JPS6344884A - リゾチ−ム精製用アフイニテイ−クロマトグラフイ−担体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

に産業上の利用分野） 本発明は、有用な酵素であるリゾチームの精製に好適な
アフィニティークロマ１−グラフィー担体を提供するも
のである。

【従来の技術Ｘ リゾチームは酵素の中でも比較的多量に存在しているも
ので、例えば卵白から精製するときは等電点沈澱法によ
り、比較的容易に結晶として得ることができる。しかし
、細菌、１１１１胞等からリゾチームを精製する場合に
は、その含有濃度が極めて希薄であるために、長時間と
かなりの手間を必要とする。アグリカルチュラル ジカル・ケミストリー〈＾ｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　ａ
ｎｄ　Ｂｉｏ　−ｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｎｉｓｔｒｙ
　）　３７　（３）巻，４６５〜４７０頁。 １９７３年の報文には、キチン粉末を利用したアフィニ
ティークロマトグラフィーによる精製法及び、セルロー
ス粉末にアルカリキチンをコーティングして酸性溶液で
キチン化する、セルロースにキチンをコーティングした
ものを用いてリゾチームを精製する試みが発表されてい
る。しかし、キチンそのものを粉砕し粉末にして使用し
た場合には、水とのなじみも悪く、カラムに充填した際
にも通液性等に問題があり、又リゾチームの吸着量が低
い欠点がある。 キチンコーティングセルロースはキチン粉末より水にな
じみ易い点は勝れているがキチンがセルロース粉末の表
面のみ゛を覆っているため持ちが悪く吸Ｗｆｆｉもそれ
程高くなく、又、セルロースが粉末のため通液性を悪く
覆る欠点がある。又、キチンはリゾチームの基質である
ため、長時間にわたる使用時その分解を防ぐために、低
温で使用しなｃプればならないという制約があった。 Ｋｎ明が解決しようとする問題点】 本発明は、リゾチームの吸着量が高く、カラムに充填し
た際の通液性に優れた、多孔質キチンよりなるリゾチー
ム精製用アフィニティークロマトグラフィー担体を得る
ことを目的とする。 多孔質粒状キトサンをアセチル化することによりキチン
の多孔質化とその比表面積の増大により、リゾチーム吸
着量の増大化を計ることが考えられるが、リゾチーム受
容量を増しても更に、粒状体の強度を向上させる必要が
ある。粒状体の強度を向上させるために架橋反応を行う
場合、架橋剤として非特異的な吸着を増大させるような
試薬を用いることは避けなければならない。このような
条件を満足する架橋剤について本発明者等は検討した結
果、アジピン酸誘導体が架橋剤として勝れていることを
見出して本発明をなすに至ったものである。 Ｋ問題点を解決するための手段】 本発明は、多孔質粒状キトサンをジカルボン酸誘導体で
架橋させた後、アセチル化剤でアセチル化して得られる
新規なリゾチーム精製用アフィニティークロマトグラフ
ィー担体に関するものである。 本発明に用いる多孔質粒状キトサンの製造法は、特開昭
６１−４０３３７号に開示された方法で作られる。 即ち、平均分子量が１０，０００〜２３０，０００の低
分子量キトサンを酢酸、ジクロル酢酸、蟻酸の単独、若
しくは混合物の水溶液に溶解し、該溶液を塩基性溶液よ
りなる凝固浴中に落下せしめて多孔質粒状キトサンを得
る。 凝固浴としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、
炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、アンモニア、エチレン
ジアミン等のアルカリ性物質を水、又はメタノール、エ
タノール等の極性を有するアルコール類、又は水とアル
コールとの混合物に加えたものを用いる。 上記のような方法で製造された多孔質粒状キトサンを常
温で約２４時間ジカルボン酸誘導体と溶媒中で攪拌して
架橋反応をさせる。架橋剤としては、ジカルボン酸の誘
導体であるジカルボン酸の活性］−ステルの例えば、ジ
−ｐ−ニトロフェニルエスチル、ジ−Ｎ−ヒドロキシス
クシイミドエステル等もしくは酸クロライド、酸ブロマ
イド等のジカルボン酸ハロゲン化物が用いられる。そし
てジカルボン酸としては一般式　０　　　０　のｎがＨ
ＯＣ（ＣＨ２）。Ｃ叶 ０〜８の範囲にあるシュウ酸、アジピン酸、セバシン酸
を用いるのが好ましい。 ジカルボン酸を活性化することなく、直接キトサンと架
橋させるためには、ジシクロへキシルカルボイミド等の
縮合試薬を用いれば可能であるが、ジカルボン酸をキト
サンのアミノ基のみに反応させることは困難で、キトサ
ンの水酸基とも反応しエステル結合を生ずる。このエス
テル結合はアルカリ域で脱離しやすくアルカリ域で使用
するときには脱離しカルボン酸を生じ、これにより非特
異吸着を起こし不都合となる欠点がある。これらの架橋
剤を溶解させる溶媒としてはジメチルホルムアミド、ジ
メチルアセトアミド等が用いられ、架橋剤の濃度は望ま
しい吸着能に応じて自由に選択可能であるが、キトサン
のアミノ基残基当り０．１〜１．５当量モルの架橋剤濃
度が好ましい。 架橋反応後、未反応の架橋剤を溶媒で充分洗浄除去し、
次いでこのジカルボン酸誘導体で架橋させた多孔質粒状
キトサンをアセチル化剤でアセチル化させ、中性になる
まで充分洗浄し、ジカルボン酸誘導体で架橋させた多孔
質粒状キチンとする。 アセチル化剤としては架橋剤に影響の少いものとして無
水酢酸、アセチルクロリド、アセチルプロミドが好まし
い。アセチル化処理はアセチル化剤をジメチルホルムア
ミド、ジメチルアセトアミド等の溶剤に溶解して使用す
る。このリゾチーム精製用アフィニティークロマ］・グ
ラフィー担体を使用する際には、例えばトリス−ＨＣｌ
　ｇ％液等公知の方法で処理して使用する。 【実　施　例１ 以下に実施例を挙げて本発明を詳述するが、本発明はこ
れらの範囲に限定されるものではない。 〔実施例１〕 脱アはチル化度９８．０％２分子吊約４５，０００のキ
トサン７０９を３．５％酢酸水溶液９３０ｇに溶解させ
て、濃度７％の溶液とした。これを孔径０．２５　ｍ／
ｍφのノズルから苛性ソーダ７％、エタノ−・ル３０％
の水溶液中に落下させて成形し、粒径１７ＦＬ／７ＦＬ
φの多孔質粒状キトサン１父を得た。これを充分水洗、
湯洗を行った後、１０ｄを採取しジメチルホルムアミド
で一回洗浄後、アミノ基残基当り０．１モルのアジピン
酸ジーＮ−ヒドロキシスクシイミドエステルのジメチル
ホルムアミド溶液を加え、室温で一日攪拌して架橋した
。 未架橋のアジピン酸ジーＮ−ヒドロキシスクシイミドエ
ステルをジメチルホルムアミドを用いて洗浄除去し、無
水酢酸を０．５ｇ加えたジメチルホルムアミドＳｏｄ中
で室温で一日攪拌し、未反応のアミノ基をアセチル化さ
せる。続いて充分に水洗し、ｌＮ−ＮａＯＨ水溶液中で
室温で１時間攪拌した後、洗液が中性になるまで充分水
洗した。得られた粒状物（試ＤＩ＞は、比表面積９３．
０　ｙｄ　／りの多孔質のリゾチーム精製用のアフィニ
ティークロマ１〜グラフイー担体であった。同様に上記
の多孔質粒状キトサンをアミノ基残基当り０．５モル、
１．０モルのアジピン酸ジ！Ｎ−ヒドロキシスクシイミ
ドエステルでそれぞれ処理した比表面積が９２．５ＴＩ
ｔ、／！？と９５．３ＴＩｔ／ｆ？の粒状物（試料■及
び試料■）と、１．０モルのセバシン酸ジ−Ｎ−ヒドロ
キシスクシンイミドエステル及び０．４モルのアジピン
酸りＯライドでそれぞれ処理した比表面積９６．７ｍ／
ｇと８８．３ｍ／ｇの粒状物（試料■及び試料Ｖ）とを
得た。尚、上記多孔質粒状キトサンの比表面積は、試料
を液体窒素中で急冷凍結し、１０’　トール（Ｔ。 ｒｒ＞　、−４０℃、８時間真空乾燥し、１４０℃、４
０分間脱ガス後比表面自動測定装置（島津マイクロメリ
ティックス２２００形）にてＢＥＴ法で測定した。 これら５種の粒状物を、それぞれトリス−塩酸緩衝液中
に充分浸漬後、大々１ｄをとり１％牛血清アルブミン（
以下ＢＳＡと略記する）溶液２ＩＩＩｅに浸漬してＢＳ
八を吸着させ、２８０　ｎｍの吸光度よりその吸着量を
測定した。又、同様にこれら粒状物を０．５％リゾチー
ム溶液２ｄに浸漬し、吸光度２８０ｎｎより吸着量を測
定した。 参考例として上記のようにして得られた多孔質粒状キ１
−サンを単にアセチル化させた多孔質粒状−〇　　− キチン及び多孔質粒状キトサンに上記ＢＳＡ　、リゾチ
ームをそれぞれ吸着させて、その吸着率を求めた。 また、比較例として、本発明による架橋剤であるアジピ
ン酸ジーＮ−ヒトＯキシスクシイミドエステルの代りに
エピクロルヒドリン等量モルで架橋後アセチル化したも
のについてもＢＳ＾、リゾチームの吸着を行った。以上
の結果を第１−１．１−２表に示す。 第１−２表 〔応用例〕 実施例１において得られた試料■の粒状体３０ｄをカラ
ムに充填し、卵白のトリス−ＭＣＩ緩衝希釈液（５０倍
）を流した後トリスーＨＣ，Ｉ緩衝希釈液で充分洗浄し
、リゾチームのみを吸着させた。これに０．１Ｈ酢酸を
流したところ、２８Ｏｒ＋ｎに吸収をもった分画が得ら
れた。これを高速液体クロマドグラフイーで測定したと
ころ、第１図に示した如く、殆どがリゾチームであり、
アフィニティークロマトグラフィー用担体として効果の
あることが判明した。尚、卵白のタンパクを同様に測定
すると第２図に示すように、卵白アルブミンとリゾチー
ムに起因する二つのピークが見られる。 に発明の効果１ 本発明により多孔質粒状キトサンをジカルボン酸誘導体
で架橋させた後、アセチル化剤でアセチル化して得られ
る多孔質キチンよりなるリゾチーム精製用アフィニティ
ークロマトグラフィー担体は、通液性に優れ、長時間の
使用が可能である。 本発明によりジカルボン酸誘導体で架橋処即を行ったも
のは、リゾチームに対する親和性が増大し、キチンに比
較して約２倍以上もの吸着量を有するものが得られる。 エピクロルヒドリンや他の架橋剤を用いてもキチンに比
較して吸＠量が減少することはあるものの、増大させる
ことはできなかった。　　・

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明によるアフィニティークロマトグラフィ
ー担体を用いて精製を行った場合のリゾチーム吸着量を
示すグラフであり、第２図は卵白の蛋白成分を示すグラ
フである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、多孔質粒状キトサンをジカルボン酸誘導体で架橋後
   、アセチル化して得られるリゾチーム精製用アフィニテ
   ィークロマトグラフィー担体。 ２、ジカルボン酸誘導体が、ジカルボン酸のジ−ｐ−ニ
   トロフェニルエスチル、ジ−Ｎ−ヒドロキシスクシイミ
   ドエステルよりなる活性エステル、もしくは酸クロライ
   ド、酸ブロマイドのジカルボン酸ハロゲン化物である特
   許請求の範囲第１項記載のリゾチーム精製用アフィニテ
   ィークロマトグラフィー担体。 ３、ジカルボン酸が次の一般式で表わされ、ｎが０〜８
   である特許請求の範囲第２項記載のリゾチーム精製用ア
   フィニティークロマトグラフィー担体。 ▲数式、化学式、表等があります▼ ４、アセチル化が、無水酢酸、アセチルクロリド、アセ
   チルブロミドよりなるアセチル化剤を用いてなされるも
   のである特許請求の範囲第１項記載のリゾチーム精製用
   アフィニティークロマトグラフィー担体。