CN104561218B - 一种利用赤霉菌制备3β，7α，15α-三羟基雄甾-5-烯-17-酮的方法 - Google Patents

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Abstract

一种利用赤霉菌制备3β，7α，15α‑三羟基雄甾‑5‑烯‑17‑酮的方法，其特征是所述方法包括以下步骤：(1)菌体培养液的制备，将保藏号为CGMCC No.4903的赤霉菌(Gibberella intermedia)CA3‑1作为生产菌种，经斜面培养、菌体培养得到菌体培养液；(2)生物转化，向步骤(1)中的菌体培养液中加入富马酰壳聚糖和DHEA，富马酰壳聚糖与菌体培养液的重量体积比为1∶50～100，DHEA的终浓度为8.5～10g/L，在26～30℃下，200～220r/min的搅拌转速下转化36～60h，即得转化液；(3)产物提取，将转化液用乙酸乙酯提取浓缩，得到3β，7α，15α‑三羟基雄甾‑5‑烯‑17‑酮。

Description

一种利用赤霉菌制备3β，7α，15α-三羟基雄甾-5-烯-17-酮的 方法
技术领域
本发明甾体化合物生物转化方法具体的设计一种羟化方法。
背景技术
屈螺酮是一种新型的孕激素，因其具有一定的盐皮质激素作用，在用于制备口服短效避孕药时，可以克服一般孕激素带来的体重增加的副作用。3β，7α，15α-三羟基雄甾-5-烯-17-酮(即7α，15α-二羟基去氢表雄酮，简称7α，15α-diOH-DHEA，CAS：2963-69-1)则是生产屈螺酮的重要中间体，因合成困难，一般采用或去氢表雄酮(DHEA)生物转化法生产。
中国专利CN102965288A公开了一种用于将DHEA转化为3β，7α，15α-三羟基雄甾-5-烯-17-酮的赤霉菌(Gibberellaintermedia)CA3-1(保藏编号为CGMCC No.4903)，可以实现高浓度投料与高产物得率，其在常规发酵工艺下，投料浓度达到5-8g/L，底物转化率达到68-84％，且随着投料浓度提高，其底物转化率出现了显著的降低，当投料浓度达到8g/L时，转化率仅有68％。
因此在采用赤霉菌将DHEA转化为3β，7α，15α-三羟基雄甾-5-烯-17-酮的生物发酵中，进一步优化发酵条件，提高底物的转化率和投料浓度，成为现有技术中亟待解决的问题
发明内容
为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种改进的利用赤霉菌制备3β，7α，15α-三羟基雄甾-5-烯-17-酮的方法，在研究中为我们惊奇的发现，现有技术中通常被用作抑菌剂的某种壳聚糖衍生物，能够意外的提高赤霉菌发酵制备3β，7α，15α-三羟基雄甾-5-烯-17-酮时的转化率和投料浓度。
本发明提供了一种利用赤霉菌(Gibberella intermedia)CA3-1制备3β，7α，15α-三羟基雄甾-5-烯-17-酮的方法，所述赤霉菌保藏编号为CGMCC No.4903，所述方法包括以下步骤：
(1)菌体培养液的制备，将保藏号为CGMCC No.4903的赤霉菌(Gibberellaintermedia)CA3-1作为生产菌种，经斜面培养、菌体培养得到菌体培养液；
(2)生物转化，向步骤(1)中的菌体培养液中加入富马酰壳聚糖和DHEA，富马酰壳聚糖与菌体培养液的重量体积比为1∶50～100，DHEA的终浓度为8.5～10g/L，在26～30℃下，200～220r/min的搅拌转速下转化36～60h，即得转化液；
(3)产物提取，将转化液用乙酸乙酯提取浓缩，得到3β，7α，15α-三羟基雄甾-5-烯-17-酮。
所述的富马酰壳聚糖的取代度为0.45～0.48。
所述的方法，其特征是斜面培养的培养基为PDA培养基，其组成为成分及配比为：土豆淀粉200～500g/L；葡萄糖30～50g/L；酵母粉5～10g/L；琼脂粉15～20g/L以及余量的蒸馏水；
所述的方法，其特征是所述用于菌体培养的培养基为菌体培养基，所述菌体培养基的成分及配比为：葡萄糖20～50g/L；NaCl 0.5～2g/L；酵母粉10～30g/L；K2HPO4 0.1～5.0g/L；FeSO4·7H2O 0.01～0.1g/L；及余量的蒸馏水，调培养基的pH至6.5-7.5。
所述的方法，其特征是所述菌体培养液的制备工艺为：
斜面培养，将接种菌种的培养基斜面置于28-32℃，培养3-5天，得到成熟的孢子菌丝，菌体培养分为一次培养和二次培养两步；
一次培养，用接种环挑斜面培养得到的一环菌丝接种于有80～120mL菌体培养基中，在26～30℃下震荡培养18-36h得到一次培养液；
二次培养，将一次培养液以体积百分比3-6％的接种量接入菌体培养基中，以与一次培养相同的条件继续培养18-36h，得到菌体培养液。
所述的方法，其特征是依发酵规模不同，二次培养可以分多次进行。每次接种均采用上一次培养得到的培养液，接种量为体积百分比3-6％，用于生产菌体培养液。
壳聚糖(chitosan)又称脱乙酰甲壳素，是由自然界广泛存在的几丁质(chitin)经过脱乙酰作用得到的，壳聚糖具有一定增溶作用，但因其也具有抑菌作用，因此一般不在生物发酵领域使用，参考文献——壳聚糖的化学改性及其衍生物的抑菌活性研究(冯永巍，江南大学博士论文，2011年6月)中公开了对壳聚糖进行化学改性得到的苯甲酰壳聚糖、对羟基苯甲酰壳聚糖、富马酰壳聚糖等壳聚糖衍生物，我们经过实验惊奇的发现，富马酰壳聚糖在用于本发明所提及的赤霉菌羟化发酵时时，能够显著的提高底物的投料浓度和转化率，而壳聚糖及其他壳聚糖衍生物均无此效果。而且对于采用其他菌种进行羟化发酵时，加入富马酰壳聚糖也无此作用。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
菌种：赤霉菌(Gibberella intermedia)CA3-1，保藏编号CGMCC No.4903
底物原料：去氢表雄酮(DHEA)，含量98％，
富马酰壳聚糖、对羟基苯甲酰壳聚糖、苯甲酰壳聚糖均按参考文献——壳聚糖的化学改性及其衍生物的抑菌活性研究(冯永巍，江南大学博士论文，2011年6月)中公开的方法制备得到，其中富马酰壳聚糖的取代度为0.45～0.48，苯甲酰壳聚糖的取代度为1.2-1.3，对羟基苯甲酰壳聚糖的取代度为1.2-1.3，壳聚糖的脱乙酰度＞大于90％。
PDA培养基的配比为：土豆淀粉300g/L；葡萄糖40g/L；酵母粉7g/L；琼脂粉17g/L以及余量的蒸馏水；pH自然，在121℃高压蒸汽下灭菌20min。
菌体培养基的配比为：葡萄糖35g/L；NaCl 0.9g/L；酵母粉15g/L；K2HPO4 0.2g/L；FeSO4·7H2O 0.05g/L；灭菌前调培养基的pH至6.5-7.5，在121℃高压蒸汽下灭菌20min。
步骤
(1)将实验室-80℃保存的菌种甘油管，加入到10mL的菌体培养基进行活化培养。再转接到置于250mL锥形瓶中的30mL菌体培养基中，培养2天得种子液，
斜面培养，将该种子液划线于PDA培养基，将接种菌种的PDA斜面置于30℃的恒温培养箱中，培养4天，得到成熟的孢子菌丝；
一次培养，用接种环挑一环斜面培养得到的菌丝接种于装有100mL菌体培养基的500mL 摇瓶中，在28℃，220rpm摇床上培养24h，得一次培养液；
二次培养，将一次培养液以体积百分比4％的接种量接入菌体培养基中，以与一次培养相同条件继续培养20小时，得到菌体培养液；
3)将去氢表雄酮及壳聚糖或其衍生物投入到菌体培养液中，去氢表雄酮的投料浓度为Ag/L，壳聚糖或其衍生物的投料浓度为Bg/L，相同条件下转化60小时放瓶。乙酸乙酯提取转化液中的产物进行HPLC分析，计算DHEA转化为7α，15α-diOH-DHEA的转化率为C％。
通过上述实验，我们惊奇的发现，当加入富马酰壳聚糖时，能够显著的提高DHEA生物转化得到7α，15α-diOH-DHEA的转化率，而与之相对的是采用其他种类壳聚糖衍生物及壳聚糖均只能降低该转化率。

Claims (3)

1.一种利用赤霉菌(Gibberella intermedia)CA3-1制备3β,7α,15α-三羟基雄甾-5-烯-17-酮的方法，所述赤霉菌保藏编号为CGMCC No.4903，其特征是所述方法包括以下步骤：
(1)菌体培养液的制备，将保藏号为CGMCC No.4903的赤霉菌(Gibberellaintermedia)CA3-1作为生产菌种，经斜面培养、菌体培养得到菌体培养液；
(2)生物转化，向步骤(1)中的菌体培养液中加入富马酰壳聚糖和DHEA，富马酰壳聚糖与菌体培养液的重量体积比为1:50～100，DHEA的终浓度为8.5～10g/L，在26～30℃下，200～220r/min的搅拌转速下转化36～60h，即得转化液，所述的富马酰壳聚糖的取代度为0.45～0.48；
(3)产物提取，将转化液用乙酸乙酯提取浓缩，得到3β,7α,15α-三羟基雄甾-5-烯-17-酮。
2.如权利要求1所述的一种利用赤霉菌(Gibberella intermedia)CA3-1制备3β,7α,15α-三羟基雄甾-5-烯-17-酮的方法，其特征是斜面培养的培养基为PDA培养基，其组成为成分及配比为：土豆淀粉200～500g/L；葡萄糖30～50g/L；酵母粉5～10g/L；琼脂粉15～20g/L以及余量的蒸馏水；
所述用于菌体培养的培养基为菌体培养基，所述菌体培养基的成分及配比为：葡萄糖20～50g/L；NaCl 0.5～2g/L；酵母粉10～30g/L；K2HPO4 0.1～5.0g/L；FeSO4·7H2O 0.01～0.1g/L；及余量的蒸馏水，调培养基的pH至6.5-7.5。
3.如权利要求1或2所述的一种利用赤霉菌(Gibberella intermedia)CA3-1制备3β,7α,15α-三羟基雄甾-5-烯-17-酮的方法，其特征是所述菌体培养液的制备工艺为：
斜面培养，将接种菌种的培养基斜面置于28-32℃，培养3-5天，得到成熟的孢子菌丝，菌体培养分为一次培养和二次培养两步；
一次培养，用接种环挑斜面培养得到的一环菌丝接种于有80～120mL菌体培养基中，在26～30℃下震荡培养18-36h得到一次培养液；
二次培养，将一次培养液以体积百分比3-6％的接种量接入菌体培养基中，以与一次培养相同的条件继续培养18-36h，得到菌体培养液。
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