CN106701729A - 一种以多肽修饰的氨基树脂为载体的固定化酶及制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种以多肽修饰的氨基树脂为载体的固定化酶及制备方法，固定化酶载体采用多肽修饰的氨基树脂，所述多肽分别为由长度不同的亮氨酸或苯丙氨酸残基组成的肽链，链肽羧端与树脂上的氨基形成肽键偶联在树脂上。本发明以脂肪酶为目标酶，以氨基树脂为载体，通过芴甲氧羰基多肽固相合成方法接枝疏水性的氨基酸链，在氨基树脂表面接枝链长不同的多肽片段，在载体表面形成一种稳定的疏水性环境，获得一种表面环境相对疏水的功能性载体；通过物理吸附将脂肪酶结合于经修饰的氨基树脂上，通过疏水等作用力相结合，提高固定化酶的稳定性。
Description
技术领域
本发明属于酶工程技术和多肽合成技术领域，具体涉及一种以多肽修饰的氨基树脂为载体的固定化酶研究方法及制备方法。
背景技术
酶是一类有生物催化功能的高分子物质，其化学本质是蛋白质，酶催化作用有高选择性、高催化活性、反应条件温和、环保无污染等优点。但游离状态的酶在高温、强酸、强碱、高离子强度、有机溶剂等环境中稳定性较差、易失活，并且反应后会和产物等物质混合，纯化困难不能重复使用。为了增强酶的催化活性和稳定性，提高酶的利用率，用物理或化学方法使酶与大分子载体结合或把酶包埋在凝胶或半透膜的微囊体中，这一过程称为酶固定化。固定化酶的稳定性一般会增加，可以非常顺利的从反应系统中分离出来，便于运输和贮存，易于控制，能多次使用。
固定化效率是酶固定化过程中的核心问题，其性能主要取决于固定化的载体材料和固定化的方法。常用的载体分为有机载体和无机载体，常用的无机载体有氧化硅、氧化钛、氧化铝陶瓷、硅藻土等；有机载体包括琼脂糖、葡聚糖、纤维素等天然高分子载体，及聚乙烯、聚苯乙烯和聚丙烯酸酯等合成有机高分子载体。传统的酶固定化方法大致可分为4类：吸附法、交联法、包埋法、共价结合法，其中吸附法因操作简单方便、吸附容量较大、工艺成本低等优点，是固定化酶最常用的方法。
研究表明，不同基质的酶固定化载体的表面基团亲疏水性不同，导致它表面微环境的亲疏水存在差异，而通过吸附作用固定化脂肪酶时，载体表面亲疏水环境的不同会对固定化效率、以及固定化酶的稳定性有较大影响。因此，选择酶固定化载体时，不仅要考虑酶负载量的大小和连接的牢固性，同时也需兼顾载体表面的基团亲疏水性，使载体表面亲疏水环境与所需固定酶的亲疏水性相匹配。但由于目前缺乏最适宜酶固定化的亲疏水环境数据，且无法实现载体表面亲疏环境强弱的有效调控，使得人们在选择酶固定化载体时的盲目性较大。
氨基酸是含有氨基和羧基的一类有机化合物的通称，是组成生物大分子的基本的单位，其基本结构中有1个α-NH 2和1个α-COOH，根据其侧链基团亲疏水性的不同，我们将常见的20种氨基酸分为亲疏水性氨基酸和疏水性氨基酸。不同链长、不同氨基酸组合的多肽具有不同的亲疏水性。因此，通过合理的序列设计，并通过多肽固相合成的方法，在载体表面接枝不同的多肽片段，便可得到具有不同亲疏水性微环境表面的酶固定化载体。这类功能性载体表面存在一定厚度，且具有不同亲疏水性的氨基酸片段，其表面疏水的微环境与所需要固定的酶的疏水性相近，使得载体通过疏水等作用力吸附酶，尽可能的减少吸附过程中载体对酶催化活性的改变，可为酶分子提供一个稳定、适宜的催化微环境，提高固定化酶的稳定性。但目前有关这方面的方法、技术均未见报道。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术的问题，提供一种能提高脂肪酶的稳定性和使用效率的固定化酶。
为实现上述技术目的，本发明采用如下技术方案：
一种以多肽修饰的氨基树脂为载体的固定化酶，包括脂肪酶和脂肪酶固定化所需载体，
所述载体为多肽修饰的氨基树脂；
所述的多肽为氨基酸序列为6、8、10、12、14或16个亮氨酸残基组成的多肽片段；或6、8、10、12或14个苯丙氨酸残基组成的多肽片段；
残基羧基端的羧基与氨基树脂上的氨基形成肽键偶合。
优选的，所述的多肽为氨基酸序列为10个亮氨酸残基组成的多肽片段或10个苯丙氨酸残基组成的多肽片段。
本发明的另一目的在于提供一种以多肽修饰的氨基树脂为载体的固定化酶的制备方法，为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种以多肽修饰的氨基树脂为载体的固定化酶的制备方法，包括如下步骤：
1）树脂载体的制备；采用芴甲氧羰基多肽固相合成法，将芴甲氧羰基保护的氨基酸与氨基树脂上的氨基形成肽键偶联到氨基树脂上，并根据设计需求延长氨基酸链长度，得到经多肽修饰的氨基树脂载体；
其中，所述的芴甲氧羰基保护的氨基酸为芴甲氧羰基-L-亮氨酸或芴甲氧羰基-L-苯丙氨酸；
芴甲氧羰基保护的氨基酸为芴甲氧羰基-L-亮氨酸时，氨基酸链长度为6、8、10、12、14或16；芴甲氧羰基保护的氨基酸为芴甲氧羰基-L-苯丙氨酸时，氨基酸链长度为6、8、10、12或14；
2）固定化酶的制备：将多肽修饰的氨基树脂载体加入脂肪酶溶液中，振荡反应后将液体滤出，用缓冲液淋洗，抽干后获取所述固定化酶。
本发明的上述方法，所述步骤1）还包括：
①将氨基树脂溶胀；
②按照氨基酸序列中的从羧基端到氨基端的顺序，依次将芴甲氧羰基保护的氨基酸偶联到树脂上；
③脱去末端氨基酸上的芴甲氧羰基。
优选的，上述步骤1）中，偶联过程中，使用的缩合试剂为1-羟基苯并三唑和N,N'-二异丙基碳酰亚胺的组合物；氨基树脂位点数、氨基酸、1-羟基苯并三唑和N,N'-二异丙基碳酰亚胺的物质的量的比为1：3：3：3。
上述步骤③中，使用含20%v/v哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液，反应10min×4，脱去末端氨基酸上的芴甲氧羰基；
优选的，脱去末端氨基酸上芴甲氧羰基后，用N,N-二甲基甲酰胺将树脂洗涤数遍，抽滤掉滤液，分别用甲醇和二氯甲烷交替洗涤，保证最后一遍使用甲醇进行洗涤，抽干既得所需的载体。
上述步骤2）中。将载体加入脂肪酶溶液中，30℃振荡反应6h，通过砂芯管将酶液滤出，用缓冲液淋洗，抽干后获取所述固定化酶；
优选的，脂肪酶溶液浓度为4mg/mL，溶剂为0.02M pH7.0的磷酸盐和0.2M的氯化钠缓冲液；对于每克干重的载体，脂肪酶溶液的用量为50mL。
脂肪酶是一种应用广泛的工业生物催化剂，但稳定性较差。本发明以脂肪酶为目标酶，以氨基树脂为载体，通过芴甲氧羰基多肽固相合成方法接枝疏水性的氨基酸链，在氨基树脂表面接枝链长不同的多肽片段，在载体表面形成一种稳定的疏水性环境，获得一种表面环境相对疏水的功能性载体；通过物理吸附将脂肪酶结合于经修饰的氨基树脂上，通过疏水等作用力相结合，提高固定化酶的稳定性。
附图说明
图1为本发明实施例1-3的技术路线图。
图2为采用不同长度的亮氨酸多肽链修饰的树脂的接触角-多肽链长度关系曲线图。
图3为采用不同长度的苯丙氨酸多肽链修饰的树脂的接触角-多肽链长度关系曲线图。
图4为经长度不同的多肽链修饰后的树脂吸附脂肪酶后的酶活测试条状图。
图5为氨基树脂-脂肪酶和多肽链长度为10的氨基树脂-亮氨酸残基-脂肪酶、氨基树脂-亮氨酸残基-脂肪酶的酶活随时间变化示意图。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例中酶活力检测方法如下：
酶活定义：以对乙酸对硝基苯酯(p-NPA)为底物，在7℃、pH7.0的条件下，1min内水解产生1μmol对硝基苯酚所需的酶量定义为一个酶活力位（U）。
测定方法：取适当的固定化酶加入5mL37℃的0.02M pH7.0的磷酸盐•0.2M的氯化钠缓冲液，将其与0.05mmol/L、pH7.0的p-NPA溶液5ml混合后，于37℃摇床，200转/min振荡反应10min。取出反应管后立即放入冰浴中终止反应，通过砂芯过滤取出反应液，稀释10倍，在400nm下测定吸光度。以未修饰载体加5mL底物和5mL缓冲液同等条件下反应10min为空白对照。
本发明实施例固定化酶制备的技术路线如图1所示。
实施例1：链长不同的亮氨酸多肽链修饰的氨基树脂载体制备
称取氨基树脂5g，将树脂于多肽固相合成反应管中溶胀；称适量芴甲氧羰基-L-亮氨酸，1-羟基苯并三唑和N,N'-二异丙基碳酰亚胺，用15ml N,N-二甲基甲酰胺溶解后放入反应器中；N2鼓吹反应3h后过滤反应液，加入N,N-二甲基甲酰胺洗涤树脂3次。
取上述少量树脂于离心管中，向其中依次加入苯酚溶液、茚三酮溶液，然后将其置于105℃的油锅中反应5分钟，反应结束后，观察离心管中的溶液颜色。
若显色反应为明黄色，将多肽反应管中的反应液抽滤除去，并用N,N-二甲基甲酰胺洗涤6遍，加入20%v/v哌啶/N,N-二甲基甲酰胺溶液，反应15min，再重复加入20%哌啶洗涤3次后，脱除芴甲氧羰基。再用N,N-二甲基甲酰胺洗涤8次。
称适量芴甲氧羰基-L-亮氨酸、1-羟基苯并三唑和N,N'-二异丙基碳酰亚胺，用15mlN,N-二甲基甲酰胺溶解后放入反应管中，进行鼓吹反应，进行缩合反应形成肽键。
按照设计的多肽链的氨基酸顺序，重复上述的缩合和脱保护反应，合成所需的肽链。
偶联上最后一个氨基酸以后，根据上述方法脱去末端氨基酸上芴甲氧羰基，用N,N-二甲基甲酰胺将树脂洗涤8遍，抽滤掉滤液，分别用甲醇和二氯甲烷交替洗涤4次，保证最后一遍使用甲醇进行洗涤，抽干既得所需的载体。链长不同的亮氨酸多肽链修饰树脂载体的疏水性测试如图2所示，经过接触角仪表征，修饰后的树脂疏水性增强，符合预期的设计。
实施例2：链长不同的苯丙氨酸多肽链修饰的氨基树脂载体制备
称取氨基氨基树脂5g，将树脂于多肽固相合成反应管中溶胀；称适量芴甲氧羰基-L-苯丙氨酸，1-羟基苯并三唑和N,N'-二异丙基碳酰亚胺，用15ml N,N-二甲基甲酰胺溶解后放入反应器中；N2鼓吹反应3h后过滤反应液，加入N,N-二甲基甲酰胺洗涤树脂3次。
取上述的少量树脂于离心管中，向其中依次加入苯酚溶液、茚三酮溶液，然后将其置于105℃的油锅中反应5分钟，反应结束后，观察离心管中的溶液颜色。
若显色反应为明黄色，将多肽反应管中的反应液抽滤除去，并用N,N-二甲基甲酰胺洗涤6遍，加入20%v/v哌啶/N,N-二甲基甲酰胺溶液，反应15min，再重复加入20%哌啶洗涤3次后，脱除芴甲氧羰基。再用N,N-二甲基甲酰胺洗涤8次。
称适量芴甲氧羰基-L-亮氨酸、1-羟基苯并三唑和N,N'-二异丙基碳酰亚胺，用15mlN,N-二甲基甲酰胺溶解后放入反应管中，进行鼓吹反应，进行缩合反应形成肽键。
按照设计的多肽链的氨基酸顺序，重复上述的缩合和脱保护反应，合成所需的肽链。
偶联上最后一个氨基酸以后，根据上述方法脱去末端氨基酸上芴甲氧羰基，用N,N-二甲基甲酰胺将树脂洗涤8遍，抽滤掉滤液，分别用甲醇和二氯甲烷交替洗涤4次，保证最后一遍使用甲醇进行洗涤，抽干既得所需的载体。链长不同的苯丙氨酸多肽链修饰树脂载体的疏水性测试如图3所示，经过接触角仪表征，修饰后的树脂疏水性增强，符合预期的设计。
实施例3：氨基树脂-脂肪酶的制备
将所获得的固定化酶载体应用于脂肪酶的固定化中。称取以未经修饰的氨基树脂，按固液比0.1g：5mL加入脂肪酶酶液（酶液浓度为4mg/ml），于30℃，180rpm摇床振荡6h；反应结束后滤除反应液，用0.02M pH7.0的磷酸盐•0.2M的氯化钠缓冲液淋洗4次，抽滤除去缓冲液后得到氨基树脂-脂肪酶。
实施例4：氨基树脂-亮氨酸残基（长度为6、8、10、12、14、16）-脂肪酶的制备
将所获得的固定化酶载体应用于脂肪酶的固定化中。称取以实施例1中制备好的氨基树脂-亮氨酸残基（长度6、8、10、12、14、16）0.1g置于反应管中，按照固液比0.1g：5mL加入脂肪酶酶液（酶液浓度为4mg/ml），于30℃，180rpm摇床振荡6h；反应结束后滤除反应液，用0.02M pH7.0的磷酸盐•0.2M的氯化钠缓冲液淋洗4次，抽滤抽干后既得氨基树脂-亮氨酸残基（长度为6、8、10、12、14、16）-脂肪酶。经长度不同的多肽链修饰后的树脂吸附脂肪酶后，进行酶活测试，如图4所示，其中，亮氨酸肽链修饰的树脂中，长度为10的固定化效果最佳。
实施例5：氨基树脂-苯丙氨酸残基（长度为6、8、10、12、14）-脂肪酶的制备
将所获得的固定化酶载体应用于脂肪酶的固定化中。称取以实施例2中制备好的氨基树脂-苯丙氨基酸残基（长度6、8、10、12、14） 0.1g置于反应管中，按照固液比0.1g：5mL加入脂肪酶酶液（酶液浓度为4mg/ml），于30℃，180rpm摇床振荡6h；反应结束后滤除反应液，用0.02M pH7.0的磷酸盐•0.2M的氯化钠缓冲液淋洗4次，抽滤抽干后既得氨基树脂-苯丙氨酸残基（长度为6、8、10、12、14）-脂肪酶。经长度不同的多肽链修饰后的树脂吸附脂肪酶后，进行酶活测试，如图4所示，其中，苯丙氨酸肽链修饰的树脂中，长度为10的固定化效果最佳。
实施例6：氨基树脂-脂肪酶、氨基树脂-亮氨酸残基（长度为10）-脂肪酶和氨基树脂-苯丙氨酸残基（长度为10）-脂肪酶的稳定性
按照实施例3、4、5方法制得固定化酶。取一定量的氨基树脂-脂肪酶、氨基树脂-亮氨酸残基（长度为10）-脂肪酶和氨基树脂-亮氨酸残基（长度为10）-脂肪酶置于4℃冰箱贮存，每隔三天取出测定酶活，初始酶活记为100%，计算固定化酶和未修饰的载体固定化酶经不同贮存时间和不同使用次数后的残余酶活。如图5所示，每隔三天测一次酶活，载体未修饰的固定化酶在存放6天后，残余酶活力为45.89%，即未经修饰氨基树脂-脂肪酶的酶活半衰期不足6天，存放12天后残余酶活下降到7.31%；而经氨基酸修饰后的载体固定化酶氨基树脂-亮氨酸残基（长度为10）-脂肪酶和氨基树脂-苯丙氨酸残基（长度为10）-脂肪酶，贮存12天后残余酶活分别为92.75%和80.86%，21天后其残余酶活仍可达初始值的36.66%和50.66%，显示出良好的稳定性。
Claims (10)
1.一种以多肽修饰的氨基树脂为载体的固定化酶，包括脂肪酶和脂肪酶固定化所需载体，其特征在于，
所述载体为多肽修饰的氨基树脂；
所述的多肽为氨基酸序列为6、8、10、12、14或16个亮氨酸残基组成的多肽片段；或6、8、10、12或14个苯丙氨酸残基组成的多肽片段；
残基羧基端的羧基与氨基树脂上的氨基形成肽键偶合。
2.根据权利要求1所述的固定化酶，其特征在于，所述的多肽为氨基酸序列为10个亮氨酸残基组成的多肽片段，或10个苯丙氨酸残基组成的多肽片段。
3.一种以多肽修饰的氨基树脂为载体的固定化酶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
1）树脂载体的制备；采用芴甲氧羰基多肽固相合成法，将芴甲氧羰基保护的氨基酸与氨基树脂上的氨基形成肽键偶联到氨基树脂上，并根据设计需求延长氨基酸链长度，得到经多肽修饰的氨基树脂载体；
其中，所述的芴甲氧羰基保护的氨基酸为芴甲氧羰基-L-亮氨酸或芴甲氧羰基-L-苯丙氨酸；
芴甲氧羰基保护的氨基酸为芴甲氧羰基-L-亮氨酸时，氨基酸链长度为6、8、10、12、14或16；芴甲氧羰基保护的氨基酸为芴甲氧羰基-L-苯丙氨酸时，氨基酸链长度为6、8、10、12或14；
2）固定化酶的制备：将多肽修饰的氨基树脂载体加入脂肪酶溶液中，振荡反应后将液体滤出，用缓冲液淋洗，抽干后获取所述固定化酶。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1）还包括：
①将氨基树脂溶胀；
②按照氨基酸序列中的从羧基端到氨基端的顺序，依次将芴甲氧羰基保护的氨基酸偶联到树脂上；
③脱去末端氨基酸上的芴甲氧羰基。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1）中，偶联过程中，使用的缩合试剂为1-羟基苯并三唑和N,N'-二异丙基碳酰亚胺的组合物；氨基树脂位点数、氨基酸、1-羟基苯并三唑和N,N'-二异丙基碳酰亚胺的物质的量的比为1：3：3：3。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤③中，使用含20%v/v哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液，反应10min×4，脱去末端氨基酸上的芴甲氧羰基。
7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤③中，脱去末端氨基酸上芴甲氧羰基后，用N,N-二甲基甲酰胺将树脂洗涤数遍，抽滤掉滤液，分别用甲醇和二氯甲烷交替洗涤，保证最后一遍使用甲醇进行洗涤，抽干既得所需的载体。
8.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1）中，氨基酸链长度为10。
9.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2）具体为：将载体加入脂肪酶溶液中，30℃振荡反应6h，通过砂芯管将酶液滤出，用缓冲液淋洗，抽干后获取所述固定化酶。
10.根据权利要求3或9所述的方法，其特征在于，所述步骤2）中，脂肪酶溶液浓度为4mg/mL，溶剂为0.02M pH7.0的磷酸盐和0.2M的氯化钠缓冲液；对于每克干重的载体，脂肪酶溶液的用量为50mL。
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