ES2257877T3 - Suministro de celulas por pulverizacion. - Google Patents
Suministro de celulas por pulverizacion.Info
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Abstract
El uso de un polímero de fibrina que se forma al cubrir una superficie diana con una mezcla de un primer componente que consiste en una proteína no polimérica relacionada con la fibrina y un segundo componente eficaz para transformar la proteína relacionada con la fibrina en un polímero de fibrina, en la preparación de una superficie diana cubierta que es la superficie tisular de un mamífero o una superficie tisular cubierta por una lámina de polímero biodegradable, en la que los dos componentes mezclados forman un polímero de fibrina con una adhesividad tal que es eficaz para adherir las células pulverizadas en una suspensión sobre la superficie diana cubierta para el tratamiento de heridas.
Description
Suministro de células por pulverización.
La presente solicitud reivindica la prioridad de
los documentos US 19980110614 P y US 19990155403 P.
La presente invención se refiere a procedimientos
para administrar y adherir células a los tejidos.
Al tratar pieles lesionadas, como las lesionadas
por heridas térmicas o crónicas u otras heridas, un enfoque ha sido
cultivar los queratinocitos derivados de biopsias, biopsias
típicamente autólogas, hasta poder levantar una lámina semejante a
la piel desde la placa de cultivo por digestión por proteinasas. Las
dificultades con este proceso incluyen que el tiempo necesario para
el crecimiento de esos cultivos sobreconfluentes o "injertos de
láminas epiteliales" es del orden de tres semanas, las láminas de
piel son difíciles de manipular y ha demostrado ser problemático
que "prendan", es decir, la adherencia estable de los injertos
laminares al tejido basal de lesión. Véase, p. ej., Rennekampff
et al., J. Surg Res. 62:288-295, 1996.
Además, los queratinocitos que crecen hasta una densidad tan alta
adquieren el carácter de células diferenciadas, no proliferantes, en
lugar de células en crecimiento activo que contribuyen a la
cicatrización de una herida. Véase p. ej., Rennekampff et
al. Ha habido varios enfoques para introducir queratinocitos
cultivados en las heridas mientras estas células están aún en una
fase de crecimiento más activo, como se analizó en Rennekampff et
al. Entre éstos se incluyen el crecimiento de las células hasta
la subconfluencia sobre soportes poliméricos porosos y la aplicación
de los soportes invertidos para orientar las células hacia abajo
sobre las heridas. Además, ciertos investigadores en este campo han
experimentado mezclando queratinocitos y fibrinógeno, y luego
mezclando trombina justo antes de la aplicación a la herida, de
modo tal que el fibrinógeno se transforme en fibrina, la que forma
una matriz polimérica para los queratinocitos. Véase Hundyadi et
al., J. Dermatol. Surg. Oncol. 14: 75-78,
1988; Keiser et al., Burns 20:23-29,
1994. La conversión enzimática del fibrinógeno proporciona un tiempo
prolongado durante el que la composición tiene una adhesividad
utilizable; esta permite que la composición que contiene las células
pueda diseminarse sobre la herida. También puede utilizarse el
"adhesivo" de fibrina para afirmar una capa protectora de piel
alogénica de cadáver.
Las investigaciones previas de otros
solicitantes, junto con las de otros que han trabajado con los
solicitantes, han identificado un adhesivo eficaz que proporcionar
fibrina en el sitio que debe adherirse; este adhesivo tiene la
forma de un "monómero de fibrina" que se estabiliza por
polimerización. En el sitio, las condiciones de estabilización se
invierten y se forma un coágulo eficaz. Véase, Edwardson et
al., solicitud de patente europea nº EP 592.242. Una de las
ventajas particulares de este adhesivo de monómero de fibrina de la
patente EP 592.242 es que se puede preparar rápidamente a partir de
una pequeña cantidad de la piel de un paciente sólo minutos antes
de la cirugía (o en una hora si se utiliza la preparación manual) y
que la preparación puede hacerse utilizando un equipo de
laboratorio estándar. También se han descrito instrumentos
especializados para preparar el monómero de fibrina, y estos
instrumentos permiten preparar un adhesivo autólogo a partir de un
paciente, de una manera rápida, muy reproducible y muy segura.
Véase, Holm, "Centrifuge Reagent Delivery System", WO
96/16713, Holm, et al. "Method and Device for Separating
Fibrin I from Blood Plasma", WO 96/16714 y Holm, "Centrifuge
with Annular Filter", WO 96/16715. La composición del monómero de
fibrina solubilizado puede utilizarse como adhesivo, como se
describe en Edwardson et al., EP 592.242. Por lo tanto, estas
mejoras permiten que se prepare un adhesivo autólogo con un proceso
automático, rápido, y el adhesivo autólogo así preparado carece de
enzimas proteinasas extrínsecas como la trombina bovina o de
proteínas bovinas como la aprotinina.
Otro adhesivo de fibrina cuya polimerización
puede inducirse sin utilizar enzimas proteolíticas emplea (1) un
primer componente que consiste en un análogo de fibrina en el que la
región C terminal de la cadena \gamma está suficientemente
alterada como para interrumpir la autopolimerización y (2) un
segundo componente que consiste en una molécula relacionada con la
fibrina tal como un fibrinógeno. Véase,
Cederholm-Williams, WO9529686A1. Al combinarse los
dos componentes, el análogo de fibrina se polimeriza con la molécula
relacionada con la fibrina.
Ahora los solicitantes han demostrado que la
pulverización de los queratinocitos sobre la zona herida,
aproximadamente dentro del mismo marco temporal que la
pulverización y mezcla de los sistemas formadores de polímeros de
dos componentes de fibrina sobre la herida, es eficaz para afirmar
los queratinocitos (y en algunos casos los fibroblastos) en la
herida dentro de una matriz polimérica tridimensional de fibrina,
donde el total de las células afirmadas se expande con eficacia y
forma una capa epitelial. En aspectos preferidos de la invención,
los queratinocitos se pulverizan junto con la pulverización y mezcla
en el vuelo de un sistema de dos componentes que da como resultado
la polimerización de las moléculas relacionadas con la fibrina de la
mezcla con capaz dinámica de polimerización.
La invención también se aplica a otros tipos de
células que pueden afirmarse sobre una superficie tisular, por
ejemplo, para generar crecimiento de tejido nuevo o estabilizar la
presencia de las células durante una cantidad de tiempo suficiente
como para lograr un resultado deseado. La invención se refiere,
además, a la pulverización de células sobre un sustrato tisular sin
fibrina o con otros polímeros biocompatibles, preferiblemente
biodegradables. La invención se refiere además a células
administradas con colágeno, con o sin fibrina.
La invención proporciona el uso de un polímero de
fibrina, que se forma al cubrir una superficie diana con una mezcla
de un primer componente que comprende una proteína no polimérica
relacionada con la fibrina y un segundo componente eficaz para
transformar la proteína relacionada con la fibrina en polímero de
fibrina, en la preparación de una superficie diana cubierta que es
la superficie tisular de un mamífero o la superficie tisular
cubierta por una lámina de polímero biodegradable, en la que los dos
componentes mezclados forman un polímero de fibrina con una
adhesividad tal que es eficaz para adherir células pulverizadas en
una suspensión sobre la superficie diana para el tratamiento de
heridas. Preferiblemente, el polímero de fibrina se forma en una
cantidad que es eficaz para asegurar una colonización eficaz de las
células sobre la superficie diana. En una realización, el
procedimiento comprende además la mezcla de una cantidad de colágeno
que sea eficaz para promover la adherencia celular.
Preferiblemente, la mezcla se pulveriza para cubrir la superficie
diana. La mezcla y la suspensión de células pueden pulverizarse
conjuntamente para cubrir la superficie diana. Preferiblemente, una
cantidad eficaz de células promotoras de colonización se atrapa en
una matriz tridimensional del polímero de fibrina en la
superficie
diana.
diana.
El uso puede comprender la adherencia de la
lámina de polímero biodegradable a la superficie tisular, de modo
tal que la suspensión de células se pulveriza sobre la lámina de
polímero que define la superficie diana. En una realización, la
lámina de polímero se adhiere junto con una capa externa de soporte
extraíble adaptada para restringir más el transporte de vapor desde
el tejido, aunque sin eliminarlo, y el procedimiento además
comprende: la eliminación de la capa de soporte después de haberse
adherido la lámina de polímero al tejido y luego la aplicación de
la suspensión de células. La lámina polimérica puede, sin
limitación, constar de una lámina polimérica de glucosaminoglucano
o de una lámina polimérica de colágeno entrecruzado.
El uso también puede comprender: el cultivo de
células autólogas a partir de una biopsia obtenida de un cierto
tipo de tejido de un mamífero y la formación de una suspensión de
células a partir de las células cultivadas, en que el tejido al
cual se aplican las células es del tipo dado o adyacente al tejido
del tipo dado.
En un aspecto preferido de la invención, el
tejido es una herida y la suspensión de células comprende
queratinocitos. Preferiblemente, los queratinocitos cultivados del
pase que produce las células para la suspensión de células se
recogen antes de que alcancen la confluencia. El uso también puede
comprender: la pulverización de una suspensión de fibroblastos
sobre la herida cubierta por la mezcla de los dos componentes. Los
fibroblastos pueden aplicarse a la misma mezcla que crea un
polímero de fibrina o a una mezcla separada que crea el
polímero.
En una realización, el primer componente
comprende fibrina solubilizada en ácido y un segundo componente
puede comprender una cantidad de base eficaz para neutralizar
suficientemente la mezcla para permitir que la fibrina se
polimerice. La aplicación del primero y el segundo componente (de
cualquier tipo) pueden comprender la pulverización del primer y el
segundo componente de modo tal que un chorro del primer componente
se fusiona con un chorro del segundo componente en el vuelo desde
dispositivo pulverizador hasta la superficie de la suspensión de
células. El procedimiento puede comprender la pulverización de la
suspensión de células, el primer componente y el segundo componente
de modo tal que los chorros de la suspensión de células, el primer
componente y el segundo componente se fusionen en el vuelo (desde el
dispositivo pulverizador hasta la superficie).
La Figura 1 muestra (a completar más tarde,
suponiendo que se utilicen los dibujos).
Los siguientes términos tendrán, a los fines de
esta solicitud, el significado respectivo presentado más abajo.
- \bullet
- Agente bioactivo. Un agente bioactivo es una sustancia tal como un producto químico que puede actuar sobre una célula, un virus, un tejido, un órgano o un organismo, que incluye los fármacos (es decir los productos farmacéuticos) o las hormonas (por ejemplo, los factores de crecimiento), aunque no limitarse a ellos, para crear un cambio en el funcionamiento de la célula, el virus, el órgano o el organismo. Preferiblemente el organismo es un mamífero, más preferiblemente un ser humano.
- \bullet
- Cantidad de colágeno que promueve con eficacia la adherencia celular: Una cantidad de colágeno que promueve con eficacia la adherencia celular es una cantidad que reduce la cantidad de células necesarias para lograr una colonización que promueva una cantidad eficaz de células o una cantidad de células eficaz para promover el crecimiento tisular.
- \bullet
- Cantidad de células que promueve una colonización eficaz. La cantidad de células que promueve una cantidad eficaz de células adherentes es una cantidad eficaz para llevar a la formación de colonias o para llevar a una residencia de células eficaz como para causar un cambio fisiológico del animal (cuando las células adherentes son recombinantes, de producir y exportar una cantidad de agente recombinante biológicamente activo) o de llevar a la formación de tejido nuevo.
- \bullet
- Sistemas dinámicos de fibrina. Los sistemas dinámicos de fibrina son sistemas binarios formadores de polímero de fibrina que generan, al mezclarse los dos componentes, las moléculas relacionadas con la fibrina que son dinámicamente capaces de polimerizarse.
- \bullet
- Dinámicamente capaces de polimerizarse. La afirmación de que las moléculas de una mezcla son dinámicamente capaces de polimerizarse indica que cualquier barrera a la capacidad de polimerización es totalmente función de la dinámica de mezclado o la cinética rápida de primer orden para cualquier cambio estructural terciario que se produzca a partir de las condiciones modificadas de la mezcla, como el pH.
- \bullet
- Proteína relacionada con la fibrina. Una proteína relacionada con la fibrina se basa en dos pares de cadenas \alpha de fibrina, dos pares de cadenas \beta de fibrina y dos pares de cadenas \gamma de fibrina que se encuentran en las fibrinas o el fibrinógeno. Una proteína relacionada con la fibrina se convierte o puede convertirse fácilmente en una forma que es dinámicamente capaz de polimerizarse. Como se ha señalado en otra parte de este documento, es posible utilizar varias formas de moléculas derivadas o basadas en el fibrinógeno para hacer un polímero de fibrina y, por lo tanto, son proteínas relacionadas con la fibrina.
- \bullet
- Cantidad de células eficaz para la promoción del crecimiento tisular. Una cantidad de células adherentes eficaz para la promoción del crecimiento tisular es una cantidad eficaz para la promoción de una colonización que conduce a la formación de tejido nuevo.
Las células se pulverizan sobre un sustrato
tisular donde se hayan pulverizado los componentes formadores del
gel de fibrina tan recientemente como para que el polímero de
fibrina no haya madurado demasiado para que tenga una adhesividad
suficiente como para adherir las células pulverizadas.
Preferiblemente, los componentes relacionados con la fibrina han
madurado hasta formar un gel suficiente que es más adherente que
cualquiera de las composiciones de los dos componentes mezclados
para formar el gel. Más preferiblemente, los dos componentes y las
células se pulverizan simultáneamente, lo que significa que tanto el
dispositivo pulverizador de adhesivo como el dispositivo para la
suspensión de células funcionan al mismo tiempo con los chorros
dirigidos hacia el mismo tejido.
Preferiblemente, la formación de fibrina que es
capaz dinámicamente de polimerizarse es independiente de cualquier
conversión proteolítica de las moléculas relacionadas con la
fibrina. Una velocidad de polimerización rápida de la fibrina es un
aspecto importante que proporciona una ventaja clara con respecto a
las mezclas de fibrinógeno/trombina/células. La polimerización
rápida permite la aplicación rápida de una capa delgada de fibrina y
células esencialmente a cualquier superficie o cavidad corporal.
Los enfoques que proporcionan una adhesividad inicial insuficiente
pueden experimentar problemas de "escurrimiento" de las
superficies horizontales.
Los estudios notificados en la presente memoria
utilizan el procedimiento de la invención como vehículo para
sembrar en las heridas suspensiones de queratinocitos monodispersas
en crecimiento activo mediante dos dispositivos de pulverización
unidos para pulverizar células y un adhesivo de fibrina sobre
heridas experimentales pequeñas. El número total y la
disponibilidad de células administradas de esta forma se han
estimado in vitro e in vivo y se considera que existe
cierto grado de pérdida celular. Las pérdidas detectadas pueden ser
pérdidas de células frágiles que están alcanzando la senescencia
natural o las pérdidas puede deberse a que el sistema de aplicación
de la pulverización no se haya optimizado para la administración de
células. Por ejemplo, se han demostrado que las variaciones en el
chorro de aire tienen un efecto importante.
Las células a introducir en un sustrato tisular
según la invención, incluyen, sin limitación, queratinocitos,
fibroblastos, hepatocitos, células pancreáticas, células pulmonares,
células musculares (músculo liso, músculo cardiaco, músculo
estriado), condrocitos, osteoblastos, células endoteliales, óvulos
fecundados, células suprarrenales y neuronas. Las células pueden
aplicarse según la invención para complementar o establecer el
crecimiento del tejido. Típicamente, las células se aplican a un
sustrato de tejido localizado adecuadamente para el crecimiento de
tejido deseado. Las células aplicadas pueden incluir células
transformadas in vitro o in situ en un fenotipo
modificado, como células transformadas para producir una agente
bioactivo útil o células de un tejido dado transformadas para
disminuir un defecto genético. En este último caso, el resultado
deseado puede lograrse mediante cierta residencia mínima de las
células transformadas en el tejido sustrato al cual se adhiere. Por
ejemplo, es posible pulverizar células, por ejemplo a través de un
dispositivo endoscópico, sobre tejido pulmonar para proporcionar
una producción terapéutica de un agente bioactivo durante un periodo
de tiempo. Para las células transformadas por la incorporación de
un vector adecuado in situ, la fibrina puede actuar como un
reactivo que aumenta la transformación, como se comentó en el
documento de número de serie de Estados Unidos 60/089.543,
presentado del 17 de junio de 1998, y el documento de número de
serie de Estados Unidos 09/334.325, presentado del 16 de junio de
1999.
Los tejidos a los cuales las células se adhieren
incluyen, sin limitación, la estructura basal de una herida (que
dependiendo de la profundidad de la herida puede comprender el
tejido epidérmico, la dermis o fascia muscular), el pulmón, el
hígado, el peritoneo o el miocardio. La presencia de una herida en
el epitelio tisular constituye un sustrato preferido.
En una realización de la presente invención, una
suspensión adecuada de fibroblastos, que son preferiblemente
autólogos, se pulveriza sobre una herida junto con la pulverización
de los queratinocitos. Los fibroblastos luego aceleran la formación
de una capa dérmica que proporciona un mejor soporte de adherencia
para la capa epidérmica que se está formando.
Las células pueden derivarse directamente del
tejido de un donante, como por ejemplo, por biopsias o de la
sangre, o cultivarse ex vivo.
En un aspecto preferido de la invención, (a) las
células pulverizadas primariamente incluyen (o comprenden) células
transformadas por recombinación para expresar un agente bioactivo
útil para establecer el crecimiento o el mantenimiento de las
células primarias, como por ejemplo un factor de crecimiento o (b)
las células secundarias así transformadas se añaden a las células
pulverizadas primariamente. Las células recombinantes pueden ser
transformadores estables, lo que significa que la característica
nueva se mantiene de manera estable con o sin condiciones
particulares. Puede esperarse que esos transformadores estables
mantengan el fenotipo de expresión recombinante durante un periodo
prolongado. O las células recombinantes pueden ser transformadores
transitorios, de los que puede esperarse que pierdan la expresión
del fenotipo en unas pocas generaciones o menos. Esas células
transformadas transitoriamente pueden crearse por aplicación de un
vector adecuado inductor de la transformación al tejido diana junto
con las células primarias. En ciertas realizaciones la expresión del
agente bioactivo inducida por recombinantes es más deseable
inmediatamente después de la aplicación de las células al tejido
diana, en el momento en que las células tienen menos soporte del
riego sanguíneo y otros mecanismos de apoyo del hospedador animal.
Por lo tanto, puede esperarse que las células transformadas
transitoriamente o las células transformadas tengan una viabilidad
limitada en la zona de tejido diana, puedan emplearse
provechosamente para proporcionar la expresión inmediata de agentes
bioactivos adecuados.
La invención puede utilizarse junto con cualquier
sistema de dos componentes que se combinen para formar un polímero
de fibrina. Esos sistemas de dos componentes incluyen adhesivos de
fibrina tradicionales donde el fibrinógeno se mezcla con una enzima
conversora (es decir, una enzima eficaz para eliminar una cantidad
de fibrinopéptidos suficiente para crear fibrina eficaz). Esos
sistemas se describen, por ejemplo, en Hundyadi et al.,
J. Dermatol. Surg. Oncol. 14: 75-78, 1988 y
en Kaiser et al, Burns 20: 23-29,
1994. Los sistemas más preferidos son aquellos en los que la única
barrera para la polimerización es un cambio reversible de la forma
física de la fibrina o la separación de los dos componentes que son
eficaces para formar un polímero de fibrina primario. Estos
sistemas crean, al mezclarse, una fibrina que es "dinámicamente
capaz de polimerizarse", como se define más arriba, y pueden
denominarse "sistemas dinámicos de fibrina". En estos sistemas,
los dos componentes pueden mezclarse en el vuelo durante la
pulverización para formar rápidamente un polímero de modo tal que
se pulveriza sobre el tejido receptor una composición viscosa que
fija las células.
Más preferido es el uso de un primer componente
que es la fibrina (preferiblemente fibrina I) disuelta en un ácido
relativamente débil y un segundo componente que es una cantidad de
base suficiente para neutralizar el primer componente, de manera
tal que mediante la mezcla de los dos componentes la fibrina se
transforma en una forma capaz de polimerizarse (es decir, es
dinámicamente capaz de polimerizarse). Este tipo de sistema de dos
componentes puede fabricarse rápidamente a partir de sangre
autóloga. El componente de fibrina es portador de protrombina y
factor XIII en una cantidad suficiente para que el suministro de ión
calcio en el segundo componente sea eficaz para activar la
trombina, iniciando así la maduración de la fibrina a fibrina II y
la activación del factor XIII para proporcionar entrecruzamiento de
fibrina.
Se han descrito instrumentos especializados para
preparar esa fibrina solubilizada o "monómero de fibrina" y
estos instrumentos permiten que se prepare un adhesivo autólogo a
partir de un paciente de manera rápida, muy reproducible, muy
fiable y muy segura. Véase Holm "Centrifuge Reagent
Delivery System", WO 96/16713, Holm et al., "Method and
Device for Separating Fibrin I from Blood Plasma", WO 96/16714 y
Holm "Centrifuge with Annular Filter", WO 96/16715. Estas
solicitudes de patente describen un aparato moldeado que funciona en
una centrífuga. Una primera cámara del aparato se llena de sangre y
un proceso de centrifugación separa el plasma a partir de una
fracción de sangre celular sedimentada. El plasma se transfiere a
una segunda cámara dentro de la que se inserta una enzima
conversora que se une a la biotina mediante uniones covalentes. La
acción de la enzima transforma el fibrinógeno del plasma en
fibrina, y las moléculas de fibrina se unen entre sí formando
polímeros que precipitan en forma de sólido. El precipitado de
fibrina se sedimenta por centrifugación y el plasma remanente se
vuelve a transferir a la primera cámara. El precipitado de fibrina
sedimentado se disuelve con un líquido solubilizador, que es
mayormente una solución acuosa tamponada con un pH ácido. La
solución viscosa de monómero de fibrina se mezcla con perlas de
agarosa que tienen unida avidina para eliminar las trazas de la
enzima conversora biotinilada y luego se lava dentro de una tercera
cámara (por ejemplo, una jeringa) a través de un filtro que elimina
las perlas de agarosa. La agarosa retenida contiene toda la enzima
residual unida mediante la interacción de alta afinidad
avidina-
biotina.
biotina.
En un aspecto preferido, la composición de la
fibrina se enriquece con factores de crecimiento adecuados como
factores de crecimiento de fibroblastos o factores de crecimiento
derivados de plaquetas. En otro aspecto, las células se administran
simultáneamente con plaquetas o macrófagos u otras células derivadas
de la sangre. Preferiblemente esas células que se administran
simultáneamente son autólogas.
Debe señalarse que se prefieren las fuentes
autólogas de fibrina, queratinocitos u otras células, pero que a
menudo son apropiadas otras fuentes. Esas fuentes incluyen plasma
fresco congelado (autólogo, donante único, etc.) o banco de sangre
de sangre completa.
Las composiciones que administran proteínas
relacionadas con la fibrina incluyen además preferiblemente
proteínas asociadas. Por ejemplo, la fibronectina está
preferiblemente presente en una cantidad de 3 \mug/ml a 1.000
\mug/ml o más, más preferiblemente 30 \mug/ml o 60 \mug/ml o
más. Protrombina está presente preferiblemente, con un peso o
actividad basada en el volumen, en una cantidad del 100% o más, más
preferiblemente 30-60% o más, donde la cantidad
porcentual está relacionada con la concentración plasmática original
de protrombina. El factor XIII está presente preferiblemente en una
cantidad de 20-2.000% o más, más preferiblemente
200-1.000 o más, donde la cantidad porcentual está
relacionada con la concentración plasmática original del Factor
XIII.
En algunos contextos, en particular el
tratamiento de heridas, puede ser deseable proporcionar una cubierta
de polímero biodegradable que permita la adherencia y la
infiltración de las células deseadas. Los apósitos de membrana de
poliuretano útiles como cubiertas de ese tipo incluyen
Hydroderm^{TM} (Wilshire Medical, Inc., Dallas, Tejas, Estados
Unidos) y Spyrofilm^{TM} (Polymedica Inc., Denver, Colorado,
Estados Unidos), que se suministran con una cubierta adhesiva
biocompatible. Las membranas basadas en ácido hialurónico útiles
como cubiertas de ese tipo incluyen Laserskin^{TM} (Fidia Advanced
Biopolymers, Abano Terme, Italia).
Otras cubiertas de ese tipo incluyen: la membrana
polimérica EpiGen^{TM} (T. J. Smith & Nephew, Limited, HU3
2BN Inglaterra); el soporte Apligraft^{TM} (véase, Eaglstein et
al., "Tissue Engineering and Development of Apligraft in a
Human Skin Equivalent", Clinical Therapeutics 19:
894-905, 1997; comercialización por Novartis AG),
en que Apligraft^{TM} es un soporte basado en fibrina que
incorpora un compuesto de epidermis viva y células de dermis y el
soporte BioSeed^{TM} (Véase, Horch et al., "Fibrin
Glue and a Carrier for Cultured Human Keratinocyte Suspensions
versus Epidermal Skin Grafts", Abstract 1997 Annual
Meeting, American Institute of Chemical Engineering, Paper
52H).
Entre las cubiertas poliméricas útiles de ese
tipo también se incluye la piel artificial Integra® (Integra Life
Sciences, Plainsboro, Nueva Jersey, Estados Unidos). La piel
artificial Integra® es un sistema de membrana de dos capas para el
reemplazo dérmico. Una capa de reemplazo dérmico está formada por
una matriz porosa de fibras de colágeno de tendón bovino
entrecruzado y un glucosaminoglucano
(condroitin-6-sulfato). La matriz
porosa se fabrica con una porosidad controlada y una tasa de
degradación controlada. Una capa de sustitución epidérmica temporal
está formada de polímero de polisiloxano sintético (silicona) y
funciona controlando la pérdida de humedad desde la herida. La capa
de reemplazo dérmico que contiene colágeno sirve como matriz para
la infiltración de fibroblastos, macrófagos, linfocitos y capilares
derivados de la base de la herida. Al progresar la cicatrización,
los fibroblastos depositan una matriz de colágeno; simultáneamente,
la capa dérmica de piel artificial Integra® se degrada. Véase,
Burke et al., Annals of Surgery 194:
413-427, 1981.
Obsérvese que esta invención se ilustra con el
uso de una cubierta de soporte membranosa, pero que ese soporte no
es necesario. En el contexto del tratamiento de heridas, ese soporte
puede ayudar a proporcionar una barrera, por ejemplo, para el
transporte de vapor. Sin embargo, hay otros procedimientos
disponibles para proporcionar tratamiento a las heridas mientras se
forma el tejido epidérmico (con el procedimiento de la invención).
Por ejemplo, pueden aplicarse aloinjertos de piel, como los
injertos de piel de espesor parcial, sobre las células pulverizadas
para proporcionar una capa protectora. En este contexto, el adhesivo
de fibrina sirve además para afirmar el injerto de piel. Esos
injertos se glicerolizan típicamente en el caso aloinjertos de
dermis desepitelializada o de injertos de piel de espesor
parcial.
Por lo tanto, la invención proporciona una
alternativa a la formación de una epidermis sobre el reemplazo
dérmico Integra, el uso de injertos de piel de espesor parcial, los
autoinjertos epiteliales cultivados y otros similares.
Un sistema de fibrina de dos componentes puede
pulverizarse mediante cualquier tipo de dispositivo conocido en la
técnica. Típicamente, la mezcla se debe realizar de inmediato,
durante o inmediatamente después de la pulverización. La mezcla que
se realiza inmediatamente antes de la pulverización debe realizarse
lo suficientemente próxima en el tiempo al evento de pulverización
para que la viscosidad no haya aumentado lo suficiente como para
interferir con la formación de pequeñas gotas. En el caso de los
sistemas dinámicos de fibrina, ese mezclado previo no se prefiere,
excepto si es de corta duración, debido a la rapidez con que aumenta
la viscosidad.
Un aparato de pulverización preferida mezclaría
los dos componentes del sistema de fibrina en el vuelo durante la
operación de pulverización. En un sistema de ese tipo, la cinética
de la mezcla de los dos chorros proporciona una dinámica de
mezclado sustancial. Puede crearse una dinámica de mezclado
adicional por los cambios de energía cinética después de la
colisión de los chorros fusionados con el tejido diana. Un
dispositivo descrito en Holm, Patente de Estados Unidos 5.605.541.
El dispositivo Holm tiene una salida central de gas y dos salidas
anulares dispuestas alrededor de la salida de gas. La salida anular
interior administra preferiblemente tampón, mientras que la salida
anular externa administra el componente de fibrina. La salida de gas
central ayuda a dar forma y fusionar los chorros de salida. Puede
alinearse un segundo dispositivo de pulverización con el primero
para que tanto las células como la fibrina se administren sobre el
tejido diana. El dispositivo Holm puede modificarse adicionalmente
para proporcionar una tercera salida, como por ejemplo, una salida
anular, para la suspensión.
En WO 97/20585 y WO 98/20931 se describen
dispositivos de pulverización particularmente preferidos. Los
dispositivos de pulverización descritos en estas solicitudes de
patente constan de tubos de lumen múltiples con diámetros de lumen
típicamente de 300 \mum o menos. Los lúmenes tienen una salida a
una superficie plana. Con tres lúmenes, en la salida los lúmenes
están alineados preferiblemente a lo largo de una línea recta. Por
ejemplo, puede utilizarse un lumen externo para descargar aire u
otro gas, el lumen medio puede utilizarse para descargar el
monómero de fibrina y el otro lumen externo puede utilizarse para
descargar la solución básica de menor volumen. Preferiblemente las
salidas de líquido tienen un diámetro de menos de 250 micrones, por
ejemplo 25 a 150 micrometros o 50 a 125 micrometros, mientras que
la salida de gas es preferiblemente un 20 a un 50% más grande. Por
ejemplo, las salidas pueden alinearse a lo largo de una línea recta
con una salida de gas de 150 micrometros seguida de salidas de
líquido de 100 micrometros. Preferiblemente, los flujos de líquido
combinados son menos de 3,0 ml/minuto, por ejemplo, 0,5 a 0,7
ml/min. Las salidas de líquido están preferiblemente espaciadas de
modo tal que las pequeñas gotas que salen por las salidas se
superponen o entran en contacto entre sí.
Los flujos de gas, cuando se utiliza, son
preferiblemente de 500 ml/min a 800 ml/min. Se suele descargar un
flujo de gas adyacente en el chorro de líquido para dispersar el
chorro en gotas más pequeñas creando una "pulverización".
Cuando no se utiliza flujo de gas, la descarga de líquido es en
gotas o en un chorro, en lugar de una dispersión de pequeñas gotas
como una dispersión cónica. La descarga de líquidos mediante esas
gotas o chorro eyectado constituye una forma de pulverización. Esas
gotas o chorro eyectado puede preferirse cuando se desea una
aplicación focalizada.
Cuando se pulverizan sólo suspensiones de
células, se utilizan preferiblemente los caudales líquidos bajos
antes descritos.
La suspensión de células puede descargarse desde
el mismo dispositivo de pulverización que descarga el sistema de
fibrina de dos componentes. Por ejemplo, puede utilizarse la
realización de la Figura 9 de WO 98/20931, que tiene por lo menos
tres salidas de descarga.
La ingeniería genética puede producir fibrinógeno
y monómeros de fibrina con rendimientos relativamente altos, en una
forma sustancialmente pura y con ausencia de virus patógenos como la
hepatitis y VIH. La expresión heteróloga de las cadenas de
fibrinógeno y la fibrina también permite la construcción de
mutaciones que pueden imitar a las variantes naturales de fibrina y
el aislamiento y el estudio de estas proteínas prescindiendo de
pacientes que padezcan estas anomalías genéticas.
Cada una de las tres diferentes cadenas
polipeptídicas de fibrinógeno (A\alpha, B\beta y \gamma) es
codificada por un gen diferente. Se ha preparado (Chung et
al. Ann. N. Y. Acad. Sci. 408: 449-456,
1983; Rixen et al., Biochemistry 22:
3237-3244, 1983; Chung et al.,
Biochemistry 22: 3244-3250, 1983; Chung et
al., Biochemistry 22: 3250-3256, 1983)
el cDNA de cada una de estas cadenas y se ha expresado en organismos
procariontes. Además, cada cadena de fibrinógeno humano se ha
introducido por separado (Huang et al., J. Biol. Chem.
268: 8919-8926, 1993; Roy et al., J. Biol.
Chem. 267: 23151-23158, 1992; Roy et al.,
1991, J. Biol. Chem., 266: 4758-4763, 1991)
o combinadas (Hardwig and Danishefski, J. Biol. Chem. 266:
6578-6585, 1991; Huang et al., J. Biol.
Chem. 268: 8919-8926, 1993; Roy et al.,
1991, J. Biol. Chem., 266: 4758-4763, 1991;
Redman and Samar, Solicitud de patente de Estados Unidos
07/663.380, expediente de marzo de 1991, disponible en Natl.
Technology Information Service No. PAT-APPL07663
380INZ) en plásmidos de expresión y se transfectó en células de
eucariontes.
La mayoría de estos plásmidos utilizados para
expresar el fibrinógeno humano recombinante derivan de los
construidos por el doctor D. Chung, Universidad de Washington,
Seattle, Estados Unidos, y se basan en clones de cDNA (Rixen et
al., Biochemistry 22: 3237-3244, 1983;
Chung et al., Biochemistry 22: 3244-3250,
1983; Chung et al., Biochemistry 22:
3250-3256, 1983). La expresión de cadenas de
fibrinógeno recombinante se logró por primera vez en E. coli
(Bolyard and Lord, Gene 66: 183, 1988; Bolyard and Lord,
Blood, 73: 1202-1206, 1989; Lord and Sowlkes,
Blood, 73, 166-171, 1989). Las cadenas
expresadas individualmente muestran similitudes antigénicas con el
fibrinógeno y muestran sitios de partición de la trombina similares
a los encontrados en el fibrinógeno nativo (Bolyard and Lord,
Blood, 73: 1202-1206, 1989; Lord and Fowlkes,
Blood, 73: 166-171, 1989). Los
fibrinopéptidos A y B puede liberarse a partir de fibrinógeno
recombinante (Bolyard and Lord, Blood, 73:
1202-1206, 1989; Lord and Fowlkes, Blood,
73: 166-171, 1989).
Se ha demostrado que las células de eucariotas
portadoras de plásmidos de expresión adecuados que codifican
células de fibrinógeno individuales sintetizan las cadenas de
fibrinógeno codificadas y forman intracelularmente moléculas de
cadena dimérica, por ejemplo, de dímeros A\alpha2, B\beta2 o
\gamma2) (Roy et al., J. Biol. Chem., 265:
6389-6393, 1990; Zhang and Redman, J. Biol.
Chem. 267: 21727-21732, 1992). Además, cuando se
transfieren dentro de la misma célula los plásmidos adecuados que
contienen genes que codifican las tres cadenas de fibrinógeno
humano, no sólo se expresan las tres cadenas sino que las cadenas
polipeptídicas se asocian por pares y se segrega el fibrinógeno
intacto dentro del medio circundante (Roy et al., J. Biol.
Chem., 266: 4758-4763, 1991, Hartwing and
Danishefsky, J. Biol. Chem. 266: 6578-6585,
1991). Al igual que el fibrinógeno natural, el fibrinógeno
recombinante segregado consiste en tres pares de cadenas de
polipéptidos diferentes y es funcional para la formación de
polímeros.
El fibrinógeno se sintetiza naturalmente en el
hígado y las células megacariocíticas y en las células hepáticas
transformadas mantenidas en cultivo son capaces de continuar la
síntesis y la secreción de fibrinógeno (Véase Otto et
al., J. Cell. Biol. 105: 1067-1072, 1987; Yu
et al., Thromb. Res. 46: 281-293, 1987;
Alving et al., Arch. Biochem. Biophys. 217: 19, 1982). Una
de esas líneas celulares son las células Hep G2 (Drs. Knowles and
Aden, Wister Institute, Philadelphia, Estados Unidos). Esta línea
sintetiza un exceso de cadenas A\alpha y \gamma por encima de
las cadenas Bb y da como resultado complejos diméricos improductivos
de cadenas A\alpha y \gamma (por ejemplo, A\alpha2\gamma2).
La introducción de otro vector de expresión que codifica las
cadenas B\beta dio como resultado la formación de complejos
triméricos (A\alphaB\beta\gamma) que adoptaron los patrones
de pliegue y los patrones de uniones bisulfuro intracatenarias
correctos (Roy et al., J. Biol. Chem., 265:
6389-6393, 1990). El mecanismo de este pliegue es
desconocido y podría involucrar proteínas y enzimas complementarias
(Roy et al., J. Biol. Chem. 267: 23151-23158,
1992). Estos estudios demostraron no sólo la trascripción correcta
del cDNA B\beta sino que la cadena B\beta excedente aumentó el
ensamblaje y la secreción de fibrinógeno intacto.
En las células Hep G2, los complejos triméricos
A\alphaB\beta\gamma se asocian por pares para formar
moléculas de fibrinógenos intactas, que se glucosilan y se segregan
activamente desde la célula (Huang et al., J. Biol. Chem.
268: 8919-8926, 1993). En realidad, sólo se segregan
moléculas de fibrinógeno ensambladas correctamente. Por lo tanto,
las células Hep G2 tienen el aparato secretor y sintético necesario
para el ensamblaje del fibrinógeno).
Experimentos posteriores han introducido
plásmidos que codifican el cDNA de la cadena del fibrinógeno en
células eucariontes que no sintetizan normalmente el fibrinógeno.
Estos experimentos han producido satisfactoriamente fibrinógeno
funcional, lo que demuestra que los factores necesarios para el
ensamblaje y la secreción del fibrinógeno no se encuentran
exclusivamente en las células derivadas del hígado como las Hep G2.
Entre las células de eucariontes conocidas por su capacidad de
ensamblar y segregar fibrinógeno recombinante se incluyen las
células de riñón de las crías de hámster (BHK), las células COS y
las células de ovario de hámster chino (CHO) (Roy et al., J.
Biol. Chem. 266: 4758-4763, 1991; Hartwig and
Danishefsky, J. Biol. Chem. 266: 6578-6585,
1991; Farrell et al., Biochemistry 30:
9414-9420, 1991).
El fibrinógeno funcional intacto que es segregado
por las células eucariontes transformadas estables da como
resultado la acumulación de niveles de fibrinógeno de
aproximadamente 1-2 \mug/ml. Los procedimientos
son conocidos por aumentar la producción de proteínas recombinantes
desde las células trasfectadas como las células CHO de manera tal
que los niveles de expresión pueden alcanzar 1.000 veces el nivel de
secreción basal.
En PCT/US95/05527 puede encontrarse otra
descripción de los procedimientos de producción recombinante de
moléculas relacionadas con fibrina.
La invención también se refiere a la
pulverización de células sobre una superficie cubierta con una
cantidad eficaz de colágeno promotora de la adherencia celular.
Preferiblemente el colágeno se pulveriza sobre la superficie
tisular.
También pueden pulverizarse células en otros
adhesivos poliméricos o composiciones basadas en polímeros
aumentadoras de la viscosidad. Preferiblemente, el adhesivo o el
polímero aumentador de la viscosidad se administra conjuntamente,
como por ejemplo, con uno de los dispositivos pulverizadores de
múltiples salidas antes descritos. Por ejemplo, las células pueden
administrarse con composiciones adhesivas que constan de colágeno,
ácido hialurónico u otros polímeros adecuados. En el caso de por lo
menos ciertos polímeros compuestos de múltiples grupos ácidos, como
el ácido hialurónico, una solución ácida tiene una viscosidad
significativamente menor, de modo tal que esa mezcla junto con la
aplicación de una solución básica aumentan la viscosidad. Por lo
tanto, esos polímeros pueden administrarse más convenientemente con
un proceso de mezclado similar al utilizado con una fibrina
solubilizada en ácido.
Los siguientes ejemplos ilustran más la presente
invención, pero, desde luego, no deben interpretarse de ninguna
manera como limitantes de su alcance.
El proceso bioquímico para preparar un monómero
de fibrina es totalmente automatizado y se ha descrito anteriormente
(Kjaergard et al. Cardiovascular Engineering 2:
204-206, 1997). Se mezclan 120 ml de sangre del
paciente en el equipo de preparación con citrato sódico para
anticoagulación. La centrifugación de ciclo rápido aísla 60 ml de
plasma que se reaccionan con batroxobina biotinilada durante 10
minutos a 37ºC. El complejo biotina-batroxobina
cataliza la liberación del fibrinopéptido A desde el fibrinógeno
pero no activa el factor XIII, lo que da como resultado la
formación de un polímero de fibrina I, que es soluble en ácido. El
polímero de fibrina I se aísla por centrifugación y se disuelve en
3,5 ml de tampón de acetato sódico 0,2 M (pH 4,0). La avidina,
unida por uniones covalentes a agarosa, se añade a la solución para
formar un complejo de biotina-batroxobina con
agarosa. El complejo de
biotina-batroxobina:avidina-agarosa
se separa luego de la solución de fibrina I por filtración.
La solución ácida de fibrina I se extrae en un
vial y se transfiere a la unidad de aplicación. Una jeringa con la
unidad aplicadora contiene 0,75 M de tampón de carbonato/bicarbonato
(pH 10). Las dos soluciones se administran simultáneamente y se
mezclan íntimamente durante el proceso de aplicación. La mezcla a
una razón de 7:1 (fibrina I:tampón) inicia la polimerización. A un
pH neutro que resulta del mezclado y en presencia de iones calcio
proporcionados por el tampón carbonato/bicarbonato, la protrombina
endógena se transforma en trombina, lo que causa que el
fibrinopéptido B se descomponga a partir de fibrina I para formar la
fibrina II. La trombina también activa el factor XIII que actúa
sobre la fibrina II para formar un polímero de fibrina II estable.
En estudios en seres humanos el proceso se completa en 30 minutos y
produce aproximadamente 4,5 ml de adhesivo de fibrina concentrado
rico en fibrina asociada las proteínas que incluyen
fibronectina.
Se realizó un estudio in vitro para
evaluar si queratinocitos subconfluentes de cerdo eran capaces de
utilizar un adhesivo de fibrina polimerizado (producido utilizando
el proceso del Ejemplo 1) como sustrato para la adherencia y el
crecimiento. El adhesivo de fibrina polimerizado se preparó a partir
de muestras de solución de fibrina I producidas a partir de una
donación única de sangre de cerdo mediante el proceso del ejemplo
1. La concentración de fibrina I de la solución fue 23,65 mg
ml^{-1} y el valor de pH fue 4,43. Se utilizó una única placa de
determinación de 24 pocillos para el cultivo de tejidos (0,8 cm de
diámetro interno de los pocillos). Los grupos experimentales se
describen en la Tabla siguiente:
pocillos de 0,8 cm | Grupo 1, n = 3 | Grupo 2, n = 3 |
Coágulo de fibrina | 150 \mul de solución de fibrina I | 150 \mul de solución de fibrina I |
750 \mul DMEM (10% FCS) | 750 \mul DMEM (10% FCS) | |
50 \mul de solución de colágeno de tipo I | 50 \mul de solución de ácido acético 0,02 M | |
Células | 1/10^{5} queratinocitos de cerdo de pase 2 | 1/10^{5} queratinocitos de cerdo de pase 2 |
5/104 células irradiadas de alimentador 3TC |
Se agregaron 150 microlitros de solución de
fibrina I a cada uno de los 6 pocillos. Se agregaron 750 microlitros
de medio de cultivo DMEM (que contiene 10% FCS), con 50 \mul de
solución de 50 \mul/ml de colágeno de cola de rata de tipo I
(disuelta en ácido acético 0,02 M) a cada uno de los 3 pocillos del
Grupo 1. Se agregó la misma solución a los 3 pocillos del Grupo 2;
sin embargo, la solución de colágeno de cola de rata se omitió y se
reemplazó por 50 \mul de ácido acético 0,02 M. La solución de
fibrina I se polimerizó inmediatamente después del agregado de la
solución de DMEM. Se aplicaron 50.000 células irradiadas de
alimentador 3TC en 0,5 ml de medio de crecimiento de queratinocitos
a la superficie del adhesivo de fibrina polimerizada en los 3
pocillos del Grupo 1 y 0,5 ml del medio de crecimiento de
queratinocitos solo se aplicaron a los pocillos del Grupo 2. Se
aplicaron 100.000 (1 x 10^{5}) del pase de queratinocitos de cerdo
subconfluentes a 0,5 ml de medio de crecimiento de queratinocitos a
la superficie de los 6 pocillos. Después de 2 días de cultivo, se
cambió el medio por aspiración suave. Después de 4 días el coágulo
de adhesivo de fibrina aún estaba presente en la base de cada
pocillo. Después de otro cambio de medio, se extrajo el coágulo del
pocillo utilizando un escalpelo (tamaño de hoja 11) y un par de
pinzas dentadas.
Luego se bloqueo cada coágulo y se congeló en
compuesto de bloqueo OCT. Se cortaron criosecciones de
15 \mum de espesor de forma transversal y tangencial a la superficie superior del coágulo. Se esperaba que las últimas secciones permitieran evaluar la morfología de los queratinocitos adhesivos. El coágulo adhesivo de fibrina tiene una fuerza mucho menor que las biopsias de tejido y lamentablemente todas esas secciones se fragmentaron durante el corte. Las criosecciones transversales se fijaron y se tiñeron para evaluar la inmunorreactividad a la queratina 14 utilizando técnicas inmunocitoquímicas estándar y microscopia fluorescente. Los queratinocitos fueron visibles sobre la superficie del coágulo de adhesivo de fibrina en ambos grupos experimentales.
15 \mum de espesor de forma transversal y tangencial a la superficie superior del coágulo. Se esperaba que las últimas secciones permitieran evaluar la morfología de los queratinocitos adhesivos. El coágulo adhesivo de fibrina tiene una fuerza mucho menor que las biopsias de tejido y lamentablemente todas esas secciones se fragmentaron durante el corte. Las criosecciones transversales se fijaron y se tiñeron para evaluar la inmunorreactividad a la queratina 14 utilizando técnicas inmunocitoquímicas estándar y microscopia fluorescente. Los queratinocitos fueron visibles sobre la superficie del coágulo de adhesivo de fibrina en ambos grupos experimentales.
En este modelo de herida bien establecido, se han
descrito los procedimientos anestésicos y quirúrgicos con
anterioridad (Kangesu et al., Brit. J. Plastic Surg.
46: 3893-400, 1994). Se realizaron tres heridas
circulares de 4 cm de diámetro de espesor completo sobre la fascia
muscular expuesta de cada flanco de la caja torácica del cerdo
Large White. Cuando se utilizó el reemplazo dérmico Integra^{TM}
en este modelo, se logró una hemostasis meticulosa de la base de la
herida utilizando cuidadosamente diatermia bipolar (es decir,
generación de calor en el tejido mediante corrientes eléctricas
para fines médicos o quirúrgicos). El reemplazo dérmico
Integra^{TM} se preparó de la manera descrita por Burke et
al. (Artificial Skin, Dermal Regeneration Template, Physician
Training Manual, Integra Lifesciences Corporation, 1996) y luego se
cortó en discos de 4,5 cm de diámetro que se suturaron a la base de
la herida utilizando suturas monofilamento de 5º posicionadas a 2 a
3 mm internamente con respecto al borde del disco. Las heridas se
aislaron de la piel circundante utilizando cámaras de
politetrafluoroetileno (PTFE) afirmadas en posición utilizando
suturas de seda de 2º. El reemplazo dérmico Integra^{TM} se
cubrió con un apósito no adherente y las cámaras se llenaron con
gasa embebida en solución salina ligeramente compactada. Se ajustó
una cubierta protectora revestida de espuma alrededor del tronco
del animal para evitar cualquier lesión inadvertida a las heridas.
Se realizó una biopsia de la piel para iniciar los cultivos de
queratinocitos el mismo día que se crearon las heridas de espesor
completo (aisladas por cámaras percutáneas) y se injertó con
reemplazo dérmico Integra^{TM} sobre la fascia del tronco
torácico.
torácico.
Se extrajo sangre de la vena yugular externa
izquierda del cerdo. El protocolo para la producción de adhesivo de
fibrina autólogo fue según el Ejemplo 1.
El protocolo para el injerto del reemplazo
dérmico Integra^{TM} (o piel artificial) se refinó (como se
detalla en Clayton and Bishop, J. Burn Care Rehabil., vol.
19:(4): 358-363, 1998) para lograr que prendieran
con tasas consistentemente altas.
En este experimento se utilizó un animal de 10
semanas. El protocolo utilizó un periodo de sólo 10 días entre la
biopsia inicial y la aplicación de células cultivadas. (Así fue
posible tomar la biopsia inicial durante la misma anestesia
utilizada para crear heridas aisladas y aplicar la piel artificial
Integra^{TM}). Los apósitos se cambiaron con anestesia general
los días 3º y 8º.
El día 10 el animal se anestesió y se canuló la
vena yugular externa izquierda. Se prepararon aproximadamente 4,5
cm^{3} de la solución de fibrina I de cerdo utilizando una única
serie de elaboración. Las heridas se expusieron y se eliminó la
membrana silástica temporal del reemplazo dérmico Integra^{TM}. El
reemplazo dérmico Integra^{TM} prendió en un 100% en la totalidad
de las 6 heridas.
Seis frascos grandes (T75) de queratinocitos con
una confluencia del 80-90% se dispersaron utilizando
5 ml de tripsina al 0,05%/ácido
etilendiamino-tetra-acético al 0,02%
precalentada (Gibco BRL, Life Technology) administrados a cada
frasco, y se incubaron los frascos a 37ºC. Las células tardaron 10
minutos para separarse del plástico de cultivo tisular. La acción
de la tripsina se neutralizó por el agregado de medio que contenía
suero. En total se recogieron aproximadamente 14 x 10^{6} células
viables. Los queratinocitos se suspendieron en medio de crecimiento
de queratinocitos para pulverizar. La viabilidad se evaluó a partir
de una muestra no pulverizada al final del procedimiento de
pulverización.
Se aplicaron aproximadamente 0,6 cm^{3} de
adhesivo de fibrina de cerdo autólogo (aproximadamente 22 mg/ml de
monómero de fibrina) y 0,6 cm^{3} de suspensión de células
porcinas a las heridas 1-3. Se aplicaron
aproximadamente 0,6 cm^{3} de adhesivo de fibrina de cerdo con
medio de crecimiento de queratinocitos porcinos sin células a las
heridas 4-6. El adhesivo de fibrina y el tampón de
carbonato/bicarbonato se pulverizaron con un dispositivo
pulverizador y las células se pulverizaron con un dispositivo
similar unido mediante cinta al primer dispositivo. Las cabezas de
pulverización se mantuvieron a 2 a 5 cm de las heridas. El
dispositivo utilizado fue de acuerdo con el documento WO 97/20585;
se utilizaron tres salidas alineadas linealmente de 300 \mum para
descargar, respectivamente, aire, fibrina disuelta en ácido y
tampón de carbonato/bicarbonato. En un grupo experimental las
heridas estaban del lado izquierdo del animal y en el otro grupo
experimental las heridas estaban del lado derecho. Esta disposición
evitó cualquier posible contaminación de las heridas tratadas sólo
con adhesivo de fibrina por los queratinocitos pulverizados del
otro grupo experimental.
La densidad de células de la suspensión de
células se estimó en 2,78 x 10^{6} células cm^{-3}. Así el
número total de células pulverizadas por heridas se estimó en 1,67 x
10^{6}. La viabilidad de la suspensión de células antes de la
pulverización se estimó en 92,8%. El adhesivo de fibrina se
polimerizó casi inmediatamente después de la aplicación sobre la
superficie de la herida.
Estudios anteriores realizados utilizando
queratinocitos de un segundo pase (P2) del mismo animal habían
indicado una viabilidad del 63,2% (EE 5,4) para células
pulverizadas sobre agarosa al 5% utilizando el mismo equipo (en
ausencia de adhesivo de fibrina autólogo). Por lo tanto, puede
esperarse que el número total de células viables administradas a
cada herida sea aproximadamente 1,1 x 10^{6} (o \approx 8,8 x
10^{4} células viables cm^{-2} de superficie de herida).
Se pulverizó una muestra de suspensión de células
(excedente de la utilizada en las heridas) en una placa de cultivo
de tejido cubierto de colágeno de 75 cm^{2} sembrada con 2 x
10^{6} células de ratón 3T3 irradiadas letalmente. Estas células
formaron una población casi confluente en el plazo de 3 días. Esta
población se cultivó luego durante otros dos pases sin impedimento
evidente en la tasa de crecimiento en comparación con los
queratinocitos no pulverizados.
Las heridas se fotografiaron y se cubrieron con
una capa de apósito no adherente y se llenaron las cámaras con gasa
humedecida en solución salina. Se tomaron biopsias con sacabocados
de las heridas 3 y 4, aproximadamente 5 minutos después de la
aplicación de los dos tratamientos diferentes para las heridas. Se
tomaron otras biopsias el día 4 después del tratamiento con
anestesia general y el día 14 se recogieron las heridas en la
eutanasia.
Día 0: Sobre ambas heridas se encontraba
presente una capa de recubrimiento de adhesivo de fibrina de
aproximadamente 60 \mum de espesor. Los queratinocitos
suspendidos en el adhesivo fueron detectables sólo en las biopsias
de las heridas a las que se habían aplicado células por
pulverización y tenían una morfología aislada y esférica.
El número total de células (viables y no viables)
administradas a cada herida se estimó en aproximadamente 1,7 x
10^{6}, de modo que la densidad prevista de células pulverizadas
sobre las heridas sería aproximadamente 1,3 x 10^{5}
cm^{-2}.
Día 4: Cuatro días después del tratamiento
con una mezcla pulverizada de adhesivo de fibrina y queratinocitos
suspendidos, se detectaron colonias de queratinocitos sobre la
superficie de la herida o muy próximas a ésta. La capa de adhesivo
de fibrina ya no era evidente. No se detectaron queratinocitos en la
biopsia a partir de la herida de control con adhesivo más medio
sólo.
Día 14: En la superficie de la herida
estaba presente un manto de múltiples capas de epitelio dos semanas
después de la aplicación por pulverización de la mezcla de adhesivo
de fibrina/queratinocito. No hubo epitelio presente sobre la
superficie de las heridas que se trataron sólo con una mezcla de
adhesivo de fibrina pulverizada y medio de cultivo.
Cubierta epidérmica a los 14 días: El
epitelio situado sobre la superficie de la herida 14 días después de
la aplicación de la pulverización de queratinocitos cultivados no
poseía un estrato córneo.
Macroscópicamente, el un cambio en la opacidad de
la superficie de la herida denota la presencia del epitelio. La
referencia a las biopsias confirmó que las áreas del epitelio tenían
aspecto de manta en comparación con la superficie por lo demás
brillante de la herida.
La cubierta epidérmica media de las heridas
1-3 a los 14 días de aplicada la pulverización de
una mezcla de adhesivo de fibrina y queratinocitos (calculada como
porcentaje del total de la superficie herida) fue del 66% como
ilustra la tabla siguiente. No había epitelio presente sobre las
heridas 4-6 que se trataron con una mezcla
pulverizada de adhesivo de fibrina y medio de cultivo solo.
Herida | tratamiento | \begin{minipage}[t]{70mm}Cubierta epidérmica 14 días después del injerto de queratinocitos (% del área total de la herida)\end{minipage} |
1 | pulverización de fibrina/queratinocitos | 74,0 |
2 | pulverización de fibrina/queratinocitos | 64,0 |
3 | pulverización de fibrina/queratinocitos | 61,0 |
Heridas 1-3, media = 66 (EE 5,7) | ||
4 | pulverización de fibrina | 0 |
5 | pulverización de fibrina | 0 |
6 | pulverización de fibrina | 0 |
Heridas 4-6, media = 0 |
Se observó un movimiento gradual del disco de
reemplazo dérmico Integra^{TM} (y, por lo tanto, de la base de la
herida) con respecto a la cámara PTFE de la herida. Se supuso que el
movimiento fue una consecuencia del fenómeno de "desplazamiento
de la herida" como resultado del crecimiento del animal. Una
fracción significativa de la base de la herida 14 días después del
tratamiento era consecuencia del desplazamiento de la herida, no
sometida nunca a la pulverización de adhesivo de
fibrina/queratinocitos. La reconstitución de epidermis calculada
como porcentaje de la piel artificial pulverizada Integra^{TM}
sería considerablemente mayor que el 66% registrado sin tener en
cuenta el fenómeno de migración.
Se tiñeron biopsias de tejido para evaluar la
inmunorreactividad a la queratina 6 y el colágeno VII. El día 4 no
se detectó ninguna inmunorreactividad a la queratina 6 o el colágeno
VII. El día 14, sin embargo, se tiñeron los queratinocitos
suprabasales fuertemente por queratina 6. La inmunorreactividad al
colágeno VII fue detectable por debajo de áreas de epidermis e
inmediatamente adyacente a los quistes de queratinocitos. La
inmunorreactividad al colágeno VII se detectó en la forma de
múltiples bandas superpuestas en lugar de una banda continua única.
No se detectó inmunorreactividad a la queratina 6 o el colágeno VII
en las biopsias de las heridas pulverizadas sólo con una mezcla de
adhesivo de fibrina y medio de cultivo.
Claims (15)
1. El uso de un polímero de
fibrina que se forma al cubrir una superficie diana con una mezcla
de un primer componente que consiste en una proteína no polimérica
relacionada con la fibrina y un segundo componente eficaz para
transformar la proteína relacionada con la fibrina en un polímero de
fibrina, en la preparación de una superficie diana cubierta que es
la superficie tisular de un mamífero o una superficie tisular
cubierta por una lámina de polímero biodegradable, en la que los dos
componentes mezclados forman un polímero de fibrina con una
adhesividad tal que es eficaz para adherir las células pulverizadas
en una suspensión sobre la superficie diana cubierta para el
tratamiento de heridas.
2. El uso de acuerdo con la reivindicación 1 en
el que el polímero de fibrina se forma en una cantidad que es
eficaz para asegurar una colonización que promueva una cantidad
eficaz de células sobre la superficie diana.
3. El uso de acuerdo con la
reivindicación 1 ó 2, que comprende además la mezcla de una cantidad
de colágeno que sea eficaz para promover la adherencia celular
dentro de la mezcla.
4. El uso de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la mezcla
se pulveriza para cubrir la superficie diana.
5. El uso de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la mezcla
y la suspensión de células pueden pulverizarse conjuntamente para
cubrir la superficie diana.
6. El uso de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que una
cantidad eficaz de células promotoras de colonización se atrapa en
una matriz tridimensional del polímero de fibrina en la superficie
diana.
7. El uso de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además:
el cultivo de células autólogas a partir de una biopsia obtenida de
un cierto tipo de tejido de un mamífero; y la formación de una
suspensión de células a partir de las células cultivadas, en que el
tejido al cual se aplican las células es del tipo dado o adyacente
al tejido del tipo dado.
8. El uso de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el tejido
es una herida y la suspensión de células comprende
queratinocitos.
9. El uso de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además:
el cultivo de queratinocitos autólogos a partir de una biopsia
obtenida de un mamífero, en el que el tejido al cual se aplican las
células es una herida.
10. El uso de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que los
queratinocitos cultivados de un pase que produce las células para
la suspensión de células se recogen antes de alcanzar la
confluencia.
11. El uso de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además:
la adhesión a una lámina de polímero biodegradable a la superficie
tisular tal que la suspensión de células se pulveriza sobre la
lámina de polímero que define la superficie diana.
12. El uso de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además
la pulverización de una suspensión de los fibroblastos sobre la
herida cubierta con una mezcla de los dos componentes.
13. El uso de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el primero
de los componentes comprende fibrina solubilizada en ácido y el
segundo componente comprende una cantidad de base eficaz para
neutralizar suficientemente la mezcla para permitir que se
polimerice la fibrina.
14. El uso de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende la
pulverización del primer y el segundo componente tal que un chorro
del primer componente se fusiona con un chorro del segundo
componente en el vuelo desde el dispositivo de pulverización hasta
la superficie.
15. El uso de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende la
pulverización de la suspensión de células, el primer componente y
el segundo componente de manera tal que los chorros de la
suspensión de células, el primer componente y el segundo componente
se fusionan en el vuelo desde el dispositivo de pulverización hasta
la superficie.
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