SK109393A3 - Fibrin sealant compositions and methods for utilizing same - Google Patents

Description

Oblasť techniky

Predložený vynález sa týka fibrínových prípravkov na utesňovanie. Presnejšie sa predložený vynález týka použitia fibrínových prípravkov na utesňovanie, pri ktorom sa prípravok obsahujúci fibrínový monomér alebo prípravok, obsahujúci nezosieťovaný fibrín, použijú ako súčasť fibrínového prípravku na utesňovanie.

Doterajší stav techniky

Jeden z mechanizmov hemostázy, t.j. prevencie straty krvi u cicavcov, je formácia krvnej zrazeniny. Formácia zrazeniny u ľudí, t.j. krvná koagulácia sa deje prostredníctvom komplexnej kaskády reakcií s konečným krokom premeny fibrinogénu - monoméru - prostredníctvom trombínu, vápnikových iónov a aktivovaného faktoru XIII - na vytvorenie zosieťovaného fibrín II polyméru, ktorý je fibrínovou zrazeninou.

Formácia zosieťovaného fibrín II polyméru začína premenou fibrinogénu trombínom na fibrín I monomér, ktorý spontánne polymeruje na fibrín I polymér, ktorý je niekedy označovaný ako rozpustný fibrín I, pretože pôsobením vhodných chemických látok môže byť premenený spätne na fibrín I monomér. Fibrín I polymér je potom premenený trombínom na fibrín II polymér, ktorý je niekedy označovaný ako rozpustný fibrín II, pretože pôsobením vhodných chemických látok môže byť fibrín II polymér premenený na fibrín II monomér. Fibrín II monomér pod vplyvom faktoru XlIIa, známeho ako aktivovaný faktor XIII, je potom zosieťovaný za tvorby zosieťovaného fibrínu II, ktorý je fibrínovou zrazeninou. Faktor XIII je aktivovaný trombínom za prítomnosti nerozpustným fibrínom II, pretože nemôže byť konvertovaný na fibrín II monomér.

- 2 Tu je treba zdôrazniť, že trombín je vytváraný z protrombínu. Protrombín je konvertovaný na trombín prostredníctvom faktoru Xa za prítomnosti vápnika alebo iných pomocných substancií.

Fibrinogén predstavuje asi 2 až 4 g/1 krvných plazmatických proteínov. Fibrinogén je monomér, ktorý pozostáva z troch párov disulfidovo viazaných polypeptidových reťazcov označených (Aa)₂, (Ββ)₂/ ·’2· ^{A a B} predstavujú dva malé aminoterminálne peptidy známe ako fibrínopeptid A a fibrínopeptid B. Štiepenie fibrínopeptidov A z fibrinogénu pri transformácii fibrinogénu trombínom vedie k fibrín I zlúčenine a následné odštiepenie fibrínopeptidov B vedie k fibrín II zlúčenine. Takéto štiepenie fibrínopeptidov A a B znižuje molekulovú hmotnosť fibrinogénu o veľmi malé množstvo, asi 6 000 z 34 000 daltonov, ale obnažuje polymeračné miesta. Pre objasnenie mechanizmu krvnej koagulácie a štruktúry fibrinogénu viď C. M. Jackson, Ann. Rev. Biochem., 49: 765-811 (1980) a B. Fúrie, Celí, 53:505-518 (1988).

Fibrínový prípravok na utesňovanie je biologické adhezívum, ktorého účinok imituje konečné stupne koagulácie a vedie tak k vytvoreniu fibrínovej zrazeniny. Konvenčné fibrínové prostriedky na zastavenie krvácania pozostávajú z koncentrovaného ľudského fibrinogénu, hovädzieho aprotinínu a faktoru XIII ako prvého komponentu a hovädzieho trombínu a chloridu vápenatého ako druhého komponentu. Aplikácia je zvyčajne vykonaná dvojkomorovou striekačkou, ktorá dovoľuje simultánne aplikáciu oboch komponentov na žiaduce miesto tak, aby sa vytvorila krvná zrazenina.

Fibrinogénový komponent fibrínových prípravkov na utesňovanie je pripravený zo spojenej ľudskej plazmy. Fibrinogén môže byť koncentrovaný z ľudskej plazmy kryoprecipitáciou alebo precipitáciou použitím rôznych činidiel, napr. polyetylénglykolu, éteru, etanolu, síranu amónného alebo glycínu.. Kvôli dôkladnému objasneniu fibrínových prípravkov na zrážanie krvi viď M. Brennan, Blood Reviews, 5:240-244 (1991), J. W. Gibble a P. M.

Ness, Transfusion, 30:741-747 (1990), H. Matras, J. Oral Maxillofac Surg., 43:605-611 (1985) a R. Lerner a N. Binur, J. of Surgical Research, 48:165-181 (1990).

V poslednej dobe bol tiež záujem o prípravky na zrážanie krvi na báze fibrínu, ktoré využívajú autológny fibrín. Autológny fibrinový prípravok na zrážanie krvi je fibrínový prípravok na zrážanie krvi, kde fibrinogénový komponent fibrínového zrážania je extrahovaný z pacientovej vlastnej krvi. Použitie autológneho fibrinogénového zrážania je preferované, pretože eliminuje riziko prenosu krvou prenášaných infekcií, napr. hepatitídy B, non A non B hepatitídy a syndrómu získaného zlyhania imunity (AIDS), ktoré môžu byt inak prítomné vo fibrinogénnej zložke extrahovanej z poolovanej ludskej plazmy. Viď L. E. Silberstein a spol., Transfusion, 28:319-321 (1988), K. Laitakar a J. Luotonen, Laryngoscope, 99:974-976 (1989) a A. Dresdale a spol., The Annals of Thoracic Surgery, 40:385-387 (1985).

Infekcia môže byt prenesená fibrínovými prípravkami na utesňovanie nielen prostredníctvom fibrinogénu, ale tiež prostredníctvom hovädzieho aprotinínu a hovädzej trombínovej zložky. Hovädzí trombín je známy ako nosič infekčného agens hovädzej spongiformnej encefalitídy (BSE) a. iných vírových patogénov na cicavce. Naviac je hovädzí trombín potenciálnym antigénom, ktorý môže spôsobovat imunologickú reakciu u človeka. Tak môže hovädzí trombín viest u príjemcu hovädzieho trombínu k nepriaznivému ovplyvneniu. Viď D.M. Taylor, J. of Hospital Infection, 18 (dodatok A): 141-146 (1991), S. B. Prusiner a spol., Cornell Vet, 81 No. 2:85-96 (1991) a D. Matthews, J. Roy. Soc. Health, 3-5 (február 1991).

V súlade s tým tu existuje potreba fibrínových zrážadiel, ktoré môžu byt zobrané od pacienta bez rizika vírovej kontaminácie a iných nežiaducich účinkov.

Podstata vynálezu

Predložený vynález sa teda týka spôsobov využitia fibrínových prípravkov na utesňovanie, ktorý zahrňuje

a) kontakt požadovaného miesta s prípravkom, obsahujúcim fibrín monomér a

b) vyhotovenie uvedeného fibrínového monoméru na fibrín - polymér súbežne s uvedeným kontaktom za vzniku fibrínovej zrazeniny.

Podstata vynálezu tiež poskytuje spôsob prípravy takého prípravku a prípravkov a kitov, obsahujúcich fibrínový monomér.

Iný aspekt vynálezu sa týka spôsobov použitia fibrínových prípravkov na utesnenie, ktoré zahrňujú

a) kontakt požadovaného miesta s prípravkom, obsahujúcim nezosieťovaný fibrín a

b) prevedenie uvedeného nezosieťovaného fibrínu na zosieťovaný fibrín súbežne s uvedeným kontaktom, za vzniku fibrínovej zrazeniny.

Predložený vynález tiež prípravkov a prípravkov nezosieťovaný fibrín.

poskytuje spôsoby prípravy takých a kitov, obsahujúcich takýto

Na účel predloženého vynálezu sú použité nasledovné definície:

fibrín' - fibrín znamená akúkolvek formu fibrínu. Neobmedzujúce príklady fibrínu sú: fibrín I, fibrín II a des BB fibrín. Fibrín môže byť v monomerizovanej forme alebo v polymérnej forme, kde v polymérnej forme je buď nezosieťovaný alebo zosieťovaný.

Fibrín monomér

Fibrín monomér fibrínu, napríklad des-BB-fibrín, kde oligomérnej forme, v kompozícii, obsahujúcej fibrín fibrín ktorá zahrňuje akúkolvek fibrín II

I, je v môže formu alebo monomérnej byť rozpustená fibrín-monomér a kde alebo

-οfibrín-monomér môže byť konvertovaný na fibrín-polymér. Fibrín-polymér - Fibrín polymér zahrňuje akúkoľvek formu fibrínu, napr. fibrín I alebo fibrín II alebo des-BB-fibrín je v polymérnej forme, buď nezosieťovaný alebo zosieťovaný.

Nezosieťovaný fibrín - Nezosieťovaný fibrín zahrňuje akúkoľvek formu fibrínu, napr. fibrín I, fibrín II alebo des-BB-fibrín, kde fibrín je nezosieťovaný a môže byť prevedený na zosieťovaný fibrín. Nezosieťovaný fibrín môže byť buď fibrín - monomér alebo nezosieťovaný fibrín - polymér.

Zosieťovaný fibrín - zosieťovaný fibrín zahrňuje akúkoľvek formu fibrínu, napr. fibrín I, fibrín II alebo des-BB- kde fibrín je fibrín polymér, ktorý je zosieťovaný.

Predložený vynález sa týka spôsobu použitia fibrínového prípravku na utesňovanie, ktorý zahrňuje:

a) kontakt požadovaného miesta s prípravkom, obsahujúcim fibrín-monomér a

b) prevedenie uvedeného fibrín monoméru na fibrín polymér súbežne so stupňom kontaktu, a tak vytvorenie fibrínovej zrazeniny.

Predmet vynálezu tiež poskytuje spôsoby prípravy takéhoto prípravku a prípravkov a kitov, obsahujúcich takýto nezosieťovaný fibrín.

4.1. Prípravok obsahujúci fibrín-monomér

Fibrínový prípravok podľa predloženého vynálezu obsahujúci fibrín-monomér je prípravok, ktorý obsahuje akúkoľvek formu fibrín-monoméru, ktorá môže byť konvertovaná na fibrín-polymér. Neobmedzujúcimi príkladmi fibrín-monoméru sú fibrín I-monomér, fibrín II-monomér, des-BB-fibrín-monomér s fibrín I-monomérom ako najvýhodnejším. Samozrejme, môžu byť prítomné zmesi fibrín-monoméru. Pre účel predloženého vynálezu zahrňuje tiež fibrín-polymér akýkoľvek polymér, vznikajúci polymeráciou fibrín-monomérov. Tak konverzia fibrín I-monoméru na fibrín-polymér môže viesť k fibrín-I-polyméru zosieťovanému alebo nezosieťovanému a/alebo fibrín II-polyméru, zosieťovanému alebo nezosieťovanému, podlá toho, aké konvertujúce kroky boli vykonané.

Fibrín I-monomér je preferovaný, pretože môže oproti fibrinogénu byť lahko konvertovaný na fibrín-polymér bez využitia trombínu alebo faktoru XIII. Fibrín I-monomér môže skutočne spontánne vytvoriť fibrin-I-polymér, ktorý môže tvoriť fibrinovú zrazeninu bez ohl’adu na to, či je fibrín I-polymér zosieťovaný alebo nezosieťovaný alebo ďalej konvertovaný na fibrín II polymér. Tak, pretože formácia fibrín II-polyméru z fibrín I-monoméru je spontánna, môže byť fibrín I-polymér vytvorený bez trombínu a faktoru XIII, a sú tak vylúčené problémy spojené s hovädzím trombínom. (Malo by byť pripomenuté, že ak je fibrín

I- monomér využitý tak, že fibrín I-monomér prichádza do kontaktu s pacientovou krvou, napríklad v rane, môže pacientov trombín a faktor XIII konvertovať fibrín I-polymér na zosieťovaný fibrín

II- polymér.)

Prípravok obsahujúci nezosieťovaný fibrín je prípravok, ktorý obsahuje akúkolvek formu nezosieťovaného fibrínu. Neobmedzujúcimi príkladmi nezosieťovaného fibrínu sú nezosieťovaný fibrín I, nezosieťovaný fibrín II a des-BB-fibrín, s preferovaným nezosieťovaným fibrínom I. Samozrejme, môžu byť prítomné zmesi nezosieťovaného fibrínu. Tiež, pre účely predkladaného vynálezu, zahrňuje zosieťovaný fibrín akúkolvek formu fibrínu, vznikajúcu konverziou nezosieťovaného fibrínu na zosieťovaný fibrín. Tak napríklad môže byť zosieťovaný fibrín, vznikajúci konverziou nezosieťovaného fibrínu. I na zosieťovaný fibrín zosieťovaným fibrínom I a/alebo zosieťovaný fibrín II, podlá toho, aké boli vykonané konvertujúce kroky.

Nezosieťovaný fibrín I je preferovaný, pretože môže byť lahšie (v porovnaní s fibrinogénom) konvertovaný na zosieťovaný fibrín. Je skutočnosťou, že sa verí, že fibrín I môže formovať zosieťovaný fibrín I, ktorý môže účinkovať ako fibrínový prostriedok na zastavenie krvácania. Formácia zosieťovaného fibrínu I z nezosieťovaného fibrínu I môže byť vykonaná bez trombinu, čím sa vylúčia problémy spojené s hovädzím trombínom, i keď môže byť vyžadovaný aktivovaný faktor XIII. (Je treba poznamenať, že ak je použitý nezosieťovaný fibrín I tak, že nezosieťovaný fibrín I prichádza do kontaktu s pacientovou krvou, napríklad v rane, môžu pacientov trombín a faktor XIII konvertovať fibrín I na zosieťovaný fibrín II.)

Nezosieťovaným fibrínom môže byť tiež polymér, oligomér alebo monomér, i keď preferovaný je oligomér alebo monomér, t.j. fibrín-monomér. Toto je spôsobené skutočnosťou, že nezosieťovaný fibrín v polymérnej forme je všeobecne gel, a preto je veľmi ťažké ho doručiť na požadované miesto a poskytnúť čo najmenší tesný kontakt s bunkami na požadovanom mieste. Naopak, výsledný nezosieťovaný fibrín v oligomérnej alebo monomérnej forme je rozpustný, a preto môže byť ľahšie doručený na požadované miesto a mať tesnejší kontakt s bunkami. Samozrejme môže prípravok obsahovať takéto formy nezosieťovaného fibrínu.

Zdrojom prípravku obsahujúceho fibrín-monomér alebo nezosieťovaný fibrín môže byť akýkoľvek zdroj, ktorý je známy alebo bol vyvíjaný tak dlho, že fibrín-monomér môže byť prevedený na fibrín-polymér alebo nezosieťovaný fibrín môže byť konvertovaný na zosieťovaný fibrín. Neobmedzujúce zdroje prípravkov, obsahujúcich fibrín-monomér alebo nezosieťovaný fibrín sú krv, výhodne krv cicavcov a výhodnejšie ľudská krv, bunečné kultúry, ktoré sekretujú fibrinogén a rekombinantný fibrinogén, preferovaná je krv. Krv môže mať akúkoľvek formu krvi, zahrňujúcu napríklad celú krv, alebo pripravené fibrinogénové prípravky. Môže byť tiež použitá krv na prípravu autológneho fibrinového prípravku na zastavenie krvácania.

Bolo pozorované, že prípravok, obsahujúci nezosieťovaný fibrín I, buď ako fibrín I monomér alebo fibrín I polymér, pripravený z plnej krvi, ako je popísané ďalej, môže byť konvertovaný na zosieťovaný fibrín II bez prídavku trombínu, faktoru XIII a iných nevyhnutných substancií pre koaguláciu krvi. Predpokladá sa, že vďaka skutočnosti, že prípravok obsahujúci nezosieťovaný fibrín I pripravený z celej krvi si udržiava dostatočné množstvo protrombínu, nevyhnutných substancií z plazmy, faktoru XIII a iných takže nezosieťovaný fibrín

I môže byť prevedený na zosieťovaný fibrín II bez prídavku exogénneho trombínu a faktoru XIII. Tento endogénny protrombín a faktor XIII môžu byť využité v prípravkoch na zastavenie krvácania, obsahujúcich fibrín podľa predloženého vynálezu ako zložky prípravku, obsahujúceho fibrín monomér alebo nezosieťovaný fibrín.

Jednako však je nutné uviesť, že dostatočné množstvá tohto endogénneho trombínu a faktoru XIII nie sú zachované, takže konvertovanie fibrinogénu na zosieťovaný fibrín II pri reakčnej rýchlosti, ktorá je vhodná pre fibrínový prípravok na zastavenie krvácania. Predpokladá sa, že je požadované viac trombínu pre prevedenie fibrinogénu na zosieťovaný fibrín II ako pre prevedenie nezosieťovaného fibrínu na zosieťovaný fibrín II pri ekvivalentnej reakčnej rýchlosti.

Každý z takýchto troch zdrojov obsahuje fibrinogén, ktorý môže byť prevedený na fibrín monomér alebo nezosieťovaný fibrín. Naviac k takému konverznému stupňu výsledný prípravok, ktorý obsahuje fibrín monomér alebo nezosieťovaný fibrín musí byť v koncentrovanej forme. Je výhodné, ak nie je koncentrácia fibrín monoméru menšia ako asi 10 mg/ml, výhodnejšie asi 20 mg/ml až asi 200 mg/ml, výhodnejšie asi 20 mg/ml až asi 100 mg/ml a najvýhodnejšie asi 25 mg/ml až asi 50 mg/ml.

Ďalej je výhodné, aby fibrín monomér alebo nezosieťovaný fibrín bol nedynamický. Pre účely predloženého vynálezu nedynamický prípravok obsahujúci nezosieťovaný fibrín znamená, že nezosieťovaný fibrín v takomto prípravku sa nezosieťuje aspoň asi

1,5 minúty, výhodne aspoň asi 3 minúty a najvýhodnejšie aspoň 30 minút po príprave takéhoto prípravku. Na účely predloženého vynálezu nedynamický prípravok obsahujúci fibrín monomér znamená, že fibrín monomér v takomto prípravku nepolymeruje aspoň asi 1,5 minúty, výhodne aspoň asi 3 minúty, výhodnejšie aspoň asi 30 minút najvýhodnejšie aspoň asi 2 hodiny po príprave prípravku. V skutočnosti by malo byť uvedené, že prípravok, obsahujúci fibrín monomér, môže byť nedynamický aspoň niekolko dní, t.j. asi 72 hodín po jeho príprave.

Prípravok obsahujúci fibrín monomér alebo nezosieťovaný fibrín môže byť pripravený z krvi. Spôsob môže viesť k vodíkom viazanému fibrín polyméru, ktorý je formou nezosieťovaného fibrínu. Takýto polymér môže byť potom použitý ako zložka fibrínového prípravku na zastavenie krvácania alebo byť prevedený na fibrín monomér spôsobom označovaným ako solubilizácia, tieto spôsoby sú popísané ďalej. Je výhodné, ak je prípravok, obsahujúci fibrín monomér alebo nezosieťovaný fibrín pripravený v sterilnom prostredí.

Prípravky obsahujúce fibrín monomér alebo fibrín môžu byť pripravené z celej krvi odobraním a výhodne za prítomnosti antikoagulantu. Môže nezosieťovaný krvi od darcu byť použitý akýkoľvek antikoagulant. Neobmedzujúce príklady antikoagulantov sú heparín, EDTA, hirudín, citrát alebo akékoľvek činidlo, ktoré môže, priamo alebo nepriamo, brániť tvorbe trombínu. Výhodný je citrát.

Plazma, ktorá obsahuje fibrinogén, sa potom oddelí od celej krvi. Akékoľvek delenie je možné použiť, napríklad sedimentáciu, odstredenie alebo filtráciu. Odstredenie môže byť vykonané pri asi 3 000 g po asi 10 minút. Jednako však, ak je žiaduce získať plazmu bohatú na doštičky, môže byť odstredenie vykonané pri nižšom g, napr. 500 g po asi 20 minút. Supernatant, ktorý obsahuje plazmu, môže byť odstránený štandardnými technikami.

Filtrácia môže byť vykonaná priechodom celej krvi vhodným filtrom, ktorý oddelí krvné bunky od plazmy. Je výhodné, aby filtrom bola mikroporézna membrána, vykazujúca dobrú transmisiu proteínov.

Výsledná plazma sa potom spracuje pre prevedenie fibrinogénu na fibrín monomér alebo nezosieťovaný fibrín. Táto konverzia môže byť vykonaná akoukolvek známou technikou alebo technikou vyvinutou na tento účel.

Výhodnou technikou pre produkciu fibrín monoméru alebo nezosieťovaného fibrínu je spracovanie enzýmom podobným trombínu, ktorý obsahuje trombín. Trombínu podobný enzým je akýkolvek enzým, ktorý katalyzuje tvorbu fibrínu z fibrinogénu. Výhodne sa trombínu podobný enzým čistí z hadích jedov. V závislosti na zdroji trombín podobného enzýmu môže takýto trombínu podobný enzým uvoľňovať fibrínopeptid A - ktorý tvorí fibrín I - fibrínopeptid B - ktorý tvorí BB fibrín - alebo ako fibrínopeptid A i B, ktorý tvorí fibrín II. Je treba poznamenať, že tieto trombínu podobné enzýmy, ktoré uvoľňujú fibrínopeptid a B, môžu prebiehať rôznymi rýchlosťami. Tak by výsledný prípravok mohol byť napríklad zmesou fibrínu II a fibrínu I alebo zmesou fibrínu II a BB fibrínu.

Tabuľka 1 je neobmedzujúcim zoznamom zdrojov hadích jedov, ktoré môžu byť použité podľa vynálezu, názov trombínu podobnému enzýmu a ktorý fibrínopeptid(y) je uvoľňovaný (sú uvoľňované) spracovaním s enzýmom.

Tabuľka 1

Zdroj	Názov	Uvoľňovaný f ibrínopeptid
Agkistrodon acutus	acutin	A
A.contortrix contortrix	venzyme	B,	(A)*
A. halys Pallas		B,	(A)*
A. (Calloselasma)	ancrod, arvin	A
Bothrops asper (B.atrox)	asperase	A
B. atrox	batroxobín reptilase-činidlo	A
B. insularis		A,	B
B. jararaca	botropase	A
B. moojeni (B. atrox)	batroxobín def ibráza	A
Lachesis muta muta		A,	B
Crotalus adamanteus	crotaláza	A
C.durissus terrificus		A
Trimeresurus flavoviridis	flavoxobin	A
T. gramineus		A
Bitis gabonica	gabonáza	A,	B

* () znamená malú aktivitu

Prehľad trombínu podobných enzýmov z hadích jedov, viď H. Pirkle a K. Stocker, Thrombosis and Haemostasis, 65 (4):444-450 (1991).

Výhodné trombínu podobné enzýmy sú batroxobín, hlavne z M. Moojeni, B. Maranhao a B. atrox a Ancrod, hlavne z A. rhodostoma.

Fibrín monomér alebo nezosieťovaný fibrín môže byť pripravený kontaktom plazmy s trombínu podobným enzýmom, čo umožní, aby fibrinogén v plazme bol prevedený na fibrín monomér. Avšak výsledný fibrín monomér spontánne polyméruje na formu gélu, ktorá sa oddeľuje od zvyšného séra, ktorým je roztok. Gel je forma prípravku, obsahujúceho nezosieťovaný fibrín.

Tento nezosieťovaný fibrín gel môže byť získaný, napríklad odstredenim (3 000 g po 10 minút), priamym manuálnym oddelením nezosieťovaného fibrínu zo séra, filtráciou, priamo alebo pod tlakom s nasledujúcim odstránením oddeleného séra (1 - 100 um filter - veľkosť pórov - môže byť použitý, napríklad sintrovaný polypropylénový filter s veľkosťou pórov 20 mikrometrov od Porex, Inc., teflónový filter s veľkosťou pórov 20 až 70 mikrometrov od Fluorotechniques Inc. alebo nylonový 66 s veľkosťou pórov 22 až 46 mikrometrov od fy Costar, Inc.).

Táto metóda získania oddeľuje nezosieťovaný fibrinový gel od séra, ktorým je roztok, a tým koncentruje nezosieťovaný fibrinový gel vis-avis plazmy. Je treba uviesť, že nezosieťovaný fibrinový gel si udržiava aspoň niečo protrombínu, faktoru XIII a iných nevyhnutných substancii z plazmy, takže nezosieťovaný fibrín I môže byť prevedený na zosieťovaný fibrín II bez prídavku exogénneho trombínu alebo faktoru XIII. Tento endogénny protrombín a faktor XIII môžu byť použité vo fibrínovom prípravku na zastavenie krvácania podľa vynálezu ako zložky prípravku obsahujúceho fibrín monomér alebo nezosieťovaný fibrín.

Intenzita získavania budú z nezosieťovaného alebo tlak, tým fibrinový gel. Je tak veľké, aby sa z protrombín a faktor XIII.

odstredenia alebo tlak filtrácie determinovať, ako veľa séra fibrínového gélu s tým, že čím koncentrovanejší je však výhodné, že takáto sila alebo tlak nie sú nezosieťovaného fibrínového gélu odstránil sa priebehu odstráni vyššia sila výsledný nezosieťovaný

Nezosieťovaný fibrinový gel je ako zložka fibrínového prípravku forma prípravku, ktorý obsahuje teraz pripravený na použitie na zastavenie krvácania ako nezosieťovaný fibrín. Bolo pozorované, že ak sa takýto prípravok pripraví z celej krvi, je v prípravku prítomných asi 60 % až asi 90 % pôvodného fibrinogénu, ale samozrejme, vo forme nezosieťovaného fibrínu.

Prípravok, obsahujúci nezosieťovaný fibrín môže byť použitý bezprostredne po svojej príprave. V skutočnosti je zvlášť preferované použitie takéhoto prípravku bezprostredne po jeho príprave, ak je prípravok autológny. Ak sa prípravok nepoužije priamo po svojej príprave, môže byť prípravok skladovaný.

Skladovanie prípravku vyžaduje, aby bol prípravok chránený, napríklad zmrazením alebo udržiavaním prípravku pri 4 lyof ilizáciou ’C. Prípravok prípravku alebo v zmrazenej alebo lyofilizovanej forme bude stabilný rádovo mesiace. Ak sa prípravok udržiava pri 4 C, predpokladá sa, že prípravok bude stabilný aspoň niekoľko dní.

Ak je prípravok zmrazený, musí sa pred použitím nechať roztopiť.

Táto technika, ktorá vedie k tvorbe nezosieťovaného fibrínového gélu, konvertuje fibrinogén na nezosieťovaný fibrínový gel a koncentruje takýto gel v podstate v jednom stupni. Alternatívne a menej výhodne je možno koncentrovať fibrinogén zvyčajnými technikami, napr. kryoprecipitáciou a zrážaním za použitia rôznych činidiel, napr. polyetylénglykolu, éteru, etanolu, síranu amonného alebo glycínu. Koncentrovaný fibrinogén potom môže byť prevedený na nezosieťovaný fibrínový gel vyššie popísanými technikami alebo, výhodne, pretože je fibrinogén vždy koncentrovaný, môže potom byť fibrinogén konvertovaný na prípravok, obsahujúci fibrín monomér bez potreby najprv vytvoriť nezosieťovaný fibrínový gel. Toto je možné vykonať kontaktom koncentrovaného fibrinogénu s chaotrópnym činidlom pre získanie fibrinogénového roztoku.

Chaotrópne činidlo je nevyhnutné na chránenie fibrín monoméru, ktorý sa tvorí za kontaktu fibrinogénu s trombínu podobným enzýmom, pred spontánnou polymeráciou. Chaotrópne činidlo sa zmieša s takým fibrinogénovým prípravkom a potom sa mieša asi 1 až 2 minúty za vzniku fibrinogénového roztoku. Fibrinogén môže potom byť prevedený na fibrín monomér, napríklad, trombín podobným enzýmom, ako je popísané vyššie, alebo trombínu podobným enzýmom imobilizovaným na nosiči ako je popísané vyššie.

Vhodné chaotrópne činidlá zahrňujú močovinu, bromid sodný, hydrochlorid guanidínu, KCNS, jodid draselný a bromid draselný. Výhodná koncentrácia chaotrópneho činidla je od asi 0,2 do asi

6,0 mól a najvýhodnejšie od asi 0,3 do asi 2,0 mól. Výhodné je použitie aspoň takého množstva chaotrópneho činidla, ktoré ešte chráni fibrín monomér pred spontánnou polymeráciou.

Je treba uviesť, že je výhodné, aby k chaotrópnemu činidlu nebol pridávaný zdroj vápnikových iónov, pokiaľ prevedenie fibrín monoméru na fibrín polymér, ako je žiaduce je popísané vyššie. Toto zaistí, pôsobením aktivácie že fibrín monomér nebude zosieťovaný akýchkoľvek endogénnych faktorov pre koaguláciu krvi.

Vo výhodnom vyhotovení je trombínu podobný enzým imobilizovaný na nosiči. Takéto vyhotovenie je výhodné, pretože je možno ľahko oddeliť imobilizovaný enzým od plazmy, a tým chrániť prípravok, obsahujúci nezosieťovaný fibrín pred kontamináciou enzýmom.

V predloženom vynáleze môže byť použitý akýkoľvek nosič, ku ktorému môže byť trombínu podobný enzým pripojený. Neobmedzujúcimi príkladmi vhodných nosičov sú celulóza, polydextrány, agaróza, polystyrény, oxid kremičitý, polyakrylové kyseliny, polyakrylamidy, polyvinylalkoholy, sklenené guličky, polytetrafluóretylén, polykarbonáty, kolagén, deriváty celulózy, teflon a ich kompozity, s tým, že preferovaný je oxid kremičitý, polystyrén a agaróza a najpreferovanejšia je agaróza.

V inom preferovanom vyhotovení je trombínu podobný enzým pripojený k nosiču, ktorým je filter alebo na jednej strane filtru a pripojený k inému nosiču, napr. guličkám. Inak povedané, trombínu podobný enzým bude prechádzať filtrom. Veľkosť pórov filtrov by mala byť taká, že imobilizovaný trombínu podobný enzým nemôže prechádzať filtrom, ale nezosieťovaný fibrín môže prechádzať filtrom. Nezosieťovaný fibrín sa pripraví kontaktom plazmy s trombínu podobným enzýmom na jednej strane filtra za vzniku fibrín monoméru, ktorý spolu so filtrom. Takto sa výsledný prípravok, fibrín, nevyhnutne oddelí od trombínu zvyškom, plazmy prechádza obsahujúci nezosieťovaný podobného enzýmu. Fibrín monomér po priechode filtrom spontánne polyméruje za vzniku nezosietovaného fibrín polyméru.

Za účelom imobilizácie trombín podobného enzýmu na nosič musí byt nosič aktivovaný. Toto možno vykonať akoukoľvek vhodnou technikou. Napríklad rôznymi aktivujúcimi chemickými skupinami vhodnými pre derivatizáciu nosiča sú: diazóniové skupiny, izokyanátové skupiny, skupiny chloridov kyselín, skupiny anhydridov kyselín, sulfonylchloridové skupiny, dinitrofluórfenylové skupiny, izotiokyanátové skupiny, hydroxylové skupiny, aminoskupiny, n-hydroxysukcinimidoskupiny, triazinové skupiny, hydrazínoskupiny, karbodiimidové skupiny, silánové skupiny a brómkyan. Viď (a) Pentapharm Patent DT 2440254 A1, (b) P. D. G. Dean, W. S. Johnson a F. A. Middle (Editors) (1991) IRL Press Oxford - Affinity Chromatography - A practical approach - chapter 2 - Activation Procedures, ktoré sú tu uvedené ako referencie.

Výhodne sa aktivačná chémia vykonáva pomocou hydražidovej skupiny. Použitie hydrazidom aktivovaného nosiča vedie k maximálnemu percentuálnemu (aspoň asi 30 % až asi 50 % merané S2238 skúškou - viď Axelsson G. a spol., Thromb. Haemost., 36: 517 (1976)) udržaniu aktivity trombinu podobného enzýmu bez podstatnej straty enzýmu. Tiež môžu byť použité nízke hodnoty pH, napr. pH 4 - 6, pre kopuláciu enzýmu na zabránenie jeho degradácie.

Všeobecne je nosič aktivovaný vysoko reaktívnou zlúčeninou, ktorá postupne reaguje s funkčnou skupinou ligandu, napr. - OH, -NH, -SH, -COOH, -CHO za vzniku kovalentnej väzby. Preferovanými aktivačnými chemickými postupmi pre použitie v predloženom vynálezu sú:

a) pôsobenie triazínovej skupiny a výhodne triazinhalogenidových skupín,

b) pôsobenie trezylchloridovej skupiny,

c) pôsobenie karbonyldiimidazolovej skupiny,

d) pôsobenie brómkyanovej skupiny a

e) pôsobenie hydrazidovej alebo aminoskupiny.

V a) až d) sa proteín kopuluje reakciou s -NH₂, -SH alebo -OH skupinami, zatiaľ čo v e) sa proteín kopuluje cez oxidovanú uhľohydrátovú skupinu, t.j. -CHO. Použitie týchto chemizmov vedie u maximálnych percent (aspoň asi 30 % až asi 50 % merané podľa S2238 skúšky) trombínu podobného enzýmu k zadržaniu jeho aktivity v podstate so žiadnou stratou enzýmu.

Pre triazínovú aktiváciu sa používajú dve rôzne metódy. Prvá spojenie triazínového kruhu

Toto je povrchovo aktivácie metóda zahrňuje OH skupinám, metódy, kde U triazínovej (kyanurchlorid).

podobné ako dialové reagujú u CNBr skupiny

OH priamo k povrchovým aktivačnej použitej reagujú s CNBr.

skupiny s triazínom

Všeobecne sa nosič aktivuje vysoko reaktívnou zlúčeninou, ktorá postupne reaguje s funkčnou skupinou ligandu, napr. -OH, -NH₂, -SH, -CHO za vzniku kovalentnej väzby. Zvyšné aktívne zlúčeniny, ktoré nie sú spojené s trombínu podobným enzýmom, môžu byť, čo nie je ale podstatné, blokované nereaktivnymi zlúčeninami ako je etanolamín, acetanhydrid alebo glycín.

Preferovanými aktivačnými chemizmami pre použitie v predloženom vynáleze sú:

a) aktivácia brómkyanom s nasledujúcim priamym spojením enzýmu cez -NH₂ skupiny proteínu.

b) Aktivácia nosiča monochlórtriazínom s nasledujúcim spojením s enzýmom cez -NH₂, -OH alebo -SH skupiny.

c) Aktivácia nosiča dichlórtriazínom s nasledujúcim napojením enzýmu cez -NH₂, -OH alebo -SH skupiny.

d) Trezylchloridová aktivácia nosiča s nasledujúcim napojením enzýmu cez ^-NH₂, -OH alebo -SH.

e) Aktivácia nosiča hydrazidom adipovej kyseliny alebo hydrazínom s nasledujúcim napojením oxidovaného enzýmu cez -CHO skupiny.

f) Aktivácia nosiča aminoligandon s nasledujúcim napojením oxidovaného enzýmu cez -CHO skupiny.

Všetky vyššie uvedené metódy využívajú agarózu ako nosič, jednako však je možné použiť oxid kremičitý. Ak sa použije tento nosič, sú výhodné chemické aktivácie nasledujúce:

a) gama-glycidyloxypropyltrimetoxysilánová aktivácia s priamym napojením trombínu podobného enzýmu cez -NH₂ skupiny proteínu.

b) Brómkyanová aktivácia s nasledujúcim priamym napojením enzýmu cez -NH₂ skupiny proteínu.

c) Gama-glycidyloxytrimetoxysilánová aktivácia s nasledujúcim otvorením epoxidového kruhu za vzniku diolovej skupiny, ktorá môže ďalej byť aktivovaná brómkyánom. Priame napojenie enzýmu môže byť dosiahnuté cez -NH₂ skupiny proteínu.

d) Gamaglycidoxypropyltrimetoxysilánov aktivácia s nasledujúcou prípravou amino-oxidu kremičitého spracovaním s roztokom amoniaku.

Amino-oxid kremičitý môže byť ďalej aktivovaný chlórkyanom (triazín) a enzým môže byť napojený cez -NH₂, -OH alebo -SH skupiny.

Napojenie enzýmu k aktivovanému nosiču musí byť pufrované na určité pH kvôli dosiahnutiu optimálneho naviazania enzýmu. Všeobecne štandardné aktivačné techniky ako je gama-glycidoxypropyltrimetoxysilánová kopulácia enzýmu k aktivovanému nosiču a brómkyanová kopulácia akéhokoľvek proteínu k aktívnym skupinám vyžaduje pufrovanie na pH o 1 - 2 jednotky vyšie ako je pKa primárnych a sekundárnych amínov enzýmu. Jednako však použitie chlórkyanu ako aktivátoru umožňuje použitie oveľa nižších pH pufrov (optimálna pH kopulácia je 4 -6). Iná metóda kopulácie glykoproteinov ako je batroxobín k inertnému nosiču je cez jeho uhľohydrátové skupiny. Toto zahrňuje najprv oxidáciu cukrovej skupiny na -CHO skupiny s nasledujúcim priamym napojením pri kyslom pH k aminoskupine ako je hydrazid. Široký rozsah kopulačných pufrov je možné použiť. Viď napr. tabuľka 2.

Tabulka 2 Príklady kopulačných pufrov použitých v imobilizácii enzýmu na nosiče - oxid kremičitý a agarózu

Nosič	Aktivačná metóda	Kopulačný pufor
oxid kremičitý	gama-glycidoxypropy1trimetoxysilán	0,1 M hydrogénuhličitan pH 8-9 10 mM HEPES pH 7,0
oxid kremičitý	..-glycidoxypropyltrimetoxysilán + brómkyan	0,1 M hydrogénuhličitan sodný pH 8-9, 10 mM HEPES pH 7,0
oxid kremičitý	brómkyan	voda pH 7,0 0,1 M hydrogénuhličitan sodný pH 7-9 10 mM HEPES pH 7,0
agaróza	monochlórtriazín	50 mM octan sodný/ 1 MNaCl pH 4,0
agaróza	dichlórtriazín	0,1 M fosforečnan draselný/1 MNaCl pH 8,0-9,0
agaróza	trezylchlorid	50 mM fosforečnan draselný/0,5 MNaCl PH 7,7
agaróza	hydrazid	50 mM octan sodný pH 5,5 10 mM NaBH4
agaróza	amín	50 mM octan sodný pH 5,5 10 mM NaBH4

Po aktivácii bude nosič vykazovať viac aktívnych miest ako je požadované pre kopuláciu enzýmu. Tieto miesta pokial nie sú deaktivované, môžu kovalentne viazať kontaminujúce proteíny, ktoré by mohli ovplyvňovať biologickú funkciu imobilizovaného enzýmu.

Prebytok skupín môže byť deaktivovaný kovalentným napojením malých, neintereferujúcich amínov ako je etanolamín.

Ak sa použijú hydrazidom alebo aminoaktivované nosiče, blokovanie zvyškových reaktívnych skupín s nasledujúcim naviazaním enzýmu môže byť dosiahnuté použitím acetanhydridu.

V závislosti na k inaktivácii enzýmu v oxidu kremičitého ako metóde imobilizácie a nosiči dochádza priebehu imobilizačného procesu. Použitím nosiča a najžiadanejšej aktivácie (napr.

brómkyanom) stráca enzým až 80 - 90 % aktivity. Jednako však použitie agarózy ako nosiča s aktiváciou chlórkyanom vedie k menšej strate enzýmovej aktivity.

Pre charakterizáciu účinnosti imobilizovaného enzýmu na nosiči môžu byť použité dve metódy pre vyhodnotenie množstva aktívneho enzýmu imobilizovaného na nosiči; dobci tvorby zrazeniny - Clot Tíme Assay - Clauss A., Acta Haematol., 17:237 (1957) a S2238 Assay - viď Axelsson G. a spol., Thromb. Haemost., 36: 517 (1976).

Na stanovenie vylúhovania enzýmu z nosiča môžu byť použité nasledovné metódy.

Vylúhovanie môže byť skúšané rádioaktívnym značením trombínu I¹²⁵ batroxobínu.

j e nevyhnutné značené látky.

ml 50 mM podobného enzýmu napr., tejto skúšky vylúhovania nenaviazané rádioaktívne postupným premytím nosiča

Avšak pred odstrániť vykonaním akékoľvek dosiahne

Tohto sa octanu sodného pH 5,5,

100 ml 50 mM glycin/ΙΜ chloridu sodného pH 3,0, 100 ml 50 mM uhličitanu sodného/ΙΜ chloridu sodného pH 10,0, 100 ml 50 mM fosforečnanu sodného/ΙΜ chloridu sodného pH 7,0, 100 ml vody a 100 ml 50 mM fosforečnanu sodného/l M chloridu sodného pH 7,0.

Po takomto premývacom postupe nebolo detegované rádioaktívne značenie v premývacich kvapalinách, s > 50% počiatočného rádioaktívne značeného enzýmu pripojeného k nosiču.

a) Požadované množstvo enzýmu

Množstvo enzýmu požadované pre spracovanie 30 - 70 ml plazmy (získanej z 60 - 150 ml celej krvi) je 30 - 200 jednotiek po asi až 15 minútach miešania.

Ak sa použije ako nosičová matrica 30 - 200 j. batroxobínu, vedie k tvorbe nezosietovaného fibrínu po asi 7 - 20 minútach. Tento systém využíva hydrazidovú aktiváciu a 0,25 g - 1,0 g suchej agarózy. V tomto prípade nie je vyžadované žiadne blokovanie zvyšných aktívnych skupín.

b) Reakcia imobilizovaného enzýmu s plazmovým fibrinogénom

Všeobecne sa reakcia imobilizovaného enzýmu s fibrinogénom v plazme vykonáva nasledovne: približne 30 - 70 ml plazmy sa pridá k známemu množstvu suchého nosiča, ktorý obsahuje imobilizovaný trombínu podobný enzým. Suspenzia sa šetrne mieša (otáčanie na špirálovom mixéri alebo ručným miešaním) približne

7-20 minút. V priebehu tejto doby sa fibrinogén v plazme štiepi imobilizovaným enzýmom za uvol’nenia fibrínopeptidu A a/alebo fibrínogénu B, čo vedie k tvorbe vodíkom naviazaného fibrín I polyméru, vodíkom naviazaného BB fibrín polyméru alebo vodíkom naviazaného fibrín II polyméru, kde každý polymér je spojený s imobilizovaným enzýmom.

Ako je popísané vyššie, vodíkom naviazaný fibrín polymér je vo forme gélu a môže byt získaný napríklad odstredením (3 000 g po 10 minút) alebo filtráciou (cez 1 - 540 mikrometrový membránový filter). Takéto získavanie oddeluje vodíkom naviazaný fibrín polymér zo séra, a tým koncentruje polymér.

Je treba uviest, že ak sa použije trombínu podobný enzým v plazme, vedie k aktivácii faktoru XIII a potom je preferované, aby plazmový prípravok bol modifikovaný v dobe, kedy sa použije trombínu podobný enzým tak, aby sa zabránilo nezosietovanému fibrínu, napr. nezosietovaného fibrínu I alebo II, v tvorbe zosietovaného fibrínu, napr. zosietovaného fibrínu I alebo II. Samozrejme, môže byt nevyhnutné modifikovat plazmový prípravok, ak sa taký prípravok použije ako fibrinové činidlo pre zastavenie krvácania ihneď potom, kedy fibrinogén bol konvertovaný na

2ί nezosieťovaný fibrín.

Plazmový prípravok môže byť modifikovaný, aby sa zabránilo zosieťovaniu nezosieťovaného fibrínu technikami, ktoré sú v odbore známe alebo blokovaním endogénneho XIII, napr. inhibítory boli vyvinuté. Je to možné vykonať trombínu, ktorý môže aktivovať faktor hirudínu alebo trombínu alebo blokovať aktivovaný faktor XIII, napr. pôsobením ťažkých kovov (Hg), tiomérozalom alebo inhibičnými protilátkami. Zosieťovanie fibrínu I alebo II vyžaduje prítomnosť iónov vápnika. Ak je vápnik odstránený z plazmového prípravku, môže byť inhibované zosieťovanie fibrínu I alebo II. Viď Carr a spol., J. Biochem., 239: 513 (1986), Kaminski a spol., J. Biol. Chem. 258: 10530 (1983) a Kanaide a spol., 13: 229 (1982). Do prípravku môžu byť pridané vápnikové chelátory na zabránenie zosieťovania fibrínu

I alebo II. Takéto chelátory sa viažu k vápniku, čím zabraňujú zosieťovaniu. Môže byť použitý akýkoľvek vápnikový chelátor.

Neobmedzujúce príklady vápnikových chelátorov zahrňujú kyselinu citrónovú, kyselinu cukrovú, kyselinu etyléndiamintetraoctovú (EDTA), kyselinu nitriltriooctovú (NTA), hydroxyetyléndiamíntriooctovú kyselinu (HEEDTA), etyléndiamindi-(o-hydroxyfenyloctovú kyselinu) (EDDHA), etylénglykolbis (2-amínoetyléter)tetraoctovú kyselinu (EGTA), dietyléntriamínpentaoctovú kyselinu (DTPA), 1,2-diaminocyklohexántetraoctovú kyselinu (DCTA), Ν,Ν-bishydroxyetylglycín, 4-(2-hydroetylJ-l-piperazín-etán-sulfónovú kyselinu (HEPES) a N-hydroxyetyliminodioctovú kyselinu (HIMDA) a ich soli; preferované sú soli kyseliny citrónovej.

V predloženom vynáleze môže byť použitá akákoľvek bunečná kultúra, ktorá sekretuje fibrinogén. Fibrinogén v bunečnej kultúre môže byť nezosieťovaný fibrín vzhľadom k plazme.

konvertovaný na rovnakými technikami Jednako však pred fibrín monomér alebo ako sú popísané vyššie takouto konverziou je výhodné, aby boli odstránené bunečné zlomky.

Spôsob môže byť vykonaný nasledovne: HEPG2 bunky sú kultivované a udržiavané ako je popísané v štandardných textoch pre kultúru buniek cicavcov. Tiež viď Liu a spol., Cytotechnology, 5: 129-139 (1991). Bunky sú vysiate do baniek pri pomere medzi 1 4 až 1 : 8 v Minimal Essential Médium, obsahujúcom 10 % teľacieho séra a pufrovanom 5 % C0₂·

Po 24 až 36 hod. rastu pri 37 °C sa médium odstráni a nahradí sa séra zbaveným médiom, obsahujúcim vodný inhibitor proteázy a 2 m.j./ml heparínu. V kultivácii sa pokračuje po ďalších 24 hodín s troma následnými zmenami séra zbaveného média.

Kondicionované médium sa odstreďuje pri 3 000 g 10 minút kvôli odstráneniu akýchkoľvek bunečných zlomkov a vyčírený supernatant, ktorý obsahuje fibrinogén, sa potom opatrne mieša s trombínu podobným enzýmom 4 - 5 hodín. Výhodne je trombínu podobný enzým imobilizovaný. Je vhodný pomer asi 1,0 ml k asi 50 ml, usadeného objemu agaróza - trombín podobného enzýmu na 500 ml média. Ako je popísané vyššie, môžu byť použité nosiče iné ako agaróza. Výsledný fibrín monomér spontánne polyméruje a zachytáva sa okolo imobilného nosiča.

Supernatant, ktorý teraz neobsahuje žiaden fibrinogén, sa zleje z gélu nosič/fibrin, ktorý sa potom premyje postupne štyrmi zmenami NaCl - 0,15 M v pomere od asi 10 ml k asi 100 ml na 1,0 ml pôvodného usadeného objemu nosiča. Premytý gel sa potom semi-hydratuje za použitia nálevky so skleneným sintrom za vákua.

Použitia bunečných kultúr, ktoré môžu sekretovať fibrinogén, sú zvlášť preferované, ak sa použije prípravok, obsahujúci fibrín monomér. Očakáva sa totiž, že takýto prípravok môže byť použitý na tvorbu fibrín polyméru, ktorý je vhodný ako prípravok na zastavenie krvácania, obsahujúci fibrín, fibrínový polymér nakoniec zosieťuje. I kultúra neobsahuje faktor XIII, ktorý zosieťovanie, nie je nutné pridávať žiaden napriek tomu, že keď takáto bunečná je podstatný pre exogénny faktor XIII na prípravu účinného fibrínového prípravku na zastavenie krvácania.

Nezosieťovaný fibrínový prípravok môže byť tiež pripravený z rekombinantného fibrinogénu. V poslednej dobe bol fibrinogén vyrobený technikami rekombinantnej DNA. Viď S. Roy a spol., The Journal of Biological Chemistry, 266: 4758-4763 (1991), ktorých obsahy sú tu uvedené ako referencie. Roy a spol. sa zdajú byť prvou skupinou na expresiu všetkých troch reťazcov fibrinogénu a uvádzajú, že COS bunky exprimujú, zostavujú a sekretujú reťazce vo forme, ktorá je schopná tvorby trombínom indukovanej zrazeniny. Výsledný fibrinogénový prípravok potom môže byť použitý na produkciu prípravku obsahujúceho fibrín monomér alebo nezosieťovaný fibrín rovnakými technikami, ako sú popísané tu vyššie vzhľadom k bunečným kultúram, ktoré sekretujú fibrinogén. Jednako však je výhodné, že pred tvorbou prípravku, obsahujúceho fibrín monomér alebo nezosieťovaný fibrín sa bunečné zlomky odstránia rovnakými technikami ako sú popísané vyššie u bunečných kultúr. Bunečné zlomky môžu byť odstránené odstredením alebo filtráciou.

Použitie rekombinantného fibrinogénu je zvlášť preferované, ak sa použije prípravok, obsahujúci fibrín monomér. Je to preto, že sa predpokladá, že takýto prípravok bude použitý na prípravu fibrín polyméru, ktorý je použiteľný ako fibrínový prípravok na zastavenie krvácania, napriek tomu, že fibrín polymér nakoniec zosieťuje. I keď rekombinantná fibrinogénová bunečná kultúra neobsahuje faktor XIII, ktorý je podstatný pre zosieťovanie, nie je nutné pridávať žiaden exogénny faktor XIII na prípravu účinného fibrínového prípravku na zastavenie krvácania.

Konverzia fibrinogénu na nezosieťovaný fibrín, napríklad trombín podobným enzýmom, vedie k tvorbe fibrínu vo forme fibrín vodíkom naviazaného polyméru. Jednako však ako bolo uvedené vyššie, je výhodné, že prípravok, obsahujúci nezosieťovaný fibrín, a to je podstatné pre prípravok, obsahujúci fibrín monomér, je v oligomérnej alebo monomérnej forme. Toto môže byť vykonané solubilizáciou prípravku, obsahujúceho nezosieťovaný fibrín.

Solubilizácia sa hlavne vykonáva, ak sa nezosieťovaný fibrín vytvára pomocou trombínu podobného enzýmu, ktorý je imobilizovaný na nosiči. Toto je spôsobené skutočnosťou, že použitie trombínu podobnému enzýmu imobilizovaného na nosiči všeobecne vedie k nezosieťovanému fibrínovému vodíkom viazanému polyméru, ktorý je spojený s takým imobilizovaným enzýmom. Pretože je výhodné, aby nosič nebol obsiahnutý vo výslednom prípravku, vykonáva sa solubilizácia tiež na odstránenie nosiča z prípravku, obsahujúceho nezosieťovaný fibrín, spolu s imobilizovaným enzýmom.

Solubilizácia môže byť vykonaná akoukolvek. technikou, ktorá je známa alebo bola vyvinutá, ktorá vedie k fibrínovému monoméru. Solubilizácia môže byť vykonaná kontaktom prípravku, obsahujúceho nezosieťovaný fibrín s vhodným roztokom kyslého pufra, výhodne kyslého pufra, majúceho pH menšie ako asi 5 a výhodne od asi 1 do asi 5. Neobmedzujúce príklady vhodných kyslých pufrovacích roztokov zahrňujú kyselinu octovú, kyselinu jantárovú, kyselinu glukurónovú, kyselinu cysteinovú, kyselinu krotónovú, kyselinu itakonovú, kyselinu glutamovú, kyselinu mravenčiu, kyselinu aspartovú, kyselinu adipovú a ich soli a preferované sú kyselina jantárová, kyselina aspartová, kyselina adipová a soli kyseliny octovej a najpreferovanejši je octan sodný. Bolo pozorované, že výhodné kyslé pufry pôsobia oveľa účinnejšie ako ostatné kyslé pufry, ktoré boli testované.

Výhodná koncentrácia kyslého pufra je od asi 0,021 M do asi 1 M a najvýhodnejšie je od asi O,1M do asi 0,3 M. Takáto výhodná koncentrácia udeluje prípravku iónovú silu a robí ho viac biologicky kompatibilným.

Je výhodné použiť aspoň taký objem kyslého pufra, ktorý ešte umožňuje solubilizovať nezosieťovaný fibrín za vzniku vodného roztoku, obsahujúceho fibrín monomér. Toto vedie k vodnému roztoku, obsahujúcemu fibrín monomér ktorý je vysoko koncentrovaný vo fibrín monoméri. Všeobecne je vyžadované asi 1 ml až asi 4 ml kyslého pufra na asi 1 ml prípravku, obsahujúceho nezosieťovaný fibrín.

Kyslý pufor sa zmieša s nezosieťovaným fibrínom a potom sa intenzívne mieša asi 1 až 2 minúty až do úplnej solubilizácie.

Solubilizácia sa môže tiež vykonávať pri neutrálnom pH pomocou chaotrópneho činidla. Vhodné chaotrópne činidlá zahrňujú močovinu, bromid sodný, hydrochlorid guanidínu, KCNS, jodid draselný a bromid draselný. Výhodná koncentrácia chaotrópneho činidla je od asi 0,2 do asi 6,0 mól a najvýhodnejšie od asi 3,5 do asi 5,0 mól.

Ako u kyslého pufra je výhodné použiť aspoň, také množstvo chaotrópneho činidla, ktoré ešte umožňuje solubilizáciu nezosieťovaného fibrínu. Všeobecne je vyžadované od asi 1,0 ml do asi 1,5 ml chaotrópneho činidla na asi 1 ml prípravku, obsahujúceho nezosieťovaný fibrín.

Chaotrópne činidlo sa zmieša s takým prípravkom a potom sa intenzívne mieša asi 1 až 2 minúty do úplnej solubilizácie.

V súlade s tým solubilizácia vedie k prípravku, obsahujúcemu fibrín monomér a hlavne vodný roztok, obsahujúci fibrín monomér. Výhodné je, aby koncentrácia fibrín monoméru vo vodnom roztoku nebola menšia ako asi 10 mg/ml, výhodnejšie asi 20 mg/ml až asi 200 mg/ml a ešte výhodnejšie asi 20 mg/ml až asi 100 mg/ml a najvýhodnejšie asi 25 mg/ml až asi 50 mg/ml.

Ak sa použije trombínu podobný enzým imobilizovaný na nosiči, dochádza k tomu, že tento enzým je prítomný v prípravku, obsahujúcom nezosieťovaný fibrín a po solubilizácii môže byť imobilizovaný enzým odstránený z prípravku, obsahujúceho fibrín monomér. Toto môže byť vykonané napríklad filtráciou cez akýkoľvek vhodný filter, ktorý môže oddeľovať enzým. Vhodné filtre zahrňujú sintrovaný polypropylénový filter s veľkosťou pórov 20 mikrometrov od Porex Inc., teflónový filter s veľkosťou pórov 20 - 70 mikrometrov od Fluortechniques, Inc. alebo nylonový filter s velkosťou pórov 22 - 46 mikrometrov (nylon 66) od Costar, Inc.

Alternatívna metóda pre zaručenie, že žiaden trombinu podobný enzým, napr. batroxobín, nie je prítomný v prípravku, obsahujúcom fibrín mononér, je použitie rozpustného trombinu podobnému enzýmu v systéme a odstránenie enzýmu nasledujúcou solubilizáciou ' fibrínového vodíkom viazaného polyméru. Odstránenie enzýmu môže byt dosiahnuté použitím afinitnej matrice, napr. ligandovej väzby na inertný nosič, ktorý má špecifickú afinitu pre trombinu podobný enzým alebo iónovýmennú alebo hydrofóbnu interakciu umožňujúci nosič alebo najúčinnejšie použitím systému avidín - biotín. Interakcií! biotín - avidín vykazuje jednu z najsilnejších nekovalentných väzobných konštánt (K_Di_S = 10“¹⁵ M) známych v prírode. Vid’ E. A. Bayer a M. Wilchek, Methods of Biochemical Analysiš, 26: 1 (1980).

V tomto procese je biotín kovalentne naviazaný napríklad k batroxobínu a konjugát biotín - batroxobín (ktorý je rozpustný) priamo reaguje s plazmou, napr. 10 BU plus 50 ml plazmy reaguje pri 37 C 10 minút. Produkovaný fibrín I polymér sa získa odstredením alebo filtráciou a resolubilizuje približne 4 ml 0,2 M octanu sodného pH 4,0 obsahujúceho 30 mM chloridu vápenatého. K roztoku fibrínu I sa pridá molárny prebytok avidínu kopulovaného k inertnému nosiču ako je agaróza. Komplex agaróza : avidín : biotín : batroxobín sa potom oddelí od fibrínu I odstredením alebo filtráciou za vzniku prípravku obsahujúceho fibrín monomér, ktorý je v podstate zbavený batroxobínu, ktorý môže byt repolymerovaný, ako je popísané ďalej za vzniku fibrínového utesňovacieho prípravku.

V súlade s tým je prípravok obsahujúci fibrín monomér v podstate zbavený trombinu podobnému enzýmu. Takýto prípravok obsahuje menej ako asi 5 %, výhodne menej ako asi 2 % a najvýhodnejšie menej ako asi 1 % trombinu podobnému enzýmu použitého pre prevedenie fibrinogénu na fibrín monomér alebo nezosieťovaný fibrín. Samozrejme je výhodné, že v takomto prípravku nie je prítomný žiaden trombínu podobný enzým.

Prípravok, obsahujúci fibrín monomér, je teraz pripravený na použitie ako zložka fibrínového prípravku pre utesňovanie. Bolo pozorované, že ak sa takýto prípravok pripraví z celej krvi, je v prípravku prítomné od asi 60 % do asi 90 % pôvodného fibrinogénu, ale samozrejme, vo forme fibrín monoméru.

V súlade s tým, v jednom vyhotovení predloženého vynálezu je prípravok, obsahujúci fibrín monomér v podstate zbavený trombínu podobného enzýmu. V podstate zbavený znamená, že buď bol odstránený všetok trombínu podobný enzým, alebo že akýkoľvek trombínu podobný enzým zostávajúci v prípravku je v koncentráciách nedostatočných pre poskytnutie akéhokoľvek nežiaduceho farmakologického účinku. Prípravky podľa vynálezu, u ktorých je žiaduce, aby boli v podstate zbavené, môžu obsahovať trombínu podobný enzým v množstve medzi asi nula a 10 percentami pôvodného enzýmu a výhodne medzi asi nula a 2 percentami trombínu podobného enzýmu použitého pri príprave prípravku, obsahujúceho fibrínový monomér.

I keď tieto vyhotovenia popisujú prípravky, kde bol trombínu podobný enzým odstránený po požadovanej konverzii na rozpustný fibrín, prípravky, ktoré si udržiavajú väčšinu alebo všetok trombínu podobný enzým sú tiež pokladané za použiteľné a tvoria preto súčasť predloženého vynálezu.

Prípravok obsahujúci fibrín monomér môže byť použitý ihneď potom, čo bol pripravený. V skutočnosti je zvlášť výhodné použitie takéhoto prípravku ihneď potom, čo bol pripravený, ak je prípravok autológny. Ak sa prípravok- nepoužije ihneď po jeho príprave, môže byť skladovaný. Skladovanie prípravku vyžaduje, aby bol prípravok chránený, napríklad zmrazením alebo lyofilizáciou prípravku alebo jeho udržiavaním pri 4 ’C. Predpokladá sa, že prípravok v zmrazenej alebo lyofilizovanej forme bude stabilný rádovo mesiace. Ak sa prípravok udržiava na 4 ’C, predpokladá sa, že prípravok je stabilný aspoň rádovo niekoľko dní.

Ak sa prípravok zmrazí, musí sa v dobe použitia nechať roztopiť. Ak sa prípravok lyofilizuje, je v dobe použitia výhodné, aby bol prípravok rekonštituovaný prídavkom rovnakého kyslého pufra, ktorý bol použitý v solubilizačnom stupni, ak bola kyselina prchavá, napr. kyselina octová, alebo ak bolo použité chaotrópne činidlo, prídavkom destilovanej vody. Ako v stupni solubilizácie malo by pri rekonštitúcii byť použité aspoň také množstvo kyslého pufrovacieho roztoku alebo destilovanej vody, ktoré ešte stačí na to, aby fibrín monomér bol rozpustný. V skutočnosti môže rekonštituovanie lyofilizovaného prípravku obsahujúceho fibrín monomér viesť k vodnému roztoku, obsahujúcemu fibrín monomér, kde koncentrácia takéhoto monoméru je až 200 mg/ml. Pred lyofilizáciou môže byť pridané bobtnajúce činidlo, napr. mannitol alebo laktóza, k prípravku. Alternatívne môže byť lyofilizovaný prípravok použitý v lyofilizovanej forme. Takáto forma je zvlášť preferovaná, ak je žiaduce pridať prísady, napr. antibiotiká, k prípravku.

Prípravok, obsahujúci fibrín monomér, môže byť vlastne v akejkoľvek forme, napríklad roztoku, suspenzie, emulzie alebo byť pevný, preferovaný je roztok. Napríklad takýmto prípravkom môže byť kvapalina, gel, pasta alebo masť. Tiež môže byť prípravok napríklad vo forme granulí napríklad lyofilizovaného fibrín monoméru, ktorý môže byť, ale nemusí byť spracovaný vo forme roztoku, emulzie alebo suspenzie bezprostredne pred použitím.

Akékoľvek vhodné rozpúšťadlo môže byť použité na prípravu roztoku, ale je samozrejme preferované, aby rozpúšťadlo bolo netoxické. Neobmedzujúce príklady rozpúšťadiel zahrňujú vodu, etylalkohol, glycerol a propylénglykol, kde najviac je preferovaná voda.

Príkladom suspenzie je, že prípravok, obsahujúci fibrín monomér môže byť zmiešaný s organickými rozpúšťadlami, napr.

etanolom, na konečnú koncentráciu etanolu nad. 3,0 M a trepaný. Fibrín monomér sa bude zrážať a môže byť odstránený odstredením. Zrazenina by mala byť premytá organickou fázou na odstránenie vodného roztoku použitého v solubilizačnom stupni. Etanolická suspenzia monomérneho fibrínu potom môže byť aplikovaná priamo na obväz alebo iný nosič alebo i aplikovaná priamo na miesto rany. Organická fáza sa nechá odpariť. V prípade obväzu alebo iného nosiča môže byť suspenzia rehydratovaná aplikácie alebo niektorým iným spôsobom polymerovať.

Alternatívne, organická suspenzia kontaktom a fibrín s miestom ponechaný fibrín monomérov pripravená vo vysoko prchavej fáze, napr. dietyléteru, môže byť atomizovaná a doručená ako sprejová suspenzia na požadované miesto. Je výhodné, ak je prchavá fáza nehorlavá. Je možné, aby organická suspenzia fibrín monoméru bola doručená do nosa, ucha, krku alebo plúc postrekom alebo vdychovaním alebo byť doručená na uzavretie oezofágovej alebo gastrickej lezie injekciou.

Fibrínový prípravok na utesňovanie podlá predloženého vynálezu sa používa kontaktom požadovaného miesta s prípravkom obsahujúcim fibrín monomér alebo nezosieťovaný fibrín a prevedením fibrín monoméru na fibrín polymér alebo nezosieťovaného fibrínu na zosieťovaný fibrín súčasne s uvedeným stupňom kontaktu, čím sa vytvorí fibrínová zrazenina.

Na účely predloženého vynálezu je požadované miesto miesto, kde je treba vytvoriť fibrínovú zrazeninu, čo alebo kde je požadované miesto, to závisí na použití fibrínového prípravku na utesňovanie podlá predloženého vynálezu. Tiež by malo byť uvedené, že sa predpokladá, že fibrínový prípravok na utesňovanie môže byť použitý nielen u ludí, ale tiež u iných cicavcov. Tiež, ak je zdrojom fibrínového prípravku na utesňovanie, potom je výhodné, ale nie je to nevyhnutné, že krv by mala byť získaná od rovnakých druhov, pre ktoré bude použitý fibrínový prípravok na zastavenie krvácania.

Fibrínový prípravok na utesňovanie môže byť použitý pre akékoľvek použitie, ktoré je známe alebo byť vyvinuté pre fibrínový prípravok na utesňovanie. Metódy, kity alebo fibrinové prípravky na utesňovanie podľa predloženého vynálezu môžu byť použité na spojenie tkanív alebo orgánov, zastavenie krvácania, hojenie rán, utesnenie chirurgických rán, použité v cievnej chirurgii zahrňujúcej poskytnutie hemostázie pre krvácajúce otvory stehov pri distálnej koronárnej arteriárnej anastomózii, šitie ľavého ventrikula, miestach aortotómie a kanylácie, difúznom epimyokardiálnom krvácaní viditeľnom pri reoperáciách a presakovaní pri venóznom krvácaní, napr. atriálne, kaválne alebo na úrovni pravého ventrikula. Predložený vynález je tiež arteriálnych implantátov pred mimo telo, pre produkciu kultúr, ukončenie krvácania pečene a iných a bronchiálnych pľúc, utesnenie a ezofageálnych a embolizáciu vo pečeňových AVM, pumping vhodný na utesnenie dakronových implantáciou, utesnenia tkanív fibrínových plstí z bunečných z poškodených slezín (čím sa chráni orgán), parenchymatóznych orgánov, utesnenie tracheálnych anastomóz a vzdušných únikov alebo bronchiálnych výbežkov, fistulí, pre vaskulárnej rádiológii angiodysplézie kolóny krvácania po peptickom použiteľný pre transplantátoch, krvácaní zubov a iné aplikácie. Viď G.

Surgery, 294-304, september/október utesňovadlo indivíduá s únikov alebo lacerácií bronchiálnych fistulí bezošvé šitie (zipper technika) intracerebrálnych AVM, ezofageálnych varixoch, pumping GI vrede atď. Predložený vynález je ďalej poskytnutie hemostázy v rohovkových z nosa, po tonzilektómii, extrakciách F. Gestring a R.

294-304, september/október 1983. podľa predloženého vynálezu je koagulačnými defektmi.

Lermer, Vasculary Tiež fibrinové zvlášť vhodné pre

Dávka prípravku, jednotlivom prípravku, obsahujúceho fibrín monomér alebo obsahujúceho nezosieťovaný fibrín závisí na použití fibrínového utesňovadla, ale dávka by mala predstavovať účinné množstvo pre zamýšľané použite. Všeobecne u prípravkov, obsahujúcich fibrín monomér, ktorý je vo vodnom roztoku, sa predpokladá, že asi 3 ml až asi 5 ml takéhoto prípravku dostačuje, aby bolo fibrinové utesňovadlo účinné.

Jednako však v závislosti na použití prípravku sa dávka môže meniť od asi 0,05 ml do asi 40 ml. Tiež, ak sa použije prípravok obsahujúci nezosieťovaný fibrín v polymérnej forme alebo je prípravok v pevnej forme, potom by prípravok mal obsahovať také množstvo fibrínu ako je vo vodnom roztoku.

Na účely predloženého vynálezu fibrín monoméru na fibrín polymér alebo nezosieťovaného fibrínu na zosieťovaný fibrín súčasne s uvedeným stupňom kontaktu znamená, že takýto stupeň konverzie a stupeň kontaktu prebiehajú v dobe každého stupňa tak, že sa vytvorí fibrínová zrazenina na požadovanom mieste. Súčasne môže znamenať, že po stupni kontaktu sa fibrínový monomér prevedie na fibrínový polymér alebo sa nezosieťovaný fibrín prevedie na zosieťovaný fibrín. Toto sa prevedie kontaktom prípravku, obsahujúceho fibrínový monomér alebo nezosieťovaný fibrín, potom, ked takýto prípravok bol aplikovaný na požadované miesto, s prípravkom, ktorý môže konvertovať fibrínový monomér na fibrínový polymér alebo nezosieťovaný fibrín na zosieťovaný fibrín. Konverzný stupeň by mal všeobecne nastať asi v 0,5 minúte po stupni kontaktu. Inak prípravok, obsahujúci fibrín monomér alebo nezosieťovaný fibrín, hlavne ak je nezosieťovaným fibrínom fibrínový monomér, môže odtekať preč z požadovaného miesta.

Súčasne môže tiež znamenať, že stupeň kontaktu a stupeň vyhotovenia pôsobí simultánne. Toto sa vykonáva kontaktom požadovaného miesta s prípravkom, obsahujúcim fibrínový monomér alebo nezosieťovaný fibrín v rovnakej dobe, ked je prípravok kontaktovaný s prípravkom, ktorý môže konvertovať fibrín monomér na fibrín polymér alebo nezosieťovaný fibrín na zosieťovaný fibrín.

Nakoniec a výhodne súčasne môže tiež znamenať, že konverzný stupeň môže tiež nastať pred stupňom kontaktu, i keď nie príliš dlho pred stupňom kontaktu, aby všetok fibrínový monomér bol konvertovaný na zosieťovaný fibrín. Inak povedané, všetok fibrínový monomér bude konvertovaný na fibrínový polymér alebo všetok nezosieťovaný fibrín bude konvertovaný na zosieťovaný fibrín, pred stupňom kontaktu, čo vedie k veľmi slabému fibrínovému utesňovadlu. Toto vyhotovenie sa vykoná zmiešaním kompozície obsahujúcej fibrínový monomér alebo nezosieťovaný fibrín s kompozíciou, ktorá môže konvertovať fibrínový monomér na fibrínový polymér alebo nezosieťovaný fibrín na zosieťovaný fibrín, pred stupňom kontaktu. Pretože je treba asi 30 sekúnd pre konverziu, aby bola úplná, nemal by konverzný stupeň začať viac ako asi 30 sekúnd a výhodne nie viac ako asi 3 sekundy pred stupňom kontaktu. Toto vyhotovenie je preferované, pretože zaisťuje, že maximálne množstvo prípravku, obsahujúceho fibrínový monomér alebo nezosieťovaný fibrín, zostane na požadovanom mieste a ešte tiež vytvorí vynikajúcu fibrinovú zrazeninu.

Konverzia fibrínového monoméru na fibrínový polymér alebo nezosieťovaného fibrínu na zosieťovaný fibrín môže byť vykonaná akoukoľvek technikou, ktorá je známa alebo vyvinutá. Ako sa však konverzný stupeň vykoná, to závisí na zdroji prípravku, obsahujúceho fibrínový monomér alebo nezosieťovaný fibrín, napr. celá krv alebo rekombinantný fibrinogén, forme fibrínového monoméru alebo nezosieťovaného fibrínu, napr. fibrín I alebo BB fibrín a k menšiemu rozsahu, kde požadované miesto bude obsahovať pacientovu krv alebo iné telesné tekutiny v dobe použitia fibrínového utesňovadla.

Ak sa použije separátny prípravok, ako je alkalický pufor (diskutovaný ďalej) pre stupeň konverzie, potom metóda predloženého vynálezu môže byť vykonaná s napríklad dvoj zásobníkovou striekačkou. Dvoj zásobníková striekačka môže mať tvar Y, čím umožní zmiešanie prípravku, obsahujúceho fibrínový monomér alebo nezosieťovaný fibrín a prípravku použitého v konverznom stupni, aby sa zmiešali bezprostredne pred stupňom kontaktu. Tiež skôr ako Y-tvarovaná dvoj zásobníková striekačka môže byť použitá dvoj zásobníková striekačka s dvoma otvormi. Toto umožňuje súčasný kontakt s požadovaným miestom a konverziu na fibrínový polymér alebo zosieťovaný fibrín. Tiež prípravky z dvoj zásobníkovéj striekačky môžu byť nastriekané na požadované miesto. Viď H. B. Krám a spol., The Američan Surgeon, 57: 381 (1991) .

Ak zdrojom prípravku obsahujúceho fibrínový monomér alebo nezosieťovaný fibrín je krv, potom, ako je uvedené vyššie, sa predpokladá, že prípravok si bude udržiavať dosť protrombinu, faktoru XIII a iných nevyhnutných substancií pre vyhotovenie takého fibrínového monoméru alebo nezosieťovaného fibrínu na zosieťovaný fibrín, napr. aktivátory protrombinu. Ak nezosieťovaným fibrínom je fibrínový polymér, t.j. nezosieťovaný fibrín nebol solubilizovaný, môže byť nezosieťovaný fibrín konvertovaný na zosieťovaný fibrín aktiváciou protrombinu a faktorom XIII takéhoto prípravku za vzniku zosieťovaného fibrínu. Takáto aktivácia môže byť vykonaná kontaktom prípravku so zdrojom vápnikových iónov. Neobmedzujúce zdroje vápnika zahrňujú chlorid vápenatý, výhodne v koncentrácii 30 mM. Alternatívne a menej výhodne môžu vápnikové ióny byť dodávané krvou na požadované miesto.

Ak bol solubilizovaný nezosieťovaný fibrín, t.j. fibrínový monomér, závisí vyhotovenie fibrínového monoméru na zosieťovaný fibrín na tom, ako bola vyhotovená solubilizácia. Ak bol nezosieťovaný fibrín solubilizovaný kyslým pufrom, môže byť zosieťovaný fibrín vytvorený zvýšením pH prípravku, obsahujúceho fibrínový monomér tak, že fibrínový monomér môže polymerovať. Toto môže byť vyhotovené kontaktom takéhoto prípravku s akýmkoľvek vhodným alkalickým pufrom. Neobmedzujúce príklady alkalických pufrov zahrňujú HEPES, hydroxid sodný, hydroxid draselný, hydroxid vápenatý, hydrogénuhličitanové pufre ako je hydrogénuhličitan sodný a hydrogénuhličitan draselný, tri-kovové soli kyseliny citrónovej, soli kyseliny octovej a soli kyseliny sírovej. Výhodné alkalické pufry zahrňujú: 0,5 - 0,75 M uhličitan/hydrogénuhličitan sodný pH 10 - 10,5, 0,5 - 0,75 M hydrogénuhličitan sodný/NaOH pH 10,0 1,5 M glycín/NaOH pH 10,0 0,5 - 1,0 M bishydroxyetylamínoetánsulfonovú kyselinu (BES) pH 7,5, IM hydroxyetylpiperazínpropánsulfónovú kyselinu (EPPS) pH

8,5 0,5 M tricín pH 8,5 , IM morfolínopropánsulfónovú kyselinu (MOPS) pH 8,0, IM trishydroxymetylamínoetánsulfónovú kyselinu (TES) pH 8,0 a 0,5 M cyklohexylamínoetánsulfónovú kyselinu (CHES) pH 10,0, najvýhodnejšie sú 0,5 - 0,75 M uhličitan/hydrogénuhličitan sodný pH 10 - 10,5, 0,5-1,0 M bis-hydroxyetylaminoetánsulfónová kyselina. (BES) pH 7,5, IM hydroxyetylpiperazínpropánsulfónová kyselina (EPPS) pH 8,5 a 1 M trishydroxymetylamínoetánsulfónová kyselina (TES) pH 8,0.

Množstvo alkalického pufra, ktoré sa použije, by malo byt dostatočné pre polymeráciu nezosietovaného fibrínu. Je výhodné, ked sa asi 10 dielov až asi jeden diel prípravku, obsahujúceho fibrínový monomér zmieša s asi 1 dielom alkalického pufra. Výhodnejší je pomer asi 9 : 1. Je treba uviest, že výhodný pomer závisí na zdroji pufra a požadovanej sile fibrínového polyméru. Samozrejme, požadovaná sila fibrínového polyméru závisí na konečnom použití fibrínového utesňovadla.

Ak sa solubilizácia vykonáva s chaotrópnym činidlom, potom môže byt fibrínový monomér konvertovaný na zosietovaný fibrín zriedením prípravku, obsahujúceho fibrínový monomér s napríklad destilovanou vodou. Zriedenie by malo byt vyhotovené tak, že sa použije minimálne množstvo riedidla. Všeobecne by mala výsledná koncentrácia chaotrópneho činidla po zriedení byt asi 0,5 až asi 0,1 molárne.

Naviac k zvýšeniu pH alebo zriedeniu chaotrópneho činidla prípravku, obsahujúceho fibrín monomér, je výhodné, že protrombín a faktor XIII takéhoto prípravku sú aktivované za vzniku zosietovaného fibrínu. Takáto aktivácia môže byt vykonaná kontaktom prípravku so zdrojom iónov vápnika. Zdrojom vápnikových iónov môže byt čast alkalického pufra alebo čast kyslého pufra, ktorý sa použije v solubilizačnom stupni. Neobmedzujúce zdroje vápnikových iónov zahrňujú chlorid vápenatý, výhodne v koncentrácii 30 mM. Alternatívne a menej výhodne môže byt zdroj vápnikových iónov dodávaný krvou na požadované miesto.

Malo by byt uvedené, že ak je alkalickým pufrom pufor uhličitan/hydrogénuhličitan, potom musí byt zdroj vápnikových iónov pridaný ku kyslému pufru v priebehu stupňa solubilizácie. Toto je vyvolané skutočnosťou, že chlorid vápenatý nie je rozpustný v pufre uhličitan/hydrogénuhličitan. Je výhodné, aby koncentrácia vápnikových iónov v kyslom pufrovacom roztoku bola od asi 5 milimól do asi 150 milimól a výhodnejšie od asi 5 mM do asi 50 mM.

Očakáva sa, že výsledná fibrínová zrazenina bude zosieťovaný fibrín II bez ohľadu na to, aká forma nezosieťovaného fibrínu, t.j. fibrínový monomér alebo fibrínový polymér, je prítomná. Ak je však formou nezosieťovaného fibrínu BB fibrín, potom sa očakáva, že môže byť vyžadovaný prídavok zdroja ďalšieho fibrínu pre vyhotovenie BB fibrínu na zosieťovaný fibrín. Takýmto zdrojom trombínu môže byť napríklad plazma pacienta, kedy sa táto plazma pridá k prípravku, obsahujúcemu nezosieťovaný fibrín.

Ak požadované miesto obsahuje krv a použije sa prípravok, obsahujúci fibrínový monomér, t.j. nezosieťovaný fibrín bol solubilizovaný, potom môže byť táto krv použitá ako riedidlo chaotrópneho činidla alebo na zvýšenie pH prípravku, obsahujúceho fibrínový monomér. Nie je tak treba použiť žiadne riedidlo alebo alkalický pufor. V takomto vyhotovení je výhodné, aby zdroj vápnikových iónov bol obsiahnutý v kyslom pufre alebo chaotrópne činidlo bolo použité v solubilizačnom stupni. Tiež v takomto prípade môže byť prípravok, obsahujúci fibrínový monomér umiestnený na pevnom nosiči, napr. obväze, stehoch, protéze alebo dressingu, ktoré budú v kontakte s požadovaným miestom. Takýto nosič sa potom umiestni do kontaktu s požadovaným miestom až do, napríklad, tvorby fibrínovej zrazeniny.

Je však treba uviesť, že ak prípravok, obsahujúci fibrínový monomér neobsahuje toľko protrombínu a faktoru XIII, aby vznikol zosieťovaný fibrín, je takýto prípravok ešte vhodný ako fibrínové utesňovadlo, pretože polymerácia fibrinového monoméru per se je vhodná pre tvorbu fibrínovej zrazeniny. Takýto prípravok tak môže byť ešte použitý na tvorbu zosieťovaného fibrínu prídavkom zdroja iónov vápnika a aktivovaného faktoru XIII (alebo prekurzorov až aktivovaného faktoru XIII) a prípadne trombínu. Takýto zdroj vápnikových iónov, aktivovaného faktoru XIII a trombínu môže byť pridaný k prípravkom, obsahujúcim fibrínový monomér. Aktivovaný faktor XIII môže byť pridaný k prípravku, obsahujúcemu fibrínový monomér v konečnej koncentrácii od asi 1,0 do asi 20 jednotiek faktoru XIII na ml prípravku, obsahujúceho nezosieťovaný fibrín. Alternatívne môže byť faktor XIII dodávaný krvou alebo telesnými tekutinami na požadované miesto alebo prídavkom autológnej plazmy k prípravku, obsahujúcemu fibrínový monomér. Neobmedzujúce zdroje vápnikových iónov zahrňujú chlorid vápenatý, výhodne v koncentrácii 30 mM. Alternatívne a menej výhodne, môžu byť vápnikové ióny dodávané krvou alebo telesnými tekutinami na požadované miesto. Od asi 4 jednotiek do asi 500 jednotiek trombínu na ml prípravku, obsahujúceho fibrínový monomér môže byť pridané, alebo trombín môže byť poskytnutý požadovaným miestom.

Ak sú zdrojom prípravku obsahujúceho nezosieťovaný fibrín bunečnej kultúry, ktoré sekretujú fibrinogén alebo rekombinantný fibrinogén a nezosieťovaným fibrínom je fibrínový polymér, t.j. nezosieťovaný fibrín nebol solubilizovaný, potom musí byť pre tvorbu zosieťovaného fibrínu použitý zdroj vápnikových iónov a aktivovaného faktoru XIII (alebo prekurzorov až aktivovaného faktoru XIII). Faktor XIII musí byť použitý, pretože tieto zdroje nezosieťovaného fibrínu neobsahujú akýkoľvek faktor XIII. Aktivovaný faktor XIII môže byť pridaný k prípravku, obsahujúcemu nezosieťovaný fibrín v konečnej koncentrácii od asi 1,0 do asi jednotiek faktoru XIII na ml nezosieťovaný fibrín. Alternatívne môže krvou alebo telesnými tekutinami na prípravku, obsahuj úceho byť faktor XIII dodávaný požadované miesto alebo prídavkom autológnej plazmy k prípravku, obsahujúcemu nezosieťovaný fibrín. Neobmedzujúce zdroje vápnikových iónov zahrňujú chlorid vápenatý, výhodne v koncentrácii 30 mM.

Alternatívne a menej výhodne môžu byť vápnikové ióny dodávané krvou alebo telesnými tekutinami na požadované miesto. Tiež, ako možnosť, môže byť trombín pridávaný k takémuto prípravku za účelom zaistenia tvorby zosieťovaného fibrínu II. Asi 4 jednotky až asi 500 jednotiek trombínu na ml prípravku, obsahujúceho nezosieťovaný fibrín môže byť pridané alebo trombín môže byť poskytnutý požadovaným miestom.

Ak bol nezosieťovaný fibrín solubilizovaný, t.j. je to fibrinový monomér, prevedenie fibrínového monoméru na fibrínový polymér závisí na tom, ako bola uskutočnená solubilizácia, napr. kyslým pufrom alebo chaotrópnym činidlom. Tvorba fibrínového polyméru môže byť uskutočnená rovnakými metódami, ako sú popísané vyššie. Tento fibrínový polymér, ak je to žiaduce, môže potom byť prevedený na zosieťovaný fibrín prídavkom zdroja vápnikových iónov a aktivovaného faktoru XIII (alebo prekurzorov až aktivovaného faktoru XIII) a pripadne trombínu k prípravku, obsahujúcemu fibrínový monomér, ako je popísané vyššie. Aktivovaný faktor XIII môže byť pridaný k prípravku, obsahujúcemu nezosieťovaný fibrín v konečnej koncentrácii od asi 1,0 do asi jednotiek faktoru XIII na ml nezosieťovaný fibrín. Alternatívne môže krvou alebo telesnými prídavkom autológnej nezosieťovaný fibrín, zahrňujú chlorid Alternatívne a krvou alebo telesnými tekutinami na požadované miesto.

tekutinami na plazmy k Neobmedzujúce vápenatý, výhodne obsahujúceho XIII dodávaný miesto alebo obsahujúcemu iónov prípravku, byť faktor požadované prípravku, zdroje vápnikových v koncentrácii 30 mM. menej výhodne, môžu byť vápnikové ióny dodávané Môže byť pridané od asi 4 jednotiek do asi 500 jednotiek trombínu na ml prípravku, obsahujúceho fibrínový monomér alebo môže byť trombín poskytnutý požadovaným miestom.

Fibrínové utesňovadlo podlá predloženého vynálezu môže tiež obsahovať prísady, napríklad antibiotiká, napr. gentamycín, cefotaxim, nebacetín a sisomycín, histaminované H₂-antagonisty, napr. ranitidín a lieky proti rakovine, napr. OK-432. Toto môže byť vykonané prídavkom požadovaných antibiotík k prípravku, obsahujúcemu fibrínový monomér alebo nezosieťovaný fibrín. Viď M.

C. H. Gersdorff a T. A. J. Robillard, Laryngoscope, 95: 127880 (1975); A. Ederle a spol., Ital. J. Gastroenterol., 23: 354-56 (1991), V. Ronfard a spol., Burns, 17: 181-84 (1991); T. Sakurai a spol., J. Control. Release, 18: 39-43 (1992); T. Monden a spol., Cancer, 69: 636-42 (1992), F. Greco, J. of Biomedical Materials Research, 25: 39-51 (1991 a H. B. Krám a spol., Journal of Surgical Research 50: 175-178 (1991), ich obsah je tu uvedený ako referencie. Môžu byť tiež pridané iné prísady, napríklad fibronektín, fibrinolytické inhibítory ako je aprotinín, alfa-2-antiplazmin, PAT-1, PAT-2, 6-amínohexánová kyselina,

4-amínometylcyklohexánová kyselina, kolagén Predpokladá sa, používa v bežných alebo keratinocyty. je rovnaká ako sa že dávka takejto prísady fibrínových utesňovadlách.

vynález môže tiež poskytuje obsahovať prvú monomér a druhú

Predložený utesňovadla. Kit obsahujúceho fibrínový alkalický pufor, ktorý je schopný alebo destilovanú vodu, podľa solubilizačný stupeň. Druhá zložka vápnikových iónov. Alternatívne môže byť prvou obsahujúci nezosieťovaný fibrín a druhou k i ty zložku zložku, fibrínového prípravku, ktorou je polymerovať fibrínový monomér toho, ako bol vykonaný môže prípadne obsahovať zdroj zložkou prípravok, zložku byť zdroj vápnikových iónov. Ak je použitý zdroj fibrinogénu na prípravu prípravku, obsahujúceho nezosieťovaný fibrín, ktorým sú bunečné kultúry ktoré sekretujú fibrinogén alebo rekombinantný fibrinogén, môže byť prvou zložku kompozícia obsahujúca nezosieťovaný fibrín, druhou zložkou môže byť zdroj vápnikových iónov a treťou zložkou aktivovaný faktor XIII.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Príprava plazmy z celej krvi

Celá krv (100 ml) sa odoberie do štandardných obchodne dostupných krvných vakov, obsahujúcich antikoagulant ako je citrát/fosfát/dextróza. Krv sa potom prevedie do kontajneru vhodného na odstreďovanie a odstreďuje sa pri teplote miestnosti 10 minút pri 3 000 g. Číra supernatantová plazma (približne 50 ml) sa dekantuje a bunečná zložka sa odloží.

Alternatívnou metódou prípravy plazmy z celej krvi je filtrácia. Opäť sa 100 ml celej krvi odoberie do vaku, obsahujúceho vhodný antikoagulant ako je citrát/fosfát/dextróza. Krv sa potom recirkuluje cez filter vykazujúci dobrú proteínovú transmisiu pomocou peristaltickej pumpy. Pretlačenie membránou vedie k plazme, ktorá je pretlačená s bunečnými zložkami, zostávajúcimi v recirkulujúcej krvi. Plazma (50 ml) sa odoberie pre ďalšie spracovanie.

Príklad 2

Imobilizácia batroxobínu na guličkovú agarózu

V imobilizačnej štúdii sa použije guličková plazma (Pharmacia). Použitá agaróza bola zo 4 % zosieťovaná, 45 - 165 μπι (90 % častíc). Tento materiál pri hydratácii nabobtnal päťkrát v porovnaní s pôvodným objemom. Batroxobín sa najprv oxiduje 0,1 M jodistanom sodným počas 1 hodiny pri teplote miestnosti v uzavretej scintilačnej nádobke. Batroxobín sa vyčistí priechodom cez Sephades PD-10 gelovou permeačnou kolónou. Oxidovaný batroxobín sa potom kopuluje k hydrazidom aktivovanému agarózovanému gélu cez noc pri teplote miestnosti v 50 mM octane sodnom pH 5,5 plus 10 mM borohydride sodnom (30 - 200 j. na 1,75 g vlhkého gélu). Nenaviazané reakčné zložky sa odstránia z gélu premytím: - 50 ml mM octanu sodného pH 5,5, 100 ml 50 mM glycín/ΙΜ chlorid sodný pH 3,0, 100 ml 50 mM uhličitan sodný/lM chlorid sodný pH 10,0, 100 ml 50 mM fosforečnan sodný/1 M chlorid sodný pH 7,0, 100 ml vody, 100 ml 50 mM fosforečnan sodný/1

M chlorid sodný pH 7,0, 100 ml fosforečnan sodný pH 7,0.

Príklad 3

Reakcia imobilizovaného enzýmu s plazmovým fibrinogénom za vzniku prípravku, obsahujúceho nezosieťovaný fibrín

Imobilizovaný enzým (350 g) sa pridá k približne 50 ml odstredenej alebo filtrovanej minút, pokial sa nevytvorí I polyméru.

plazmy a opatrne sa mieša 7 až 20 zrazenina nezosieťovaného fibrín

Fibrín I potom odoberú s nasledujúcim polymér plus asociovaný imobilizovaný enzým sa buď a) odstredením pri 3 000 počas 10 min. odstránením supernatantového séra dekantáciou, alebo b) filtráciou vhodným filtrom, viažucim malé proteíny s nasledujúcim odložením filtrovaného séra a uchovaním fibrín I polyméru plus imobilizovaného enzýmu pre ďalšie spracovanie. Tento fibrín I polymér je príkladom prípravku, obsahujúceho nezosieťovaný fibrín.

Príklad 4

Solubilizácia fibrín I polyméru za vzniku prípravku, obsahujúceho fibrínový monomér

Solubilizácia fibrín I polyméru sa dosiahne prídavkom asi 1-4 ml 0,2 M octanu sodného pH 4,0, obsahujúceho 30 mM pufru chloridu vápenatého k získanému fibrín I polyméru plus imobilizovaného enzýmu. Vzorka sa ďalej intenzívne mieša, napr. na vortex mixéri, 2 minúty. Odstránenie imobilizovaného enzýmu môže byť dosiahnuté filtráciou roztoku fibrínu I filtrom viažucim 1 až 20 μπι malé proteíny. Enzým agaróza bude zadržaný na filtri, čím sa dosiahne jeho odstránenie zo systému. Zvyšný roztok, prípravok, obsahujúci fibrín I monomér, obsahuje koncentrovaný roztok fibrín I monoméru v spojení s inými plazmovými proteínmi. Všeobecne asi 10 ml celej krvi poskytne asi 4 ml alebo 5 ml prípravku, obsahujúceho fibrín monomér, kde koncentrácia fibrín monoméru je od asi 265 mg/ml do asi 35 mg/ml. Tento je teraz pripravený pre doručenie k pacientovi buď samotný alebo koextrudovaný s repolymerizujúcim pufrom za vzniku fibrínového utesňovadla.

Príklad 5

Repolymerácia prípravku, obsahujúceho fibrín I monomér

Repolymerácia sa dosiahne súčasným zmiešaním roztoku, obsahujúceho fibrín I monomér s 1 dielom vhodného repolymeračného pufru, napr. 0,75 M uhličitan sodný/hydrogénuhličitan sodný, pH 10,0. Pomer miešania môže byť menený, avšak pomer 9 : 1 udržiava vysokú koncentráciu fibrínu v konečnom produkte. Koextrúziou fibrín I spontánne repolymeruje a konvertuje na fibrín II s nasledujúcim zosieťovanim fibrínu v priebehu periódy asi 30 minút.

Predložený vynález nie je obmedzený popísanými špecifickými vyhotoveniami, ktoré sú mienené ako jednotlivé ilustrácie individuálnych aspektov vynálezu. V skutočnosti budú z uvedeného popisu odborníkom zrejmé rôzne modifikácie predloženého vynálezu. Takéto modifikácie spadajú do rozsahu pripojených nárokov.

Príklad 6

Aktivácia agarózy hydrazidom a kopulácia cez uhlohydrátovú skupinu enzýmu

Pre reakciu uhľohydrátovej skupiny batroxobínu s hydrazidom aktivovaným nosičom musí byť cukor najprv oxidovaný za vzniku volných -CHO skupín. Toto sa vykoná nasledovne.

Batroxobín 1 - 7 mg sa rozpusti v 2 ml vody a 0,2 ml 0,lM jodistanu sodného. Zmes sa inkubuje pri teplote miestnosti 1 hodinu, po ktorej sa odsolí gelovou filtráciou na Sephadexe G-25. Oxidovaný aktívny batroxobín sa eluuje z kolóny 0,9 % hmot./obj. chloridu sodného.

Štandardná komerčne dostupná hydrazidom aktivovaná agaróza (Bio-rad Laboratories Ltd UK) alebo akákoľvek skupina s terminálnou voľnou amínoskupinou môže byť použitá pre priame napojenie voľných aldehydových skupín (-CHO). Ak sa použije hydrazid - agaróza, je kopulačný postup nasledovný.

- 5 g gélu hydrazid-agarózy sa suspenduje v 4 ml 50 mM octanu sodného pH 5,5. K suspenzii sa pridá 1 ml 10 mM borohydridu sodného spolu s požadovaným množstvom oxidovaného batroxobínu (typicky 100- 200 Bj. na g vlhkého gélu).

Vzorka sa cez noc mieša pri teplote miestnosti a postupne sa premyje v sklenenej nálevke so sintrom 50 ml 50 mM octanu sodného pH 5,5, 100 ml 50 mM glycin/ΙΜ chloridu sodného pH 3,0, 100 ml 50 mM uhličitanu sodného/ΙΜ chloridu sodného pH 10,9, 100 ml 50 mM fosfátu sodného/ΙΜ chloridu sodného pH 7,0, 100 ml vody a 100 ml 50 mM fosfátu sodného/ΙΜ chloridu sodného pH 7,0a nakoniec 100 ml 50 mM fosforečnanu sodného pH 7,0.

Spôsob reakcie imobilizovaného batroxobínu s plazmou je nasledovný.

pH plazmy (50 ml) sa zníži na pH 5,5 prídavkom kyseliny octovej. K plazme sa pridá ekvivalent 100 - 200 Bj. batroxobínu imobilizovaného na približne 1,75 g (hmotnosť vlhkého gélu) agarózy. Plazma sa inkubuje pri 37 ’C počas 10 až 15 minút, po tejto dobe sa pH zvýši na pH 7,4 prídavkom hydroxidu sodného. Polymerácia fibrínu I sa objaví takmer okamžite.. Fibrín I polymér sa získa odstredením pri 3 500 ot/min. počas 10 minút a znova sa rozpustí v 3 - 4 ml 0,2 M octanu sodného pH 4,0, obsahujúceho 30 mM chloridu vápenatého. Agaróza - enzým sa potom oddelí od fibrínu I odstredením alebo filtráciou. Fibrín I sa potom repolymeruje za vzniku fibrínového utesňovadla prídavkom 9 dielov roztoku fibrínu I k 1 dielu 0,75 M uhličitanu sodného/hydrogénuhličitanu pH 10,0.

Príklad 7

Systém zachytenia enzýmu za použitia biotín-avidínu

Zachytenie enzýmu sa vykoná najprv biotinyláciou batroxobinu a zachytením biotín-enzýmu imobilizovaným (avidín-kopulovaný k 6 % zosieťovanej agarózy).

avidínom

Biotinylácia proteínov môže byť dosiahnutá za použitia mnohých činidiel. V tomto prípade sa použije N-hydroxysukcinimid-biotín (vo vode rozpustný) (obchodne dostupný od fy Amersham). NHS-biotín (50 μΐ) sa pridá k 1 mg batroxobinu pri pH 8,6 a roztok sa Prebytok biotinylačného stĺpci Sephadexu G-25 s eluačným činidlom.

inkubuje pri teplote miestnosti 1 hodinu, činidla sa odstráni gelovou filtráciou na 0,1

M fosforečnanom draselným pH

K 50 ml plazmy sa

- batroxobin) a inkubuje sa sa získa odstredením (3 500 ml 0,2 M octanu vápenatého, dostupná

I.

pridá pri 37 ot/min sodného pH

K fibrínu I sa (Biotín polymér chloridu (obchodne na ml fibrínu minút a odstredí fibrín I je v podstate zbavený batroxobinu. Repolymerácia fibrínu za vzniku fibrinového utesňovadla sa dosiahne ako je popísané v príklade 6.

ekvivalent 10 Bj.

“C 10 minút. Fibrín I minút) a znovu sa rozpusti 4,0, obsahujúceho 30 mM pridá avidín - agaróza od Sigma Chemical Co.) pri 0,2 g (vlhký gel) Vzorka sa inkubuje pri teplote miestnosti 10 sa pri 2 000 ot/min počas 10 minút. Získaný

Claims (69)

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Spôsob použitia fibrínového utesňovadla, vyznačujúci sa tým, že zahrňuje

a) kontakt požadovaného miesta s prípravkom, obsahujúcim fibrín monomér a

b) prevedenie uvedeného fibrínového monoméru na fibrinový polymér súčasne s uvedeným stupňom kontaktu, čím sa vytvorí uvedené fibrínové utesňovadlo.

2. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že uvedený fibrinový monomér je vybraný zo skupiny, zahrňujúcej nezosieťovaný fibrín I, BB fibrín a nezosieťovaný fibrín II.

3. Spôsob podľa nároku 2, vyznačujúci sa tým, že uvedeným fibrínovým monomérom je fibrín I.

4. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že uvedeným fibrínovým polymérom je fibrín II polymér.

5. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že uvedený fibrinový polymér je zosieťovaný.

6. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že uvedený prípravok je v podstate zbavený trombínu podobného enzýmu.

7. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že uvedený prípravok je vytvorený zo zdroja vybraného zo skupiny, zahrňujúcej krv, bunečné kultúry, ktoré sekretujú fibrinogén a rekombinantný fibrinogén.

8. Spôsob podľa nároku 7, vyznačujúci sa tým, že uvedeným zdrojom je krv.

9. Spôsob podľa nároku 8, vyznačujúci sa tým, že uvedený prípravok ďalej obsahuje protrombín, aktivátory protrombínu a faktor XIII.

10,0, 0,5 - 1,0 M bis-hydroxyetylamínoetánsulfónovú kyselinu (BES) pH 7,5, IM hydroxyetylpiperazínpropánsulfónovú kyselinu (EPPS) pH 8,5, 0,5 M tricín pH 8,5, 1 M morfolínopropánsulfónovú kyselinu (MOPS) pH 8,0, IM trihydroxymetylaminoetánsulfónovú kyselinu (TES) pH 8,0 a 0,5 M cyklohexylaminoetánsulfónovú kyselinu (CHES) pH 10,0.

10. Spôsob podľa nároku 7, vyznačujúci sa tým, že uvedenou krvou je autológna krv.

11. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že uvedený stupeň vyhotovenia sa vykoná pomocou alkalického pufra alebo destilovanej vody.

12. Spôsob podľa nároku 11, vyznačujúci sa tým, že uvedený alkalický pufor alebo destilovaná voda ďalej obsahuje zdroj vápnikových iónov.

13. Spôsob podľa nároku 11, vyznačujúci sa tým, že uvedený alkalický pufor je vybraný zo skupiny, zahrňujúcej hydroxid sodný, hydroxid draselný, hydroxid vápenatý, hydrogénuhličitanové pufre, tri-kovové soli kyseliny citrónovej, soli kyseliny octovej a soli kyseliny sírovej.

14. Spôsob podľa nároku 11, vyznačujúci sa tým, že uvedený alkalický pufor je vybraný zo skupiny, zahrňujúcej 0,5 - 0,75 M uhličitan/hydrogénuhličitan sodný pH 10 - 10,5, 0,5 - 0,75

M hydrogénuhličitan sodný/NaOH pH 10,0, 1,5 M glycín/NaOH pH

15. Spôsob podľa nároku 11, vyznačujúci sa tým, že uvedený alkalický pufor je vybraný zo skupiny, zahrňujúcej 0,5 - 0,75 M uhličitan/hydrogénuhličitan sodný pH 10 - 10,5, 0,5-1,0

M bis-hydroxyetylaminoétánsulfónovú kyselinu (BES) pH 7,5, 1

M hydroxyetylpiperazínpropánsulfónovú kyselinu (EPPS) pH 8,5 a 1 M trishydroxymetylaminoetánsulfónovú kyselinu (TES) pH 8,0.

16. Spôsob podlá nároku 11, vyznačujúci sa tým, že uvedený stupeň kontaktu sa vykoná pomocou dvoj zásobníkovéj striekačky, v ktorej jeden zásobník obsahuje uvedený prípravok a druhý zásobník obsahuje uvedený alkalický pufor alebo destilovanú vodu.

17. Spôsob podlá nároku 1, vyznačujúci sa tým, že uvedeným prípravkom je vodný prípravok a má pH od asi 1 do asi 5 alebo obsahuje chaotrópne činidlo.

18. Spôsob podlá nároku 17, vyznačujúci prípravok ďalej obsahuje kyslý pufor zahrňujúcej glukurónovú, itakonovú, aspartovú, kyselinu adipovú a ich kyselinu kyselinu kyselinu octovú, cysteovú, glutamovú, kyselinu kyselinu kyselinu soli.

sa tým, že uvedený vybraný zo jantárovú, krotónovú, i mravčiu, skupiny, kyselinu kyselinu kyselinu

19. Spôsob podlá nároku 18, vyznačujúci sa tým, že uvedený kyslý pufor je vybraný zo skupiny, zahrňujúcej kyselinu jantárovú, kyselinu aspartovú, kyselinu adipovú a soli kyseliny octovej.

20. Spôsob podlá nároku 19, vyznačujúci sa tým, že uvedeným kyslým pufrom je octan sodný.

21. Spôsob podlá nároku 18, vyznačujúci sa tým, že koncentrácia uvedeného kyslého pufra je od asi 0,02 M do asi 1 M.

22. Spôsob podlá nároku 21, vyznačujúci sa tým, že uvedená koncentrácia je od asi 0,1 M do asi 0,3 M.

23. Spôsob podlá nároku 17, vyznačujúci sa tým, že uvedené chaotrópne činidlo je vybrané zo skupiny, zahrňujúcej močovinu, bromid sodný, hydrochlorid guanidínu, KCNS, jodid draselný a bromid draselný.

24. Spôsob podľa nároku 23, vyznačujúci sa tým, že koncentrácia uvedeného chaotrópneho činidla je od asi 0,2 M do asi 6,0 M.

25. Spôsob podlá nároku 24, vyznačujúci sa tým, že uvedená koncentrácia je od asi 3,5 M do asi 5,0 M.

26. Spôsob pódia nároku 17, vyznačujúci sa tým, že koncentrácia fibrinového monoméru v uvedenom vodnom roztoku je od asi 10 mg/ml do asi 200 mg/ml.

27. Spôsob podlá nároku 26, vyznačujúci sa tým, že uvedená koncentrácia je od asi 20 mg/ml do asi 100 mg/ml.

28. Spôsob pódia nároku 17, vyznačujúci sa tým, že uvedený vodný prípravok ďalej obsahuje zdroj vápnikových iónov.

29. Spôsob pódia nároku 1, vyznačujúci sa tým, že požadované miesto je na cicavcovi.

30. Spôsob podlá nároku 29, vyznačujúci sa tým, že uvedeným cicavcom je človek.

31. Spôsob podlá nároku 30, vyznačujúci sa tým, že požadované miesto je vybrané zo skupiny, zahrňujúcej kožu, kardiovaskulárny systém, lymfatický systém, pulmonárny systém, ucho, nos, oko, pečeň, slezinu, lebku, chrbticu, pažerák, maxillo-facial, kosť, šlachu, slinivku, genitálny - urinárny trakt a zažívací trakt.

32. Spôsob prípravy prípravku, obsahujúceho fibrínový monomér z fibrinogénu, vyznačujúci sa tým, že obsahuje

a) kontakt prípravku obsahujúceho fibrinogén s trombínu podobným enzýmom pre prevedenie uvedeného fibrinogénu na nezosieťovaný fibrínový polymér,

b) oddelenie uvedeného nezosieťovaného fibrinového polyméru z uvedeného prípravku obsahujúceho fibrinogén a

c) solubilizácia uvedeného nezosieťovaného fibrínového polyméru za vzniku prípravku, obsahujúceho fibrínový monomér.

33. Spôsob podľa nároku 22, vyznačujúci sa tým, že uvedený trombínu podobný enzým je imobilizovaný na nosiči a uvedený stupeň kontaktu vedie k tomu, že trombínu podobný enzým sa asociuje s uvedeným nezosieťovaným fibrínovým polymérom a ďalej zahrňuje oddelenie uvedeného trombínu podobného enzýmu z uvedeného prípravku, obsahujúceho fibrínový monomér.

34. Spôsob podľa nároku 33, vyznačujúci sa tým, že uvedený nosič je vybraný zo skupiny, zahrňujúcej celulózu, polydextramy, agarózu, polystyrény, oxid kremičitý, polyakrylové kyseliny, polyakrylamidy, polyvinylalkoholy, sklenené guličky, polykarbonáty, kolagén, deriváty celulózy, polytetrafluóretylén a ich kompozity.

35. Spôsob podľa nároku 34, vyznačujúci sa tým, že uvedený nosič je vybraný zo skupiny, zahrňujúcej agarózu a oxid kremičitý.

36. Spôsob podľa nároku 32, vyznačujúci sa tým, že uvedený trombínu podobný enzým je imobilizovaný na filtri alebo je uvedený trombínu podobný enzým imobilizovaný na nosič a je na jednej strane filtra a po uvedenom stupni kontaktu výsledný fibrínový monomér prejde uvedeným filtrom.

37. Spôsob podľa nároku 32, vyznačujúci sa tým, že uvedený stupeň solubilizácie sa vykoná pomocou roztoku kyslého pufra, majúceho pH menšie ako asi 5 alebo chaotrópneho činidla.

38. Spôsob podľa nároku 37, vyznačujúci sól tým, že uvedený roztok kyslého pufra je vybraný zo skupiny, zahrňujúcej kyselinu octovú, kyselinu jantárovú, kyselinu glukurónovú, kyselinu cystenovú, kyselinu krotónovú, kyselinu itakonovú, kyselinu glutamovú, kyselinu mravčiu, kyselinu aspartovú, kyselinu adipovú a ich soli.

39. Spôsob podľa nároku 37, vyznačujúci sa tým, že roztok kyslého pufra alebo chaotrópne činidlo dalej obsahuje zdroj vápnikových iónov.

40. Spôsob podľa nároku 32, vyznačujúci sa tým, že uvedený stupeň oddelenia sa vykoná filtráciou.

41.

trombínu

Spôsob podobný podľa enzým nároku 32, vyznačujúci sa môže prevádzať fibrinogén na fibrín I.

tým, že uvedený

Spôsob podobný

42. trombínu a batroxobín.

podľa enzým nároku 32, vyznačujúci je vybraný sa tým, že uvedený zo skupiny, zahrňujúcej ancrod

43.

podľa zahrňuje z uvedeného biotinylácie uvedeného s imobilizovaným avidínom,

Spôsob odstránenie prípravku, uvedeného prípravku, vyznačujúci sa tým, že dalej trombínu podobného monomér nároku 32, uvedeného obsahujúceho fibrínový trombínu podobnému enzýmu a obsahujúceho fibrínový čím sa odstráni uvedený podobný enzým z uvedeného prípravku obsahujúceho monomér.

enzýmu pomocou kontakt monomér trombínu fibrínový

44. Spôsob použitia fibrínového utesňovadla, vyznačujúci sa tým, že zahrňuje

a) kontakt požadovaného miesta s prípravkom, obsahujúcim nezosieťovaný fibrín a

b) prevedenie uvedeného nezosieťovaného fibrínu na zosieťovaný fibrín súčasne s uvedeným stupňom kontaktu.

45. Spôsob podľa nároku 44, vyznačujúci sa tým, že uvedený nezosieťovaný fibrín je vybraný zo skupiny, zahrňujúcej nezosieťovaný fibrín I, des BB fibrín a nezosieťovaný fibrín II.

46. Spôsob podľa nároku 45, vyznačujúci sa tým, že uvedeným nezosieťovaným fibrínom je fibrín I.

47. Spôsob podľa nároku 44, vyznačujúci sa tým, že uvedený prípravok je vytvorený z krvi, bunečných kultúr, ktoré vylučujú fibrinogén alebo rekombinantný fibrinogén.

48. Spôsob podľa nároku 47, vyznačujúci sa tým, že uvedenou krvou je autológna krv.

49. Spôsob podľa nároku 44, vyznačujúci sa tým, že uvedený _ť stupeň prevedenia sa vykoná kontaktom uvedeného prípravku so • zdrojom vápnikových iónov.

50. Vodný prípravok, vyznačujúci sa tým, že obsahuje nezosieťovaný fibrínový monomér v koncentrácii od asi 10 mg/ml do asi 200 mg/ml a uvedený prípravok má pH od asi 1 do asi 5.

51. Vodný prípravok podľa nároku 50, vyznačujúci sa tým, že uvedená koncentrácia je od asi 20 mg/ml do asi 100 mg/ml.

52. Vodný prípravok podľa nároku 50, vyznačujúci sa tým, že uvedený fibrínový monomér je vybraný zo skupiny, zahrňujúcej fibrín I, des BB fibrín a fibrín II.

53. Vodný prípravok podľa nároku 52, vyznačujúci sa tým, že uvedeným fibrínovým monomérom je fibrín I.

b *

54. Vodný prípravok obsahujúci fibrínový monomér, vyznačujúci sa tým, že koncentrácia uvedeného fibrínového monoméru je od asi 20 mg/ml do asi 200 mg/ml.

55. Vodný prípravok podľa nároku 54, vyznačujúci sa tým, že uvedená koncentrácia je od asi 20 mg/ml do asi 100 mg/ml.

56. Vodný prípravok podľa nároku 54, vyznačujúci sa tým, že uvedený fibrínový monomér je vybraný zo skupiny, zahrňujúcej fibrín I, des BB fibrín a fibrín II.

57. Vodný prípravok podľa nároku 56, vyznačujúci sa tým, že uvedeným fibrínovým monomérom je fibrín I.

58. Vodný prípravok, vyznačujúci sa tým, že obsahuje

a) fibrínový monomér a

b) zdroj vápnikových iónov, pričom koncentrácia uvedených vápnikových iónov je od asi 5 mM do asi 200 mM.

59. Prípravok, vyznačujúci sa tým, že obsahuje fibrínový monomér a je v pevnej forme.

60. Prípravok podľa nároku 59, vyznačujúci sa tým, že uvedený prípravok je vytvorený lyofilizáciou vodného roztoku, obsahujúceho fibrínový monomér.

61. Prípravok, vyznačujúci sa tým, že obsahuje fibrínový monomér a zlúčeninu vybranú zo skupiny, zahrňujúcej antibiotiká, histamín H₂~antagonistu, liek proti rakovine, fibronektín a fibrinolytický inhibítor.

62. Kit, vyznačujúci sa tým, že zahrňuje

a) prípravok, obsahujúci fibrínový monomér a

b) prípravok vybraný zo skupiny zahrňujúcej alkalický pufor a destilovanú vodu.

63. Kit podľa nároku 62, vyznačujúci sa tým, že uvedený alkalický pufor alebo uvedená destilovaná voda ďalej obsahuje zdroj vápnikových iónov.

64. Kit, obsahujúci

a) prípravok obsahujúci nezosieťovaný fibrín a

b) prípravok obsahujúci zdroj vápnikových iónov.

65. Kit podľa nároku 64, vyznačujúci sa tým, že ďalej obsahuje aktivovaný faktor XIII.

66. Pevný nosič, vyznačujúci sa tým, že má na svojom povrchu prípravok, obsahujúci fibrinový monomér.

67. Pevný nosič podľa nároku 66, vyznačujúci sa tým, že uvedený pevný nosič je vybraný zo skupiny, zahrňujúcej obväzy, stehy, protézy a dressing.

68. Pevný nosič podľa nároku 66, vyznačujúci sa tým, že uvedený monomér je vybraný zo skupiny, zahrňujúcej fibrín I, des BB fibrín a fibrín II.

69. uvedený Pevný nosič podľa nároku monomér je fibrín I. 66, vyznačujúci sa tým, že 70. Pevný nosič podľa nároku 66, vyznačujúci sa tým, že uvedený prípravok je v pevnej forme • 71. . Pevný nosič podľa nároku 70, vyznačujúci sa tým, že uvedený prípravok je vytvorený lyofilizáciou vodného roztoku,

obsahujúceho fibrinový monomér.