CN104561216B - 一种利用亚麻刺盘孢霉制备7α，15α-二羟基去氢表雄酮的方法 - Google Patents
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Abstract
一种利用亚麻刺盘孢霉制备7α，15α‑二羟基去氢表雄酮的方法，所述方法包括以下步骤(1)孢子培养，亚麻刺盘孢霉ST‑1作为生产菌种，经斜面培养得到成熟孢子；(2)菌体培养，步骤(1)得到的孢子接种到的菌体培养基中进行菌体培养得到菌体培养液；(3)生物转化，向步骤(1)中的菌体培养液中加入羧甲基油酰壳聚糖和DHEA，DHEA的终浓度为10.5～12g/L，羧甲基油酰壳聚糖和DHEA的重量比为2～3∶1，在28～30℃下，200～220r/min的搅拌转速下转化36～60h，即得转化液；(4)产物提取，将转化液用乙酸乙酯提取浓缩，得到7α，15α‑二羟基去氢表雄酮。
Description
技术领域
本发明甾体化合物生物转化方法具体的设计一种羟化方法。
背景技术
屈螺酮是一种新型的孕激素，因其具有一定的盐皮质激素作用，在用于制备口服短效避孕药时，可以克服一般孕激素带来的体重增加的副作用。7α，15α-二羟基去氢表雄酮(即7α，15α-二羟基去氢表雄酮，简称7α，15α-diOH-DHEA，CAS：2963-69-1)则是生产屈螺酮的重要中间体，因合成困难，一般采用或去氢表雄酮(DHEA)生物转化法生产。
中国专利CN102703558B公开了一种采用亚麻刺盘孢霉(Colletotrichum lini)ST-1(保藏编号为CGMCC No.6051)将DHEA转化为7α-羟基-去氢表雄酮和7α，15α-二羟基去氢表雄酮和转化方法，采用了将底物与等摩尔比的甲基-β-环糊精预包合后再投料的方式，并生成能够提高了底物的溶解度和转化效率，经过我们实验方法，这种方法对于菌种有很高的选择性，即不同的菌种在处理甲基-β-环糊精预包合的底物时，结果并不一致，当采用亚麻刺盘孢霉处理甲基-β-环糊精预包合的底物时效果并不好，且该方法得到的产物为7α-羟基去氢表雄酮与7α，15α-二羟基去氢表雄酮的混合物，根据该专利公开数据，在转化产物中仅有60％为7α，15α-二羟基去氢表雄酮，且这两种产物分离较为困难。
中国专利CN 102757997A公开了一种采用底物诱导法制备7α，15α-二羟基雄甾烯酮(即7α，15α-二羟基去氢表雄酮)的方法，分次添加底物，使底物的最终添加浓度达到8-10g/L，并能将转化率提高到90％左右，然而经过我们实验发现，这种方法需要延长总发酵时间，从而影响生产效率，且该方法中采用的接种量为8-10％，较大的接种量实际上也会制约生产规模的扩大。
因此在采用亚麻刺盘孢霉将DHEA转化为7α，15α-二羟基去氢表雄酮的生物发酵中，进一步优化发酵条件，提高底物的转化率和投料浓度，成为现有技术中亟待解决的问题
发明内容
为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种改进的利用亚麻刺盘孢霉制备7α，15α-二羟基去氢表雄酮的方法，在研究中为我们惊奇的发现，现有技术中通常被用作抑菌剂的某种壳聚糖衍生物，能够意外的提高亚麻刺盘孢霉发酵制备7α，15α-二羟基去氢表雄酮时的转化率和投料浓度。
本发明提供了一种利用亚麻刺盘孢霉(Colletotrichum lini)ST-1制备7α，15α-二羟基去氢表雄酮的方法，所述亚麻刺盘孢霉保藏编号为为CGMCC No.6051，所述方法包括以下步骤(1)孢子培养，将保藏号为CGMCC No.6051的亚麻刺盘孢霉(Colletotrichumlini)ST-1作为生产菌种，经斜面培养得到成熟孢子；
(2)菌体培养，步骤(1)得到的孢子接种到的菌体培养基中进行菌体培养得到菌体培养液；
(3)生物转化，向步骤(1)中的菌体培养液中加入羧甲基油酰壳聚糖和DHEA，DHEA的终浓度为10.5～12g/L，羧甲基油酰壳聚糖和DHEA的重量比为2～3∶1，在28～30℃下，200～220 r/min的搅拌转速下转化36～60h，即得转化液。
(4)产物提取，将转化液用乙酸乙酯提取浓缩，得到7α，15α-二羟基去氢表雄酮。
所述的羧甲基油酰壳聚糖的羧甲基取代度为0.58～0.62，油酰基取代度为0.08～0.09。
所述的方法，其特征是斜面培养的培养基为PDA培养基，其组成为成分及配比为：土豆淀粉200～500g/L；葡萄糖30～50g/L；酵母粉5～10g/L；琼脂粉15～20g/L以及余量的蒸馏水；
所述的方法，其特征是所述用于菌体培养的菌体培养基的成分及配比为：葡萄糖10～15g/L；豆饼粉8～15g/L，酵母粉10～15g/L；玉米浆2～3g/L；及余量的蒸馏水；
所述的方法，其特征是
所述步骤(1)的工艺为：将亚麻刺盘胞菌(Colletotrichum lini) ST-1按活化后，接种到斜面培养的培养基上，置于28-32℃的恒温培养箱中进行斜面培养得到成熟的孢子，培养时间3～5天。
所述步骤(2)的菌体培养工艺分为为一次培养和二次培养；
一次培养，将步骤(1)得到的孢子接种于80～120mL菌体培养基中，在28～30℃下振荡
培养18-36h得到一次培养液；
二次培养，将一次培养液以体积百分比3-5％的接种量接入菌体培养基中，以与一次培养相同的条件继续培养18-36h，得到菌体培养液。
所述的方法，其特征是依发酵规模不同，二次培养可以分多次进行。每次接种均采用上一次培养得到的培养液，接种量为体积百分比3-5％，用于生产菌体培养液。
壳聚糖(chitosan)又称脱乙酰甲壳素，是由自然界广泛存在的几丁质(chitin)经过脱乙酰作用得到的，壳聚糖具有一定增溶作用，但因其也具有抑菌作用，因此一般不在生物发酵领域使用，参考文献1——“壳级糖的化学改性及其衍生物的抑菌活性研究”(冯永巍，江南大学博士论文，2011年6月)中公开了对壳聚糖进行化学改性得到的苯甲酰壳聚糖、对羟基苯甲酰壳聚糖、富马酰壳聚糖等壳聚糖衍生物，参考文献2——“两种水溶性壳聚糖衍生物的制备与抑菌性能研究”(孟祥君，河北大学硕士论文，2012年5月)中也公开了羧甲基壳聚糖及羧甲基油酰壳聚糖等壳聚糖衍生物，我们经过实验惊奇的发现，羧甲基油酰壳聚糖在用于本发明所提及的亚麻刺盘孢霉羟化发酵时时，能够显著的提高底物在较高投料浓度下转化率，而壳聚糖及其他壳聚糖衍生物均无此效果。而且对于采用其他菌种进行羟化发酵时，加入羧甲基油酰壳聚糖也无此作用，且本发明提供的方法，将降低了菌种培养液的接种量，更有利于发酵规模的扩大。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
菌种：亚麻刺盘孢霉(Colletotrichum lini)ST-1，保藏编号CGMCC No.6051
底物原料：去氢表雄酮(DHEA)，含量98％，
富马酰壳聚糖、对羟基苯甲酰壳聚糖、苯甲酰壳聚糖均按参考文献1——壳聚糖的化学改 性及其衍生物的抑菌活性研究(冯永巍，江南大学博士论文，2011年6月)中公开的方法制备得到，其中羧甲基油酰壳聚糖的取代度为0.45～0.48，苯甲酰壳聚糖的取代度为1.2-1.3，对羟基苯甲酰壳聚糖的取代度为1.2-1.3，
羧甲基壳聚糖及羧甲基油酰壳聚糖均按参考文献2——“两种水溶性壳聚糖衍生物的制备与抑菌性能研究”(孟祥君，河北大学硕士论文，2012年5月)中公开的方法制备得到，其中羧甲基壳聚糖的取代度为0.85～0.90。羧甲基油酰壳聚糖中，羧甲基取代度为0.58～0.62，油酰基取代度为0.08～0.9
壳聚糖的脱乙酰度＞大于90％。
PDA培养基的配比为：土豆淀粉300g/L；葡萄糖40g/L；酵母粉7g/L；琼脂粉17g/L以及余量的蒸馏水；pH自然，在121℃高压蒸汽下灭菌20min。
菌体培养基的配比为：葡萄糖10g/L；豆饼粉15g/L，酵母粉10g/L；玉米浆3g/L；及余量的蒸馏水，在121℃高压蒸汽下灭菌20min。
步骤
(1)孢子培养，将实验室-80℃保存的菌种甘油管，加入到10mL的菌体培养基进行活化培养。再转接到置于250mL锥形瓶中的30mL菌体培养基中，培养2天得种子液，将该种子液划线于PDA培养基，将接种菌种的PDA斜面置于30℃的恒温培养箱中，培养4天，得到成熟的孢子菌丝；
(2)菌体培养，分为一次培养和二次培养，其中一次培养工艺为，用接种环挑一环斜面培养得到的孢子菌丝接种于装有100mL菌体培养基的500mL摇瓶中，在28℃，220rpm摇床上培养24h，得一次培养液；
二次培养，将一次培养液以体积百分比5％的接种量接入菌体培养基中，以与一次培养相同条件继续培养24小时，得到菌体培养液；
3)将去氢表雄酮及壳聚糖或其衍生物投入到菌体培养液中，去氢表雄酮的投料浓度为Ag/L，壳聚糖或其衍生物的投料浓度为Bg/L，相同条件下转化48小时放瓶。乙酸乙酯提取转化液中的产物进行HPLC分析，计算DHEA转化为7α，15α-diOH-DHEA的转化率为C％。
通过上述实验，我们惊奇的发现，当加入羧甲基油酰壳聚糖时，能够显著的提高DHEA生物转化得到7α，15α-diOH-DHEA的转化率，而与之相对的是采用其他种类壳聚糖衍生物及壳聚糖中，除了加入羧甲基壳聚糖的实验组转化率较高外，其他实验组的转化率均低于不加入壳 聚糖的实验组，说明羧甲基壳聚糖及羧甲基油酰壳聚糖均对采用亚麻刺盘孢霉羟化去氢表雄酮制备7α，15α-二羟基去氢表雄酮的生物转化反应有促进作用，尤其是羧甲基油酰壳聚糖，其促进作用还要明显优于羧甲基壳聚糖。
Claims (3)
1.一种利用亚麻刺盘孢霉(Colletotrichum lini)ST-1制备7α,15α-二羟基去氢表雄酮的方法，所述亚麻刺盘孢霉保藏编号为为CGMCC No.6051，所述方法包括以下步骤
(1)孢子培养，将保藏号为CGMCC No.6051的亚麻刺盘孢霉(Colletotrichum lini)ST-1作为生产菌种，经斜面培养得到成熟孢子；
(2)菌体培养，步骤(1)得到的孢子接种到的菌体培养基中进行菌体培养得到菌体培养液；
(3)生物转化，向步骤(1)中的菌体培养液中加入羧甲基油酰壳聚糖和DHEA，DHEA的终浓度为10.5～12g/L，羧甲基油酰壳聚糖和DHEA的重量比为2～3：1，在28～30℃下，200～220r/min的搅拌转速下转化36～60h，即得转化液，所述的羧甲基油酰壳聚糖的羧甲基取代度为0.58～0.62，油酰基取代度为0.08～0.09；
(4)产物提取，将转化液用乙酸乙酯提取浓缩，得到7α,15α-二羟基去氢表雄酮。
2.如权利要求1所述的一种利用亚麻刺盘孢霉(Colletotrichum lini)ST-1制备7α,15α-二羟基去氢表雄酮的方法，其特征是斜面培养的培养基为PDA培养基，其组成为成分及配比为，土豆淀粉200～500g/L，葡萄糖30～50g/L，酵母粉5～10g/L，琼脂粉15～20g/L以及余量的蒸馏水；用于菌体培养的菌体培养基的成分及配比为，葡萄糖10～15g/L，豆饼粉8～15g/L，酵母粉10～15g/L，玉米浆2～3g/L及余量的蒸馏水。
3.如权利要求1或2所述的一种利用亚麻刺盘孢霉(Colletotrichum lini)ST-1制备7α,15α-二羟基去氢表雄酮的方法，其特征是
所述步骤(1)的工艺为：将亚麻刺盘胞菌(Colletotrichum lini)ST-1按活化后，接种到斜面培养的培养基上，置于28-32℃的恒温培养箱中进行斜面培养得到成熟的孢子，培养时间3～5天；
所述步骤(2)的菌体培养工艺分为为一次培养和二次培养；
一次培养，将步骤(1)得到的孢子接种于80～120mL菌体培养基中，在28～30℃下振荡培养18-36h得到一次培养液；
二次培养，将一次培养液以体积百分比3-5％的接种量接入菌体培养基中，以与一次培养相同的条件继续培养18-36h，得到菌体培养液。
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