滤、超滤与纳滤组成,上清液b首先通过膜孔为0.5-5μm的微滤膜过滤,将微滤透过液采用超滤膜过滤,随后超滤透过液采用纳滤处理,纳滤浓缩至超滤透过液体积的10-30%时,终止纳滤。干燥可以是真空干燥、冷冻真空干燥、喷雾干燥。真空干燥的温度为40-65℃,气压为-0.05--0.20MPa;冷冻真空干燥温度为-40--60℃;喷雾干燥的进风温度为140-180℃,出风温度为65-95℃。
4)虾青素制备:
干燥沉淀b,装袋后,亚临界萃取,加酸将萃取液的pH调节到3-4,抽滤获得沉淀d,将沉淀c和d合并,加入乙醇溶解,重新调节pH到3-4,静置抽滤,获得沉淀e,乙醇溶解沉淀e,柱层析分离后,旋转蒸发,干燥,获得虾青素。
其中干燥沉淀b的方式是鼓风干燥,干燥条件为:40-65℃。柱层析的填料可以是硅胶、聚酰胺、大孔树脂。
多肽纯度测定:
采用238nm光吸收法测定。以牛血清白蛋白为标准蛋白,采用0.9%氯化钠溶液将其溶解,配制成标准溶液,随后采用紫外分光光度计在238nm测定吸光度,以吸光度与牛血清白蛋白浓度做标准曲线。将多肽粉加入0.9%氯化钠溶液中溶解后,定容后,取3mL多肽溶液加入2 mL 25%的三氯乙酸溶液,采用8000rpm离心10min,取上清液测定238nm的吸光值,计算多肽浓度与多肽质量,比上多肽粉质量,得出纯度。
虾青素纯度测定:
采用HPLC法。采用C18色谱柱,以甲醇-水( 体积比为95:5) 为流动相,流速1.0mL/min,检测波长为482nm,柱温为30℃,进样量为20μL,配制0.2-8μg/mL虾青素标准溶液,制作标准曲线。随后,准确称取虾青素样品,加5mL体积比为 1∶3二氯甲烷与甲醇混合溶剂,再加入3mL 体积的1%KOH甲醇溶液,超声15min,用溶剂定容至10mL。避光4℃中皂化7 h,皂化后,溶液过0.22μm 超滤膜,进行检测。通过回归方程计算虾青素样品中的虾青素质量,随后比上虾青素样品质量,得出纯度。
本发明比较传统从虾蟹加工废弃物提取虾青素的方法,将电生功能水、酶解、膜分离、亚临界萃取和层析技术有机集成,其中电生功能水的应用减少酸碱试剂的使用,减少环境污染;生物酶解的应用提升下脚料中蛋白的附加值,且产品安全性提高;膜分离的应用提高样品处理量,并将分离、浓缩、富集等目的集于一身,提高生产效率;亚临界萃取较传统提取工艺,具有提取效率高,溶剂残留少(溶剂残留量小于10mg/kg);较超临界萃取,具有成本低、样品处理量大等优点。以上技术的运用使本发明方法具有成熟可靠,性能先进,节能降耗等优点,推动虾蟹资源的充分开发利用。
有益效果:
1)生产过程中条件温和,使用的化学试剂毒腐性小且易于回收处理,减少了设备防腐和治污处理成本;
2)综合设计优化工艺,实现多肽与虾青素联产:将虾蟹加工废弃物中的蛋白酶解生产多肽,提高原料利用率,提升废弃物加工产品附加值,且由于酶法处理条件温和,产品安全性高,可以广泛应用于食品、医药等领域。
3)制备的虾青素与多肽纯度高(纯度大于90%),安全性好,不但可以进一步纯化生产保健药品,也可以作为原料应用于食品、化妆品等行业。
附图说明
图1 是本发明制备虾青素的HPLC曲线。图中峰1为虾青素。
具体实施方式
如无具体说明,本发明的各种原料均可以通过市售得到;或根据本领域的常规方法制备得到。除非另有定义或说明,本文中所使用的所有专业与科学用语与本领域技术熟练人员所熟悉的意义相同。此外任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。
本发明的其他方面由于本文的公开内容,对本领域的技术人员而言是显而易见的。
原料:虾蟹的废弃物,包括但不限于河蟹、青蟹、梭子蟹、南美白对虾、中国对虾、日本对虾、草虾、罗氏沼虾、水晶虾、大麦虫等甲壳动物的头部,尾部,脚部,壳部等部位。
预处理:
将上述原料进行粉碎打浆后,过筛,将浆液pH调节到0-5,搅拌3-12h,离心。
在本发明的一个具体实施方式中,所述的粉碎包括机械撞击,刀片切割,动力碾压等机械形式的粉粹方式。
在本发明的一个具体实施方式中,所述的粉碎后的浆液过50-100目筛。调节PH值为0-2,其使用的调节试剂为电生功能水和酸液的混合溶液,其中酸液包括但不限于盐酸,硫酸,磷酸,硝酸,碳酸等无机酸或乙酸、磺酸等有机酸。
物料酶解:
将上述的预处理所得的沉淀加入到pH值为8-11的碱水中,其中沉淀和碱水的料液比为1:6-1:20,调节混合液的pH值为8-11,优选8.5-9.0。
在本发明的一个具体方式中,按照混合溶液的1%-5%(m/V)加入蛋白酶,蛋白酶为猪、马、牛等动物的胰腺或者胃液提取物或者木瓜等植物产生的酵素的单一酶类或者它们的复合物。在35-55℃,优选40℃,按照100-600r/min的转速酶解。完成后以4000r/min离心,分别收集沉淀b与上清液a。
多肽制备:
使用酸性溶液调节酶解后的上清液a的pH值为3-4,酸液包括但不限于盐酸,硫酸,磷酸,硝酸,碳酸等无机酸或乙酸、磺酸等有机酸。静置后,采用5000r/min离心。然后依次采用1-2μm、5000-10000D、150-500Da的滤膜过滤。其中滤膜包括聚四氟乙烯,聚醚砜,混合纤维素酯,尼龙,聚偏氟乙烯等材质滤膜。
纳滤浓缩至超滤透过液体积的10-30%时,终止纳滤。干燥可以是真空干燥、冷冻真空干燥、喷雾干燥。真空干燥的温度为40-65℃,气压为-0.05--0.20 MPa;冷冻真空干燥温度为-40- -60℃;喷雾干燥的进风温度为140-180℃,出风温度为65-95℃。冷冻干燥后,以市售的虾青素多肽为标准对照品,进行多肽纯度测定,验证得到多肽样品的纯度为90%以上。
虾青素制备:
在本发明的一个具体实施方式中,亚临界萃取所采用的溶剂为丙烷,丁烷,液化石油气等短链饱和烷烃等。
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照国家标准测定。若没有相应的国家标准,则按照通用的国际标准、常规条件、或按照制造厂商所建议的条件进行。除非另外说明,否则所有的份数为重量份,所有的百分比为重量百分比。
实施例1
一种从虾蟹加工废弃物中制备多肽与虾青素的方法,其包括如下步骤:
1)原料预处理:
收集虾壳10kg,剔除发霉虾壳,用自来水清洗除去泥沙与海藻,沥干后,粉碎打浆,浆液过60目筛,加入电生功能水与盐酸的混合溶液,使体系的pH为1,以150r/min搅拌6h后,采用装有600目滤布的平板离心机以3000r/min离心,收集沉淀a,低温备用。
2)物料酶解:
以1:10(m/V)的料液比将沉淀a加入到pH8.5-9.0的电生功能水中,随后按加酶量为3%加入复合蛋白酶,在40℃以300r/min搅拌速度水解4h。酶解完成后,以4000r/min离心,分别收集沉淀b与上清液a。
3)多肽制备:
调节上清液a的pH到3-4,静置后,采用5000r/min离心,分别收集上清液b和沉淀c。对于上清液b依次采用膜孔2μm的微滤膜过滤,将微滤透过液采用截留分子量为8000Da的超滤膜处理,超滤透过液采用截留分子量为300Da的纳滤膜浓缩,浓缩至超滤透过液体积10%时,终止纳滤。采用-60℃真空冷冻干燥后,获得525.26g纯度为(91.35±0.29)%的多肽粉。
4)虾青素制备:
通过鼓风干燥沉淀b,装袋后,放入亚临界萃取罐中,以丙烷为萃取剂,乙醇为夹带剂,按料液比为1:6(m/V)加入丙烷,在40℃萃取5次,每次萃取时间为30min。萃取完成后,将萃取液转移入物料罐中,回收溶剂,获得虾青素粗品。将虾青素粗品的pH调节到3-4,静置抽滤,获得沉淀d。将沉淀d与沉淀c合并,加入乙醇溶解,加酸调节pH到3-4,静置抽滤,获得沉淀e,将沉淀e用乙醇溶解后,采用聚酰胺层析纯化,纯化后虾青素通过旋转蒸发回收溶剂,得到1.675g纯度(90.26±0.16)%的虾青素。
实施例2
一种从虾蟹加工废弃物中制备多肽与虾青素的方法,其包括如下步骤:
1)原料预处理:
收集蟹壳20kg,剔除发霉部分,用自来水清洗除去泥沙与海藻,沥干后,粉碎打浆,浆液过80目筛,加入电生功能水与盐酸的混合溶液,使体系的pH为0,以200r/min搅拌6h后,采用装有600目滤布的平板离心机以3500r/min离心,收集沉淀a,低温备用。
2)物料酶解:
以1:15(m/V)的料液比将沉淀a加入到pH9.0-10.0的电生功能水中,随后按加酶量为5%加入复合蛋白酶,在50℃以300r/min搅拌速度水解3h。酶解完成后,以4000r/min离心,分别收集沉淀b与上清液a。
3)多肽制备:
调节上清液a的pH到3-4,静置后,采用5000r/min离心,分别收集上清液b和沉淀c。对于上清液b依次采用膜孔1μm的微滤膜过滤,将微滤透过液采用截留分子量为5000Da的超滤膜处理,超滤透过液采用截留分子量为150Da的纳滤膜浓缩,浓缩至超滤透过液体积20%时,终止纳滤。采用喷雾干燥,获得1071.65g纯度为(90.87±0.34)%的多肽粉。
4)虾青素制备:
通过鼓风干燥沉淀b,装袋后,放入亚临界萃取罐中,以丁烷为萃取剂,乙醇为夹带剂,按料液比为1:4(m/V)加入丙烷,在40℃萃取6次,每次萃取时间为40min。萃取完成后,将萃取液转移入物料罐中,回收溶剂,获得虾青素粗品。将虾青素粗品的pH调节到3-4,静置抽滤,获得沉淀d。将沉淀d与沉淀c合并,加入乙醇溶解,加酸调节pH到3-4,静置抽滤,获得沉淀e,将沉淀e用乙醇溶解后,采用硅胶柱层析纯化,纯化后虾青素通过旋转蒸发回收溶剂,得到3.272g纯度为(90.29±0.46)%的虾青素。
实施例3
一种从虾蟹加工废弃物中制备多肽与虾青素的方法,其包括如下步骤:
1)原料预处理:
收集虾壳15kg,剔除发霉虾壳,用自来水清洗除去泥沙与海藻,沥干后,粉碎打浆,浆液过100目筛,加入电生功能水与盐酸的混合溶液,使体系的pH为2,以200r/min搅拌9h后,采用装有800目滤布的平板离心机以3500r/min离心,收集沉淀a,低温备用。
2)物料酶解:
以1:12(m/V)的料液比将沉淀a加入到pH8.5-9.5的电生功能水中,随后按加酶量为5%加入复合蛋白酶,在50℃以300r/min搅拌速度水解6h。酶解完成后,以5000r/min离心,分别收集沉淀b与上清液a。
3)多肽制备:
调节上清液a的pH到3-4,静置后,采用5000r/min离心,分别收集上清液b和沉淀c。对于上清液b依次采用膜孔3μm的微滤膜过滤,将微滤透过液采用截留分子量为6000Da的超滤膜处理,超滤透过液采用截留分子量为200Da的纳滤膜浓缩,浓缩至超滤透过液体积10%时,终止纳滤。采用真空干燥,获得781.48g纯度为(90.76±0.45)%的多肽粉。
4)虾青素制备:
通过鼓风干燥沉淀b,装袋后,放入亚临界萃取罐中,以丁烷为萃取剂,乙醇为夹带剂,按料液比为1:8(m/V)加入丙烷,在50℃萃取4次,每次萃取时间为30min。萃取完成后,将萃取液转移入物料罐中,回收溶剂,获得虾青素粗品。将虾青素粗品的pH调节到3-4,静置抽滤,获得沉淀d。将沉淀d与沉淀c合并,加入乙醇溶解,加酸调节pH到3-4,静置抽滤,获得沉淀e,将沉淀e用乙醇溶解后,采用大孔树脂吸附纯化,纯化后虾青素通过旋转蒸发回收溶剂,得到2.326 g纯度为(90.16±0.27)%的虾青素。
综上可看出:相较于传统从虾蟹加工废弃物中制备虾青素的方法,本发明方法具有联产多肽与虾青素,实现更高的经济效益,更有效利用虾蟹加工废弃物,且具有产品纯度高、生产效率高、节能环保等优点。因此,本发明方法实施可以产生更高的经济效益同时,也会产生良好的社会与环境效益。
Claims (10)
1.一种制备多肽与虾青素的方法,其特征在于,包括如下步骤:
1)原料预处理:
虾蟹加工废弃物清洗除杂后,粉碎打浆,过筛,将浆液pH调节到0-5,分离沉淀a,备用;
2)物料酶解:
将沉淀a加入溶液中,调节混合液为碱性,优选pH值为8-11,蛋白酶酶解,酶解结束后,分别收集上清液a与沉淀b;
3)多肽制备:
将上清液a的pH调节到3-4,离心,分别收集上清液b与沉淀c,中和上清液b,经膜分离处理后,干燥,获得多肽粉;
4)虾青素制备:
干燥沉淀b,装袋后,亚临界萃取,加酸将萃取液的pH调节到3-4,抽滤获得沉淀d,将沉淀c和沉淀d合并,加入乙醇溶解,重新调节pH到3-4,静置抽滤,获得沉淀e,乙醇溶解沉淀e,柱层析分离后,旋转蒸发,干燥,获得虾青素。
2.如权利要求1所述方法,其特征在于,步骤1)中调节浆液的pH所用的试剂为电生功能水的酸水与盐酸的混合溶液,其活性氯浓度在1%以下。
3.如要求1所述方法,其特征在于,步骤1)中所述调节浆液的pH调节到0-5,其中优选为0-2,搅拌的时间优选为3-12h。
4.如权利要求1所述方法,其特征在于,步骤2)中调节沉淀a溶液混合液pH所用的试剂为电生功能水的碱水,其pH为8-11;优选沉淀a与溶液的比例(m/V)为1:6-1:20。
5.如权利要求1所述方法,其特征在于,步骤2)中所述蛋白酶选自动物胰腺提取的蛋白酶、或者植物提取蛋白酶与碱性蛋白酶的复合酶,加酶量1-5%(m/V),酶解温度35-55℃,酶解2-6h。
6.如权利要求1所述方法,其特征在于,步骤3)中所述膜分离由微滤、超滤与纳滤组成,其中超滤膜截留分子量为5000-10000Da,纳滤膜截留分子量为150-500Da。
7.如权利要求1所述方法,其特征在于,步骤4)中所述的亚临界萃取使用的溶剂为低分子量的饱和烷烃,优选丙烷、丁烷、液化石油气,夹带剂为乙醇。
8.如权利要求1所述方法,其特征在于,步骤4)所述亚临界萃取的萃取温度为20-60℃,萃取次数为2-6次,每次萃取时间为20-120min,物料与萃取剂比例(m/V)为1:3-1:12。
9.如权利要求1所述方法,其特征在于,步骤3)中所述干燥的方式可选自真空干燥、冷冻真空干燥、喷雾干燥,真空干燥的温度为40-65℃,气压为-0.05--0.20MPa;冷冻真空干燥温度为-40--60℃;喷雾干燥的进风温度为140-180℃,出风温度为65-95℃。
10.如权利要求1所述方法,其特征在于,步骤4)中干燥沉淀b的方式是鼓风干燥,干燥条件为:40-65℃;柱层析的填料可选自硅胶、聚酰胺或大孔树脂。
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