KR102076567B1 - 효소를 고정할 수 있는 go/peg 자성 비드 및 그 제조방법 - Google Patents

효소를 고정할 수 있는 go/peg 자성 비드 및 그 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 효소를 고정할 수 있는 GO/PEG 자성 비드 및 그 제조방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는, 효소의 활성 및 저장 안정성이 우수하고, 효소의 재사용이 가능하도록 효소를 고정할 수 있는 GO/PEG 자성 비드 및 그 제조방법에 관한 것이다. 이를 위해 GO/PEG 자성 비드는 마그네틱 비드(bead), 그래핀 옥사이드(graphene oxide, GO) 및 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol, PEG)이 혼합되어 제조된 것을 특징으로 한다.

Description

효소를 고정할 수 있는 GO/PEG 자성 비드 및 그 제조방법{MAGNETIC GO/PEG BEADS CAPABLE OF IMMOBILIZING ENZYME AND MANUFACTURING METHOD THEREOF}
본 발명은 효소를 고정할 수 있는 GO/PEG 자성 비드 및 그 제조방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는, 효소의 활성 및 저장 안정성이 우수하고, 효소의 재사용이 가능하도록 효소를 고정할 수 있는 GO/PEG 자성 비드 및 그 제조방법에 관한 것이다.
효소는 자연 어떤 곳이나 존재하는 나노 크기 수준의 생촉매로서 다양한 화학 공정 산업 속에서 이용되었다. 점차 그것들의 이용 분야는 미세화학합성, 조제학, 바이오센서, 생물학적 환경정화, 바이오 탈색, 단백질공학의 단백질 소화, 그리고 생물연료세포 등 더욱 새롭고 다양한 분야로 확장되어가고 있다. 그럼에도 불구하고 효소 촉매제는 그들의 안정성의 한계 때문에 이용에 제한을 받고 있다. 따라서, 이러한 효소의 안정성을 개선한다면 값비싼 효소의 사용으로 인해 발생하는 비용을 줄일 수 있고, 그들의 재사용 하거나 쉽게 분리하는 공정을 통해서, 차후의 효소 분리 및 처리과정 공정을 단축시킴으로써 그 활용폭이 확대 될 수 있다.
이러한 효소의 안정성을 증가시키기 위해 효소 고정화, 효소 변형, 단백질 공학, 그리고 매개공학 등의 방법을 통해 많은 연구들이 진행되었고, 상당한 수준의 결과도 나왔다. 그러나 효소 고정화 방법만큼 간단하고, 효율적인 방법은 없었다. 효소 고정화는 거대한 구조물 속에 효소들을 간단하게 흡착시키거나, 공유결합 시키거나, 캡슐화를 시켜서 활성을 잃어버리는 것을 방지하고, 그 구조물의 환경에 의해 발생하는 안정성 증진 유도하는 등의 결과들이 보고 되었다.
비드 형태의 구조물은 간편하게 효소를 고정시킬 수 있어서 아주 오랫동안 사용되어 왔다. 최근에는 효소의 안정성을 더욱 증가시키기 위한 방법으로 하이브리드 기술이 이용되고 있다. 효소 분자의 고정화를 위해 다양한 유기 소재 및 무기 소재들이 개발되고 이들 소재 구조물이 효소와 결합할 표면을 제공함으로써 효소와 결합하여 효소의 활성을 잃어버리는 것을 방지한다. 다만, 아직까지 실용성 있는 하이브리드 기술이 나타나지 않아 이에 대한 개발이 요구되고 있다.
대한민국 등록특허공보 제10-0962007호
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위한 것으로서, 본 발명의 목적은 효소의 활성 및 저장 안정성이 우수하고, 효소의 재사용이 가능하도록 효소를 고정할 수 있는 GO/PEG 자성 비드 및 그 제조방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 상기 및 다른 목적과 이점은 바람직한 실시예를 설명한 하기의 설명으로부터 분명해질 것이다.
상기 목적은, 마그네틱 비드(bead), 그래핀 옥사이드(graphene oxide, GO) 및 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol, PEG)이 혼합되어 제조된 GO/PEG 자성 비드에 의해 달성될 수 있다.
이때, 마그네틱 비드는, 자성 물질이 침전되고, 아민 그룹을 가진 폴리스티렌 비드(bead)일 수 있다.
또한, GO/PEG 자성 비드는 내부 공극에 효소를 고정할 수 있고, 이때, 효소는 카르복실 에스터레이즈(carboxyl esterase)일 수 있다.
또한, 상기 목적은, 그래핀 옥사이드(GO)와 폴리에틸렌글리콜(PEG)를 혼합하여 GO/PEG 혼합물을 제조하는 제1-1단계; GO/PEG 혼합물에 마그네틱 비드(bead)를 혼합하는 제1-2단계; 및 마그네틱 비드와 혼합된 GO/PEG 혼합물에 초음파를 처리하는 제1-3단계;를 포함하는 GO/PEG 자성 비드 제조방법에 의해 달성될 수 있다.
이때, 제1-2단계의 마그네틱 비드는, 자성 물질이 침전되고, 아민 그룹을 가진 폴리스티렌 비드(bead)일 수 있고, 제1-3단계는, 10~90분 동안 초음파 처리할 수 있다.
또한, 제1-3단계 이 후에, 내부 공극에 효소를 고정시키는 제2단계;를 더 포함할 수 있고, 이때, 효소는 카르복실 에스터레이즈(carboxyl esterase)일 수 있다.
제2단계는, 효소를 공유 결합에 의해 비드 내부에 고정시킬 수 있다. 또한, 제2단계는, 효소를 공유 결합에 의해 비드 내부에 고정시키는 제2-1단계; 및 효소를 가교시켜 비드 내부에 고정시키는 제2-2단계;를 포함할 수도 있다.
본 발명에 따르면, 효소를 효과적으로 고정할 수 있는 효과를 가진다.
구체적으로, 효소의 활성을 유지하면서도, 자성을 이용하여 쉽게 분리할 수 있고, 재사용 및 저장 안정성이 확보될 수 있는 효과를 가진다.
다만, 본 발명의 효과들은 이상에서 언급한 효과로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 효과들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 GO/PEG 자성 비드 내부에 효소를 고정화하는 것을 개략적으로 나타낸 도면이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 GO/PEG 자성 비드 제조방법을 나타낸 도면이다.
도 3은 효소 고정화 단계를 더 포함하는 본 발명의 일 실시예에 따른 GO/PEG 자성 비드 제조방법을 나타낸 도면이다.
도 4는 도 3의 제2단계의 일 예를 구체적으로 나타낸 도면이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 GO/PEG 자성 비드를 자석으로 분리하는 장면을 나타내는 디지털 이미지(10초 내에 자석에 의해 분리)이다.
도 6은 실시예 1의 횡단면을 나타낸 SEM 사진이다.
도 7은 실시예 1의 표면을 확대하여 나타낸 SEM 사진이다.
도 8은 실시예 1의 EDS 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 9는 실시예 1의 FT-IR 결과를 나타낸 그래프이다.
도 10은 실시예 2 및 실시예 3의 효소 재사용 안정성을 나타낸 그래프이다.
도 11은 실시예 2 및 실시예 3의 효소 저장 안정성을 나타낸 그래프이다.
이하, 본 발명의 실시예와 도면을 참조하여 본 발명을 상세히 설명한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위해 예시적으로 제시한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가지는 자에 있어서 자명할 것이다.
또한, 달리 정의하지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 숙련자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 가지며, 상충되는 경우에는, 정의를 포함하는 본 명세서의 기재가 우선할 것이다.
도면에서 제안된 발명을 명확하게 설명하기 위해서 설명과 관계없는 부분은 생략하였으며, 명세서 전체를 통하여 유사한 부분에 대해서는 유사한 도면 부호를 붙였다. 그리고, 어떤 부분이 어떤 구성 요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다. 또한, 명세서에서 기술한 "부"란, 특정 기능을 수행하는 하나의 단위 또는 블록을 의미한다.
각 단계들에 있어 식별부호(제1, 제2, 등)는 설명의 편의를 위하여 사용되는 것으로 식별부호는 각 단계들의 순서를 설명하는 것이 아니며, 각 단계들은 문맥상 명백하게 특정 순서를 기재하지 않는 이상 명기된 순서와 다르게 실시될 수 있다. 즉, 각 단계들은 명기된 순서와 동일하게 실시될 수도 있고 실질적으로 동시에 실시될 수도 있으며 반대의 순서대로 실시될 수도 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 GO/PEG 자성 비드 내부에 효소를 고정화하는 것을 개략적으로 나타낸 도면이다. 도 1을 참조하여 설명하면, 본 발명의 일 실시예에 따른 GO/PEG 자성 비드는 마그네틱 비드(bead), 그래핀 옥사이드(graphene oxide, GO) 및 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol, PEG)이 혼합되어 제조된 것을 특징으로 한다. 종래에 사용되는 효소 고정 비드는 효소의 활성이 유지되지 않거나, 재사용 안정성 또는 저장 안정성이 낮아 효소 고정화 방법으로 적당하지 못하다는 단점이 있었다. 그러나, 본 발명은 자성을 이용하여 쉽게 분리할 수 있으면서도 내부 공극에 효소를 효과적으로 고정하여 효소의 활성을 유지하고, 효소의 재사용 안정성 및 저장 안정성이 우수한 상태로 유지할 수 있는 효과를 가진다.
이때, 마그네틱 비드(bead)는 자성을 부여하기 위해 혼합되는 것으로서, 공지의 여러가지 마그네틱 비드를 사용할 수 있으나, 자성 물질이 침전되고, 아민 그룹을 가진(functionalized) 폴리스티렌 비드(bead)를 사용하는 것이 바람직하다. 한편, GO/PEG 자성 비드 내부에 고정될 수 있는 효소는 카르복실 에스터레이즈일 수 있으나, 이에 국한되는 것은 아니고, 본 발명의 목적을 저해하지 않는 범위 내에서 다양한 효소를 사용할 수도 있다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 GO/PEG 자성 비드 제조방법을 나타낸 도면이다. 도 2를 참조하여 설명하면, 본 발명의 일 실시예에 따른 GO/PEG 자성 비드 제조방법은 그래핀 옥사이드(GO)와 폴리에틸렌글리콜(PEG)를 혼합하여 GO/PEG 혼합물을 제조하는 제1-1단계; GO/PEG 혼합물에 마그네틱 비드(bead)를 혼합하는 제1-2단계; 및 마그네틱 비드와 혼합된 GO/PEG 혼합물에 초음파를 처리하는 제1-3단계;를 포함(이를 통틀어 제1단계로 표현할 수 있다)한다. 본 발명은 자성을 띠는 GO/PEG 비드를 제조함으로써, 내부 공극에 효소를 고정할 수 있고, 자성을 활용해 쉽게 분리할 수 있으면서도 효소의 활성을 유지하고, 재사용 안정성 및 저장 안정성을 확보할 수 있는 효과를 가질 수 있다.
이때, 제1-2단계의 마그네틱 비드(bead)는 자성을 부여하기 위해 혼합되는 것으로서, 공지의 여러가지 마그네틱 비드를 사용할 수 있으나, 자성 물질이 침전되고, 아민 그룹을 가진 폴리스티렌 비드(bead)를 사용하는 것이 바람직하다. 또한, 제1-3단계에서 초음파는 10~90분 동안 처리할 수 있고, 30~60분 동안 처리하는 것이 보다 바람직하다.
또한, 본 발명은 도 3과 같이, GO/PEG 자성 비드 제조 후에 GO/PEG 자성 비드 내부에 효소 고정화 단계를 더 포함할 수 있다. 이때, 내부에 고정될 수 있는 효소는 카르복실 에스터레이즈일 수 있으나, 이에 국한되는 것은 아니고, 본 발명의 목적을 저해하지 않는 범위 내에서 다양한 효소를 사용할 수도 있다.
구체적으로, 제2단계는, 효소를 공유 결합에 의해 비드 내부에 고정시킬 수 있다. 즉, GO/PEG 자성 비드(free aldehyde 그룹)와 효소(amine)를 혼합 및 교반하여 효소를 GO/PEG 자성 비드 내부에 고정시킬 수 있다. 또한, 제2단계는, 도 4와 같이, GO/PEG 자성 비드와 효소를 공유결합에 의해 비드 내부에 고정시키는 제2-1단계; 및 효소를 가교시켜 비드 내부에 고정시키는 제2-2단계;를 포함할 수도 있다. 즉, 효소를 비드 내부에 먼저 공유 결합 시킨 후에 응집제(암모늄 설페이트 및/또는 글루타알데하이드 등)를 넣어 효소를 응집시킨 후, 2차적으로 효소를 가교결합시켜 효소의 활성을 더욱 유지하고, 재사용 안정성 및 저장 안정성을 크게 향상시킬 수 있다.
이하, 구체적인 실시예를 통하여 본 발명의 구성 및 그에 따른 효과를 보다 상세히 설명하고자 한다. 그러나, 본 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
[재료준비]
내부에 효소가 고정된 GO/PEG 자성 비드를 합성하기 위해 필요한 시약으로 8 arm PEG Amine(hexaglycerol) HCl Salt(MW : 10,000)는 JEKEN TECHNOLOGY, 마그네틱 비드인 Dynabeadsㄾ M-270 Amine(2*109 bead/ml)은 invitrogen, Alginic acid sodium salt, 카르복실 에스터레이즈, CaCl2, sodium citrate를 시그마에서 구입하여 사용하였다. 고농도 그래핀 옥사이드(GO)는 Graphene-Supermarket에서 구입하였다.
[실시예 1 : GO/PEG 자성 비드]
알지네이트 비드(alginate bead)를 제조하는 방식을 기반으로 하되, 아래와 같은 순서로 GO/PEG 자성 비드를 제조하였다.
1. 0.31 mg의 GO(graphene oxide)를 619.35 uL의 증류수(0.05 w%)에 넣고 초음파 처리한다.
2. 10 mg의 알긴산(alginic acid)과 200mg의 8 arm PEG Amine을 1번 샘플에 넣는다.
3. 33.3 uL의 마그네틱 비드를 2번 용액에 넣고 30분간 초음파 처리한다.
4. 13.3 uL의 GA(글루타알데하이드) 용액을 3번 샘플에 넣고 1시간 동안 초음파 처리한다.
5. CaCl2 용액(14.4 mL CaCl2(22 mg/mL의 농도) + 600 uL의 GA(글루타알데하이드))에 700 rpm으로 교반하면서 4번의 용액을 주사기를 이용하여 떨어뜨린다.
6. 계속 교반한 상태로 16시간 이상 인큐베이션한다.
7. 증류수로 비드를 5번 이상 씻어낸다.
8. 15 mL sodium citrate(29.4 mg/mL의 농도) 용액을 넣고 15분 동안 500 rpm에서 교반한다.
9. 증류수로 비드를 5번 이상 씻어내고 24시간 이상 냉장고에 보관한다.
[실시예 2(CA) : 효소를 고정시킨 GO/PEG 자성 비드]
상기 실시예 1에 의해 제조된 GO/PEG 자성 비드 약 200개를 기준으로, 아래와 같이 비드 내부에 효소를 공유결합 방법(CA 방법, covalent attachment)으로 고정시켜 실시예 2를 제조하였다.
1. 10 mg/mL 농도의 카르복실 에스터레이즈 용액 1 mL(100 mM PB(pH8.0))를 자성을 띠는 GO/PEG 비드와 섞고 4 mL 유리병(glass vials)에 넣는다.
2. 가볍게 교반(Vortex)한다.
3. 200 rpm의 조건으로 RT(room temperature)에서 30분 동안 쉐이킹한다.
4. 60 rpm의 조건으로 4℃에서 2시간 동안 쉐이킹한다.
5. 비드를 자석으로 분리하고 남은 용액을 버리고, 신선한 2 mL의 버퍼(100 mM PB(pH8.0))로 3번 씻어내고 보관한다.
[실시예 3(CLEAs) : 효소를 고정시킨 GO/PEG 자성 비드]
상기 실시예 1에 의해 제조된 자성을 띠는 GO/PEG 비드 약 200개를 기준으로, 아래와 같이 비드 내부에 효소를 공유결합 후 가교결합 시키는 방법(CLEAs 방법, cross-linked enzyme aggregates)으로 고정시켜 실시예 3을 제조하였다.
1. 10 mg/mL 농도의 카르복실 에스터레이즈 용액 1 mL(100 mM PB(pH8.0))를 자성을 띠는 GO/PEG 비드와 섞고 4 mL 유리병(glass vials)에 넣는다.
2. 가볍게 교반(Vortex)한다.
3. 200 rpm의 조건으로 RT(room temperature)에서 30분 동안 쉐이킹한다.
4. 60 rpm의 조건으로 4℃에서 2시간 동안 쉐이킹한다.
5. 비드를 자석으로 분리하고 남은 용액을 버리고, 신선한 2 mL의 버퍼(100 mM PB(pH8.0))로 3번 씻어내고 보관한다.
6. 보관한 GO/PEG 비드를 1 mL의 0.5 g/mL ammonium sulfate 용액에 넣는다(효소 응집 효과).
7. 1% GA(글루타알데하이드)용액 1 mL을 넣는다(효소 응집 효과).
8. 200 rpm의 조건으로 RT(room temperature)에서 2시간 동안 쉐이킹한다.
9. 60 rpm의 조건으로 4℃에서 16시간 이상 쉐이킹한다.
10. 비드를 자석으로 분리하고 남은 용액을 버리고, 신선한 2 mL의 버퍼(100 mM PB(pH8.0))로 3번 씻어내고 보관한다.
[실험예 1 : SEM 이미지 분석]
도 6은 실시예 1의 횡단면을 나타낸 SEM 사진이고, 도 7은 실시예 1의 표면을 확대하여 나타낸 SEM 사진이다. SEM 이미지를 통해 다공성(porous) 구조를 확인할 수 있었고, 마그네틱 비드, PEG 고분자, GO가 뒤섞여 있는 구조를 지님을 확인할 수 있었다.
[실험예 2 : FT-IR 분석]
도 9는 실시예 1의 FT-IR 결과를 나타낸 그래프로서, GO 및 PEG로부터 3410cm-1(O-H stretching), 3300cm-1(C-H stretching), 1033cm-1(C-O-C stretching)을 나타내고, GO로부터 1720cm-1(C=O stretching)을 나타내며, PEG와 마그네틱 비드 간의 결합으로 인한 1690cm-1(imine stretching)의 결합 특성을 나타내었다.
[실험예 3 : 실시예 2(CA) 및 실시예 3(CLEAs)의 활성 측정 및 비교]
실시예 2 및 실시예 3의 내부에 고정된 카르복실에스터레이즈 활성은 N,N-dimethylformamide 내에서 용해된 p-nitrophenyl butyrate의 가수분해로부터 생성되는 p-nitrophenol의 농도를 이용하여 측정하였다. 활성 측정을 위하여 100 mM phosphate buffer(pH 6.5) 1.98mL와 50 mM의 p-nitrophenylbutyrate 20uL를 기질로서 사용하였다. 10분 동안의 반응시간 동안 2분 간격으로 A400 영역의 흡광도를 측정하며, 이것은 p-nitrophenol의 농도와 비례하여, 반응시간 당 흡광도를 측정한 기울기 값의 평균으로 효소의 활성도를 구할 수 있다. 시그마로부터 구입한 p-nitrophenol의 standard curve를 이용하여 농도 환산하였다. 실시예 2과 실시예 3의 활성은 아래 표 1과 같이, 각각 0.026 mM/min과 0.057 mM/min 임을 알 수 있었고, 실시예 3가 실시예 2에 비해 2.2배 높은 활성을 나타낸다는 것을 알 수 있었다.
[표 1]
Figure 112018107828649-pat00001
[실험예 4 : 실시예 2(CA) 및 실시예 3(CLEAs)의 재사용 및 저장 안정성 측정]
효소의 재사용 및 저장 안정성을 측정하기 위해서, 효소 활성도를 측정한 후, 실시예 2 및 실시예 3를 10mM phosphate buffer(pH 6.5)에 4~5번 반복하여 세척한 후 각각 쉐이킹(shaking) 조건에 보관하였다. 그리고 재사용 시 실험예 3과 같은 방법으로 활성 측정하였다. 모든 샘플들은 오차 분석을 위해서 3개씩의 샘플을 각각 이용하였다. 오차의 표준편차도 그래프와 함께 조절하였다. 도 10 및 도 11에서 확인할 수 있듯이, 실시예 2 및 실시예 3 모두 쉐이킹(shaking) 조건에 보관하여 각각 5번의 재사용 및 7일 이상의 저장 기간에도 그 활성이 처음의 70%와 100%를 지님을 통해 안정화 됨을 알 수 있었다. 실시예 3가 보다 우수하다는 것을 알 수 있었다.
본 명세서에서는 본 발명자들이 수행한 다양한 실시예 가운데 몇 개의 예만을 들어 설명하는 것이나 본 발명의 기술적 사상은 이에 한정하거나 제한되지 않고, 당업자에 의해 변형되어 다양하게 실시될 수 있음은 물론이다.

Claims (11)

  1. 마그네틱 비드(bead), 그래핀 옥사이드(graphene oxide, GO) 및 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol, PEG)이 혼합되어 제조되되,
    마그네틱 비드는,
    자성 물질이 침전되고, 아민 그룹을 가진 폴리스티렌 비드(bead)이고,
    내부 공극에 카르복실 에스터레이즈(carboxyl esterase) 효소가 고정된 것을 특징으로 하는, GO/PEG 자성 비드.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 그래핀 옥사이드(GO)와 폴리에틸렌글리콜(PEG)를 혼합하여 GO/PEG 혼합물을 제조하는 제1-1단계;
    GO/PEG 혼합물에 마그네틱 비드(bead)를 혼합하는 제1-2단계;
    마그네틱 비드와 혼합된 GO/PEG 혼합물에 초음파를 처리하는 제1-3단계; 및
    내부 공극에 카르복실 에스터레이즈(carboxyl esterase) 효소를 고정시키는 제2단계;를 포함하되,
    제1-2단계의 마그네틱 비드는,
    자성 물질이 침전되고, 아민 그룹을 가진 폴리스티렌 비드(bead)인 것을 특징으로 하는, GO/PEG 자성 비드 제조방법.
  6. 삭제
  7. 제5항에 있어서, 제1-3단계는,
    10~90분 동안 초음파 처리하는 것을 특징으로 하는, GO/PEG 자성 비드 제조방법.
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 제5항에 있어서, 제2단계는,
    효소를 공유 결합에 의해 비드 내부에 고정시키는 것을 특징으로 하는, GO/PEG 자성 비드 제조방법.
  11. 제5항에 있어서, 제2단계는,
    효소를 공유 결합에 의해 비드 내부에 고정시키는 제2-1단계; 및
    효소를 가교시켜 비드 내부에 고정시키는 제2-2단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는, GO/PEG 자성 비드 제조방법.



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