CN105777522B - 一种从贯叶连翘中提取金丝桃素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种从贯叶连翘中提取金丝桃素的方法，所述方法包括依次采用酶处理、超声辅助溶剂提取、大孔吸附树脂分离提纯等步骤，通过工艺条件的优化而高效提取得到了金丝桃素，提高了提取物中金丝桃素的含量。该提取工艺原料易得，操作简单，提取成本低廉，生产成本可控，具有广泛的工业化应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种植物活性成分的提取，特别地涉及一种从贯叶连翘中提取金丝桃素药用活性成分的提取方法，属于药物活性成分的提取技术领域。
背景技术
贯叶连翘中含有多种生物活性物质，可检测到的活性化合物的种类主要分为：萘骈二蒽醌类(Naphtodianthrones)、黄酮类(Flavonoides)、间苯三酚类(Phloroglucinols)、原花青素(Procyanidins)、单宁类(Tannins)等。
其中，萘骈二蒽醌类(Naphtodianthrones)是该类植物的代表性化学成分，其包括：金丝桃素(Hypericin)、伪金丝桃素(Pseudohypericin)、原金丝桃素(Protohypercin)、原伪金丝桃素(Protopseudohypericin)和环伪金丝桃素(Cyclopseudohypericin)。
经过大量的研究发现，金丝桃素和伪金丝桃素对单纯疱疹病毒-1和-2、人类免疫缺陷病毒、流感病毒等有一定的抑制和杀灭活性。金丝桃素对集体的免疫系统也有一定的调节作用，在临床医学中对于自身免疫疾病(如器官排斥反应)的治疗有巨大的潜在应用价值。目前，国际市场对于金丝桃素提取物的需要日益增加。
贯叶连翘中金丝桃素的含量长期以来被作为贯叶连翘提取物的质控指标，国际市场普遍要求金丝桃素的质量含量不低于0.3%。
经过大量的深入研究，目前已经开发出了多种提取贯叶连翘活性成分的方法，例如：
CN1247071A公开了利用NaOH溶液浸提贯叶连翘原药，该方法所得成品中金丝桃素的含量为0.6%。
CN1385412A中利用KOH和/或NaHCO3溶液浸提两次，得到金丝桃素提取物。
CN1436562A和CN1689596A分别公开了利用柱色谱分离提纯金丝桃素，该方法虽然得到了金丝桃素的含量为0.6%的提取物，但其收率仅为2.7%，换算可知，金丝桃素的提取率仅仅为0.0162%。
CN1850766A得到金丝桃素浓缩液后，利用大孔吸附树脂分离提纯金丝桃素，所得浸膏中金丝桃素含量为0.9%，其收率只有万分之2-5，提取率更低。
因此，针对现有金丝桃素提取工艺状况，有必要研究一种能够从贯叶连翘中更高效提取和分离金丝桃素的生产方法，这也是当前该领域内的研究热点和重点之一。
发明内容
针对现有技术存在的诸多缺陷，本发明人经过大量的深入研究，在付出了充分的创造性劳动后，从而研发了一种从贯叶连翘中高效提取和分离提纯金丝桃素的方法，进而完成了本发明。
具体而言，本发明涉及一种从贯叶连翘中提取金丝桃素的方法，所述方法包括如下步骤：
步骤(1)：处理原料
取贯叶连翘部位，清洗，避光干燥，粉碎，过100-200目筛，得到贯叶连翘粉末。
在本发明的所述方法中，所述贯叶连翘部位为贯叶连翘的花、叶、果实或各部位的混合物，优选贯叶连翘的花或叶或幼果或它们任意几种的混合物。
步骤(2)：酶处理
在惰性气体氛围下，向水中加入贯叶连翘粉末和生物酶，其中贯叶连翘粉末与水的质量比为1:5-30，生物酶与贯叶连翘粉的质量比为0.1-10:100，从而配制得到贯叶连翘酶溶液；然后调节所述酶溶液的pH为3.0-7.0，调节后放入恒温摇床中，摇床转速为100-120rpm，在25-75℃下进行保温酶解60-180 min，最后温度升高至85-100℃，搅拌10-20 min，使酶灭活，得到酶解液。
在本发明的所述方法中，所述步骤(2)中的惰性气体例如可为氮气。
在本发明的所述方法中，所述步骤(2)中的生物酶为纤维素酶、果胶酶、半纤维素酶、蛋白酶、淀粉酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶或上述酶中任何几种的混合物，优选纤维素酶、果胶酶、木聚糖酶或其混合物，最优选纤维素酶和果胶酶的混合物，两者的质量比优选为1:1-10，优选1:3-8，更优选1:6-8。
在本发明的所述方法中，所述步骤(2)中贯叶连翘粉末与水的质量比优选1:8-20，更优选1:10-15，最优选1:12。
在本发明的所述方法中，所述步骤(2)中生物酶(以下有时也称为“酶”)与贯叶连翘粉末的质量比优选为0.5-10:100；随着反应体系中酶用量的增加，酶与底物接触机会增加，但当酶用量达到一定比例后，再增加酶的用量，金丝桃素的提取率增加不明显，从节约成本、提高提取率的角度考虑，酶与贯叶连翘的质量比更优选为3-6:100。
在本发明的所述方法中，为了保证生物酶的活力，所述步骤(2)中pH优选为4.5-6.0，最优选为5.0。反应液的pH过高或过低，都会影响酶的稳定性，从而使酶催化遭受不可逆破坏。
在本发明的所述方法中，所述步骤(2)中的酶解保温温度优选35-65℃，酶解温度过高或过低均会使酶的活力降低，从而导致酶解效率降低，本发明中的酶解温度更优选45-65℃，最优选55℃。
在本发明的所述方法中，所述步骤(2)中酶解时间优选60-120 min。酶解反应时间与酶解进行程度密切相关，酶解时间太短，酶解不充分，但当反应进行到一定程度以后，延长酶促反应时间并不能显著增加提取率，综合考虑，酶解时间更优选60-90 min。
在本发明的所述方法中，所述pH的调节可利用无机酸或者无机碱来进行，例如无机酸可选自盐酸、硫酸、硝酸或磷酸，无机碱可选自氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠、碳酸钾、碳酸氢钠或碳酸氢钾。
步骤(3)：超声提取和纯化
抽滤酶解液，得到滤渣，将该滤渣在30-40℃下真空干燥20 min后，与有机溶剂按照质量体积比(g/mL)为1:10-50进行混合，然后在一定温度和功率下，超声提取30-90 min，得到提取液；浓缩提取液，过吸附树脂柱，用醇水溶液洗脱，收集洗脱液；减压蒸馏洗脱液，得到金丝桃素提取物。
在本发明的所述方法中，所述步骤(3)中的有机溶剂选自C1-C4一元醇、C2-C4二元醇、C1-C4一元醇的水溶液、C1-C4一元醇的丙酮溶液或者C1-C4一元醇的氯仿溶液。其中，更优选选自体积分数为50%-90%的乙醇水溶液、体积分数为10%-50%的甲醇丙酮溶液或体积分数为10%-50%的乙醇丙酮溶液，最优优选体积分数为10-30%的乙醇丙酮溶液。
在本发明的所述方法中，所述步骤(3)中所述滤渣与有机溶剂质量体积比(g/mL)为1:10-50，即以克(g)计的所述滤渣与以毫升(mL)计的所述有机溶剂的比为1:10-50，也即每1克(g)滤渣使用10-50毫升(mL)有机溶剂，优选为1:10-30，最优选1:20。
在本发明的所述方法中，所述步骤(3)中超声提取温度为25-60℃，优选未35-55℃，最优选为45℃；所述超声功率为120-240 W，优选为160-200 W，最优选为160-180 W；超声时间为30-90 min，优选为40-60 min，最优选为45-60 min。
在本发明的所述方法中，该超声提取过程可进行1-2次，当进行两次时，将两次所得的提取液进行合并，并进行后续的浓缩等后续处理过程。
在本发明的所述方法中，所述步骤(3)的有机溶剂中还优选加入无机碱或有机碱，所述无机碱或有机碱可以其水溶液的形式进行加入。所述无机碱选自氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠、碳酸氢钠或NH4OH，优选氢氧化钠或氢氧化钾；所述有机碱选自三乙胺。所述无机碱或有机碱的用量相对于有机溶剂的质量体积比(g/mL)为0.001-0.01:1，即以克(g)计的所述有机碱或无机碱与以毫升(mL)计的所述有机溶剂的比为0.001-0.01:1，也即每1毫升(mL)有机溶剂加入0.001-0.01克(g)的有机碱或无机碱，优选0.001-0.05:1，最优选0.002-0.003:1。
在本发明的所述方法中，所述步骤(3)的有机溶剂在加入有机碱或无机碱后，最优选进一步加入浓度为0.01-0.2 M的三聚磷酸钠水溶液，所述三聚磷酸钠水溶液浓度优选为0.05-0.1 M，最优选为0.08 M。
所述三聚磷酸钠水溶液与有机溶剂的体积比为0.005-0.1:1，优选为0.01-0.1:1，最优选为0.05:1。
在本发明的所述方法中，所述步骤(3)中的吸附树脂选自HZ8160、HZ818、HZ841、AB-8、HPD-100、HPD-600或D101，优选HZ8160、HZ841、HPD-100、AB-8或D101，最优选HZ841或D101。
在本发明的所述方法中，所述步骤(3)中进行洗脱的醇水溶液优选为乙醇水溶液，更优选利用该乙醇水溶液进行梯度洗脱，即依次用等体积的体积分数为25%、35%、45%、55%、60%、65%、75%、80%、85%、95%的乙醇水溶液进行梯度洗脱，收集体积分数为55%-80%的乙醇水溶液洗脱部分。
可利用高效液相色谱法(HPLC)检测提取物中金丝桃素含量。
如上所述，本发明提供了一种从贯叶连翘中提取金丝桃素的方法，与现有技术相比，本发明所述方法取得了多种有益效果，例如：
1、利用生物酶所具有的高效性、专一性、以及温和性等特点，省去了传统有机溶剂直接提取法必须预处理除去贯叶连翘中绿色素、多酚鞣质等干扰物质这一过程，节约了生产工序，所的产品长期暴露空气中不会发粘结块。
2、超声波辅助溶剂提取，进一步提高了金丝桃素的溶出率，大大缩短了溶剂提取时间，调节超声操作条件，在提高金丝桃素提取率的同时，有效避免了金丝桃素的分解。
3、利用大孔吸附树脂特有的性能，高度富集活性成分，极大地提高了提取物中金丝桃素的含量。
4、本发明原料易得，提取工艺简单，所得产品含量高，综合成本可控，适合于工业化生产。
具体实施方式
下面通过具体的实施例对本发明进行详细说明，但这些例举性实施方式的用途和目的仅用来例举本发明，并非对本发明的实际保护范围构成任何形式的任何限定，更非将本发明的保护范围局限于此。
实施例1：生物酶的种类和用量筛选
步骤(1)：处理原料
取贯叶连翘的花和叶清洗后，置于鼓风干燥箱中，在温度35℃下进行干燥至水分质量含量小于10%，然后高速剪切粉碎，过筛，收集粒度为100-200目的部分，得到贯叶连翘粉末。
步骤(2)：酶处理
在惰性气体如氮气氛围下，向水中加入贯叶连翘粉末和生物酶，其中贯叶连翘粉末为100 g，贯叶连翘粉末与水的质量比为1:12，所加入酶的种类与用量见下表1和表2，从而配制得到贯叶连翘酶溶液；然后调节所述酶溶液的pH调节至5.0，调节完毕后放入恒温摇床中，摇床转速为110 rpm，在30℃下进行保温酶解60 min；最后将温度升高至100℃，搅拌15 min，使酶灭活，得到酶解液。
步骤(3)：超声提取和纯化
抽滤上述酶解液，得到滤渣，将该滤渣在30℃下真空干燥20 min后，与乙醇按照质量体积比(g/mL)为1:10进行混合，然后在温度为45℃和超声功率为160 W的条件下，超声提取45 min，得到提取液；将提取液浓缩至原体积的1/5，过填装有AB-8大孔吸附树脂的吸附柱，依次利用等体积的体积分数为25%、35%、45%、55%、60%、65%、75%、80%、85%、95%的乙醇水溶液梯度洗脱，收集体积分数为55%-80%的乙醇洗脱部分，得到洗脱液，减压蒸馏洗脱液，得金丝桃素提取物，用HPLC测定金丝桃素含量。
其中，酶解过程中所用生物酶的种类、酶的用量(与贯叶连翘粉末的质量比)对金丝桃素提取率的影响如表1和2所示：(其中，提取率 = 所得提取物中金丝桃素质量/贯叶连翘粉末质量×1000‰，下同)。
表1 不同种类的酶对金丝桃素提取率的影响
| 生物酶 | 酶用量/wt% | 提取率/‰ |
| 纤维素酶 | 1% | 0.59 |
| 果胶酶 | 1% | 0.62 |
| 半纤维素酶 | 1% | 0.31 |
| 蛋白酶 | 1% | 0.40 |
| 淀粉酶 | 1% | 0.29 |
| 木聚糖酶 | 1% | 0.56 |
| β-葡聚糖酶 | 1% | 0.54 |
| 纤维素酶与果胶酶质量比1:1 | 1% | 0.50 |
| 纤维素酶与果胶酶质量比1:2 | 1% | 0.51 |
| 纤维素酶与果胶酶质量比1:3 | 1% | 0.53 |
| 纤维素酶与果胶酶质量比1:4 | 1% | 0.57 |
| 纤维素酶与果胶酶质量比1:5 | 1% | 0.59 |
| 纤维素酶与果胶酶质量比1:6 | 1% | 0.61 |
| 纤维素酶与果胶酶质量比1:7 | 1% | 0.67 |
| 纤维素酶与果胶酶质量比1:8 | 1% | 0.62 |
| 纤维素酶与果胶酶质量比1:10 | 1% | 0.59 |
| 纤维素酶与果胶酶质量比1:12 | 1% | 0.53 |
表2 不同酶用量对金丝桃素提取率的影响
实施例2：酶解过程pH和温度的筛选
步骤(1)：处理原料
取贯叶连翘的花和叶清洗后，置于鼓风干燥箱中，在温度35℃下进行干燥至水分质量含量小于10%，然后高速剪切粉碎，过筛，收集粒度为100-200目的部分，得到贯叶连翘粉末。
步骤(2)：酶处理
在惰性气体如氮气氛围下，向水中加入贯叶连翘粉末和复合酶，其中贯叶连翘粉末为100 g，贯叶连翘粉末与水的质量比为1:12，所述复合酶为纤维素酶与果胶酶的混合物，其中纤维素酶与果胶酶的质量比为1:7，所述复合酶的质量之和与贯叶连翘粉末的质量比为4:100，从而配制得到贯叶连翘酶解液；然后调节所述酶解液的pH，调节完毕后放入恒温摇床中，摇床转速为110 rpm，在一定温度下进行保温酶解60 min；最后将温度升高至100℃，搅拌15 min，使酶灭活，得到酶解液。
步骤(3)：超声提取和纯化
抽滤上述酶解液，得到滤渣，将该滤渣在35℃下真空干燥20 min后，与乙醇按照质量体积比(g/mL)为1:10进行混合，然后在温度为45℃和超声功率为170 W的条件下，超声提取50 min，得到提取液；将提取液浓缩至原体积的1/5，过填装有AB-8大孔吸附树脂的吸附柱，依次利用等体积的体积分数为25%、35%、45%、55%、60%、65%、75%、80%、85%、95%的乙醇水溶液梯度洗脱，收集体积分数为55%-80%的乙醇洗脱部分，得到洗脱液，减压蒸馏洗脱液，得金丝桃素提取物，用HPLC测定金丝桃素含量。
其中，步骤(2)酶处理过程中的酶解液pH、保温酶解温度对金丝桃素提取率的影响如表3-4所示：
表3 不同pH对金丝桃素提取率的影响(在25℃下)
表4 不同温度对金丝桃素提取率的影响(pH=5.0)
实施例3：超声提取溶剂的种类、料液比以及碱用量的考察
步骤(1)：处理原料
取贯叶连翘的花和叶清洗后，置于鼓风干燥箱中，在温度35℃下进行干燥至水分质量含量小于10%，然后高速剪切粉碎，过筛，收集粒度为100-200目的部分，得到贯叶连翘粉末。
步骤(2)：酶处理
在惰性气体如氮气氛围下，向水中加入贯叶连翘粉末和复合酶，其中贯叶连翘粉末为100 g，贯叶连翘粉末与水的质量比为1:12，所述复合酶为纤维素酶与果胶酶的混合物，其中纤维素酶与果胶酶的质量比为1:7，所述复合酶的质量之和与贯叶连翘粉末的质量比为4:100，从而配制得到贯叶连翘酶解液；然后调节所述酶解液的pH至5.0，调节完毕后放入恒温摇床中，摇床转速为110 rpm，在55℃下进行保温酶解60 min；最后将温度升高至100℃，搅拌15 min，使酶灭活，得到酶解液。
步骤(3)：超声提取和纯化
抽滤上述酶解液，得到滤渣，将该滤渣在40℃下真空干燥20 min后，与有机溶剂进行混合，任选在碱存在下或在碱和三聚磷酸水溶液共同存在下进行超声提取50 min，其中超声功率为180 W、超声温度为50℃，得到提取液；将提取液浓缩至原体积的1/5，过填装有AB-8大孔吸附树脂的吸附柱，依次利用等体积的体积分数为25%、35%、45%、55%、60%、65%、75%、80%、85%、95%的乙醇水溶液梯度洗脱，收集体积分数为55%-80%的乙醇洗脱部分，得到洗脱液，减压蒸馏洗脱液，得金丝桃素提取物，用HPLC测定金丝桃素含量。
其中，所述碱的用量是与有机溶剂的质量体积比(g/mL)而言；所述三聚磷酸钠水溶液的用量是与有机溶剂的体积比而言。
在步骤(3)中，超声提取有机溶剂的种类、料液比(即步骤(3)中的干燥后滤渣与有机溶剂的质量体积比(g/mL))、碱种类和用量对金丝桃素提取率的影响如表6-9所示(其中的v/v含义是体积比)，碱是以水溶液的形式进行加入：
表6 不同有机溶剂对金丝桃素提取率的影响(未加入碱和三聚磷酸水溶液)
表7 料液比对金丝桃素提取率的影响(未加入碱和三聚磷酸水溶液)
表8 碱的种类及用量对金丝桃素提取率的影响(只加入碱)
“--”表示未加入碱。
表9 三聚磷酸水溶液对金丝桃素提取率的影响
实施例4：提纯过程中树脂种类的筛选
步骤(1)：处理原料
取贯叶连翘的花和叶清洗后，置于鼓风干燥箱中，在温度35℃下进行干燥至水分质量含量小于10%，然后高速剪切粉碎，过筛，收集粒度为100-200目的部分，得到贯叶连翘粉末。
步骤(2)：酶处理
在惰性气体如氮气氛围下，向水中加入贯叶连翘粉末和复合酶，其中贯叶连翘粉末为100 g，贯叶连翘粉末与水的质量比为1:12，所述复合酶为纤维素酶与果胶酶的混合物，其中纤维素酶与果胶酶的质量比为1:7，所述复合酶的质量之和与贯叶连翘粉末的质量比为4:100，从而配制得到贯叶连翘酶解液；然后调节所述酶解液的pH至5.0，调节完毕后放入恒温摇床中，摇床转速为110 rpm，在55℃下进行保温酶解60 min；最后将温度升高至100℃，搅拌15 min，使酶灭活，得到酶解液。
步骤(3)：超声提取和纯化
抽滤上述酶解液，得到滤渣，将该滤渣在35℃下真空干燥20 min后，与有机溶剂进行混合，其中所述有机溶剂为体积分数20%的乙醇丙酮溶液，加入NaOH水溶液，其中NaOH与有机溶剂的质量体积比为0.002 g/mL，然后加入0.08 M三聚磷酸钠水溶液，其中三聚磷酸钠水溶液与有机溶剂的体积比为0.05:1。在超声功率为160 W、超声温度为45℃下进行超声提取45 min，得到提取液；将提取液浓缩至原体积的1/5，过填装有吸附树脂的吸附柱，依次利用等体积的体积分数为25%、35%、45%、55%、60%、65%、75%、80%、85%、95%的乙醇水溶液梯度洗脱，收集体积分数为55%-80%的乙醇洗脱部分，得到洗脱液，减压蒸馏洗脱液，得金丝桃素提取物，用HPLC测定金丝桃素含量。
其中，步骤(3)中吸附树脂的种类对金丝桃素提取率的影响如表10所示：
表10 不同吸附树脂对金丝桃素提取率的影响
| 大孔树脂型号 | 提取率/‰ |
| HZ8160 | 2.93 |
| HZ818 | 2.51 |
| HZ841 | 3.79 |
| HPD-100 | 3.26 |
| HPD-600 | 3.02 |
| D101 | 3.72 |
应当理解，这些实施例的用途仅用于说明本发明而非意欲限制本发明的保护范围。此外，也应理解，在阅读了本发明的技术内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动、修改和/或变型，所有的这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种从贯叶连翘中提取金丝桃素的方法，所述包括以下步骤：
步骤(1)：处理原料
取贯叶连翘部位，清洗，避光干燥，粉碎，过100-200目筛，得到贯叶连翘粉末；
步骤(2)：酶处理
在惰性气体氛围下，向水中加入贯叶连翘粉末和生物酶，其中贯叶连翘粉末与水的质量比为1:5-30，生物酶与贯叶连翘粉的质量比为0.1-10:100，从而配制得到贯叶连翘酶溶液；然后调节所述酶溶液的pH为3.0-7.0，调节后放入恒温摇床中，摇床转速为100-120rpm，在25-75℃下进行保温酶解60-180min，最后温度升高至85-100℃，搅拌10-20min，使酶灭活，得到酶解液；
步骤(3)：超声提取和纯化
抽滤酶解液，得到滤渣，将该滤渣在30-40℃下真空干燥20min后，与有机溶剂按照g/mL的质量体积比为1:10-50进行混合，然后在一定温度和功率下，超声提取30-90min，得到提取液；浓缩提取液，过吸附树脂柱，用醇水溶液洗脱，收集洗脱液；减压蒸馏洗脱液，得到金丝桃素提取物；
所述步骤(3)的有机溶剂中还加入无机碱或有机碱，所述无机碱或有机碱的用量相对于有机溶剂按照g/mL的质量体积比为0.001-0.01:1；
所述无机碱为氢氧化钠或氢氧化钾；所述有机碱为三乙胺；
所述步骤(3)的有机溶剂在加入有机碱或无机碱后，进一步加入三聚磷酸钠水溶液，所述三聚磷酸钠水溶液浓度为0.08M；所述三聚磷酸钠水溶液与有机溶剂的体积比为0.05:1。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(2)中的生物酶为纤维素酶和果胶酶的混合物，两者的质量比为1:6-8。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(2)中生物酶与贯叶连翘粉末的质量比为3-6:100。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(2)中pH为5.0；酶解保温温度为55℃。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(3)中的有机溶剂选自C1-C4一元醇、C2-C4二元醇、C1-C4一元醇的水溶液、C1-C4一元醇的丙酮溶液或者C1-C4一元醇的氯仿溶液。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述步骤(3)中的有机溶剂为10-30％的乙醇丙酮溶液。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其特征在于：所述步骤(3)中的吸附树脂选自HZ841或D101。
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