JP2002531176A - 細胞の噴霧輸送 - Google Patents

細胞の噴霧輸送

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Abstract

(57)【要約】 本発明はとりわけ、哺乳類の組織表面または該組織表面に生分解性ポリマーシートを被覆したものである標的表面に細胞を接着する方法であって、非ポリマーフィブリン−関連たん白からなる第１成分と該フィブリン−関連たん白をフィブリンポリマーに変換するのに有効な第２成分の混合物を、上記標的表面に被覆し；次いで細胞の懸濁液を、被覆標的表面に噴霧することから成り、混合した二成分が、細胞を接着するのに有効な粘着力を持つフィブリンポリマーを形成することを特徴とする接着方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本発明は、細胞を輸送して（delivering）組織に接着する方法に関する。 損傷した皮膚、たとえば温熱または慢性創傷もしくは他の創傷で損傷した皮膚
の処置において、生検材料、典型例として自己由来生検材料から誘導されるケラ
チノサイトを培養し、培養平板からプロテアーゼ消化によって、多層皮膚様シー
トが浮き上がってくるまで培養を行なう１つのアプローチが知られている。
【０００２】 この方法の難点としては、このような超融合性培養物、または“上皮移植片シ
ート”を成長させるのに必要な時間が３週間もの長さであること；薄いシートの
取扱いが困難であること；および移植片シートの外傷の基底組織への“生着（ta
ke）”、すなわち、安定な接着性が不確かであったことが挙げられる［たとえば
、Rennekampffらの「J. Surg. Res.」（６２：２８８−２９５、１９９６年）参
照］。さらに、かかる高密度に成長したケラチノサイトは、創傷治癒に寄与する
活発に成長する細胞よりはむしろ、非増殖性の分化した細胞の特性を呈する［た
とえば、上記 Rennekampffらの文献参照］。培養したケラチノサイトを創傷に導
入する多くのアプローチが着手されているが、このような細胞は、上記 Renneka
mpffらの文献で吟味されているように、活性の大きい成長相にある。
【０００３】 これらは、細胞を多孔質ポリマー支持体上で亜交会（subconfluence）まで成
長させ、次いで該支持体を創傷に対して、細胞が下方に向くようにひっくり返し
て適用することを包含する。さらに、この分野のある研究者達は、ケラチノサイ
トをフィブリノゲンと混合し、次いで創傷への適用直前にトロンビン中で混合し
て、フィブリノゲンをフィブリンに変換せしめ、ケラチノサイト用のポリマーマ
トリックスを形成する実験を行った［Hundyadiらの「J. Dermatol. Surg. Oncol
.」（１４：７５−７８、１９８８年）；Kaiserらの「Burns」（２０：２３−２
９、１９９４年）参照］。フィブリノゲンの酵素交換は、組成物が作用しうる粘
着力を有する十分な時間を付与することにより、細胞含有組成物が創傷面に広が
るのを可能ならしめる。またフィブリン“グルー”を用いて、同種異系の死体皮
膚の保護層を固定することもできる。
【０００４】 本発明者と他の共同研究者による先の研究により、フィブリンを重合に対して
安定化した“フィブリン・モノマー”形状で、シールすべき部位へ輸送する有効
なシーラントを同定した。上記部位において、安定化条件は逆転し、かつ有効な
クロットが形成する［ Edwardsonらのヨーロッパ特許出願Ｎｏ．ＥＰ５９２２４
２参照］。
【０００５】 このＥＰ５９２２４２のフィブリン・モノマーシーラントの特別な利点の１つ
は、手術のわずか数分前に少量の患者の血液から（または、１時間以内のマニュ
アル・プレパラートを用いて）、該シーラントを素早く調製することができ、か
つこの調製は標準実験室装置で行なえることである。またフィブリンモノマーを
製造する特殊化した工具も記載されており、これらの工具は、患者からの自己由
来シーラントを素早く高再現可能で、信頼性が高く、かつ非常に安全な方法で製
造されるのを可能ならしめる［ Holm のＷＯ９６／１６７１３，“遠心試薬輸送
系”；HolmらのＷＯ９６／１６７１４，“フィブリンＩを血漿から分離する方法
および装置”；および Holm のＷＯ９６／１６７１５，“環状フィルター付遠心
機”参照］。
【０００６】 EdwardsonのＥＰ５９２２４２に記載の如く、シーラントとして可溶化したフ
ィブリンモノマーをしようすることができる。すなわち、これらの改善は、自己
由来シーラントが素早い自動化方法で製造されることを考慮に入れていることで
あり、かつこのように製造される自己由来シーラントは、外因性プロティナーゼ
酵素、たとえばウシ・トロンビンまたはアプロチニンなどのウシ・たん白が無い
。
【０００７】 たん白分解酵素を使用せずに、重合するのを誘発することができる他のフィブ
リン・シーラントには、（１）γ−鎖のＣ−末端領域が自己重合を中断するよう
十分に改変されているフィブリン類縁体の第１成分、および（２）フィブリノゲ
ンのようなフィブリン−関連分子の第２成分が用いられている［Cederholm−Wil
liamsのＷＯ９５／２９６８６Ａ１参照］。かかる二成分の組合せにおいて、フ
ィブリン類縁体が、フィブリン−関連分子と重合する。
【０００８】 そこで、本発明者らは以下の事項を示した。すなわち、創傷部位に噴霧される
ケラチノサイトは、二成分の噴霧および混合とほぼ同時にフィブリンポリマーを
組立て（frame）、創傷上の系の形成は、ケラチノサイト（および、場合によっ
て線維芽細胞）を、三次元フィブリンポリマー・マトリックス内の創傷に固定す
るのに有効であり、ここで、固定される細胞の量は、膨張させて上皮質を形成す
るのに有効である。彼らの発明の好ましい観点において、二成分系の噴霧および
飛行中混合と同時にケラチノサイトを噴霧することにより、混合物のフィブリン
−関連分子は機能的に重合するだけの力が備わる。
【０００９】 また本発明は、たとえば所望の結果を達成するのに十分な量の時間にわたり、
新組織の成長を生じたりあるいは細胞の存在を立証するため、組織表面に固定す
ることができる他のタイプの細胞にも適用される。さらに本発明は、フィブリン
を用いず、または他の生適合性、好ましくは生分解性の接着性ポリマーを用いて
、細胞を組織基質に噴霧することに関する。さらにまた、本発明は、コラーゲン
を用いてあるいはフィブリンを用いもしくは用いずに、輸送される細胞に関する
。
【００１０】 （発明の概要） 本発明はとりわけ、哺乳類の組織表面または該組織表面に生分解性ポリマーシ
ートを被覆したものである標的表面に細胞を接着する方法であって、非ポリマー
フィブリン−関連たん白からなる第１成分と該フィブリン−関連たん白をフィブ
リンポリマーに変換するのに有効な第２成分の混合物を、上記標的表面に被覆し
；次いで細胞の懸濁液を、被覆標的表面に噴霧することから成り、混合した二成
分が、細胞を接着するのに有効な粘着力を持つフィブリンポリマーを形成するこ
とを特徴とする接着方法を提供する。
【００１１】 フィブリンポリマーは好ましくは、集落形成（colonization）促進に有効量の
細胞を標的表面に固定するのに有効な量で形成する。１つの具体例において、該
方法はさらに、混合物に細胞−接着性促進に有効量のコラーゲンを混合すること
を包含する。混合物を噴霧して標的表面を被覆することが好ましい。混合物と細
胞懸濁液を同時に噴霧して、標的表面を被覆することができる。好ましくは、標
的表面におけるフィブリンポリマーの三次元マトリックスに、集落形成促進に有
効量の細胞を閉じ込める。
【００１２】 この方法は、生分解性ポリマーシートを組織表面に接着し、細胞懸濁液をポリ
マーシート上に噴霧して標的表面を形成することを包含することができる。１つ
の具体例において、組織からの蒸気移送を、排除しなくとも、制限するのに適し
た剥離可能な外部バッキング層といっしょに、ポリマーシートを接着し、そして
該方法はさらに、ポリマーシートを組織に接着した後、バッキング層を剥離して
から、細胞懸濁液を適用することを包含する。ポリマーシートは、制限されるこ
となく、たとえばグルコサミノグルカン・ポリマーシートあるいは架橋コラーゲ
ン・ポリマーシートであってよい。
【００１３】 さらにこの方法は、哺乳類から採取した、一定タイプの組織の生検材料からの
自己由来細胞を培養し；次いで該培養細胞から細胞懸濁液を形成することを包含
し、細胞が適用される組織は、一定タイプのもの、あるいは一定タイプの組織に
隣接する。
【００１４】 本発明の１つの好ましい観点において、組織は創傷で、細胞懸濁液はケラチノ
サイトを包含する。交会（confluence）に達する前に、細胞懸濁液のため細胞を
生成する継代接種（passage）の培養ケラチノサイトを取入れることが好ましい
。さらにこの方法は、混合二成分を被覆した創傷に、線維芽細胞の懸濁液を噴霧
することを包含する。線維芽細胞は、フィブリンポリマーを作る同じ配合物に、
該ポリマーを作る別個の配合物に適用することができる。
【００１５】 １つの具体例において、第１成分は酸可溶化フィブリンからなり、第２成分は
混合物を中和してフィブリンを重合せしめるのに十分有効量の塩基からなる。第
１および第２成分（いずれのタイプも）の適用は、第１成分の流れが、噴霧装置
から標的表面への飛行中の第２成分の流れと合流するように、第１および第２成
分を噴霧することを包含することができる。この方法は、細胞懸濁液、第１成分
および第２成分の流れが、噴霧装置から標的表面への飛行中に合流するように、
細胞懸濁液、第１成分および第２成分を噴霧することを包含することができる。
【００１６】 １つの具体例において、本発明は、哺乳類において細胞を組織表面に輸送する
方法であって、集落形成促進に有効量の細胞を組織表面に固定するのに有効量で
、細胞の懸濁液を組織表面に噴霧し；次いで細胞を組織表面上で維持もしくは成
長せしめることから成る輸送方法を提供する。細胞は、３．０ｍｌ／分以下の液
体流量で噴霧するのが好ましい。好ましくは、細胞−接着性促進に有効量のコラ
ーゲンを被覆した組織表面に、細胞を噴霧するか、または細胞をガス流で噴霧す
る。
【００１７】 定義 以下に示す用語は、その適用を目的として、下記のそれぞれの意味を有する。 生活性作用物質： 生活性作用物質は、細胞、ウイルス、組織、器官または生体に対して作用しう
る化学薬品などの物質であって、たとえば、これらに限定されるものでないが、
細胞、ウイルス、器官または生体の機能に変化をもたらす薬物（すなわち、医薬
品）またはホルモン（たとえば成長因子）が挙げられる。生体は好ましくは哺乳
類で、より好ましくはヒトである。 コラーゲンの細胞−接着性促進に有効量： コラーゲンの細胞−接着性促進に有効量とは、集落形成促進に有効量の細胞ま
たは組織成長促進に有効量の細胞の場合に必要な細胞量を減じる量である。
【００１８】 細胞の集落形成促進に有効量： 接着性細胞の集落形成促進に有効量とは、集落の形成に導くのに、または動物
において生理学的変化を起こすのに有効な細胞の滞留に導くのに（接着性細胞が
、生物学的活性な組換え型作用物質を生成しかつ移入する組換え型細胞であると
き）、または新しい組織に導くのに有効な量である。 機能的フィブリン系： 機能的フィブリン系は、二成分の混合時に、機能的に重合するだけの力がある
フィブリン−関連分子を生じる、二成分のフィブリンポリマー−形成系である。 機能的に重合するだけの力がある： 混合物のフィブリン−関連分子が機能的に重合するだけの力があるという記述
は、重合受容能力に対するいずれのバリアも単に、混合力学の機能、または混合
物のｐＨなどの条件変化から生じるいずれかの第三次構造変化の場合の急速な一
次動力学の機能にすぎないことを示す。
【００１９】 フィブリン−関連たん白： フィブリン−関連たん白は、フィブリンまたはフィブリノゲンに見られる二対
のフィブリンα−鎖、二対のフィブリンβ−鎖および二対のフィブリンγ−鎖を
ベースとする。フィブリン−関連たん白は、機能的に重合するだけの力がある形
態であるか、または該形態に容易に変換しうる。本明細書の他の箇所で記載の如
く、幾つかの形態のフィブリノゲン−誘導またはベース分子を用いて、フィブリ
ンポリマーを作ることができ、このため上記分子はフィブリン−関連たん白であ
る。 細胞の組織−成長促進に有効量： 接着性細胞の組織−成長促進に有効量とは、新しい組織形成に導く集落形成促
進に有効な量である。
【００２０】 （発明の詳細な説明） フィブリンゲル−形成成分を十分に噴霧した組織基質に、細胞を噴霧し、フィ
ブリンポリマーは、噴霧した細胞を接着するのに十分な粘着力を有するには熟し
すぎることはなかった。フィブリン−関連成分は十分なゲルまで熟し、ゲル形成
のため混合される二成分組成のいずれかよりも接着性が高くなっていることが好
ましい。二成分と細胞を同時に噴霧するのが最も好ましいが、これは、シーラン
ト噴霧装置と細胞懸濁液噴霧装置の両方が同時に作動し、それらの流れが同じ組
織の方に向かっていることを意味する。
【００２１】 好ましくは、機能的に重合するだけの力があるフィブリンの形成は、フィブリ
ン−関連分子のいずれのたん白分解変換とも関係しない。フィブリン重合の急速
な速度は、フィブリノゲン／トロンビン／細胞混合物に比し明瞭な利点を付与す
る重要な側面である。急速な重合は、フィブリンと細胞の薄層を本質的にいずれ
かの体面または体腔に急速適用するのを可能ならしめる。不十分な初期接着性を
付与するアプローチでは、非水平面からの“流出”という問題が起りうる。
【００２２】 本明細書に記載の実験には、活発に成長する単分散ケラチノサイト懸濁液を創
傷にまく（seed）媒体として本発明の方法を用い、細胞およびフィブリンシーラ
ントを小さな実験創傷の方へ噴霧できるように共に取付けた２つの噴霧装置を使
用する。このようにして輸送される細胞の総数および成育可能をインビトロおよ
びインビボで評価したが、ある程度の細胞損失が起っていると思われる。検出し
た損失は、自然老化に接近するぜい弱細胞の損失であるか、あるいは細胞の輸送
に最適化されていない噴霧適用システムに基づくのかもしれない。たとえば、空
気流の変化は重要な影響を持つことが認められる。
【００２３】 細胞タイプ；組織タイプ 本発明に従って組織基質に導入される細胞としては、何ら制限なく、ケラチノ
サイト、線維芽細胞、肝細胞、膵細胞、肺細胞、筋細胞（平滑筋、心筋、横紋筋
）、軟骨細胞、骨芽細胞、内皮細胞、受精卵副腎細胞およびニューロンが挙げら
れる。本発明に従って細胞を適用し、組織の成長を補充もしくは確立することが
できる。典型例として、所望の組織成長のため適切に位置した組織基質に、細胞
を適用する。適用細胞は、インビトロまたは現場で（in situ）変性表現型に形
質転換した細胞、たとえば有用な生活性作用物質を生成するよう形質転換した細
胞、または遺伝的欠損を改善するよう形質転換した一定組織の細胞を包含するこ
とができる。
【００２４】 上記後者の場合、接着する基質組織での形質転換細胞の少なくともある程度の
滞留によって、所望の結果を達成することができる。たとえば、内視鏡装置など
により細胞を肺組織に噴霧して、一定期間にわたり、生活性作用物質の治療産生
を付与することができる。現場の適切なベクターの取込みによって形質転換した
細胞の場合、Ｕ．Ｓ．特許出願Ｎｏ．６０／０８９５４３（１９９８年６月１７
日出願）およびＵ．Ｓ．特許出願Ｎｏ．０９／３３４３２５（１９９９年６月１
６日出願）で考察されているように、フィブリンは形質転換を高める作用物質と
して作用しうる。
【００２５】 細胞を接着する組織としては、何ら制限なく、創傷の基底組織（創傷深さに基
づき、基底の表皮組織、真皮または筋膜が含まれる）、それぞれ肺、肝臓、腹膜
または心筋層の基底組織が挙げられる。組織上皮の創傷の存在は、好ましい基質
を付与する。 本発明の１つの具体例において、線維芽細胞の適当な懸濁液（該線維芽細胞は
自己由来が好ましい）を創傷に対して、ケラチノサイトの噴霧輸送と共に噴霧輸
送する。次いで線維芽細胞は、皮膚層の形成を加速して、新しく形成する表皮層
の接着性良好な支持体を付与する。 細胞は、ドナー組織、たとえば生検材料もしくは血液から直接誘導するか、ま
たは ex−vivo 培養することができる。
【００２６】 本発明の１つの好ましい観点において、（ａ）第１の噴霧される細胞としては
、第１細胞の成長または維持を確立するのに役に立つ、生活性作用物質、たとえ
ば成長因子を発現するよう組換えで形質転換した細胞を包含し（またはから成り
）、または（ｂ）このように形質転換した第２細胞を第１噴霧細胞に加える。組
換え型細胞は、安定な形質転換株であってよく、これは、選択的条件を用いまた
は用いずに新しい特性を安定に維持しうることを意味する。このような安定な形
質転換株は、長期間にわたって、組換え発現表現型を維持することが期待されう
る。
【００２７】 あるいは、組換え型細胞は、数世代もしくはそれ以下にわたって発現表現型を
失うことが期待できる一時的な形質転換株であってよい。このような一時的に形
質転換した細胞は、組織標的に対して、適当な形質転換−誘発ベクターと第１細
胞を同時に適用することによって作ることができる。ある具体例において、生活
性作用物質の組換え誘発発現は、組織標的への細胞の適用後の早くが最も望まし
く、その期間中、宿主動物の血液供給または他の支持メタニズムによる細胞の支
持は最も少ない。すなわち、一時的に形質転換された細胞、または組織標的部位
での生育可能が制限されることが期待できる形質転換細胞を、便利に用いて、適
当な生活性作用物質の早期発現を付与することができる。
【００２８】 二成分フィブリン系 本発明は、コンバインによってフィブリンポリマーを形成する、いずれの二成
分系とも共に使用することができる。かかる二成分系としては、フィブリノゲン
を変換酵素（すなわち、有効なフィブリンを作るのに十分量のフィブリノペプチ
ドを除去するのに有効な酵素）と混合した慣例のフィブリンシーラントが挙げら
れる。かかる系は、たとえば Hundyadiらの「J. Dermatol. Surg. Oncol.」（１
４：７５−７８、１９８８年）および Kaiserらの「Burns」（２０：２３−２９
、１９９４年）に記載されている。
【００２９】 より好ましい系は、重合に対するバリアのみが、フィブリンの物理的形態にお
ける可逆性変化または二元フィブリンポリマーの形成に有効な二成分の分離であ
る系である。これらの系は、混合時に、上述の“機能的に重合するだけの力があ
る”フィブリンをもたらし、該系を“機能的フィブリン系”と呼ぶことができる
。これらの系において、二成分を噴霧中に飛行混合せしめ、ポリマーを急速に形
成して、レシピエント組織に粘稠な細胞−固定組成物を噴霧する。
【００３０】 第１成分が比較的緩和な酸に溶解したフィブリンであり、第２成分が第１成分
の中和に十分量の塩基であり、それらの使用がより好ましく、かかる二成分の混
合によって、フィブリンを重合能力のある形態（すなわち、機能的に重合するだ
けの力がある）に変換するようになっている。このタイプの二成分系は、自己由
来血液から急速に製造することができる。フィブリン成分は十分なプロトロンビ
ンと因子ＸＩＩＩを運搬し、この結果、第２成分におけるカルシウムイオンの供
給はトロンビンを賦活するのに有効で、これによって、フィブリンのフィブリン
ＩＩへの熟成および因子ＸＩＩＩの賦活を開始して、フィブリン架橋を付与する
。
【００３１】 このような可溶化したフィブリン、または“フィブリンモノマー”を製造する
ための特殊化した工具は記載されており、そしてこれらの工具は、患者から自己
由来シーラントを素早く高再現可能で、信頼性が高く、かつ安全性の高い方法で
製造するのを可能ならしめる［ HolmのＷＯ９６／１６７１３，“遠心試薬輸送
系”；HolmらのＷＯ９６／１６７１４，“血漿からフィブリンＩを分離する方法
および装置”；および HolmのＷＯ９６／１６７１５，“環状フィルター付遠心
機”参照］。これらの特許出願には、遠心機内で作動する成形装置が記載されて
いる。該装置の第１室に血液を充填し、遠心法によって、ペレット状細胞血液画
分から血漿を分離する。
【００３２】 血漿を第２室に移し、これに、ビオチンと共有結合する変換酵素を入れる。酵
素は作用して血漿中のフィブリノゲンをフィブリンに変換せしめ、フィブリン分
子は相互に結合してポリマーを形成し、該ポリマーは沈殿して固体を形成する。
フィブリン沈殿物を遠心法でペレット化し、残った血漿を第１室に戻す。ペレッ
ト状フィブリン沈殿物を、可溶化液体と共に溶解せしめるが、該可溶化液体は最
も頻繁には、酸性ｐＨで緩衝する水溶液である。粘稠なフィブリンモノマー溶液
を、結合アビジンを有するアガロース・ビーズと混合して、極微量のビオチニル
化変換酵素を除去し、次いでアガロース・ビーズを除去するフィルターを介して
、第３室に洗出する（たとえば注射器）。保留したアガロースは、高親和性アビ
ジン−ビオチン相互作用によって結合した残余酵素を含有する。
【００３３】 １つの好ましい観点において、適当な成長因子、たとえば線維芽細胞成長因子
または血小板誘導成長因子で、フィブリン組成を豊富にする。他の観点において
、細胞を血小板もしくは大食細胞と、または他の血液−誘導細胞と共同輸送する
。かかる共同輸送の細胞は、自己由来が好ましい。 注目すべき点は、フィブリン、ケラチノサイトまたは他の細胞の自己由来源が
好ましいが、他の源も適当であることが少なくないことである。かかる源として
は、新鮮な冷凍血漿（自己由来、シングルドナー等）または血液銀行全血が挙げ
られる。
【００３４】 フィブリン−関連たん白を輸送する組成物はさらに、結合（associated）たん
白を包含することが好ましい。たとえば、フィブロネクチンが３〜１０００μｇ
／ｍｌもしくはそれ以上、より好ましくは３０〜６０μｇ／ｍｌもしくはそれ以
上の量で存在することが好ましい。プロトロンビンが重量に基づきまたは容量ベ
ースに対する活性に基づき、１００％もしくはそれ以上、より好ましくは３０〜
６０％もしくはそれ以上の量で存在することが好ましく、ここで、百分率量はプ
ロトロンビンの元の血漿濃度に関係する。因子ＸＩＩＩが２０〜２０００％もし
くはそれ以上、より好ましくは２００〜１０００％もしくはそれ以上の量で存在
することが好ましく、ここで、百分率量は因子ＸＩＩＩの元の血漿濃度に関係す
る。
【００３５】 ポリマー支持体 幾つかの情況、特に創傷ケアにおいて、所望細胞の接着性（密着性）および浸
潤を可能ならしめる生分解性ポリマーの剤皮を設けることが望まれる。かかる剤
皮として有用なポリウレタン膜包帯（dressings）としては、Hydroderm（登録商
標）(ＴＸ、ダラスの Wilshire Medical. Inc.）および Spyrofilm（登録商標）
(ＣＯ、デンバーの Polymedica Inc.）が挙げられ、これらは、生分解性接着剤
被膜といっしょに供給される。かかる被膜として有用なヒアルロン酸ベース膜と
しては、Laserskin（登録商標)(イタリア国、アバノ・テルメの Fidia Advanced
Biopolymers）が挙げられる。
【００３６】 さらに、かかる被膜として有用なものは、EpiGen（登録商標）ポリマー膜（イ
ングランド、ＨＵ３ ２ＢＮの T.J.Smith & Nephew, Limited.）；Apligraft（
登録商標）サポート（Eaglsteinらの「Clinical Therapeutics」（１９：８９４
−９０５、１９９７年），“ヒト皮膚等価物における Apligraftの組織工学と発
育”、Novartis A.G.によりマーケティング参照）、ここで、Apligraft（登録商
標）は生存表皮と真皮細胞から成るフィブリン−ベースサポート（support）で
ある；および BioSeed（登録商標）サポート（Horchらの「American Institute
of Chemical Engineering」（アブストラクト、１９９７年度会議、Paper ５２
Ｈ），“培養ヒトケラチノサイト懸濁液のフィブリングルーおよび担体と表皮の
皮膚移植”参照）が挙げられる。
【００３７】 また、かかる有用なポリマー被膜としては、Integra（登録商標）人工スキン
（ＮＪ、プレインズボロの Integra Life Sciences）が挙げられる。Integra（
登録商標）人工スキンは、真皮交換用の二層膜系である。皮膚交換層は、架橋し
たウシの腱コラーゲンの繊維の多孔質マトリックスと、グルコサミノグルカン（
コンドロイチン−６−硫酸）から作られる。多孔質マトリックスは、多孔度の制
御と崩壊速度の規定によって製造される。一時的な表皮代用層は、合成ポリシロ
キサンポリマー（シリコーン）から作られ、創傷からの湿分損失をコントロール
するよう機能する。コラーゲン含有皮膚交換層は、線維芽細胞、大食細胞、リン
パ球、および創傷床から誘導される毛細管の浸潤のためのマトリックスとして役
立つ。治癒が進むにつれて、コラーゲンマトリックスは線維芽細胞によって沈着
し；同時に、Integral（登録商標）人工スキンの皮膚層は崩壊する［Burkeらの
「Annals of Surgery」（１９４：４１３−４２７、１９８１年）参照］。
【００３８】 注として、本発明は膜支持体被膜の使用によって説明されているが、このよう
な支持体（サポート）は必要でない。創傷ケアの情況において、かかる支持体は
、たとえば蒸気移送に対するバリアを付与するのを助成しうる。しかしながら、
創傷ケアを付与し、かつ表皮組織が形成する（本発明の方法により）他の方法も
利用できる。たとえば、中間層皮膚移植片（植皮）などの同種異系皮膚移植片を
噴霧細胞上に適用して、保護層を設けることができる。この情況でのフイブリン
・グルーは、皮膚移植片を固定するのに役立つ。かかる移植片はたとえば、同種
移植の脱上皮形成真皮または中間層植皮の場合に、グリセロール化される。 このように、本発明は、Ｉntegra皮膚交換層に表皮の形成の他の方法、中間層
植皮、培養した上皮自己移植片の使用を提供する。
【００３９】 噴霧装置 二成分フイブリン系は、当該分野で公知のいずれの装置によっても噴霧するこ
とができる。典型例として、噴霧の直前、最中または直後に混合が生じるべきで
ある。噴霧の直前に生じる混合は、噴霧にほぼ間に合うのに十分に行なわなけれ
ばならず、これによって、液体粒子（液滴）の形成を妨げる程度に粘度が上昇し
ないようにする。機能的フイブリン系の場合、このような前もっての混合は、短
かい時間を除き、粘度上昇の迅速さに基づき好ましくない。
【００４０】 好ましい噴霧装置は、フイブリン系の二成分を、噴霧操作の飛行中に混合する
だろう。かかる系において、２つの流れを混合する動力学により、実質的な混合
力学が得られる。標的組織で合流する流れの衝突時の力学エネルギー変化により
、他の混合力学をもたらすことができる。１つの装置が、ＨolmのＵ．Ｓ．特許
Ｎｏ．５６０５５４１に記載されている。Ｈolm装置は、中心ガス出口と、該ガ
ス出口のまわりに整列した２つの環状出口を有する。内側の環状出口は中和緩衝
液を輸送するのが好ましく、一方、外側の環状出口はフイブリン成分を輸送する
。中心ガス出口は、出力流れを定め、合併するのを助成する。第２の噴霧装置を
第１に並べて、細胞とフイブリンの両方を標的組織に輸送できるようにする。さ
らにＨolm装置を改変して、細胞懸濁液用の第３出口（たとえば環状出口）を設
けることができる。
【００４１】 特に好ましい噴霧装置は、ＷＯ９７／２０５８５およびＷＯ９８／２０９３１
に記載されている。これらの特許出願に記載の噴霧装置は、管腔（lumen）直径
がたとえば３００μｍ以下の多重管腔チューブを有する。管腔出口はフラットな
面にある。３つの管腔の場合、出口において各管腔は一直線に沿って並んでいる
のが好ましい。たとえば、１つの外側管腔を用いて空気または他のガスを輸送（
送出）することができ、中間の管腔でフイブリンモノマーを輸送でき、そしても
う１つの外側管腔で少量の塩基溶液を輸送することができる。好ましくは、液体
出口は２５０ミクロン、たとえば２５〜１５０ミクロンまたは５０〜１２５ミク
ロンの直径を有するが、ガス出口は２０〜５０％大きいのが好ましい。たとえば
各出口の配列にあって、１５０ミクロンのガス出口の後に、２つの１００ミクロ
ン液体出口を一直線に並べることができる。コンバインした液体の流量は、３．
０ｍｌ／分以下、たとえば０．５〜０．７ｍｌ／分が好ましい。液体出口の間隔
は、該出口を出る液滴が重なり合ったり、あるいは互いに接触するようになって
いるのが好ましい。
【００４２】 用いる場合のガス流量は、５００〜８００ｍｌ／分が好ましい。隣接するガス
流は、液体流に近づき、液体流を小さな液滴に散らすのに役立つ（“分散噴霧”
をもたらす）。ガス流を用いない場合、液体輸送は、液滴の分散液、たとえば円
錐分散液（conical dispersion）よりもむしろ、しずくまたは流れの形状にあ
る。このような噴出しずくまたは流れによる液体の輸送は、１つの噴霧形態を構
成する。このような噴出しずくまたは流れは、一点集中適用が望まれるときに選
定することができる。
【００４３】 細胞懸濁液だけを噴霧するとき、上述の低液体流量の使用が好ましい。 細胞懸濁液は、二成分フイブリン系を輸送する同じ噴霧装置から輸送すること
ができる。たとえば、ＷＯ９８／２０９３１の図９に記載の、少なくとも３つの
液体輸送出口を有する具体例を使用することができる。
【００４４】 組換え型フイブリノゲンおよびフイブリン 遺伝子工学は、フイブリノゲンおよびフイブリンモノマーを、比較的高収率で
、実質的純粋な形状で、かつ肝炎やＨＩＶなどの病原性ウイルスの存在もなく生
成することができる。また、フイブリノゲンおよびフイブリン鎖の異種発現は、
天然産出フイブリン変異体によく似る突然変異の構成、並びにこれらのまれな遺
伝的欠損を持つ患者にとって必要でないたん白の単離および研究を可能ならしめ
る。
【００４５】 フイブリノゲンの３つの異なるポリペプチド鎖（Ａα、Ｂβおよびγ）のそれ
ぞれは、個々の遺伝子によってコードされる。これら鎖のそれぞれのｃＤＮＡは
、調製され［Ｃhungらの「Ａnn．Ｎ．Ｙ．Ａcad．Ｓci．」（４０８：４４９−
４５６、１９８３年）；Ｒixenらの「Ｂiochemistry」（２２：３２３７−３２
４４、１９８３年）；Ｃhungらの「Ｂiochemistry」（２２：３２４４−３２５
０、１９８３年）；Ｃhungらの「Ｂiochemistry」（２２：３２５０−３２５６
、１９８３年）参照］、かつ原核生物で発現されている。さらに、各ヒトフイブ
リノゲン鎖は、発現プラスミドの中に別々に［Ｈuangらの「Ｊ．Ｂiol．Ｃhem．
」（２６８：８９１９−８９２６、１９９３年）；Ｒoyらの「Ｊ．Ｂiol．Ｃhem
．」（２６７：２３１５１−２３１５８、１９９２年）；Ｒoyらの「Ｊ．Ｂiol
．Ｃhem．」（２６６：４７５８−４７６３、１９９１年）参照］または組合せ
て［ＨartwigおよびＤanishefskyの「Ｊ．Ｂiol．Ｃhem．」（２６６：６５７８
−６５８５、１９９１年）；Ｈuangらの「Ｊ．Ｂiol．Ｃhem．」（２６８：８９
１９−８９２６、１９９３年）；Ｒoyらの「Ｊ．Ｂiol．Ｃhem．」（２６６：４
７５８−４７６３、１９９１年）；ＲedmanおよびＳamarのＵ．Ｓ．特許出願Ｎ
ｏ．０７／６６３３８０（１９９１年３月出願）、Ｎatl．Ｔechnology Ｉnfor
mation Ｓervice Ｎｏ．ＰＡＴ−ＡＰＰＬ ０７６６３ ３８０１ ＩＮＺか
ら入手可能］導入され、かつ真核生物細胞にトランスフェクションされている。
【００４６】 組換え型ヒトフイブリノゲンを発現するのに用いられるプラスミドのほとんど
は、シアトルのワシントン大学のＤｒ．Ｄ．Ｃhungが構成したものから誘導され
、かつｃＤＮＡクローンに基づく［Ｒixenらの「Ｂiochemistry」（２２：３２
３７−３２４４、１９８３年）；Ｃhungらの「Ｂiochemistry」（２２：３２４
４−３２５０、１９８３年）；Ｃhungらの「Ｂiochemistry」（２２：３２５０
−３２５６、１９８３年）参照］。組換え型フイブリノゲン鎖の発現は、最初に
Ｅ．coliで達成された［ＢolyardおよびＬordの「Ｇene」（６６：１８３、１９
８８年）；ＢolyardおよびＬordの「Ｂlood」（７３：１２０２−１２０６、１
９８９年）；ＬordおよびＦowlkesの「Ｂlood」（７３：１６６−１７１、１９
８９年）参照］。個別に発現した鎖は、フイブリノゲンと抗原性の類似を示し、
かつ自然産出のフイブリノゲンに見られるものに類するトロンビン開裂性部位を
示す［ＢolyardおよびＬordの「Ｂlood」（７３：１２０２−１２０６、１９８
９年）；ＬordおよびＦowlkesの「Ｂlood」（７３：１６６−１７１、１９８９
年）参照］。フイブリノペプチドＡおよびＢを、組換え型フイブリノゲンから放
出することができる［ＢolyardおよびＬordの「Ｂlood」（７３：１２０２−１
２０６、１９８９年）；ＬordおよびＦowlkesの「Ｂlood」（７３：１６６−１
７１、１９８９年）参照］。
【００４７】 個々のフイブリノゲン鎖をコードする適当な発現プラスミドを運搬する真核生
物細胞は、コード化フイブリノゲン鎖を合成し、かつダイマー鎖分子、たとえば
Ａα２、Ｂβ２またはγ２二量体を細胞内で形成することが知られている［Ｒoy
らの「Ｊ．Ｂiol．Ｃhem．」（２６５：６３８９−６３９３、１９９０年）；Ｚ
hangおよびＲedmanの「Ｊ．Ｂiol．Ｃhem．」（２６７：２１７２７−２１７３
２、１９９２年）参照］。さらに、３つのヒトフイブリノゲン鎖の全ての場合に
コードする遺伝子を含有する適当なプラスミドを同じ細胞の中に移すと、３つの
鎖全てが発現するばかりでなく、ポリペプチド鎖は対になって連合し、かつ無傷
のフイブリノゲンがまわりの媒質に分泌される［Ｒoyらの「Ｊ．Ｂiol．Ｃhem．
」（２６６：４７５８−４７６３、１９９１年）；ＨartwigおよびＤanishefsky
の「Ｊ．Ｂiol．Ｃhem．」（２２６：６５７８−６５８５、１９９１年）参照］
。分泌した組換え型フイブリノゲンは、天然フイブリノゲンと同様、三対の異な
るポリペプチド鎖からなり、かつフイブリンポリマーの形成に機能する。
【００４８】 フイブリノゲンは肝臓で自然合成され、そして培養物に維持される巨大カリオ
サイト細胞および形質転換肝臓細胞は、フイブリノゲン合成と分泌を続けること
ができる［Ｏttoらの「Ｊ．Ｃell．Ｂiol．」（１０５：１０６７−１０７２、
１９８７年）；Ｙuらの「Ｔhromb．Ｒes．」（４６：２８１−２９３、１９８７
年）；Ａlvingらの「Ａrch．Ｂiochem．Ｂiophys．」（２１７：１９、１９８２
年）参照］。かかる細胞系の１つは、Ｈｅｐ Ｇ２細胞である［Ｄｒ．Ｋnowles
およびＡden、フイラデルフィアのＷister Ｉnstitute］。この系は、Ｂｂ−鎖
上に過剰のＡα−およびγ−鎖を合成して、Ａα−およびγ−鎖の非増殖性ダイ
マー複合物（たとえばＡα２γ２）をもたらす。
【００４９】 Ｂβ−鎖をコードする余分の発現ベクターの導入は、トリマー複合物（ＡαＢ
βγ）の形成をもたらし、該複合物は正しいホールディング（folding）および
鎖内のジスルフィド結合パターンを採用する（adopt）［Ｒoyらの「Ｊ．Ｂiol．
Ｃhem．」（２６５：６３８９−６３９３、１９９０年）参照］。このホールデ
ィングのメカニズムは未知で、補助的なたん白および酵素が必要かもしれない［
Ｒoyらの「Ｊ．Ｂiol．Ｃhem．」（２６７：２３１５１−２３１５８、１９９２
年）参照］。これらの研究は、Ｂβ ｃＤＮＡの正しい転写ばかりでなく、過剰
のＢβ−鎖が無傷のフイブリノゲンのアセンブリー（assembly）および分泌を高
めることをも証明した。
【００５０】 Ｈｅｐ Ｇ２細胞において、ＡαＢβγトリマー複合物は対になって連合して
、無傷のフイブリノゲン分子を形成し、該分子はグリコシル化されるようになり
、かつ細胞から活発に分泌される［Ｈuangらの「Ｊ．Ｂiol．Ｃhem．」（２６８
：８９１９−８９２６、１９９３年）参照］。実際に、正しくアセンブリーした
フイブリノゲン分子のみが分泌される。このように、Ｈｅｐ Ｇ２細胞は、フイ
ブリノゲンのアセンブリー用の合成および分泌の器を有する。 次の実験で、フイブリノゲン鎖をコードするｃＤＮＡプラスミドを、普通はフ
イブリノゲンを合成しない真核生物細胞に導入した。これらの実験は、機能性フ
イブリノゲンをうまく生成し、これは、フイブリノゲンのアセンブリーおよび分
泌に必要な因子が、Ｈｅｐ Ｇ２のような肝臓−誘導細胞に対して特異でないこ
とを証明した。組換え型フイブリノゲンをアセンブリーし、分泌しうることが知
られている真核生物細胞としては、ハムスター・ベービーの腎細胞（ＢＨＫ）、
ＣＯＳ細胞およびチャイニーズ・ハムスターの卵巣細胞（ＣＨＯ）が挙げられる
［Ｒoyらの「Ｊ．Ｂiol．Ｃhem．」（２６６：４７５８−４７６３、１９９１年
）；ＨartwigおよびＤanishefskyの「Ｊ．Ｂiol．Ｃhem．」（２６６：６５７８
−６５８５、１９９１年）；Ｆarrellらの「Ｂiochemistry」（３０：９４１４
−９４２０、１９９１年）参照］。
【００５１】 安定に形質転換した真核生物細胞によって分泌される無傷の機能性フイブリノ
ゲンは、フイブリノゲン・レベル約１〜２μｇ／ｍｌの堆積をもたらす。発現レ
ベルが基礎分泌レベルの１０００倍に達しうるように、ＣＨＯ細胞のようなトラ
ンスフェクションした細胞からの組換え型たん白の出力を増大する方法が知られ
ている。 組換えでフイブリン−関連分子を生成する方法の付加的な説明は、ＰＣＴ／Ｕ
Ｓ９５／０５５２７に記載されている。
【００５２】 コラーゲン また本発明は、細胞−接着性促進に有効量のコラーゲンを被覆した組織表面に
、細胞を噴霧することにも関係する。好ましくは、組織表面にコラーゲンを噴霧
する。
【００５３】 他の接着性マトリックス 他のポリマー接着剤または増粘性ポリマー・ベース組成物に、細胞を噴霧する
ことができる。好ましくは、上述の多重出口噴霧装置の１つを用い、接着性また
は増粘性ポリマーを共同噴霧する。たとえば、コラーゲン、ヒアルロン酸、また
は他の適当なポリマーを含有する接着剤組成物といっしょに、細胞を輸送するこ
とができる。多様な酸性基、たとえばヒアルロン酸からなる少なくとも特定のポ
リマーの場合、酸性溶液はかなり粘度が低く、塩基溶液の適用と共に行なう混合
で粘度を上げるようになっている。すなわち、酸可溶化フイブリンの場合に用い
るのに類する混合プロセスによって、かかるポリマーをより便宜的に輸送するこ
とができる。
【００５４】 次に実施例を挙げて、本発明をより具体的に説明するが、これらの実施例は、
いかなる場合にも、本発明の技術的範囲を限定するものではない。 実施例１：フイブリンモノマーの製造 フイブリンモノマーを製造する生化学方法は、完全自動化され、かつ既に記載
されている［Ｋjaergardらの「Ｃardiovascular Ｅngineering」（２：２０４
−２０６、１９９７年）参照］。抗凝固のため、クエン酸ナトリウムで固化した
プレパラートに、１２０ｍｌの患者の血液を混合する。急サイクル遠心分離で、
６０ｍｌの血漿を単離し、これをビオチニル化バトロキソビン（batroxobin）と
３７℃にて１０分間反応させる。ビオチン−バトロキソビン複合物は、フイブリ
ノゲンからのフイブリノペプチドＡの放出を触媒するが、フイブリンＩポリマー
の形成をもたらす、酸可溶性の因子ＸＩＩＩを賦活しない。遠心分離でフイブリ
ンＩポリマーを単離し、３．５ｍｌの０．２Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．
０）に溶解する。該溶液に、アガロースと共有結合するアビジンを加え、ビオチ
ン−バトロキソビンをアガロースに複合させる。次に、濾過でフイブリンＩ溶液
から、ビオチン−バトロキソビン：アビジン−アガロース複合物を分離する。
【００５５】 酸性フイブリンＩ溶液をバイアルに吸引し、これをアプリケーター・ユニット
に移す。アプリケーター・ユニット内の注射器は、０．７５Ｍ炭酸塩／重炭酸塩
緩衝液（ｐＨ１０）を含有する。２つの溶液を同時に加え、適用プロセス中に密
に混合する。フイブリンＩ：緩衝液＝７：１比で混合して、重合を開始する。混
合によって生じる中性ｐＨにて、および炭酸塩／重炭酸塩緩衝液によって供給さ
れるカルシウムイオンの存在下で、内因性プロ−トロンビンはトロンビンに変換
することにより、フイブリノペプチドＢがフイブリンＩから開裂されるようにせ
しめ、フイブリンＩＩを形成する。またトロンビンは因子ＸＩＩＩを賦活し、該
因子ＩＩＩがフイブリンＩＩに作用して、安定なフイブリンＩＩポリマーを形成
する。ヒトの実験では、このプロセスは３０分で終了し、かつフイブロネクチン
を含むフイブリン結合たん白が豊富な約４．５ｍｌの濃厚フイブリンシーラント
を生成する。
【００５６】 実施例２：フイブリンポリマーへの細胞成長 亜融合性（sub−confluent）ブタのケラチノサイトが、接着性および成長の基
質とし重合したフイブリンシーラント（実施例１の方法を用いて製造）を使用で
きるかどうかを評価する、インビトロの実験を行った。重合したフイブリンシー
ラントは、実施例１の方法を用い、寄贈のブタ血液から生じたフイブリンＩ溶液
のサンプルから製造した。溶液中のフイブリンＩの濃度は、２３．６４ｍｇ／ｍ
ｌで、ｐＨ値は４．４３である。１枚の２４ウェル組織培養プラスチック平板を
用いる（内部ウェルの直径０．８ｃｍ）。実験グループを、下記表に記載する。
【００５７】
【００５８】 ６ウェルのそれぞれに、１５０μｌのフイブリンＩ溶液を加える。グループ１
の３ウェルのそれぞれに、７５０μｌのＤＭＥＭ培地（ＦＣＳ１０％含有）を、
５０μｇ／ｍｌタイプ１ラット尾部コラーゲン溶液（０．０２Ｍ酢酸に溶解）５
０μｌと共に加える。グループ２の３ウェルの場合、同じ溶液を加えるが、ラッ
ト尾部コラーゲン溶液を省略し、その代わりに５０μｌの０．０２Ｍ酢酸を用い
る。ＤＭＥＭ溶液の添加により直ちに、フィブリンＩ溶液が重合する。
【００５９】 グループ１の３ウェルの重合したフィブリンシーラントの表面に、０．５ｍｌ
のケラチノサイト成長培地の５万個の３Ｔ３照射フィーダー（feeder）細胞を適
用し、グループ２のウェルには、０．５ｍｌのケラチノサイト成長培地のみ適用
する。０．５ｍｌのケラチノサイト成長培地中の１０万個（１×１０５）の継代
亜融合性ブタ・ケラチノサイトを、６ウェル全ての表面に適用する。２日間の培
養後、緩和な吸引で培地を変える。４日後、各ウェルの基部にフィブリンシーラ
ントのクロットがなお存在する。さらに培地の変化後、小刀（サイズＩＩブレー
ド）と一組の歯付鉗子を用いて、ウェルからクロットを取除く。
【００６０】 次いで各クロットを、ＯＣＴブロッキング・コンパウンド（blocking compoun
d）でブロックし、冷凍する。クロットの上面に対して、横および接線方向に１
５μｍ厚の凍結切片（cryosection）をカットする。後者の切片は、接着性ケラ
チノサイトの形態の評価を可能ならしめることが期待される。フィブリンシーラ
ントのクロットは、組織生検材料より強度がはるかに小さく、残念なことに、か
かる切片の全ては、切断中にばらばらになった。無傷の横凍結切片を固定し、標
準の免疫細胞学技法および蛍光顕微鏡検査法を用いて、ケラチン１４免疫反応性
のため染色する。両実験グループにおいて、フィブリンシーラントのクロットの
表面に、ケラチノサイトが見えた。
【００６１】 実施例３：創傷ケア 本例の十分に確立した創傷モデルにおける、麻酔および外科操作はこれまでに
記載されている〔Kangesu らの「Brit. J. Plastic Surg.」(４６：３８９３−
４００、１９９４年)参照〕。ラージ・ホワイト・ピッグ（Large white Pig）の
胸郭の各側腹部の露出筋膜に、３つの４ｃｍ直径丸形の全厚創傷をつける。この
モデルで、Integra（登録商標）皮膚交換層を用いるとき、創傷床の綿密な止血
は、双極ジアテルミーの慎重な使用によって行なう（すなわち、医療または外科
目的のため電流によって組織に熱を発生）。Burkeらの「Physician Training Ma
nual」(インテグラル・ライフサイエンシーズ・コーポレーション、１９９６年)
，“人工皮膚 皮膚再生テンプレート”に記載の方法で、Integra (登録商標)皮
膚交換層を作成し、次いで４．５cm直径の円板にカットし、該円板の縁の内側の
２〜３ｍｍの位置に５゜モノフィラメント縫合糸をインターラプトして、円板を
創傷基部に縫合する。
【００６２】 ２゜シルク縫合糸を用い適切な位置に固定したポリテトラフルオロウレタン（
ＰＴＦＥ）チャンバー（室）を用いて、まわりの皮膚から創傷を隔離する。Inte
gra（登録商標）皮膚交換層を非接着性の包帯でカバーし、チャンバーに、食塩
水でぬらしたガーゼを少ししぼって充填する。動物の胴体のまわりに、フォーム
を裏打ちした保護ジャケットをストラップして、創傷への不注意な損傷を防止す
る。ケラチノサイト培養を開始する皮膚生検は、全厚創傷の作成と同日に行ない
（経皮チャンバーで隔離）、胸部幹筋膜上にIntegra（登録商標）皮膚交換層を
移植する。
【００６３】 ブタの左外頸静脈から血液を採取する。自己由来フィブリンシーラントの製造
のプロトコルは、実施例１に従う。 Integra（登録商標）皮膚交換層（または人工皮膚）を移植するプロトコルは
正確であり（ClaytonおよびBishopの「J. Burn Care Rehabil.」(vol. １９、４
：３５８−３６３、１９９８年)に詳しく記載）、一貫して高速度の生着（take
）を達成する。
【００６４】 この実験には、１０週令の動物を用いる。プロトコルにおいて、初期生検と培
養細胞の適用間にわずか１０日の期間を用いる。（すなわち、同じ麻酔剤を用い
て、隔離創傷を作り、Integra（登録商標）人工皮膚を適用する間に、初期生検
をとることができる。）３日目と８日目に、一般的な麻酔下で包帯を変える。
【００６５】 １０日目に動物に麻酔をかけ、左外頸静脈にカニューレを入れる。単一製造工
程で、約４．５ｃｍ３のブタ・フィブリンＩ溶液を製造する。創傷を露出し、In
tegra（登録商標）皮膚交換層の一時的ジラスチック（silastic）膜を除去する
。この実験のIntegra（登録商標）皮膚交換層の生着は、６創傷全てにおいて１
００％であった。
【００６６】 ６つの大（Ｔ７５）フラスコの８０〜９０％交会（confluence）のケラチノサ
イトを、予備加温した０．０５％トリプシン／０．０２％エチレンジアミンテト
ラ酢酸（Gibco BRL、ライフ・テクノロジー）５ｍｌを各フラスコに加えて分散
せしめ、フラスコを３７℃で培養する。組織培養プラスチックから細胞を分離す
るのに、１０分要した。血清含有培地を加えて、トリプシンの作用を中和する。
トータル約１４×１０６個の生育可能な細胞を取入れる。噴霧用のケラチノサイ
ト成長培地に、ケラチノサイトを懸濁する。噴霧操作の終りに、未噴霧サンプル
から生育可能を評価する。
【００６７】 約０．６ｃｍ３の自己由来ブタ・フィブリンシーラント（約２２ｍｇ／ｍｌの
フィブリンモノマー）と０．６ｃｍ３のブタ細胞懸濁液を、創傷１−３に適用す
る。創傷４−６には、約０．６ｃｍ３のブタ・フィブリンシーラントを、細胞の
ないブタ・ケラチノサイト成長培地といっしょに適用する。１つの噴霧装置でフ
ィブリンシーラントと、炭酸塩／重炭酸塩緩衝液を噴霧し、第１装置にテープで
とめた同じ装置で、細胞を噴霧する。噴霧ヘッドを創傷から２〜５ｃｍに保持す
る。用いた装置は、ＷＯ９７／２０５８５に係り、ここで、３つの直線に配列し
た３００μｍ出口を用い、それぞれ、空気；酸−溶解フィブリン；および炭酸塩
／重炭酸塩緩衝液を輸送する。動物の左側の創傷は１つの実験グループであり、
動物の右側の創傷は、他のグループである。この配置は、他の実験グループから
の噴霧ケラチノサイトによる、フィブリンシーラント単独創傷の潜在的な汚染を
回避する。
【００６８】 細胞懸濁液の細胞密度の概算は、２．７８×１０６細胞ｃｍ−３である。すな
わち、１創傷当りの噴霧細胞の総数の概算は、１．６７×１０６である。噴霧前
の細胞懸濁液の成育可能の概算は、９２．８％である。適用のほぼ直後に、フィ
ブリンシーラントは創傷表面上で重合する。
【００６９】 同じ動物からの第２継代（passage）（Ｐ２）ケラチノサイトを用いて行なっ
た以前の実験では、同じ装置（自己由来フィブリンシーラントなし）を用いて、
５％アガロースに対し噴霧細胞の成育可能として６３．２（Ｓ．Ｄ．５．４）％
を示した。すなわち、各創傷に輸送される成育可能な細胞の総数は、約１．１×
１０６（または創傷面積１ｃｍ２当り、≦８．８×１０４の成育可能な細胞）が
予想される。
【００７０】 ２×１０６個の致死照射マウス３Ｔ３細胞をまいた、７５ｃｍ２コラーゲン被
覆培養フラスコに、細胞懸濁液（創傷に用いたものより過剰）のサンプルを噴霧
する。これらの細胞は、３日以内にほぼ融合性の母集団を形成する。次にこの母
集団をさらに２継代にわたって培養したが、未噴霧ケラチノサイトと比較して、
成長速度に明らかな障害はなかった。
【００７１】 創傷の写真をとり、該創傷に非接着性包帯の層を当て、そしてチャンバーに食
塩水で湿ったガーゼを入れる。２つの異なる創傷処置の適用の約５分後に、創傷
３および４からパンチ生検材料を取る。さらに一般的な麻酔下の処置の４日目に
生検材料を取り、１４日目に安楽死で創傷を取り入れる。
【００７２】 ０日目：両創傷上に、約６０μｍ厚のフィブリンシーラントの被膜層が存在す
る。噴霧適用で細胞を適用した創傷からの生検材料のみに、シーラントに懸濁し
たケラチノサイトを検出することができ、かつ該ケラチノサイトは単離しており
、球状形態であった。 各創傷に輸送された細胞（成育可能および成育不可の両方）の総数の概算は、
約１．７×１０６で、この結果、創傷への噴霧細胞の予測密度（濃度）は約１．
３×１０５ｃｍ−２となる。
【００７３】 ４日目：フィブリンシーラントと懸濁ケラチノサイトの噴霧混合による処置の
４日後に、創傷表面にもしくはその近位に、ケラチノサイト・コロニーが検出さ
れる。フィブリンシーラント＋培地のみの対照創傷からの生検材料には、ケラチ
ノサイトは検出されなかった。 １４日目：フィブリンシーラント／ケラチノサイト混合物の噴霧適用の２週間
後、創傷表面をおおう多層上皮が存在する。噴霧フィブリンシーラントと培地単
独の混合物で処置した創傷の表面には、上皮はなかった。
【００７４】 １４日の表皮カバー：培養ケラチノサイトの噴霧適用の１４日後の創傷表面の
上皮は、角質層を有さない。肉眼では、創傷表面の不透明の変化によって上皮が
示される。生検材料により、上皮の領域は創傷の別の輝く面と比較して、マット
外観を有することが確認される。
【００７５】 フィブリンシーラントとケラチノサイトの混合物の噴霧適用の１４日後の創傷
１−３の平均表皮カバーは、トータル創傷面積の百分率で計算して、下記表に示
されるように６６％であった。フィブリンシーラントと培地単独の噴霧混合物で
処置した創傷４−６には、上皮は存在しなかった。
【００７６】
【００７７】 ＰＴＦＥ創傷チャンバー（室）に関するIntegra（登録商標）皮膚交換円板（
このため、創傷床）の徐々の動きが見られる。この動きは、動物の成長の結果と
して、“創傷シフト”の現象の結果であると推定される。処置の１４日後の創傷
床の重要な断片は、フィブリンシーラント／ケラチノサイト噴霧に付されない、
創傷シフトの結果である。噴霧したIntegra（登録商標）人工皮膚の百分率で計
算した表皮の再生は、移動現象を考慮しなければ、記録した６６％よりかなり大
きいだろう。
【００７８】 ケラチン６およびコラーゲンＶＩＩ染色： ケラチン６およびコラーゲンＶＩＩに対する免疫反応性のため、組織生検材料
を染色する。４日目、ケラチン６またはコラーゲンＶＩＩに対する免疫反応性は
全く検出されず。しかし、１４日目にＫ６に対し基底の上のケラチノサイトが強
く染色した。表皮の領域の下およびケラチノサイト嚢腫のすぐ隣接位置に、コラ
ーゲンＶＩＩ免疫反応性が検出できた。コラーゲンＶＩＩ免疫反応性は、シング
ル連続バンドよりはむしろ多重に重なった縞の形状で検出された。フィブリンシ
ーラントと培地単独の混合物を噴霧した創傷からの生検材料の中には、ケラチン
６またはコラーゲンＶＩＩ免疫反応性は検出できなかった。
【００７９】 本明細書で引用した、特許および特許出願に限定されないがこれらを含む、全
ての刊行物および参照文献は、参考としてその完全なままで、ここに導入する。
また、本願の優先権主張の基礎になるいずれの特許出願についても参考として、
ここにその完全なままで導入する。
【００８０】 本発明については、好ましい具体例を強調して説明しているが、当業者にとっ
て、選択される装置や方法におけるバリエーションを適宜に採用しうること、並
びに本明細書で特別に記載した以外の方法で本発明を実施しうることは明らかで
あろう。従って、本発明は、特許請求の範囲によって規定される精神および技術
的範囲内に属しうる全ての改変を包含するものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図面が必要な場合、後に補完する予定である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 17/02 Ａ６１Ｋ 37/12 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ， ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，Ｃ Ｚ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ， ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，Ｌ Ｔ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ， ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，Ｕ Ａ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 イアン・グラント イギリス、アールエイチ19・３ディゼッ ト、サセックス、イースト・グロムステッ ド、クイーン・ビクトリア・ホスピタル、 ブロンド・マッキンドー・センター (72)発明者 スチュアート・エイ・シーダーホーム−ウ ィリアムズ イギリス、オーエックス４・４ワイジー、 オックスフォード、リトルモア、ヘイフォ ード・ヒル・レイン10シー番 Ｆターム(参考） 4C076 AA24 BB31 CC19 FF16 4C081 AA04 AA08 AA12 BA12 BB04 CD111 CD121 DA02 DC01 4C084 BA44 BA46 MA01 MA13 NA14 ZA89 4C087 AA01 AA02 BB33 BB34 BB48 CA04 MA01 MA13 NA14 ZA89

Claims (19)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 哺乳類の組織表面または該組織表面に生分解性ポリマーシー
    トを被覆したものである標的表面に細胞を接着する方法であって、 非ポリマーフィブリン−関連たん白からなる第１成分と該フィブリン−関連た
    ん白をフィブリンポリマーに変換するのに有効な第２成分の混合物を、上記標的
    表面に被覆し；次いで 細胞の懸濁液を、被覆標的表面に噴霧することから成り、混合した二成分が、
    細胞を接着するのに有効な粘着力を持つフィブリンポリマーを形成することを特
    徴とする接着方法。
  2. 【請求項２】 集落形成促進に有効量の細胞を標的表面に固定するのに有効
    な量でフィブリンポリマーが形成する請求項１に記載の接着方法。
  3. 【請求項３】 混合物にさらに、細胞−接着性促進に有効量のコラーゲンを
    混合する請求項１に記載の接着方法。
  4. 【請求項４】 混合物を噴霧して標的表面を被覆する請求項１に記載の接着
    方法。
  5. 【請求項５】 混合物と細胞懸濁液を同時に噴霧して、標的表面を被覆する
    請求項１に記載の接着方法。
  6. 【請求項６】 標的表面におけるフィブリンポリマーの三次元マトリックス
    に、集落形成促進に有効量の細胞を閉じ込める請求項１に記載の接着方法。
  7. 【請求項７】 さらに、哺乳類から採取した、一定タイプの組織の生検材料
    からの自己由来細胞を培養し；次いで 該培養細胞から細胞懸濁液を形成し、細胞が適用される組織が、一定タイプの
    もの、あるいは一定タイプの組織に隣接する請求項１に記載の接着方法。
  8. 【請求項８】 組織が創傷で、細胞懸濁液がケラチノサイトを包含する請求
    項１に記載の接着方法。
  9. 【請求項９】 さらに、哺乳類から採取した生検材料からの自己由来ケラチ
    ノサイトを培養し、細胞が適用される組織が創傷である請求項８に記載の接着方
    法。
  10. 【請求項１０】 交会に達する前に、細胞懸濁液のため細胞を生成する継代
    接種の培養ケラチノサイトを取入れる請求項９に記載の接着方法。
  11. 【請求項１１】 さらに、生分解性ポリマーシートを組織表面に接着し、細
    胞懸濁液をポリマーシート上に噴霧して標的表面を形成する請求項１０に記載の
    接着方法。
  12. 【請求項１２】 さらに、混合二成分を被覆した創傷に、線維芽細胞の懸濁
    液を噴霧する請求項８に記載の接着方法。
  13. 【請求項１３】 第１成分が酸可溶化フィブリンからなり、第２成分が混合
    物を中和してフィブリンを重合せしめるのに十分有効量の塩基からなる請求項１
    乃至１３のいずれか１つに記載の接着方法。
  14. 【請求項１４】 第１成分の流れが、噴霧装置から標的表面への飛行中の第
    ２成分の流れと合流するように、第１および第２成分を噴霧する請求項１３に記
    載の接着方法。
  15. 【請求項１５】 細胞懸濁液、第１成分および第２成分の流れが、噴霧装置
    から標的表面への飛行中に合流するように、細胞懸濁液、第１成分および第２成
    分を噴霧する請求項１３に記載の接着方法。
  16. 【請求項１６】 哺乳類において細胞を組織表面に輸送する方法であって、 集落形成促進に有効量の細胞を組織表面に固定するのに有効量で、細胞の懸濁
    液を組織表面に噴霧し；次いで 細胞を組織表面上で維持もしくは成長せしめることから成る輸送方法。
  17. 【請求項１７】 細胞を３．０ｍｌ／分以下の液体流量で噴霧する請求項１
    ６に記載の輸送方法。
  18. 【請求項１８】 細胞−接着性促進に有効量のコラーゲンを被覆した組織表
    面に、細胞を噴霧する請求項１６に記載の輸送方法。
  19. 【請求項１９】 細胞をガス流で噴霧する請求項１６に記載の輸送方法。
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JP2017509352A (ja) * 2014-02-04 2017-04-06 ガルエ，エドゥアルド アルバロ ヒト線維芽細胞およびケラチノサイト溶液の細胞スプレー配合物を得る方法、ならびに皮膚病変の再生剤としてのその使用

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