CN103103228B - 复合材料固定化赤霉菌制备烟酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物工程技术应用领域，具体涉及一种将产腈水解酶的赤霉菌CA3-1（CGMCC No. 4903）用壳聚糖-聚乙烯醇复合材料固定化并用于制备烟酸的方法。具体是将赤霉菌CA3-1固定化，加入适量的3-氰基吡啶，选择固定化细胞的最适反应条件，得到产物烟酸。研究发现，壳聚糖-聚乙烯醇固定化细胞的转化活力比聚乙烯醇小球高，重复利用性也优于壳聚糖固定化小球。这种固定化细胞可以重复利用多次，具有较高的底物耐受性，能够提高单位菌体的生产能力。为生物转化法制备烟酸提供了前提，为赤霉菌CA3-1（CGMCC No. 4903）在由3-氰基吡啶制备烟酸的工业化应用做好铺垫。
Description
技术领域
本发明涉及一种利用复合材料固定化产腈水解酶的赤霉菌CA3-1（Gibberella intermedia，CGMCC No.4903）制备烟酸的方法，属于生物工程应用技术领域。
背景技术
烟酸的生产主要是采用化学合成法和生物催化法，目前在工业上，仍然主要采用化学合成的方法进行生产，如高锰酸钾氧化法、硝酸氧化法、气相氧化法、臭氧氧化法、氨氧化法、电解氧化法等，合成条件苛刻，如高温高压，能耗较大，易产生大量的废气废渣等，而且合成效率较低，普遍存在着污染大、工艺复杂、成本高等缺点。违背了现价段可持续发展战略和建设环境友好型社会的要求，不符合原子经济性和绿化化学的发展方向。
生物法生产烟酸条件温和，催化效率较高，对环境的影响小，反应过程易于控制，底物选择性强，与化学合成法相比，生物法制备烟酸具有非常大的优势，适合现代应用于工业化生产。腈水解酶具有极为广泛的底物谱，这也使得其在食品、制药、化工等领域有很好的应用前景，利用腈水解酶降解腈类化合物制备有机酸必将成为未来化工生产中的一个不可或缺的工艺。从已有研究成果来看，腈水解酶在腈类化合物中的转化应用具有较高潜力，研究其细胞固定化过程和固定化细胞的转化工艺具有重要的理论意义和应用价值。
游离细胞与固定化细胞相比，固定化细胞的转化活力因受到固定化过程的影响而有所降低，但固定化细胞的优势在于：固定化细胞容易回收重复利用，有利于产物的分离纯化，而且降低了生产成本，提高了单位利用效率。因此，选择合适的固定方法和固定化材料制备残留活性高、能多次重复利用、储存和操作稳定性好的固定化细胞前景值得期待。
腈类物质对于产腈水解酶的微生物来说，都会有或强或弱的毒性。微生物细胞经过固定化后，被包埋在生物材料里面，避免了与腈类化合物的直接接触，减弱了腈类化合物毒性对微生物的伤害，使微生物细胞能够长时间的保存转化能力。产腈水解酶的微生物在固定化以后，能够增强对产物和底物的耐受性，提高持续转化能力。
复合材料固定化细胞的优势在于，不同的材料混合使用，集合不同材料的优势，弥补单一材料的不足。单一材料固定化时，固定化细胞难以同时兼有良好机械强度和高的残留活力。将具有较高活力的固定化材料和具有较好机械强度的固定化材料复合使用，这样的复合材料就比较好的解决了这个的问题。本专利采用壳聚糖-聚乙烯醇复合材料固定化赤霉菌CA3-1，既弥补了壳聚糖固定化小球机械强度差的劣势，也弥补了聚乙烯醇固定化小球活力低的缺点。
至今为止，从未有利用复合材料固定化产腈水解酶的丝状真菌并且用于腈类化合物生物转化的任何专利及文献报道。而目前国内在这方面的研究仍处于空白。
发明内容
本发明目的是提供一种复合材料固定化赤霉菌CA3-1（Gibberella intermedia，CGMCC No. 4903）制备烟酸的方法。该菌株为赤霉菌（Gibberella intermedia）CA3-1，保藏在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.4903，保藏日期为2011年5月24日。
本发明的技术方案为：赤霉菌CA3-1通过液体培养获得菌液，经过离心分离获得湿菌体，用生理盐水离心洗涤数次后重悬于生理盐水中，加入聚乙烯醇和壳聚糖的混合包埋材料溶液，混合均匀后用注射器平稳的注入到多聚磷酸钠和饱和硼酸混合固化溶液中固化，得到的固定化小球经过滤、用PBS洗去表面未固定的细胞和固化溶液。取定量的固定化小球参与反应，加入PBS缓冲液，加底物3-氰基吡啶，在一定温度、一定pH值的条件下反应一定时间后，得到产物烟酸。
上述过程中，赤霉菌CA3-1的液体培养基（g/L）为：磷酸二氢钾2.72，硫酸亚铁0.0139，葡萄糖10，酵母粉7.5，氯化钠1.16，己内酰胺3.39，pH值为7.0。培养条件为：500mL三角瓶装50mL培养基在30℃，220rpm，往复式摇床振荡培养60h。离心分离所得菌体重悬于生理盐水中，获得10g/L的菌悬液，聚乙烯醇的质量分数为5%，壳聚糖溶液的质量分数为4%，多聚磷酸钠的质量分数为10%，在0℃固化时间8h。形成的固定化小球用纱布过滤，用PBS缓冲液洗涤。转化反应时，PBS缓冲液的加入量为7mL，pH值为9.0，底物3-氰基吡啶的浓度为100mM 7mL，温度为40℃，反应时间为30min。
具体实施方式
下面的实例将具体说明本发明的操作方法，但不能作为对本发明的限定。
实例一
1、腈水解酶产生菌-赤霉菌CA3-1菌液的制备
液体培养基配方：磷酸二氢钾2.72g，硫酸亚铁0.0139g，葡萄糖10g，酵母粉7.5g，氯化钠1.16g，己内酰胺3.39g，加水至1L，充分溶解后调pH值为7.0。
培养方法：从斜面菌种中用接种环挑取真菌菌丝，接种于摇瓶种子培养基中，500mL三角瓶装50mL液体培养基，在30℃，220rpm条件下，培养60h。
实例二
1、赤霉菌CA3-1的固定化
壳聚糖-聚乙烯醇复合材料固定化细胞的方法：将制备的菌液经离心分离获得湿菌体，用生理盐水离心洗涤后，取0.05g菌体重悬于生理盐水中，制备成10g/L的菌悬液，向其加入质量分数为3%的聚乙烯醇溶液和4%的壳聚糖溶液，充分混合均匀后用注射器平稳注入到浓度为10%（w/v）多聚磷酸钠和饱和硼酸的混合溶液中，0℃下固化8h，得到固定化小球经过纱布过滤后用PBS缓冲液洗去未固定的细胞和混合固化溶液，固化结束后小球保存于生理盐水中。固定化小球呈亮白色，直径1.8mm左右。
单一材料壳聚糖的固定化方法为：将制备的菌液经离心分离获得菌体，用生理盐水离心洗涤数次后，同样取0.05菌体重悬于生理盐水中，制备成10g/L的菌悬液，向其加入质量分数为4%的壳聚糖溶液，充分混合均匀后用注射器平稳注入到浓度为10%（w/v）多聚磷酸钠溶液中，0℃下固化8h，得到固定化小球经过纱布过滤后用PBS缓冲液洗去未固定的细胞和多聚磷酸钠溶液，固化结束小球保存于4℃生理盐水中。
单一材料聚乙烯醇的固定化方法为：将制备的菌液经离心分离获得菌体，用生理盐水离心洗涤数次后，同样取0.05菌体重悬于生理盐水中，制备成10g/L的菌悬液，向其加入质量分数为8%的聚乙烯醇溶液，充分混合均匀后用注射器平稳注入到饱和硼酸溶液中，0℃下固化8h，得到固定化小球经过纱布过滤后用PBS缓冲液洗去未固定的细胞和饱和硼酸溶液，固化结束小球保存于4℃生理盐水中。
将上述制备的三种固定化小球分别取4mL用质构仪进行机械强度测试（测定结果见表1），对三种固定化细胞进行活力测定（数据见表1）。由数据可知，壳聚糖-聚乙烯醇复合材料制备的固定化小球机械强度要优于壳聚糖固定化小球，其活力比聚乙烯醇固定化细胞高，与壳聚糖固定化细胞活力持平。
壳聚糖小球对pH比较敏感，并且机械强度低；聚乙烯醇小球韧性大，机械强度好，但是内部结构致密，具有较大的传质阻力。而壳聚糖-聚乙烯醇固定化小球呈亮白色，韧性大，活力高。
表1 复合材料与单一材料固定化小球机械强度对比
| 制备方式 | 测试样品量（mL） | 机械强度（N） | 比酶活（U/g） |
| 壳聚糖固定化 | 4 | 85.74 | 735.38 |
| 聚乙烯醇固定化 | 4 | 295.19 | 561.94 |
| 壳聚糖-聚乙烯醇固定化 | 4 | 283.03 | 714.35 |
实例三
1、烟酸的制备
壳聚糖固定化细胞、聚乙烯醇固定化细胞核壳聚糖-聚乙烯醇固定化细胞的制作如实例二所述。分别取3种固定化细胞6mL，然后向其中加入7mL的PBS缓冲液，加入浓度为100mM的底物3-氰基吡啶溶液7mL，40℃，反应30min。实验数据如表2所示。转化结束，将固定化细胞从转化体系中滤出，并用PBS缓冲液洗涤三次后重新投入到新的转化体系中，进行转化。如此往复进行批次试验。重复利用次数见表2。
表2 复合材料与单一材料固定化细胞转化活力对比
| 反应时间min | 转化率(%) | 重复次数 | |
| 壳聚糖固定化细胞 | 30 | 100 | 4 |
| 聚乙烯醇固定化细胞 | 30 | 82.18 | 32 |
| 壳聚糖-聚乙烯醇固定化细胞 | 30 | 100 | 31 |
由表中数据可知，壳聚糖-聚乙烯醇固定化细胞的活力要高于聚乙烯醇固定化细胞，与壳聚糖固定化细胞活力持平。在相同的30min内，聚乙烯醇固定化细胞只转化82.18%的底物；然而壳聚糖-聚乙烯醇固定化细胞和壳聚糖固定化细胞已经将底物完全转化。
壳聚糖-聚乙烯醇固定化细胞可以重复利用31次，只比单一聚乙烯醇固定化细胞少一次，但是比壳聚糖固定化细胞重复利用次数多27次。这样一来就充分的利用了赤霉菌CA3-1的转化能力，也降低了该菌株进行工业化应用的要求，因为固定化细胞比游离细胞更具有稳定性和操作的方便性。
Claims (2)
1.一种利用固定化赤霉菌CA3-1，即编号CGMCC No.4903的细胞制备烟酸的方法，其特征在于将腈水解酶产生菌经过液体培养得到菌液，利用聚乙烯醇-壳聚糖复合材料进行赤霉菌CA3-1的全细胞固定化，并用于烟酸的生物转化；具体操作步骤为腈水解酶产生菌经过液体培养得到菌液，经过离心分离获得菌体，用生理盐水离心洗涤后重悬于生理盐水中，得到浓度为8-12g/L的菌悬液；取3-8mL菌悬液加入3-8mL 0.5-6%聚乙烯醇溶液和1-6%的壳聚糖溶液的混合溶液，混合均匀后用注射器平稳的注入到含有饱和硼酸和6-15%的多聚磷酸钠的混合固化溶液中，于-4-10℃下，固化2-8h，得到的固定化小球经过滤、洗去表面未固定的细胞和混合固化溶液，最后将固定化细胞保存在0-10℃的生理盐水中；分别取2-12mL的固定化小球参与反应，加入3-8mL pH值6.0-10.0 的PBS缓冲液，加50-150mM底物3-氰基吡啶3-8mL，在30-50℃、pH值为6.0-10.0的条件下反应20-45min，得到产物烟酸和副产物烟酰胺的混合溶液。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征是腈水解酶产生菌液体培养的培养基组成为葡萄糖 6-12g，酵母粉 5-10g，磷酸二氢钾 1-5g，氯化钠 1-6g，硫酸亚铁 0.01-0.1g，己内酰胺 1-5g，加水至1L，pH为7.0；培养条件为500mL三角瓶装液30-60mL，于25-35℃、180-220rpm摇床培养36-72h。
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