ES2257877T3

ES2257877T3 - Suministro de celulas por pulverizacion.

Info

Publication number: ES2257877T3
Application number: ES99961914T
Authority: ES
Inventors: Julian M. Marshall; Ian Grant; Stewart A. Cederholm-Williams; Paul Martin Robin
Original assignee: Bristol Myers Squibb Co
Current assignee: Bristol Myers Squibb Co
Priority date: 1998-12-02
Filing date: 1999-12-02
Publication date: 2006-08-01
Anticipated expiration: 2019-12-02
Also published as: WO2000032207A1; EP1143983A4; NO20012695L; ATE318608T1; US6479052B1; JP2002531176A; AU764347B2; CA2352810A1; AU1840200A; DE69930155T2; EP1143983B1; DE69930155D1; NO20012695D0; NZ528340A; DK1143983T3; EP1143983A1

Abstract

El uso de un polímero de fibrina que se forma al cubrir una superficie diana con una mezcla de un primer componente que consiste en una proteína no polimérica relacionada con la fibrina y un segundo componente eficaz para transformar la proteína relacionada con la fibrina en un polímero de fibrina, en la preparación de una superficie diana cubierta que es la superficie tisular de un mamífero o una superficie tisular cubierta por una lámina de polímero biodegradable, en la que los dos componentes mezclados forman un polímero de fibrina con una adhesividad tal que es eficaz para adherir las células pulverizadas en una suspensión sobre la superficie diana cubierta para el tratamiento de heridas.

Description

Suministro de células por pulverización.

La presente solicitud reivindica la prioridad de los documentos US 19980110614 P y US 19990155403 P.

La presente invención se refiere a procedimientos para administrar y adherir células a los tejidos.

Al tratar pieles lesionadas, como las lesionadas por heridas térmicas o crónicas u otras heridas, un enfoque ha sido cultivar los queratinocitos derivados de biopsias, biopsias típicamente autólogas, hasta poder levantar una lámina semejante a la piel desde la placa de cultivo por digestión por proteinasas. Las dificultades con este proceso incluyen que el tiempo necesario para el crecimiento de esos cultivos sobreconfluentes o "injertos de láminas epiteliales" es del orden de tres semanas, las láminas de piel son difíciles de manipular y ha demostrado ser problemático que "prendan", es decir, la adherencia estable de los injertos laminares al tejido basal de lesión. Véase, p. ej., Rennekampff et al., J. Surg Res. 62:288-295, 1996. Además, los queratinocitos que crecen hasta una densidad tan alta adquieren el carácter de células diferenciadas, no proliferantes, en lugar de células en crecimiento activo que contribuyen a la cicatrización de una herida. Véase p. ej., Rennekampff et al. Ha habido varios enfoques para introducir queratinocitos cultivados en las heridas mientras estas células están aún en una fase de crecimiento más activo, como se analizó en Rennekampff et al. Entre éstos se incluyen el crecimiento de las células hasta la subconfluencia sobre soportes poliméricos porosos y la aplicación de los soportes invertidos para orientar las células hacia abajo sobre las heridas. Además, ciertos investigadores en este campo han experimentado mezclando queratinocitos y fibrinógeno, y luego mezclando trombina justo antes de la aplicación a la herida, de modo tal que el fibrinógeno se transforme en fibrina, la que forma una matriz polimérica para los queratinocitos. Véase Hundyadi et al., J. Dermatol. Surg. Oncol. 14: 75-78, 1988; Keiser et al., Burns 20:23-29, 1994. La conversión enzimática del fibrinógeno proporciona un tiempo prolongado durante el que la composición tiene una adhesividad utilizable; esta permite que la composición que contiene las células pueda diseminarse sobre la herida. También puede utilizarse el "adhesivo" de fibrina para afirmar una capa protectora de piel alogénica de cadáver.

Las investigaciones previas de otros solicitantes, junto con las de otros que han trabajado con los solicitantes, han identificado un adhesivo eficaz que proporcionar fibrina en el sitio que debe adherirse; este adhesivo tiene la forma de un "monómero de fibrina" que se estabiliza por polimerización. En el sitio, las condiciones de estabilización se invierten y se forma un coágulo eficaz. Véase, Edwardson et al., solicitud de patente europea nº EP 592.242. Una de las ventajas particulares de este adhesivo de monómero de fibrina de la patente EP 592.242 es que se puede preparar rápidamente a partir de una pequeña cantidad de la piel de un paciente sólo minutos antes de la cirugía (o en una hora si se utiliza la preparación manual) y que la preparación puede hacerse utilizando un equipo de laboratorio estándar. También se han descrito instrumentos especializados para preparar el monómero de fibrina, y estos instrumentos permiten preparar un adhesivo autólogo a partir de un paciente, de una manera rápida, muy reproducible y muy segura. Véase, Holm, "Centrifuge Reagent Delivery System", WO 96/16713, Holm, et al. "Method and Device for Separating Fibrin I from Blood Plasma", WO 96/16714 y Holm, "Centrifuge with Annular Filter", WO 96/16715. La composición del monómero de fibrina solubilizado puede utilizarse como adhesivo, como se describe en Edwardson et al., EP 592.242. Por lo tanto, estas mejoras permiten que se prepare un adhesivo autólogo con un proceso automático, rápido, y el adhesivo autólogo así preparado carece de enzimas proteinasas extrínsecas como la trombina bovina o de proteínas bovinas como la aprotinina.

Otro adhesivo de fibrina cuya polimerización puede inducirse sin utilizar enzimas proteolíticas emplea (1) un primer componente que consiste en un análogo de fibrina en el que la región C terminal de la cadena \gamma está suficientemente alterada como para interrumpir la autopolimerización y (2) un segundo componente que consiste en una molécula relacionada con la fibrina tal como un fibrinógeno. Véase, Cederholm-Williams, WO9529686A1. Al combinarse los dos componentes, el análogo de fibrina se polimeriza con la molécula relacionada con la fibrina.

Ahora los solicitantes han demostrado que la pulverización de los queratinocitos sobre la zona herida, aproximadamente dentro del mismo marco temporal que la pulverización y mezcla de los sistemas formadores de polímeros de dos componentes de fibrina sobre la herida, es eficaz para afirmar los queratinocitos (y en algunos casos los fibroblastos) en la herida dentro de una matriz polimérica tridimensional de fibrina, donde el total de las células afirmadas se expande con eficacia y forma una capa epitelial. En aspectos preferidos de la invención, los queratinocitos se pulverizan junto con la pulverización y mezcla en el vuelo de un sistema de dos componentes que da como resultado la polimerización de las moléculas relacionadas con la fibrina de la mezcla con capaz dinámica de polimerización.

La invención también se aplica a otros tipos de células que pueden afirmarse sobre una superficie tisular, por ejemplo, para generar crecimiento de tejido nuevo o estabilizar la presencia de las células durante una cantidad de tiempo suficiente como para lograr un resultado deseado. La invención se refiere, además, a la pulverización de células sobre un sustrato tisular sin fibrina o con otros polímeros biocompatibles, preferiblemente biodegradables. La invención se refiere además a células administradas con colágeno, con o sin fibrina.

Resumen de la invención

La invención proporciona el uso de un polímero de fibrina, que se forma al cubrir una superficie diana con una mezcla de un primer componente que comprende una proteína no polimérica relacionada con la fibrina y un segundo componente eficaz para transformar la proteína relacionada con la fibrina en polímero de fibrina, en la preparación de una superficie diana cubierta que es la superficie tisular de un mamífero o la superficie tisular cubierta por una lámina de polímero biodegradable, en la que los dos componentes mezclados forman un polímero de fibrina con una adhesividad tal que es eficaz para adherir células pulverizadas en una suspensión sobre la superficie diana para el tratamiento de heridas. Preferiblemente, el polímero de fibrina se forma en una cantidad que es eficaz para asegurar una colonización eficaz de las células sobre la superficie diana. En una realización, el procedimiento comprende además la mezcla de una cantidad de colágeno que sea eficaz para promover la adherencia celular. Preferiblemente, la mezcla se pulveriza para cubrir la superficie diana. La mezcla y la suspensión de células pueden pulverizarse conjuntamente para cubrir la superficie diana. Preferiblemente, una cantidad eficaz de células promotoras de colonización se atrapa en una matriz tridimensional del polímero de fibrina en la superficie
diana.

El uso puede comprender la adherencia de la lámina de polímero biodegradable a la superficie tisular, de modo tal que la suspensión de células se pulveriza sobre la lámina de polímero que define la superficie diana. En una realización, la lámina de polímero se adhiere junto con una capa externa de soporte extraíble adaptada para restringir más el transporte de vapor desde el tejido, aunque sin eliminarlo, y el procedimiento además comprende: la eliminación de la capa de soporte después de haberse adherido la lámina de polímero al tejido y luego la aplicación de la suspensión de células. La lámina polimérica puede, sin limitación, constar de una lámina polimérica de glucosaminoglucano o de una lámina polimérica de colágeno entrecruzado.

El uso también puede comprender: el cultivo de células autólogas a partir de una biopsia obtenida de un cierto tipo de tejido de un mamífero y la formación de una suspensión de células a partir de las células cultivadas, en que el tejido al cual se aplican las células es del tipo dado o adyacente al tejido del tipo dado.

En un aspecto preferido de la invención, el tejido es una herida y la suspensión de células comprende queratinocitos. Preferiblemente, los queratinocitos cultivados del pase que produce las células para la suspensión de células se recogen antes de que alcancen la confluencia. El uso también puede comprender: la pulverización de una suspensión de fibroblastos sobre la herida cubierta por la mezcla de los dos componentes. Los fibroblastos pueden aplicarse a la misma mezcla que crea un polímero de fibrina o a una mezcla separada que crea el polímero.

En una realización, el primer componente comprende fibrina solubilizada en ácido y un segundo componente puede comprender una cantidad de base eficaz para neutralizar suficientemente la mezcla para permitir que la fibrina se polimerice. La aplicación del primero y el segundo componente (de cualquier tipo) pueden comprender la pulverización del primer y el segundo componente de modo tal que un chorro del primer componente se fusiona con un chorro del segundo componente en el vuelo desde dispositivo pulverizador hasta la superficie de la suspensión de células. El procedimiento puede comprender la pulverización de la suspensión de células, el primer componente y el segundo componente de modo tal que los chorros de la suspensión de células, el primer componente y el segundo componente se fusionen en el vuelo (desde el dispositivo pulverizador hasta la superficie).

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 muestra (a completar más tarde, suponiendo que se utilicen los dibujos).

Definiciones

Los siguientes términos tendrán, a los fines de esta solicitud, el significado respectivo presentado más abajo.

\bullet: Agente bioactivo. Un agente bioactivo es una sustancia tal como un producto químico que puede actuar sobre una célula, un virus, un tejido, un órgano o un organismo, que incluye los fármacos (es decir los productos farmacéuticos) o las hormonas (por ejemplo, los factores de crecimiento), aunque no limitarse a ellos, para crear un cambio en el funcionamiento de la célula, el virus, el órgano o el organismo. Preferiblemente el organismo es un mamífero, más preferiblemente un ser humano.

\bullet: Cantidad de colágeno que promueve con eficacia la adherencia celular: Una cantidad de colágeno que promueve con eficacia la adherencia celular es una cantidad que reduce la cantidad de células necesarias para lograr una colonización que promueva una cantidad eficaz de células o una cantidad de células eficaz para promover el crecimiento tisular.

\bullet: Cantidad de células que promueve una colonización eficaz. La cantidad de células que promueve una cantidad eficaz de células adherentes es una cantidad eficaz para llevar a la formación de colonias o para llevar a una residencia de células eficaz como para causar un cambio fisiológico del animal (cuando las células adherentes son recombinantes, de producir y exportar una cantidad de agente recombinante biológicamente activo) o de llevar a la formación de tejido nuevo.

\bullet: Sistemas dinámicos de fibrina. Los sistemas dinámicos de fibrina son sistemas binarios formadores de polímero de fibrina que generan, al mezclarse los dos componentes, las moléculas relacionadas con la fibrina que son dinámicamente capaces de polimerizarse.

\bullet: Dinámicamente capaces de polimerizarse. La afirmación de que las moléculas de una mezcla son dinámicamente capaces de polimerizarse indica que cualquier barrera a la capacidad de polimerización es totalmente función de la dinámica de mezclado o la cinética rápida de primer orden para cualquier cambio estructural terciario que se produzca a partir de las condiciones modificadas de la mezcla, como el pH.

\bullet: Proteína relacionada con la fibrina. Una proteína relacionada con la fibrina se basa en dos pares de cadenas \alpha de fibrina, dos pares de cadenas \beta de fibrina y dos pares de cadenas \gamma de fibrina que se encuentran en las fibrinas o el fibrinógeno. Una proteína relacionada con la fibrina se convierte o puede convertirse fácilmente en una forma que es dinámicamente capaz de polimerizarse. Como se ha señalado en otra parte de este documento, es posible utilizar varias formas de moléculas derivadas o basadas en el fibrinógeno para hacer un polímero de fibrina y, por lo tanto, son proteínas relacionadas con la fibrina.

\bullet: Cantidad de células eficaz para la promoción del crecimiento tisular. Una cantidad de células adherentes eficaz para la promoción del crecimiento tisular es una cantidad eficaz para la promoción de una colonización que conduce a la formación de tejido nuevo.

Descripción detallada de la invención

Las células se pulverizan sobre un sustrato tisular donde se hayan pulverizado los componentes formadores del gel de fibrina tan recientemente como para que el polímero de fibrina no haya madurado demasiado para que tenga una adhesividad suficiente como para adherir las células pulverizadas. Preferiblemente, los componentes relacionados con la fibrina han madurado hasta formar un gel suficiente que es más adherente que cualquiera de las composiciones de los dos componentes mezclados para formar el gel. Más preferiblemente, los dos componentes y las células se pulverizan simultáneamente, lo que significa que tanto el dispositivo pulverizador de adhesivo como el dispositivo para la suspensión de células funcionan al mismo tiempo con los chorros dirigidos hacia el mismo tejido.

Preferiblemente, la formación de fibrina que es capaz dinámicamente de polimerizarse es independiente de cualquier conversión proteolítica de las moléculas relacionadas con la fibrina. Una velocidad de polimerización rápida de la fibrina es un aspecto importante que proporciona una ventaja clara con respecto a las mezclas de fibrinógeno/trombina/células. La polimerización rápida permite la aplicación rápida de una capa delgada de fibrina y células esencialmente a cualquier superficie o cavidad corporal. Los enfoques que proporcionan una adhesividad inicial insuficiente pueden experimentar problemas de "escurrimiento" de las superficies horizontales.

Los estudios notificados en la presente memoria utilizan el procedimiento de la invención como vehículo para sembrar en las heridas suspensiones de queratinocitos monodispersas en crecimiento activo mediante dos dispositivos de pulverización unidos para pulverizar células y un adhesivo de fibrina sobre heridas experimentales pequeñas. El número total y la disponibilidad de células administradas de esta forma se han estimado in vitro e in vivo y se considera que existe cierto grado de pérdida celular. Las pérdidas detectadas pueden ser pérdidas de células frágiles que están alcanzando la senescencia natural o las pérdidas puede deberse a que el sistema de aplicación de la pulverización no se haya optimizado para la administración de células. Por ejemplo, se han demostrado que las variaciones en el chorro de aire tienen un efecto importante.

Tipos de células; tipos de tejidos

Las células a introducir en un sustrato tisular según la invención, incluyen, sin limitación, queratinocitos, fibroblastos, hepatocitos, células pancreáticas, células pulmonares, células musculares (músculo liso, músculo cardiaco, músculo estriado), condrocitos, osteoblastos, células endoteliales, óvulos fecundados, células suprarrenales y neuronas. Las células pueden aplicarse según la invención para complementar o establecer el crecimiento del tejido. Típicamente, las células se aplican a un sustrato de tejido localizado adecuadamente para el crecimiento de tejido deseado. Las células aplicadas pueden incluir células transformadas in vitro o in situ en un fenotipo modificado, como células transformadas para producir una agente bioactivo útil o células de un tejido dado transformadas para disminuir un defecto genético. En este último caso, el resultado deseado puede lograrse mediante cierta residencia mínima de las células transformadas en el tejido sustrato al cual se adhiere. Por ejemplo, es posible pulverizar células, por ejemplo a través de un dispositivo endoscópico, sobre tejido pulmonar para proporcionar una producción terapéutica de un agente bioactivo durante un periodo de tiempo. Para las células transformadas por la incorporación de un vector adecuado in situ, la fibrina puede actuar como un reactivo que aumenta la transformación, como se comentó en el documento de número de serie de Estados Unidos 60/089.543, presentado del 17 de junio de 1998, y el documento de número de serie de Estados Unidos 09/334.325, presentado del 16 de junio de 1999.

Los tejidos a los cuales las células se adhieren incluyen, sin limitación, la estructura basal de una herida (que dependiendo de la profundidad de la herida puede comprender el tejido epidérmico, la dermis o fascia muscular), el pulmón, el hígado, el peritoneo o el miocardio. La presencia de una herida en el epitelio tisular constituye un sustrato preferido.

En una realización de la presente invención, una suspensión adecuada de fibroblastos, que son preferiblemente autólogos, se pulveriza sobre una herida junto con la pulverización de los queratinocitos. Los fibroblastos luego aceleran la formación de una capa dérmica que proporciona un mejor soporte de adherencia para la capa epidérmica que se está formando.

Las células pueden derivarse directamente del tejido de un donante, como por ejemplo, por biopsias o de la sangre, o cultivarse ex vivo.

En un aspecto preferido de la invención, (a) las células pulverizadas primariamente incluyen (o comprenden) células transformadas por recombinación para expresar un agente bioactivo útil para establecer el crecimiento o el mantenimiento de las células primarias, como por ejemplo un factor de crecimiento o (b) las células secundarias así transformadas se añaden a las células pulverizadas primariamente. Las células recombinantes pueden ser transformadores estables, lo que significa que la característica nueva se mantiene de manera estable con o sin condiciones particulares. Puede esperarse que esos transformadores estables mantengan el fenotipo de expresión recombinante durante un periodo prolongado. O las células recombinantes pueden ser transformadores transitorios, de los que puede esperarse que pierdan la expresión del fenotipo en unas pocas generaciones o menos. Esas células transformadas transitoriamente pueden crearse por aplicación de un vector adecuado inductor de la transformación al tejido diana junto con las células primarias. En ciertas realizaciones la expresión del agente bioactivo inducida por recombinantes es más deseable inmediatamente después de la aplicación de las células al tejido diana, en el momento en que las células tienen menos soporte del riego sanguíneo y otros mecanismos de apoyo del hospedador animal. Por lo tanto, puede esperarse que las células transformadas transitoriamente o las células transformadas tengan una viabilidad limitada en la zona de tejido diana, puedan emplearse provechosamente para proporcionar la expresión inmediata de agentes bioactivos adecuados.

Sistemas de fibrina de dos componentes

La invención puede utilizarse junto con cualquier sistema de dos componentes que se combinen para formar un polímero de fibrina. Esos sistemas de dos componentes incluyen adhesivos de fibrina tradicionales donde el fibrinógeno se mezcla con una enzima conversora (es decir, una enzima eficaz para eliminar una cantidad de fibrinopéptidos suficiente para crear fibrina eficaz). Esos sistemas se describen, por ejemplo, en Hundyadi et al., J. Dermatol. Surg. Oncol. 14: 75-78, 1988 y en Kaiser et al, Burns 20: 23-29, 1994. Los sistemas más preferidos son aquellos en los que la única barrera para la polimerización es un cambio reversible de la forma física de la fibrina o la separación de los dos componentes que son eficaces para formar un polímero de fibrina primario. Estos sistemas crean, al mezclarse, una fibrina que es "dinámicamente capaz de polimerizarse", como se define más arriba, y pueden denominarse "sistemas dinámicos de fibrina". En estos sistemas, los dos componentes pueden mezclarse en el vuelo durante la pulverización para formar rápidamente un polímero de modo tal que se pulveriza sobre el tejido receptor una composición viscosa que fija las células.

Más preferido es el uso de un primer componente que es la fibrina (preferiblemente fibrina I) disuelta en un ácido relativamente débil y un segundo componente que es una cantidad de base suficiente para neutralizar el primer componente, de manera tal que mediante la mezcla de los dos componentes la fibrina se transforma en una forma capaz de polimerizarse (es decir, es dinámicamente capaz de polimerizarse). Este tipo de sistema de dos componentes puede fabricarse rápidamente a partir de sangre autóloga. El componente de fibrina es portador de protrombina y factor XIII en una cantidad suficiente para que el suministro de ión calcio en el segundo componente sea eficaz para activar la trombina, iniciando así la maduración de la fibrina a fibrina II y la activación del factor XIII para proporcionar entrecruzamiento de fibrina.

Se han descrito instrumentos especializados para preparar esa fibrina solubilizada o "monómero de fibrina" y estos instrumentos permiten que se prepare un adhesivo autólogo a partir de un paciente de manera rápida, muy reproducible, muy fiable y muy segura. Véase Holm "Centrifuge Reagent Delivery System", WO 96/16713, Holm et al., "Method and Device for Separating Fibrin I from Blood Plasma", WO 96/16714 y Holm "Centrifuge with Annular Filter", WO 96/16715. Estas solicitudes de patente describen un aparato moldeado que funciona en una centrífuga. Una primera cámara del aparato se llena de sangre y un proceso de centrifugación separa el plasma a partir de una fracción de sangre celular sedimentada. El plasma se transfiere a una segunda cámara dentro de la que se inserta una enzima conversora que se une a la biotina mediante uniones covalentes. La acción de la enzima transforma el fibrinógeno del plasma en fibrina, y las moléculas de fibrina se unen entre sí formando polímeros que precipitan en forma de sólido. El precipitado de fibrina se sedimenta por centrifugación y el plasma remanente se vuelve a transferir a la primera cámara. El precipitado de fibrina sedimentado se disuelve con un líquido solubilizador, que es mayormente una solución acuosa tamponada con un pH ácido. La solución viscosa de monómero de fibrina se mezcla con perlas de agarosa que tienen unida avidina para eliminar las trazas de la enzima conversora biotinilada y luego se lava dentro de una tercera cámara (por ejemplo, una jeringa) a través de un filtro que elimina las perlas de agarosa. La agarosa retenida contiene toda la enzima residual unida mediante la interacción de alta afinidad avidina-
biotina.

En un aspecto preferido, la composición de la fibrina se enriquece con factores de crecimiento adecuados como factores de crecimiento de fibroblastos o factores de crecimiento derivados de plaquetas. En otro aspecto, las células se administran simultáneamente con plaquetas o macrófagos u otras células derivadas de la sangre. Preferiblemente esas células que se administran simultáneamente son autólogas.

Debe señalarse que se prefieren las fuentes autólogas de fibrina, queratinocitos u otras células, pero que a menudo son apropiadas otras fuentes. Esas fuentes incluyen plasma fresco congelado (autólogo, donante único, etc.) o banco de sangre de sangre completa.

Las composiciones que administran proteínas relacionadas con la fibrina incluyen además preferiblemente proteínas asociadas. Por ejemplo, la fibronectina está preferiblemente presente en una cantidad de 3 \mug/ml a 1.000 \mug/ml o más, más preferiblemente 30 \mug/ml o 60 \mug/ml o más. Protrombina está presente preferiblemente, con un peso o actividad basada en el volumen, en una cantidad del 100% o más, más preferiblemente 30-60% o más, donde la cantidad porcentual está relacionada con la concentración plasmática original de protrombina. El factor XIII está presente preferiblemente en una cantidad de 20-2.000% o más, más preferiblemente 200-1.000 o más, donde la cantidad porcentual está relacionada con la concentración plasmática original del Factor XIII.

Soportes poliméricos

En algunos contextos, en particular el tratamiento de heridas, puede ser deseable proporcionar una cubierta de polímero biodegradable que permita la adherencia y la infiltración de las células deseadas. Los apósitos de membrana de poliuretano útiles como cubiertas de ese tipo incluyen Hydroderm^{TM} (Wilshire Medical, Inc., Dallas, Tejas, Estados Unidos) y Spyrofilm^{TM} (Polymedica Inc., Denver, Colorado, Estados Unidos), que se suministran con una cubierta adhesiva biocompatible. Las membranas basadas en ácido hialurónico útiles como cubiertas de ese tipo incluyen Laserskin^{TM} (Fidia Advanced Biopolymers, Abano Terme, Italia).

Otras cubiertas de ese tipo incluyen: la membrana polimérica EpiGen^{TM} (T. J. Smith & Nephew, Limited, HU3 2BN Inglaterra); el soporte Apligraft^{TM} (véase, Eaglstein et al., "Tissue Engineering and Development of Apligraft in a Human Skin Equivalent", Clinical Therapeutics 19: 894-905, 1997; comercialización por Novartis AG), en que Apligraft^{TM} es un soporte basado en fibrina que incorpora un compuesto de epidermis viva y células de dermis y el soporte BioSeed^{TM} (Véase, Horch et al., "Fibrin Glue and a Carrier for Cultured Human Keratinocyte Suspensions versus Epidermal Skin Grafts", Abstract 1997 Annual Meeting, American Institute of Chemical Engineering, Paper 52H).

Entre las cubiertas poliméricas útiles de ese tipo también se incluye la piel artificial Integra® (Integra Life Sciences, Plainsboro, Nueva Jersey, Estados Unidos). La piel artificial Integra® es un sistema de membrana de dos capas para el reemplazo dérmico. Una capa de reemplazo dérmico está formada por una matriz porosa de fibras de colágeno de tendón bovino entrecruzado y un glucosaminoglucano (condroitin-6-sulfato). La matriz porosa se fabrica con una porosidad controlada y una tasa de degradación controlada. Una capa de sustitución epidérmica temporal está formada de polímero de polisiloxano sintético (silicona) y funciona controlando la pérdida de humedad desde la herida. La capa de reemplazo dérmico que contiene colágeno sirve como matriz para la infiltración de fibroblastos, macrófagos, linfocitos y capilares derivados de la base de la herida. Al progresar la cicatrización, los fibroblastos depositan una matriz de colágeno; simultáneamente, la capa dérmica de piel artificial Integra® se degrada. Véase, Burke et al., Annals of Surgery 194: 413-427, 1981.

Obsérvese que esta invención se ilustra con el uso de una cubierta de soporte membranosa, pero que ese soporte no es necesario. En el contexto del tratamiento de heridas, ese soporte puede ayudar a proporcionar una barrera, por ejemplo, para el transporte de vapor. Sin embargo, hay otros procedimientos disponibles para proporcionar tratamiento a las heridas mientras se forma el tejido epidérmico (con el procedimiento de la invención). Por ejemplo, pueden aplicarse aloinjertos de piel, como los injertos de piel de espesor parcial, sobre las células pulverizadas para proporcionar una capa protectora. En este contexto, el adhesivo de fibrina sirve además para afirmar el injerto de piel. Esos injertos se glicerolizan típicamente en el caso aloinjertos de dermis desepitelializada o de injertos de piel de espesor parcial.

Por lo tanto, la invención proporciona una alternativa a la formación de una epidermis sobre el reemplazo dérmico Integra, el uso de injertos de piel de espesor parcial, los autoinjertos epiteliales cultivados y otros similares.

Dispositivos pulverizadores

Un sistema de fibrina de dos componentes puede pulverizarse mediante cualquier tipo de dispositivo conocido en la técnica. Típicamente, la mezcla se debe realizar de inmediato, durante o inmediatamente después de la pulverización. La mezcla que se realiza inmediatamente antes de la pulverización debe realizarse lo suficientemente próxima en el tiempo al evento de pulverización para que la viscosidad no haya aumentado lo suficiente como para interferir con la formación de pequeñas gotas. En el caso de los sistemas dinámicos de fibrina, ese mezclado previo no se prefiere, excepto si es de corta duración, debido a la rapidez con que aumenta la viscosidad.

Un aparato de pulverización preferida mezclaría los dos componentes del sistema de fibrina en el vuelo durante la operación de pulverización. En un sistema de ese tipo, la cinética de la mezcla de los dos chorros proporciona una dinámica de mezclado sustancial. Puede crearse una dinámica de mezclado adicional por los cambios de energía cinética después de la colisión de los chorros fusionados con el tejido diana. Un dispositivo descrito en Holm, Patente de Estados Unidos 5.605.541. El dispositivo Holm tiene una salida central de gas y dos salidas anulares dispuestas alrededor de la salida de gas. La salida anular interior administra preferiblemente tampón, mientras que la salida anular externa administra el componente de fibrina. La salida de gas central ayuda a dar forma y fusionar los chorros de salida. Puede alinearse un segundo dispositivo de pulverización con el primero para que tanto las células como la fibrina se administren sobre el tejido diana. El dispositivo Holm puede modificarse adicionalmente para proporcionar una tercera salida, como por ejemplo, una salida anular, para la suspensión.

En WO 97/20585 y WO 98/20931 se describen dispositivos de pulverización particularmente preferidos. Los dispositivos de pulverización descritos en estas solicitudes de patente constan de tubos de lumen múltiples con diámetros de lumen típicamente de 300 \mum o menos. Los lúmenes tienen una salida a una superficie plana. Con tres lúmenes, en la salida los lúmenes están alineados preferiblemente a lo largo de una línea recta. Por ejemplo, puede utilizarse un lumen externo para descargar aire u otro gas, el lumen medio puede utilizarse para descargar el monómero de fibrina y el otro lumen externo puede utilizarse para descargar la solución básica de menor volumen. Preferiblemente las salidas de líquido tienen un diámetro de menos de 250 micrones, por ejemplo 25 a 150 micrometros o 50 a 125 micrometros, mientras que la salida de gas es preferiblemente un 20 a un 50% más grande. Por ejemplo, las salidas pueden alinearse a lo largo de una línea recta con una salida de gas de 150 micrometros seguida de salidas de líquido de 100 micrometros. Preferiblemente, los flujos de líquido combinados son menos de 3,0 ml/minuto, por ejemplo, 0,5 a 0,7 ml/min. Las salidas de líquido están preferiblemente espaciadas de modo tal que las pequeñas gotas que salen por las salidas se superponen o entran en contacto entre sí.

Los flujos de gas, cuando se utiliza, son preferiblemente de 500 ml/min a 800 ml/min. Se suele descargar un flujo de gas adyacente en el chorro de líquido para dispersar el chorro en gotas más pequeñas creando una "pulverización". Cuando no se utiliza flujo de gas, la descarga de líquido es en gotas o en un chorro, en lugar de una dispersión de pequeñas gotas como una dispersión cónica. La descarga de líquidos mediante esas gotas o chorro eyectado constituye una forma de pulverización. Esas gotas o chorro eyectado puede preferirse cuando se desea una aplicación focalizada.

Cuando se pulverizan sólo suspensiones de células, se utilizan preferiblemente los caudales líquidos bajos antes descritos.

La suspensión de células puede descargarse desde el mismo dispositivo de pulverización que descarga el sistema de fibrina de dos componentes. Por ejemplo, puede utilizarse la realización de la Figura 9 de WO 98/20931, que tiene por lo menos tres salidas de descarga.

Fibrinógeno y fibrina recombinantes

La ingeniería genética puede producir fibrinógeno y monómeros de fibrina con rendimientos relativamente altos, en una forma sustancialmente pura y con ausencia de virus patógenos como la hepatitis y VIH. La expresión heteróloga de las cadenas de fibrinógeno y la fibrina también permite la construcción de mutaciones que pueden imitar a las variantes naturales de fibrina y el aislamiento y el estudio de estas proteínas prescindiendo de pacientes que padezcan estas anomalías genéticas.

Cada una de las tres diferentes cadenas polipeptídicas de fibrinógeno (A\alpha, B\beta y \gamma) es codificada por un gen diferente. Se ha preparado (Chung et al. Ann. N. Y. Acad. Sci. 408: 449-456, 1983; Rixen et al., Biochemistry 22: 3237-3244, 1983; Chung et al., Biochemistry 22: 3244-3250, 1983; Chung et al., Biochemistry 22: 3250-3256, 1983) el cDNA de cada una de estas cadenas y se ha expresado en organismos procariontes. Además, cada cadena de fibrinógeno humano se ha introducido por separado (Huang et al., J. Biol. Chem. 268: 8919-8926, 1993; Roy et al., J. Biol. Chem. 267: 23151-23158, 1992; Roy et al., 1991, J. Biol. Chem., 266: 4758-4763, 1991) o combinadas (Hardwig and Danishefski, J. Biol. Chem. 266: 6578-6585, 1991; Huang et al., J. Biol. Chem. 268: 8919-8926, 1993; Roy et al., 1991, J. Biol. Chem., 266: 4758-4763, 1991; Redman and Samar, Solicitud de patente de Estados Unidos 07/663.380, expediente de marzo de 1991, disponible en Natl. Technology Information Service No. PAT-APPL07663 380INZ) en plásmidos de expresión y se transfectó en células de eucariontes.

La mayoría de estos plásmidos utilizados para expresar el fibrinógeno humano recombinante derivan de los construidos por el doctor D. Chung, Universidad de Washington, Seattle, Estados Unidos, y se basan en clones de cDNA (Rixen et al., Biochemistry 22: 3237-3244, 1983; Chung et al., Biochemistry 22: 3244-3250, 1983; Chung et al., Biochemistry 22: 3250-3256, 1983). La expresión de cadenas de fibrinógeno recombinante se logró por primera vez en E. coli (Bolyard and Lord, Gene 66: 183, 1988; Bolyard and Lord, Blood, 73: 1202-1206, 1989; Lord and Sowlkes, Blood, 73, 166-171, 1989). Las cadenas expresadas individualmente muestran similitudes antigénicas con el fibrinógeno y muestran sitios de partición de la trombina similares a los encontrados en el fibrinógeno nativo (Bolyard and Lord, Blood, 73: 1202-1206, 1989; Lord and Fowlkes, Blood, 73: 166-171, 1989). Los fibrinopéptidos A y B puede liberarse a partir de fibrinógeno recombinante (Bolyard and Lord, Blood, 73: 1202-1206, 1989; Lord and Fowlkes, Blood, 73: 166-171, 1989).

Se ha demostrado que las células de eucariotas portadoras de plásmidos de expresión adecuados que codifican células de fibrinógeno individuales sintetizan las cadenas de fibrinógeno codificadas y forman intracelularmente moléculas de cadena dimérica, por ejemplo, de dímeros A\alpha2, B\beta2 o \gamma2) (Roy et al., J. Biol. Chem., 265: 6389-6393, 1990; Zhang and Redman, J. Biol. Chem. 267: 21727-21732, 1992). Además, cuando se transfieren dentro de la misma célula los plásmidos adecuados que contienen genes que codifican las tres cadenas de fibrinógeno humano, no sólo se expresan las tres cadenas sino que las cadenas polipeptídicas se asocian por pares y se segrega el fibrinógeno intacto dentro del medio circundante (Roy et al., J. Biol. Chem., 266: 4758-4763, 1991, Hartwing and Danishefsky, J. Biol. Chem. 266: 6578-6585, 1991). Al igual que el fibrinógeno natural, el fibrinógeno recombinante segregado consiste en tres pares de cadenas de polipéptidos diferentes y es funcional para la formación de polímeros.

El fibrinógeno se sintetiza naturalmente en el hígado y las células megacariocíticas y en las células hepáticas transformadas mantenidas en cultivo son capaces de continuar la síntesis y la secreción de fibrinógeno (Véase Otto et al., J. Cell. Biol. 105: 1067-1072, 1987; Yu et al., Thromb. Res. 46: 281-293, 1987; Alving et al., Arch. Biochem. Biophys. 217: 19, 1982). Una de esas líneas celulares son las células Hep G2 (Drs. Knowles and Aden, Wister Institute, Philadelphia, Estados Unidos). Esta línea sintetiza un exceso de cadenas A\alpha y \gamma por encima de las cadenas Bb y da como resultado complejos diméricos improductivos de cadenas A\alpha y \gamma (por ejemplo, A\alpha2\gamma2). La introducción de otro vector de expresión que codifica las cadenas B\beta dio como resultado la formación de complejos triméricos (A\alphaB\beta\gamma) que adoptaron los patrones de pliegue y los patrones de uniones bisulfuro intracatenarias correctos (Roy et al., J. Biol. Chem., 265: 6389-6393, 1990). El mecanismo de este pliegue es desconocido y podría involucrar proteínas y enzimas complementarias (Roy et al., J. Biol. Chem. 267: 23151-23158, 1992). Estos estudios demostraron no sólo la trascripción correcta del cDNA B\beta sino que la cadena B\beta excedente aumentó el ensamblaje y la secreción de fibrinógeno intacto.

En las células Hep G2, los complejos triméricos A\alphaB\beta\gamma se asocian por pares para formar moléculas de fibrinógenos intactas, que se glucosilan y se segregan activamente desde la célula (Huang et al., J. Biol. Chem. 268: 8919-8926, 1993). En realidad, sólo se segregan moléculas de fibrinógeno ensambladas correctamente. Por lo tanto, las células Hep G2 tienen el aparato secretor y sintético necesario para el ensamblaje del fibrinógeno).

Experimentos posteriores han introducido plásmidos que codifican el cDNA de la cadena del fibrinógeno en células eucariontes que no sintetizan normalmente el fibrinógeno. Estos experimentos han producido satisfactoriamente fibrinógeno funcional, lo que demuestra que los factores necesarios para el ensamblaje y la secreción del fibrinógeno no se encuentran exclusivamente en las células derivadas del hígado como las Hep G2. Entre las células de eucariontes conocidas por su capacidad de ensamblar y segregar fibrinógeno recombinante se incluyen las células de riñón de las crías de hámster (BHK), las células COS y las células de ovario de hámster chino (CHO) (Roy et al., J. Biol. Chem. 266: 4758-4763, 1991; Hartwig and Danishefsky, J. Biol. Chem. 266: 6578-6585, 1991; Farrell et al., Biochemistry 30: 9414-9420, 1991).

El fibrinógeno funcional intacto que es segregado por las células eucariontes transformadas estables da como resultado la acumulación de niveles de fibrinógeno de aproximadamente 1-2 \mug/ml. Los procedimientos son conocidos por aumentar la producción de proteínas recombinantes desde las células trasfectadas como las células CHO de manera tal que los niveles de expresión pueden alcanzar 1.000 veces el nivel de secreción basal.

En PCT/US95/05527 puede encontrarse otra descripción de los procedimientos de producción recombinante de moléculas relacionadas con fibrina.

Colágeno

La invención también se refiere a la pulverización de células sobre una superficie cubierta con una cantidad eficaz de colágeno promotora de la adherencia celular. Preferiblemente el colágeno se pulveriza sobre la superficie tisular.

Otras matrices adhesivas

También pueden pulverizarse células en otros adhesivos poliméricos o composiciones basadas en polímeros aumentadoras de la viscosidad. Preferiblemente, el adhesivo o el polímero aumentador de la viscosidad se administra conjuntamente, como por ejemplo, con uno de los dispositivos pulverizadores de múltiples salidas antes descritos. Por ejemplo, las células pueden administrarse con composiciones adhesivas que constan de colágeno, ácido hialurónico u otros polímeros adecuados. En el caso de por lo menos ciertos polímeros compuestos de múltiples grupos ácidos, como el ácido hialurónico, una solución ácida tiene una viscosidad significativamente menor, de modo tal que esa mezcla junto con la aplicación de una solución básica aumentan la viscosidad. Por lo tanto, esos polímeros pueden administrarse más convenientemente con un proceso de mezclado similar al utilizado con una fibrina solubilizada en ácido.

Los siguientes ejemplos ilustran más la presente invención, pero, desde luego, no deben interpretarse de ninguna manera como limitantes de su alcance.

Ejemplo 1 Preparación de monómero de fibrina

El proceso bioquímico para preparar un monómero de fibrina es totalmente automatizado y se ha descrito anteriormente (Kjaergard et al. Cardiovascular Engineering 2: 204-206, 1997). Se mezclan 120 ml de sangre del paciente en el equipo de preparación con citrato sódico para anticoagulación. La centrifugación de ciclo rápido aísla 60 ml de plasma que se reaccionan con batroxobina biotinilada durante 10 minutos a 37ºC. El complejo biotina-batroxobina cataliza la liberación del fibrinopéptido A desde el fibrinógeno pero no activa el factor XIII, lo que da como resultado la formación de un polímero de fibrina I, que es soluble en ácido. El polímero de fibrina I se aísla por centrifugación y se disuelve en 3,5 ml de tampón de acetato sódico 0,2 M (pH 4,0). La avidina, unida por uniones covalentes a agarosa, se añade a la solución para formar un complejo de biotina-batroxobina con agarosa. El complejo de biotina-batroxobina:avidina-agarosa se separa luego de la solución de fibrina I por filtración.

La solución ácida de fibrina I se extrae en un vial y se transfiere a la unidad de aplicación. Una jeringa con la unidad aplicadora contiene 0,75 M de tampón de carbonato/bicarbonato (pH 10). Las dos soluciones se administran simultáneamente y se mezclan íntimamente durante el proceso de aplicación. La mezcla a una razón de 7:1 (fibrina I:tampón) inicia la polimerización. A un pH neutro que resulta del mezclado y en presencia de iones calcio proporcionados por el tampón carbonato/bicarbonato, la protrombina endógena se transforma en trombina, lo que causa que el fibrinopéptido B se descomponga a partir de fibrina I para formar la fibrina II. La trombina también activa el factor XIII que actúa sobre la fibrina II para formar un polímero de fibrina II estable. En estudios en seres humanos el proceso se completa en 30 minutos y produce aproximadamente 4,5 ml de adhesivo de fibrina concentrado rico en fibrina asociada las proteínas que incluyen fibronectina.

Ejemplo 2 Crecimiento celular sobre polímero de fibrina

Se realizó un estudio in vitro para evaluar si queratinocitos subconfluentes de cerdo eran capaces de utilizar un adhesivo de fibrina polimerizado (producido utilizando el proceso del Ejemplo 1) como sustrato para la adherencia y el crecimiento. El adhesivo de fibrina polimerizado se preparó a partir de muestras de solución de fibrina I producidas a partir de una donación única de sangre de cerdo mediante el proceso del ejemplo 1. La concentración de fibrina I de la solución fue 23,65 mg ml^{-1} y el valor de pH fue 4,43. Se utilizó una única placa de determinación de 24 pocillos para el cultivo de tejidos (0,8 cm de diámetro interno de los pocillos). Los grupos experimentales se describen en la Tabla siguiente:

Figura 8.1a: Grupos para el estudio in vitro del crecimiento de queratinocitos de cerdo sobre un adhesivo de fibrina

pocillos de 0,8 cm	Grupo 1, n = 3	Grupo 2, n = 3
Coágulo de fibrina	150 \mul de solución de fibrina I	150 \mul de solución de fibrina I
	750 \mul DMEM (10% FCS)	750 \mul DMEM (10% FCS)
	50 \mul de solución de colágeno de tipo I	50 \mul de solución de ácido acético 0,02 M
Células	1/10^{5} queratinocitos de cerdo de pase 2	1/10^{5} queratinocitos de cerdo de pase 2
	5/104 células irradiadas de alimentador 3TC

Se agregaron 150 microlitros de solución de fibrina I a cada uno de los 6 pocillos. Se agregaron 750 microlitros de medio de cultivo DMEM (que contiene 10% FCS), con 50 \mul de solución de 50 \mul/ml de colágeno de cola de rata de tipo I (disuelta en ácido acético 0,02 M) a cada uno de los 3 pocillos del Grupo 1. Se agregó la misma solución a los 3 pocillos del Grupo 2; sin embargo, la solución de colágeno de cola de rata se omitió y se reemplazó por 50 \mul de ácido acético 0,02 M. La solución de fibrina I se polimerizó inmediatamente después del agregado de la solución de DMEM. Se aplicaron 50.000 células irradiadas de alimentador 3TC en 0,5 ml de medio de crecimiento de queratinocitos a la superficie del adhesivo de fibrina polimerizada en los 3 pocillos del Grupo 1 y 0,5 ml del medio de crecimiento de queratinocitos solo se aplicaron a los pocillos del Grupo 2. Se aplicaron 100.000 (1 x 10^{5}) del pase de queratinocitos de cerdo subconfluentes a 0,5 ml de medio de crecimiento de queratinocitos a la superficie de los 6 pocillos. Después de 2 días de cultivo, se cambió el medio por aspiración suave. Después de 4 días el coágulo de adhesivo de fibrina aún estaba presente en la base de cada pocillo. Después de otro cambio de medio, se extrajo el coágulo del pocillo utilizando un escalpelo (tamaño de hoja 11) y un par de pinzas dentadas.

Luego se bloqueo cada coágulo y se congeló en compuesto de bloqueo OCT. Se cortaron criosecciones de
15 \mum de espesor de forma transversal y tangencial a la superficie superior del coágulo. Se esperaba que las últimas secciones permitieran evaluar la morfología de los queratinocitos adhesivos. El coágulo adhesivo de fibrina tiene una fuerza mucho menor que las biopsias de tejido y lamentablemente todas esas secciones se fragmentaron durante el corte. Las criosecciones transversales se fijaron y se tiñeron para evaluar la inmunorreactividad a la queratina 14 utilizando técnicas inmunocitoquímicas estándar y microscopia fluorescente. Los queratinocitos fueron visibles sobre la superficie del coágulo de adhesivo de fibrina en ambos grupos experimentales.

Ejemplo 3 Tratamiento de la herida

En este modelo de herida bien establecido, se han descrito los procedimientos anestésicos y quirúrgicos con anterioridad (Kangesu et al., Brit. J. Plastic Surg. 46: 3893-400, 1994). Se realizaron tres heridas circulares de 4 cm de diámetro de espesor completo sobre la fascia muscular expuesta de cada flanco de la caja torácica del cerdo Large White. Cuando se utilizó el reemplazo dérmico Integra^{TM} en este modelo, se logró una hemostasis meticulosa de la base de la herida utilizando cuidadosamente diatermia bipolar (es decir, generación de calor en el tejido mediante corrientes eléctricas para fines médicos o quirúrgicos). El reemplazo dérmico Integra^{TM} se preparó de la manera descrita por Burke et al. (Artificial Skin, Dermal Regeneration Template, Physician Training Manual, Integra Lifesciences Corporation, 1996) y luego se cortó en discos de 4,5 cm de diámetro que se suturaron a la base de la herida utilizando suturas monofilamento de 5º posicionadas a 2 a 3 mm internamente con respecto al borde del disco. Las heridas se aislaron de la piel circundante utilizando cámaras de politetrafluoroetileno (PTFE) afirmadas en posición utilizando suturas de seda de 2º. El reemplazo dérmico Integra^{TM} se cubrió con un apósito no adherente y las cámaras se llenaron con gasa embebida en solución salina ligeramente compactada. Se ajustó una cubierta protectora revestida de espuma alrededor del tronco del animal para evitar cualquier lesión inadvertida a las heridas. Se realizó una biopsia de la piel para iniciar los cultivos de queratinocitos el mismo día que se crearon las heridas de espesor completo (aisladas por cámaras percutáneas) y se injertó con reemplazo dérmico Integra^{TM} sobre la fascia del tronco
torácico.

Se extrajo sangre de la vena yugular externa izquierda del cerdo. El protocolo para la producción de adhesivo de fibrina autólogo fue según el Ejemplo 1.

El protocolo para el injerto del reemplazo dérmico Integra^{TM} (o piel artificial) se refinó (como se detalla en Clayton and Bishop, J. Burn Care Rehabil., vol. 19:(4): 358-363, 1998) para lograr que prendieran con tasas consistentemente altas.

En este experimento se utilizó un animal de 10 semanas. El protocolo utilizó un periodo de sólo 10 días entre la biopsia inicial y la aplicación de células cultivadas. (Así fue posible tomar la biopsia inicial durante la misma anestesia utilizada para crear heridas aisladas y aplicar la piel artificial Integra^{TM}). Los apósitos se cambiaron con anestesia general los días 3º y 8º.

El día 10 el animal se anestesió y se canuló la vena yugular externa izquierda. Se prepararon aproximadamente 4,5 cm^{3} de la solución de fibrina I de cerdo utilizando una única serie de elaboración. Las heridas se expusieron y se eliminó la membrana silástica temporal del reemplazo dérmico Integra^{TM}. El reemplazo dérmico Integra^{TM} prendió en un 100% en la totalidad de las 6 heridas.

Seis frascos grandes (T75) de queratinocitos con una confluencia del 80-90% se dispersaron utilizando 5 ml de tripsina al 0,05%/ácido etilendiamino-tetra-acético al 0,02% precalentada (Gibco BRL, Life Technology) administrados a cada frasco, y se incubaron los frascos a 37ºC. Las células tardaron 10 minutos para separarse del plástico de cultivo tisular. La acción de la tripsina se neutralizó por el agregado de medio que contenía suero. En total se recogieron aproximadamente 14 x 10^{6} células viables. Los queratinocitos se suspendieron en medio de crecimiento de queratinocitos para pulverizar. La viabilidad se evaluó a partir de una muestra no pulverizada al final del procedimiento de pulverización.

Se aplicaron aproximadamente 0,6 cm^{3} de adhesivo de fibrina de cerdo autólogo (aproximadamente 22 mg/ml de monómero de fibrina) y 0,6 cm^{3} de suspensión de células porcinas a las heridas 1-3. Se aplicaron aproximadamente 0,6 cm^{3} de adhesivo de fibrina de cerdo con medio de crecimiento de queratinocitos porcinos sin células a las heridas 4-6. El adhesivo de fibrina y el tampón de carbonato/bicarbonato se pulverizaron con un dispositivo pulverizador y las células se pulverizaron con un dispositivo similar unido mediante cinta al primer dispositivo. Las cabezas de pulverización se mantuvieron a 2 a 5 cm de las heridas. El dispositivo utilizado fue de acuerdo con el documento WO 97/20585; se utilizaron tres salidas alineadas linealmente de 300 \mum para descargar, respectivamente, aire, fibrina disuelta en ácido y tampón de carbonato/bicarbonato. En un grupo experimental las heridas estaban del lado izquierdo del animal y en el otro grupo experimental las heridas estaban del lado derecho. Esta disposición evitó cualquier posible contaminación de las heridas tratadas sólo con adhesivo de fibrina por los queratinocitos pulverizados del otro grupo experimental.

La densidad de células de la suspensión de células se estimó en 2,78 x 10^{6} células cm^{-3}. Así el número total de células pulverizadas por heridas se estimó en 1,67 x 10^{6}. La viabilidad de la suspensión de células antes de la pulverización se estimó en 92,8%. El adhesivo de fibrina se polimerizó casi inmediatamente después de la aplicación sobre la superficie de la herida.

Estudios anteriores realizados utilizando queratinocitos de un segundo pase (P2) del mismo animal habían indicado una viabilidad del 63,2% (EE 5,4) para células pulverizadas sobre agarosa al 5% utilizando el mismo equipo (en ausencia de adhesivo de fibrina autólogo). Por lo tanto, puede esperarse que el número total de células viables administradas a cada herida sea aproximadamente 1,1 x 10^{6} (o \approx 8,8 x 10^{4} células viables cm^{-2} de superficie de herida).

Se pulverizó una muestra de suspensión de células (excedente de la utilizada en las heridas) en una placa de cultivo de tejido cubierto de colágeno de 75 cm^{2} sembrada con 2 x 10^{6} células de ratón 3T3 irradiadas letalmente. Estas células formaron una población casi confluente en el plazo de 3 días. Esta población se cultivó luego durante otros dos pases sin impedimento evidente en la tasa de crecimiento en comparación con los queratinocitos no pulverizados.

Las heridas se fotografiaron y se cubrieron con una capa de apósito no adherente y se llenaron las cámaras con gasa humedecida en solución salina. Se tomaron biopsias con sacabocados de las heridas 3 y 4, aproximadamente 5 minutos después de la aplicación de los dos tratamientos diferentes para las heridas. Se tomaron otras biopsias el día 4 después del tratamiento con anestesia general y el día 14 se recogieron las heridas en la eutanasia.

Día 0: Sobre ambas heridas se encontraba presente una capa de recubrimiento de adhesivo de fibrina de aproximadamente 60 \mum de espesor. Los queratinocitos suspendidos en el adhesivo fueron detectables sólo en las biopsias de las heridas a las que se habían aplicado células por pulverización y tenían una morfología aislada y esférica.

El número total de células (viables y no viables) administradas a cada herida se estimó en aproximadamente 1,7 x 10^{6}, de modo que la densidad prevista de células pulverizadas sobre las heridas sería aproximadamente 1,3 x 10^{5} cm^{-2}.

Día 4: Cuatro días después del tratamiento con una mezcla pulverizada de adhesivo de fibrina y queratinocitos suspendidos, se detectaron colonias de queratinocitos sobre la superficie de la herida o muy próximas a ésta. La capa de adhesivo de fibrina ya no era evidente. No se detectaron queratinocitos en la biopsia a partir de la herida de control con adhesivo más medio sólo.

Día 14: En la superficie de la herida estaba presente un manto de múltiples capas de epitelio dos semanas después de la aplicación por pulverización de la mezcla de adhesivo de fibrina/queratinocito. No hubo epitelio presente sobre la superficie de las heridas que se trataron sólo con una mezcla de adhesivo de fibrina pulverizada y medio de cultivo.

Cubierta epidérmica a los 14 días: El epitelio situado sobre la superficie de la herida 14 días después de la aplicación de la pulverización de queratinocitos cultivados no poseía un estrato córneo.

Macroscópicamente, el un cambio en la opacidad de la superficie de la herida denota la presencia del epitelio. La referencia a las biopsias confirmó que las áreas del epitelio tenían aspecto de manta en comparación con la superficie por lo demás brillante de la herida.

La cubierta epidérmica media de las heridas 1-3 a los 14 días de aplicada la pulverización de una mezcla de adhesivo de fibrina y queratinocitos (calculada como porcentaje del total de la superficie herida) fue del 66% como ilustra la tabla siguiente. No había epitelio presente sobre las heridas 4-6 que se trataron con una mezcla pulverizada de adhesivo de fibrina y medio de cultivo solo.

TABLA Cubierta epidérmica

Herida	tratamiento	\begin{minipage}[t]{70mm}Cubierta epidérmica 14 días después del injerto de queratinocitos (% del área total de la herida)\end{minipage}
1	pulverización de fibrina/queratinocitos	74,0
2	pulverización de fibrina/queratinocitos	64,0
3	pulverización de fibrina/queratinocitos	61,0
		Heridas 1-3, media = 66 (EE 5,7)
4	pulverización de fibrina	0
5	pulverización de fibrina	0
6	pulverización de fibrina	0
		Heridas 4-6, media = 0

Se observó un movimiento gradual del disco de reemplazo dérmico Integra^{TM} (y, por lo tanto, de la base de la herida) con respecto a la cámara PTFE de la herida. Se supuso que el movimiento fue una consecuencia del fenómeno de "desplazamiento de la herida" como resultado del crecimiento del animal. Una fracción significativa de la base de la herida 14 días después del tratamiento era consecuencia del desplazamiento de la herida, no sometida nunca a la pulverización de adhesivo de fibrina/queratinocitos. La reconstitución de epidermis calculada como porcentaje de la piel artificial pulverizada Integra^{TM} sería considerablemente mayor que el 66% registrado sin tener en cuenta el fenómeno de migración.

Tinción de queratina 6 y colágeno VII

Se tiñeron biopsias de tejido para evaluar la inmunorreactividad a la queratina 6 y el colágeno VII. El día 4 no se detectó ninguna inmunorreactividad a la queratina 6 o el colágeno VII. El día 14, sin embargo, se tiñeron los queratinocitos suprabasales fuertemente por queratina 6. La inmunorreactividad al colágeno VII fue detectable por debajo de áreas de epidermis e inmediatamente adyacente a los quistes de queratinocitos. La inmunorreactividad al colágeno VII se detectó en la forma de múltiples bandas superpuestas en lugar de una banda continua única. No se detectó inmunorreactividad a la queratina 6 o el colágeno VII en las biopsias de las heridas pulverizadas sólo con una mezcla de adhesivo de fibrina y medio de cultivo.

Claims

1. El uso de un polímero de fibrina que se forma al cubrir una superficie diana con una mezcla de un primer componente que consiste en una proteína no polimérica relacionada con la fibrina y un segundo componente eficaz para transformar la proteína relacionada con la fibrina en un polímero de fibrina, en la preparación de una superficie diana cubierta que es la superficie tisular de un mamífero o una superficie tisular cubierta por una lámina de polímero biodegradable, en la que los dos componentes mezclados forman un polímero de fibrina con una adhesividad tal que es eficaz para adherir las células pulverizadas en una suspensión sobre la superficie diana cubierta para el tratamiento de heridas.

2. El uso de acuerdo con la reivindicación 1 en el que el polímero de fibrina se forma en una cantidad que es eficaz para asegurar una colonización que promueva una cantidad eficaz de células sobre la superficie diana.

3. El uso de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, que comprende además la mezcla de una cantidad de colágeno que sea eficaz para promover la adherencia celular dentro de la mezcla.

4. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la mezcla se pulveriza para cubrir la superficie diana.

5. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la mezcla y la suspensión de células pueden pulverizarse conjuntamente para cubrir la superficie diana.

6. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que una cantidad eficaz de células promotoras de colonización se atrapa en una matriz tridimensional del polímero de fibrina en la superficie diana.

7. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además: el cultivo de células autólogas a partir de una biopsia obtenida de un cierto tipo de tejido de un mamífero; y la formación de una suspensión de células a partir de las células cultivadas, en que el tejido al cual se aplican las células es del tipo dado o adyacente al tejido del tipo dado.

8. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el tejido es una herida y la suspensión de células comprende queratinocitos.

9. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además: el cultivo de queratinocitos autólogos a partir de una biopsia obtenida de un mamífero, en el que el tejido al cual se aplican las células es una herida.

10. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que los queratinocitos cultivados de un pase que produce las células para la suspensión de células se recogen antes de alcanzar la confluencia.

11. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además: la adhesión a una lámina de polímero biodegradable a la superficie tisular tal que la suspensión de células se pulveriza sobre la lámina de polímero que define la superficie diana.

12. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además la pulverización de una suspensión de los fibroblastos sobre la herida cubierta con una mezcla de los dos componentes.

13. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el primero de los componentes comprende fibrina solubilizada en ácido y el segundo componente comprende una cantidad de base eficaz para neutralizar suficientemente la mezcla para permitir que se polimerice la fibrina.

14. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende la pulverización del primer y el segundo componente tal que un chorro del primer componente se fusiona con un chorro del segundo componente en el vuelo desde el dispositivo de pulverización hasta la superficie.

15. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende la pulverización de la suspensión de células, el primer componente y el segundo componente de manera tal que los chorros de la suspensión de células, el primer componente y el segundo componente se fusionan en el vuelo desde el dispositivo de pulverización hasta la superficie.