CN108034651A - 一种协同固载l-阿拉伯糖异构酶和离子液体的方法 - Google Patents

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王静
刘鹏
齐菲
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Abstract

本发明提供了一种协同固载L‑阿拉伯糖异构酶和离子液体的方法，腈纶纤维为载体，协同固载离子液体和L‑阿拉伯糖异构酶，方法包括如下步骤：腈纶纤维、化合物I和去离子水30mL加入到三口瓶中，回流后取出纤维试样，抽滤，用水洗涤，晾干后，真空干燥，得PANF‑I，化合物I的分子式为H2N(CH2)nCH2NH2；干燥的PANF‑I，在HY酸溶液中，搅拌，取出所形成的纤维固载离子液体，抽滤，淋洗，晾干后，干燥；将PANF‑II和5mL游离酶液加入到交联剂中，振荡交联，倾去溶液，分别用0.9％氯化钠和去离子水洗涤固定化酶颗粒，抽滤干燥即得固定化酶，低温保存。本发明以腈纶纤维为载体，协同固载硝酸乙胺类离子液体和L‑阿拉伯糖异构酶，该方法条件温和，收率高，方法简单，易于大规模制备。

Description

一种协同固载L-阿拉伯糖异构酶和离子液体的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其是涉及一种协同固载L-阿拉伯糖异构酶和离子液体的方法。
背景技术
L-阿拉伯糖异构酶是一种胞内酶，能催化合成D-塔格糖、L-核酮糖等稀有功能糖，在食品和医药领域有着重要应用。其中L-核酮糖可经过一步生物催化转化得到L-核糖，L-核糖在食品和药物上具有巨大的潜在生物活性，而L-核酮糖是制备L-核糖最有效的生物合成途径，其中L-阿拉伯糖异构酶是生物法生产L-核酮糖最有效的酶之一。近年来，国内外研究报道了一些可用来发酵生产L-阿拉伯糖异构酶的微生物，但这些微生物产酶水平均较低，若以游离酶形式生产L-核酮糖，存在添加量偏大且不利于产品的分离纯化等缺点，造成生产成本高，不利于实现工业化生产。而固定化可以使酶具有酶活稳定、易回收、可重复使用等优点，这样可以减少L-阿拉伯糖异构酶的使用量，从而相应地降低L-核酮糖的生产成本。
聚丙烯腈纤维即腈纶纤维(PANF)，通常是指含丙烯腈在85％以上的丙烯腈共聚物或均聚物的纤维材料。腈纶纤维的内部结构十分独特，聚丙烯腈聚合物链具有不规则的螺旋形构象，而且没有十分严格的结晶区，但是有高低排列的区别，这种结构使腈纶纤维具备许多优良性能。腈纶纤维比表面积大，适宜固载较多的功能基团；容易回收，仅需简单过滤即可从反应体系中取出；柔韧性好，在反应过程中不易破碎；价格低廉。腈纶纤维表面存在大量的具有化学活性的氰基，这些腈基能够通过简单的化学方法转化为酰胺、偕肟胺、羧基等基团，这些特性使腈纶纤维成为固载催化的理想载体材料。此外，离子液体(IL)由于其独特的物理和化学性质，在酶催化的过程中对酶的活性、稳定性和选择性均有显著的影响。
发明内容
有鉴于此，本发明旨在提出一种协同固载L-阿拉伯糖异构酶和离子液体的方法，以腈纶纤维(PANF)为载体，协同固载硝酸乙胺类离子液体和L-阿拉伯糖异构酶，该方法条件温和，收率高，方法简单，易于大规模制备。
为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：
一种协同固载L-阿拉伯糖异构酶和离子液体的方法，腈纶纤维(PANF)为载体，协同固载离子液体和L-阿拉伯糖异构酶，方法包括如下步骤：
步骤1)干燥的腈纶纤维(PANF)2.0g、0.12mol化合物I和去离子水30mL加入到100mL的三口瓶中，电磁搅拌下回流4h然后取出纤维试样，抽滤，用60-70℃的水反复洗涤至洗液呈中性，空气中晾干后，再经60℃下真空干燥12h，得PANF-I，化合物I的分子式为H2N(CH2)nCH2NH2；
步骤2)干燥的PANF-I，在相应的HY酸溶液中，室温下搅拌3h，然后取出所形成的纤维固载离子液体，抽滤，用去离子水淋洗至中性，空气中晾干后，再在60℃下真空干燥12h；
步骤3)将PANF-II和5mL游离酶液加入到交联剂中，室温下振荡交联1h，倾去溶液，分别用0.9％氯化钠和去离子水洗涤固定化酶颗粒，抽滤干燥即得固定化酶，低温保存。
优选的，所述步骤1)所述化合物I中n＝1～10。
优选的，所述步骤2)所述HY中，阴离子为：NO3 -、Cl-、Br-，HSO4 -和CF3SO3 -中的一种或几种，优选的，阴离子为NO3 -。
优选的，所述步骤2)所述HY的浓度为0.1～10M，当量数为0.1～10eq。
优选的，所述步骤3)所述的交联剂为：乙二醛、丙二醛、丁二醛、戊二醛和己二醛中一种或几种，优选的，交联剂为戊二醛。
优选的，所述步骤3)所述交联剂的质量分数为0.1～10％。
优选的，所述步骤1)所述化合物I中n＝2。
优选的，所述步骤2)所述HY的浓度为1M，当量数为2eq。
优选的，所述步骤3)所述交联剂的质量分数为0.5％。
相对于现有技术，本发明所述的协同固载L-阿拉伯糖异构酶和离子液体的方法具有以下优势：
本发明所述的协同固载L-阿拉伯糖异构酶和离子液体的方法，以腈纶纤维材料作为固定化载体，可以不同的形式满足生物反应器设计的要求，如片状、束状和织物膜状；经过离子液体修饰后的腈纶纤维载体，不仅在后续与酶交联时可以提高纤维载体的酶蛋白固定量，同时可以有效提高固载后酶的活性，具有广阔的商业应用前景。
具体实施方式
除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下面结合实施例来详细说明本发明。
实施例1
步骤一PANF-I的制备
干燥的腈纶纤维(PANF)2.0g、乙二胺(0.12mol)和去离子水30mL加入到100mL的三口瓶中，电磁搅拌下回流4h然后取出纤维试样，抽滤，用60-70℃的水反复洗涤至洗液呈中性。空气中晾干后，再经60℃下真空干燥12h，得PANF-I。
步骤二PANF-II的制备
干燥的PANF-I，在1M，2eq的硝酸溶液中，室温下搅拌3h，然后取出所形成的纤维固载离子液体，抽滤，用去离子水淋洗至中性。空气中晾干后，再经真空干燥(60℃)12h。
步骤三PANF-III的制备
将PANF-II和5mL游离酶液加入到28mL质量分数为0.5％的戊二醛水溶液中，室温(25℃)下振荡交联1h，倾去溶液，分别用0.9％氯化钠和去离子水洗涤固定化酶颗粒，抽滤干燥即得固定化酶，低温保存。
酶活的测定：
游离酶1mL或固定化酶1g加入100mmol/L底物L-阿拉伯糖(pH7.2，PBS缓冲溶液配制)，50℃反应30min，HCl停止反应，离心除去除去酶蛋白，将上清液适当稀释后，按BK法测定L-核酮糖的浓度，并计算酶活。
L-阿拉伯糖异构酶的酶活定义为：以L-阿拉伯糖为底物，1min内转化生成1μg的L-核酮糖所需要的酶量为一个酶活力单位。
L-阿拉伯糖异构酶的相对酶活：设定同组酶活最高的相对酶活为100％，以同组最高酶活为参照，计算出的比值为相对酶活。
该实施例1制备的固定化酶的酶活力可达60.5U。
实施例2
步骤一PANF-I的制备
干燥的腈纶纤维(PANF)2.0g、0.12mol的丁二胺和去离子水30mL加入到100mL的三口瓶中，电磁搅拌下回流4h然后取出纤维试样，抽滤，用60-70℃的水反复洗涤至洗液呈中性。空气中晾干后，再经60℃下真空干燥12h，得PANF-I。
步骤二PANF-II的制备
干燥的PANF-I，在1M，2eq的硫酸溶液中，室温下搅拌3h，然后取出所形成的纤维固载离子液体，抽滤，用去离子水淋洗至中性。空气中晾干后，再经真空干燥(60℃)12h。
步骤三PANF-III的制备
将PANF-II和5mL游离酶液加入到28mL质量分数为0.5％的戊二醛水溶液中，室温(25℃)下振荡交联1h，倾去溶液，分别用0.9％氯化钠和去离子水洗涤固定化酶颗粒，抽滤干燥即得固定化酶，低温保存。
酶活的测定：
游离酶1mL或固定化酶1g加入100mmol/L底物L-阿拉伯糖(pH7.2，PBS缓冲溶液配制)，50℃反应30min，HCl停止反应，离心除去除去酶蛋白，将上清液适当稀释后，按BK法测定L-核酮糖的浓度，并计算酶活。
L-阿拉伯糖异构酶的酶活定义为：以L-阿拉伯糖为底物，1min内转化生成1μg的L-核酮糖所需要的酶量为一个酶活力单位。
L-阿拉伯糖异构酶的相对酶活：设定同组酶活最高的相对酶活为100％，以同组最高酶活为参照，计算出的比值为相对酶活。
该实施例2制备的固定化酶的酶活力可达57.4U。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种协同固载L-阿拉伯糖异构酶和离子液体的方法，其特征在于：腈纶纤维即PANF为载体，协同固载离子液体和L-阿拉伯糖异构酶，方法包括如下步骤：
步骤1)干燥的腈纶纤维即PANF2.0g、0.12mol化合物I和去离子水30mL加入到100mL的三口瓶中，电磁搅拌下回流4h然后取出纤维试样，抽滤，用60-70℃的水反复洗涤至洗液呈中性，空气中晾干后，再经60℃下真空干燥12h，得PANF-I，化合物I的分子式为H2N(CH2)nCH2NH2；
步骤2)干燥的PANF-I，在相应的HY酸溶液中，室温下搅拌3h，然后取出所形成的纤维固载离子液体，抽滤，用去离子水淋洗至中性，空气中晾干后，再在60℃真空干燥12h；
步骤3)将PANF-II和5mL游离酶液加入到交联剂中，室温下振荡交联1h，倾去溶液，分别用质量分数0.9％氯化钠和去离子水洗涤固定化酶颗粒，抽滤干燥即得固定化酶，低温保存。
2.根据权利要求1所述的协同固载L-阿拉伯糖异构酶和离子液体的方法，其特征在于：步骤1)所述化合物I中n＝1～10。
3.根据权利要求1所述的协同固载L-阿拉伯糖异构酶和离子液体的方法，其特征在于：步骤2)所述HY中，阴离子为：NO3 -、Cl-、Br-，HSO4 -和CF3SO3 -中的一种或几种，优选的，阴离子为NO3 -。
4.根据权利要求1所述的协同固载L-阿拉伯糖异构酶和离子液体的方法，其特征在于：步骤2)所述HY的浓度为0.1～10M，当量数为0.1～10eq。
5.根据权利要求1所述的协同固载L-阿拉伯糖异构酶和离子液体的方法，其特征在于：步骤3)所述的交联剂为：乙二醛、丙二醛、丁二醛、戊二醛和己二醛中一种或几种，优选的，交联剂为戊二醛。
6.根据权利要求1所述的协同固载L-阿拉伯糖异构酶和离子液体的方法，其特征在于：步骤3)所述交联剂的质量分数为0.1～10％。
7.根据权利要求2所述的协同固载L-阿拉伯糖异构酶和离子液体的方法，其特征在于：步骤1)所述化合物I中n＝2。
8.根据权利要求4所述的协同固载L-阿拉伯糖异构酶和离子液体的方法，其特征在于：步骤2)所述HY的浓度为1M，当量数为2eq。
9.根据权利要求6所述的协同固载L-阿拉伯糖异构酶和离子液体的方法，其特征在于：步骤3)所述交联剂的质量分数为0.5％。
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