CN106117326A - 一种离心法结合阴离子交换层析介质制备藻红蛋白的方法 - Google Patents

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唐志红
吕家森
赵吉路
张超
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Abstract

本发明提供了一种离心法结合阴离子交换层析介质制备藻红蛋白的方法。以新鲜紫球藻为原料,离心后将藻泥与磷酸盐缓冲液按一定比例混合后进行超声破碎处理，得到破壁液；将破壁液冷冻离心后取上清液，上清液用分子截留量为50～60kD的膜包超滤4～6次后，加入用磷酸盐缓冲液预处理的强阴离子层析介质，经两次冷冻离心后，取上清，得到纯度A 545/A 280>4.0的藻红蛋白。本发明所采取的制备方法,工艺简便，成本低，纯化效果好,蛋白回收率高,易于放大,具有较好的推广价值及应用前景。

Description

一种离心法结合阴离子交换层析介质制备藻红蛋白的方法
技术领域
本发明属于海洋生物活性物质制备技术领域，具体的说是涉及一种离心法结合阴离子交换层析介质制备高纯度藻红蛋白的方法。
背景技术
藻胆蛋白(phycobiliprotein，PBP)是存在于蓝藻、红藻、隐藻和少数甲藻中的一类捕光色素蛋白。根据紫外吸收光谱的特点，人们将藻胆蛋白分为三类：藻蓝蛋白(phycoeyanin，PC)、别藻蓝蛋白(allophycoeyanin，APC)和藻红蛋白(phycoerythrin，PE)。藻红蛋白主要分布于海洋红藻中，它是由脱辅基蛋白和色基组成，其脱辅基蛋白是一类寡聚蛋白，基本单位为α和β亚基，有些藻红蛋白中还有少量的γ亚基。由于色素分子的存在，藻红蛋白在可见光区480～570nm处有较强的光吸收，并且具有强烈的荧光。藻红蛋白用途非常广泛，它既可以作为天然色素应用于食品、化妆品等行业，还可制成荧光试剂，用于生物医学分析和免疫化学等领域。藻红蛋白也是一种重要的生理活性物质，具有抗肿瘤，抗病毒，增强免疫力等，它还是一种具有开发潜力的光敏剂，可制成光敏剂应用于肿瘤光动力学治疗。藻红蛋白的纯度通常用(A 545/A 280)来表示，等级划分为0.7<食品级<3.0<反应级<4.0<分析级，藻红蛋白的纯度越高，价格越高。目前人们主要采用硫酸按分级沉淀、羟基磷灰石柱层析、凝胶过滤层析等相结合的方法制备藻红蛋白，现有的制备工艺流程存在操作复杂，生产成本高，产品质量不稳定，且难以实现工业化的大规模的生产。
发明内容
本发明就是针对上述问题，提供一种操作简便、成本低廉且易于大规模制备高纯度藻红蛋白的方法。
为解决上述技术问题，本发明采用的制备方案为
（1) 离心收集新鲜培养的紫球藻，将藻泥与磷酸盐缓冲液按1:5～1:10比例混合，得细胞悬液；
（2) 将细胞悬液在0～4˚C条件下进行超声波处理，得到破壁液；将破壁液冷冻离心，收集上清液；
（3) 室温下将上清液超滤，得到藻红蛋白粗提液；
(4) 向所得的藻红蛋白粗提液加入用磷酸盐缓冲液预处理的强阴离子层析介质，充分混匀，冷冻离心，取沉淀；接着向沉淀中加入2倍体积含有0.1mol/LNaCl的磷酸盐缓冲液，充分混匀，冷冻离心，取上清，得到纯化的藻红蛋白。
以上步骤所用的磷酸盐缓冲液pH为6.5～7.0，浓度为0.01～0.02mol/L。
步骤（2)中所述的破碎条件为输出功率为300～500W，破碎4～6s、间歇4～6s，破碎时间为5～8min。
步骤(3)中所述的将上清液用分子截留量为50～60kD的膜包超滤，超滤4～6次。
步骤(4)中所述的强阴离子交换介质为source15Q或source30Q。
本发明的有益效果:
本发明采用的离心技术结合阴离子层析介质制备藻红蛋白的方法，与传统技术相比省去了柱层析的步骤，操作方法简便易行，成本低廉，纯度高，回收率高，并且经过了实验室放大设备的验证。本发明采用了超声破碎、超滤以及加入层析介质离心的方法，得到的藻红蛋白纯度A 545/A 280>4.0，为藻红蛋白应用于生物医学分析和免疫化学等领域奠定了基础。
附图说明
图1为本发明实施例提供的纯化后藻红蛋白的全波长扫描图；
图2为本发明实施例提供的纯化后藻红蛋白的SDS-PAGE电泳图（泳道1，标准蛋白；泳道2, 纯化的藻红蛋白）。
具体实施方式
实施例1
（1) 离心收集新鲜培养的紫球藻5g，将藻泥与磷酸盐缓冲液(pH 6.8，0.02mol/L)按1:6比例混合，得细胞悬液；
（2) 将细胞悬液在0～4˚C条件下在进行超声处理，输出功率为500W，破碎4s、间歇4s，破碎时间为6min；得到破壁液；将破壁液冷冻离心，收集上清液；
（3) 室温下将上清液经分子截留量为50kD膜包超滤，超滤5次，收集滤液，得藻红蛋白粗提液；
(4) 向所得藻红蛋白粗提液加入用磷酸盐缓冲液(pH 6.8，0.02mol/L)预处理的层析介质Source15Q（0.2g），充分混匀，冷冻离心，取沉淀；接着向沉淀中加入2倍体积含有0.1mo/LNaCl的磷酸盐缓冲液，充分混匀，冷冻离心，取上清，得到纯化的藻红蛋白（见图1和图2）。
从图2可以看出，纯化的藻红蛋白在可见光区545nm和565nm处有2个吸收峰，在498nm处有1个吸收肩峰。藻红蛋白纯度（A 545/A 280）>4.0；用536nm荧光激发，发射峰位于578nm；纯化后的藻红蛋白的SDS-PAGE电泳图谱见图2，在分子量为30kD处的条带为γ亚基，在分子量为19kD处的条带为α和β亚基，由于这两种亚基的分子量接近，所以在图谱中出现了重叠现象，该结果与相关文献的报道一致。
实施例2
（1) 离心收集新鲜培养的紫球藻50g，将藻泥与磷酸盐缓冲液(pH 6.8，0.01mol/L)按1:8比例混合，得细胞悬液；
（2) 将细胞悬液在0～4˚C条件下进行超声处理，输出功率为500W，破碎3s、间歇3s，破碎时间为8min，得到破壁液；将破壁液低温离心，收集上清液；
（3) 室温下将上清液经分子截留量为60kD膜包超滤，超滤4次，收集滤液，得藻红蛋白粗提液；
(4) 向所得藻红蛋白粗提液加入用磷酸盐缓冲液(pH 6.8，0.01mol/L)预处理的层析介质Source15Q（2g），充分混匀，冷冻离心，取沉淀；接着向沉淀中加入2倍体积含有0.1 mol/L NaCl的磷酸盐缓冲液（pH 6.8，0.01mol/L），充分混匀，冷冻离心，取上清，得到纯化的藻红蛋白，制备的藻红蛋白纯度（A 545/A 280）>4.0，回收率为42.6%。

Claims (5)

1.一种离心法结合阴离子交换层析介质制备藻红蛋白的方法，其特征在于所述制备方法包括如下步骤:
（1) 离心收集新鲜培养的紫球藻，将藻泥与磷酸盐缓冲液按1:5～1:10比例混合，得细胞悬液；
（2) 将步骤(1)所得细胞悬液在0～4˚C条件下进行超声波处理，得到破壁液；将破壁液冷冻离心, 收集上清液；
（3) 室温下将步骤(3)所得上清液超滤后得到藻红蛋白粗提液，然后向藻红蛋白粗提液中加入20%饱和度硫酸铵；
(4) 向步骤(4)所得的藻蓝蛋白粗提液加入用磷酸盐缓冲液预处理的强阴离子层析介质，充分混匀，冷冻离心，取沉淀；接着向沉淀中加入2倍体积含有0.1mol/LNaCl的磷酸盐缓冲液，充分混匀，冷冻离心，取上清，得到纯化的藻红蛋白。
2.根据权利要求1所述的藻红蛋白制备方法，其特征在于所用的磷酸盐缓冲液pH为6.5～7.0，浓度为0.01～0.02mol/L。
3.根据权利要求1所述的藻红蛋白制备方法,其特征在于，步骤（2)中破碎条件为破碎4～6s、间歇4～6s,输出功率为300～500W，破碎时间为5～8min。
4.根据权利要求1所述的藻红蛋白制备方法，其特征在于，步骤(3)中将上清液用分子截留量为50～60kD的膜包超滤，超滤次数为4～6次。
5.根据权利要求1所述的藻红蛋白制备方法，其特征在于，步骤(4)中强阴离子交换介质为source15Q或source30Q。
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