CN101591441A - 一种透明质酸与琼脂糖凝胶连接的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于有机化学合成领域，涉及一种透明质酸与琼脂糖凝胶连接的方法，其步骤为：透明质酸与己二酸二酰肼合成透明质酸－己二酸二酰肼衍生物，用高碘酸钠对琼脂糖凝胶Sepharose 4B进行活化，得到含有醛基的琼脂糖凝胶，将透明质酸－己二酸二酰肼与含有醛基的琼脂糖凝胶Sepharose 4B用硼氢化钠还原，得到透明质酸与琼脂糖凝胶Sepharose 4B连接物。本发明反应条件温和，步骤简单，成本低廉。
Description
技术领域
本发明涉及一种透明质酸与琼脂糖凝胶Sepharose 4B连接的方法，属于有机化学合成领域。
背景技术
透明质酸广泛存在于人和动物的结缔组织中。各种测定方法的不断涌现，使透明质酸含量测定达到精确的程度，清楚地反映出类风湿性关节炎、肝病、某些肿瘤和硬皮病患者样品内透明质酸均明显增高，尤其透明质酸测定在肝硬化诊断上优于所有常规肝功试验，肝硬化患者血清中透明质酸较正常人升高10-100倍。国内有人报导在慢性肝病、肝硬化中，透明质酸增高幅度大于III型前胶原肽和板层素(Lamp1)，在慢性活动性肝炎组中透明质酸增高大于III型前胶原肽，在迁延性肝炎中则与对照组无差别。因此，透明质酸测定是一项极有价值的肝病诊断指标。
在人或动物体内，存在多种可与透明质酸特异性结合的蛋白质，主要分布在基质和细胞膜上，统称为透明质酸结合蛋白。透明质酸结合蛋白可以用来测定人体内透明质酸的含量，主要原理是：其反应体系是先将样品和透明质酸结合蛋白(限量)结合，再加入125I标记的透明质酸，竞争剩余透明质酸结合蛋白，再加入第一抗体，即抗透明质酸结合蛋白，最后加入相应第二抗体，以使复合物沉淀，测定沉淀放射性计数。透明质酸结合蛋白分布广泛，利用其与透明质酸的结合特性，可以将其从大量蛋白中分离，再进行凝胶电泳，即可得到纯化的透明质酸结合蛋白；也可以利用透明质酸-琼脂糖凝胶进行一次性反应。后者所需要的透明质酸-琼脂糖凝胶需要将透明质酸连接到琼脂糖凝胶上，反应比较复杂，一般的方法效果不佳。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可以将透明质酸与琼脂糖凝胶Sepharose 4B连接的方法，步骤简单，成本较低。
本发明的原理是：透明质酸分子上含有羧基，可以与己二酸二酰肼的酰肼基进行反应，反应后还可以保留一个酰肼基，这个酰肼基可以与活化后的琼脂糖凝胶分子上的醛基反应，相当于将透明质酸通过己二酸二酰肼连接到琼脂糖凝胶上。
本发明通过以下技术方案得以实现：透明质酸与己二酸二酰肼反应，合成透明质酸-己二酸二酰肼衍生物；使用高碘酸钠对琼脂糖凝胶Sepharose 4B进行活化，得到含有醛基的琼脂糖凝胶；将透明质酸-己二酸二酰肼衍生物与含有醛基的琼脂糖凝胶Sepharose 4B进行反应，最后用硼氢化钠还原，得到透明质酸与琼脂糖凝胶Sepharose 4B连接物。其具体步骤为：
1、透明质酸-己二酸二酰肼衍生物的制备：将透明质酸溶于双蒸水中，加入10倍透明质酸质量的己二酸二酰肼，搅拌，用0.1M的HCl调节pH值4.0-5.5，加入5倍透明质酸质量的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)，用0.1M的HCl调节pH值，使之维持在4.0-5.5，反应2小时后，用1M的NaOH调节pH值至7.0。将反应后产物用双蒸水透析，透析4次，每次1升双蒸水透析18小时，透析后冷冻干燥。
2、含有醛基的琼脂糖凝胶Sepharose 4B的制备：将琼脂糖凝胶Sepharose 4B用蒸馏水洗净，加入1/5琼脂糖凝胶Sepharose 4B体积的新配制的0.2M的NaIO4，室温搅拌反应5小时，反应后的凝胶用蒸馏水洗净。
3、透明质酸与琼脂糖凝胶Sepharose 4B连接物的制备：将冷冻干燥后的透明质酸-己二酸二酰肼衍生物加入双蒸水中溶解，溶解后倒入5倍体积的含有醛基的琼脂糖凝胶Sepharose 4B中，室温搅拌12-16个小时，按1毫克/毫升琼脂糖凝胶Sepharose 4B体积慢慢加入硼氢化钠粉末，继续搅拌2小时后，用双蒸水洗净。
本方法所获得的产物与琼脂糖凝胶Sepharose 4B外观一致，为有弹性的半透明凝胶微球，可以用于提取透明质酸结合蛋白。
本发明的有益效果是反应条件温和，步骤简单，成本低廉。
具体实施方式
结合具体实施例说明本发明。
实施例一：
1、透明质酸-己二酸二酰肼衍生物的制备：称取100毫克透明质酸，溶于50毫升双蒸水中，加入1克己二酸二酰肼，搅拌，用0.1M的HCl调节pH值5.0，加入0.5克EDC，用0.1M的HCl调节pH值，使之维持在5。反应2小时后，用1M的NaOH调节pH值至7.0。将反应后产物用双蒸水透析，透析4次，每次1升双蒸水透析18小时，透析后冷冻干燥。
2、含有醛基的琼脂糖凝胶Sepharose 4B的制备：量取50毫升琼脂糖凝胶Sepharose 4B，用蒸馏水洗净，加入10毫升新配制的0.2M的NaIO4，室温搅拌反应5小时，反应后的凝胶用蒸馏水洗净。
3、透明质酸与琼脂糖凝胶Sepharose 4B连接衍生物的制备：称取20毫克冷冻干燥后的透明质酸-己二酸二酰肼衍生物，加入10毫升双蒸水中，溶解后倒入含有醛基的琼脂糖凝胶Sepharose 4B 50毫升中，室温搅拌12小时，慢慢加入50毫克硼氢化钠粉末，继续搅拌2小时后，用双蒸水洗净。
实施例二：
1、透明质酸-己二酸二酰肼衍生物的制备：称取1g透明质酸，溶于500毫升双蒸水中，加入10克己二酸二酰肼，搅拌，用0.1M的HCl调节pH值5.0，加入5克EDC，用0.1M的HCl调节pH值，使之维持在5。反应2小时后，用1M的NaOH调节pH值至7.0。将反应后产物用双蒸水透析，透析4次，每次1升双蒸水透析18小时，透析后冷冻干燥。
2、含有醛基的琼脂糖凝胶Sepharose 4B的制备：量取500毫升琼脂糖凝胶Sepharose 4B，用蒸馏水洗净，加入100毫升新配制的0.2M的NaIO4，室温搅拌反应5小时，反应后的凝胶用蒸馏水洗净。
3、透明质酸与琼脂糖凝胶Sepharose 4B连接物的制备：称取200毫克冷冻干燥后的透明质酸-己二酸二酰肼衍生物，加入100毫升双蒸水中，溶解后倒入含有醛基的琼脂糖凝胶Sepharose 4B 500毫升中，室温搅拌16小时，慢慢加入500毫克硼氢化钠粉末，继续搅拌2小时后，用双蒸水洗净。
Claims (5)
1、一种透明质酸与琼脂糖凝胶Sepharose 4B连接的方法，其特征在于包含以下步骤：
A：透明质酸与己二酸二酰肼合成透明质酸-己二酸二酰肼衍生物；
B：用高碘酸钠对琼脂糖凝胶Sepharose 4B进行活化，得到含有醛基的琼脂糖凝胶Sepharose 4B；
C：将透明质酸-己二酸二酰肼与含有醛基的琼脂糖凝胶Sepharose 4B进行反应，用硼氢化钠还原，得到透明质酸与琼脂糖凝胶Sepharose 4B连接物。
2、根据权利要求1所述的方法，其特征在于透明质酸-己二酸二酰肼衍生物的制备过称是：将透明质酸溶于双蒸水中，加入10倍透明质酸质量的己二酸二酰肼，搅拌，用0.1M的HCl调节pH值4.0-5.5，加入5倍透明质酸质量的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，用0.1M的HCl调节pH值，使之维持在4.0-5.5，反应2小时，用1M的NaOH调节pH值至7.0，将反应后产物用双蒸水透析，透析后冷冻干燥。
3、根据权利要求1所述的方法，其特征是含有醛基的琼脂糖凝胶Sepharose 4B的制备过称是：将琼脂糖凝胶Sepharose 4B用蒸馏水洗净，加入1/5琼脂糖凝胶Sepharose 4B体积的新配制的0.2M的NaIO4，室温搅拌反应5小时，反应后的凝胶用蒸馏水洗净。
4、根据权利要求1所述的方法，其特征是透明质酸与琼脂糖凝胶Sepharose 4B连接物的制备：将冷冻干燥后的透明质酸-己二酸二酰肼衍生物加入双蒸水中溶解，溶解后倒入5倍体积的含有醛基的琼脂糖凝胶Sepharose 4B中，室温搅拌12-16个小时，按1毫克/毫升琼脂糖凝胶Sepharose 4B体积慢慢加入硼氢化钠粉末，继续搅拌2小时后，用双蒸水洗净。
5、根据权利要求2所述的方法，其特征在于双蒸水透析过程为透析4次，每次1升双蒸水透析18小时。
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| GR01 | Patent grant | ||
| EE01 | Entry into force of recordation of patent licensing contract |
Assignee: Tianjin Xiehe Medical Technology Co., Ltd. Assignor: Union Biotechnologies (Tianjin) Ltd. Contract record no.: 2011120000005 Denomination of invention: Method for connecting hyaluronic acid and sepharose Granted publication date: 20101208 License type: Exclusive License Open date: 20091202 Record date: 20110126 |
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| ASS | Succession or assignment of patent right |
Owner name: TIANJIN UNION MEDICAL TECHNOLOGY GROUP CO., LTD. Free format text: FORMER OWNER: UNION BIOTECHNOLOGIES (TIANJIN) LTD. Effective date: 20110923 |
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| C41 | Transfer of patent application or patent right or utility model | ||
| COR | Change of bibliographic data |
Free format text: CORRECT: ADDRESS; FROM: 300457 HANGU, TIANJIN TO: 300192 NANKAI, TIANJIN |
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| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20110923 Address after: 300192, 238 Bai Causeway Road, Tianjin, Nankai District Patentee after: Tianjin Xiehe Medical Technology Group Co., Ltd. Address before: C area 7 floor Tower Road 300457 Tianjin City Development Zone No. 12 business center Patentee before: Union Biotechnologies (Tianjin) Ltd. |
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| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right |
Denomination of invention: Method for connecting hyaluronic acid and sepharose Effective date of registration: 20120528 Granted publication date: 20101208 Pledgee: Pudong Shanghai Development Bank Limited by Share Ltd Tianjin branch Pledgor: Tianjin Xiehe Medical Technology Group Co., Ltd. Registration number: 2012990000239 |
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| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20101208 Termination date: 20180223 |