JP2000514778A - 安定なビオチン化生体分子の組成物及び方法 - Google Patents
安定なビオチン化生体分子の組成物及び方法Info
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Abstract
(57)【要約】
ビオチン化生体分子、例えば、酵素のための組成物及び方法を開示する。本組成物は、ビオチン化生体分子、生体分子保護剤、バッファー、1以上の水溶性非イオン性ポリマーから選ばれたバルキング剤、及び好ましくは、最終滅菌保護剤を含む。本組成物は、水溶液として、又は好ましくは、乾燥形態で、例えば、凍結乾燥粉末ケーキとして使用されることができる。それらは、アビジン/ビオチン技術が使用されるいずれのケースにおいても利用可能性を有し、そしてトロンビン様酵素を含有する組成物として特に重要である。フィブリン・モノマー及びフィブリン・モノマー−ベースのフィブリン接着剤の調製は、アビジン/ビオチン技術が使用される例であり、そしてこのようなモノマーを提供する方法をも開示する。
Description
【発明の詳細な説明】
安定なビオチン化生体分子の組成物及び方法
背景
アビジン−ビオチンのアフィニティーに基づく技術は、1970年代にDr.Edward
BayerとDr.Meier Wilchekによる先駆的な研究以降、生物学及びバイオテクノ
ロジーの多くの分野で広く利用されてきた。アビジンとビオチンの間のアフィニ
ティー定数は、極めて高く、そしてビオチンが多種多様の生体分子に結合すると
きにも有意に減じられることはない。さらに、このアフィニティーは、ビオチン
の誘導体化された形態が使用されるときでさえ維持され、そして生体分子の活性
又は他の所望の特性における最小の又はほんの僅かな損失を伴って、生体分子を
ビオチンにカップリングさせるために、多くの化学物質が同定されてきた。特定
の適応においては、アビジンは、その上をビオチン化生体分子を含有する溶液が
通過するところの不活性材料上に固定化される。アビジンについてのビオチンの
アフィニティーは、その溶液からの生体分子の分離を提供する。ビオチン−アビ
ジン技術のレビューは、Applications of Avidin-Biotin Technology to Affini
ty-Based Separation,Bayer,et al.,J .of Chromatography,1990,pgs.3-
11中に見られる。
EP 592242は、従来のフィブリノーゲン−ベースの接着剤とは異なりフィブリ
ン・モノマーに基づく新規のフィブリン接着剤について記載しており、そしてフ
ィブリノーゲンを、処置後に好ましくは除去されるトロンビン−様酵素に供する
ことを含むものである。EP592242は、上記酵素の捕獲及び除去が、アビジン材料
により再捕獲されることができるビオチン化バトロキソビンを使用することに
より達成されることができるということを記載している。
上記及び他の応用は、ビオチン化生体分子とアビジン材料のより便利な形態か
ら利得を得るであろう。現在、これらの材料は、ときどき、取り扱いが困難であ
り、不安定であることができ、凍結乾燥の如き処理において酵素活性を失うこと
ができ、不当に吸湿性であり、そして滅菌プロセスに耐えることができないもの
である。
本発明の要約
本発明に従って、ビオチン化生体分子及びビオチン/アビジン・アフィニティ
ー技術のための新規組成物及び方法が記載される。ビオチンを含む新規組成物は
:
i)ビオチン化生体分子;
ii)生体分子保護剤;
iii)所望のpHを維持するためのバッファー手段;及び
iv)水溶性非イオン性ポリマーから選ばれた1以上のバルキング剤、
を含んで成る。
本組成物は、便利には、水溶液であり、そして好ましくは、最終滅菌の間の不
安定性に対して上記組成物を保護するための剤を含む。最も好ましくは、上記組
成物は、上記ビオチン化生体分子の安定な照射可能な粉末形態を提供するために
凍結乾燥される。例えば、フィブリン接着剤において有用なフィブリン・モノマ
ー材料の製造方法をも開示する。
好ましい態様の詳細な説明
本発明は、ビオチン−生体分子の新規な、安定組成物を開示する。好ましい組
成物は、凍結乾燥され、そして安定であり、取扱いが
容易であり、そして例えば、その組成物に対する損傷を伴わずにガンマ線照射に
より、最終滅菌されることができる。これは、本組成物がビオチン化生体分子で
あるときに特に有利である。なぜなら、それは、その活性に対する損傷を伴わず
に凍結乾燥されたビオチン化生体分子を最終滅菌することができるために、ひじ
ょうに効率的であることが発見されているからである。本凍結乾燥ビオチン−ベ
ースの組成物は、上記アビジン−ビオチン技術が有用であるところで広い利用可
能性をもつ。なぜなら、これらの組成物は、水溶性であり、低い水分取り込みを
もち、低い生物負荷をもち、最終滅菌(例えば、照射される)ことができ、安定
して残り、そして薬理学的に許容されるからである。これらの利点は、本明細書
中に記載するような、保護剤とバルキング剤のユニークな組合せにより提供され
る。
上記の新規組成物は、ビオチン化生体分子と共に、生体分子保護剤、所望のpH
を維持するためのバッファー手段、及び1以上の水溶性、非イオン性ポリマー・
バルキング剤を含む。好ましくは、本組成物はさらに、最終滅菌、例えば、ガン
マ線照射の有害な効果に対し本組成物を保護するための剤を含む。上記生体分子
は、ビオチン化形態で使用されることが予定されるいずれかの所望の酵素又はタ
ンパク質であることができる。多くのビオチン化生体分子が、従来技術において
存在し、そしてそれらの従来の生体分子の全てが本発明において同様に有用であ
る。先に参照したEP 592242における新規のフィブリン・モノマー・プロセスに
関しては、トロンビニー様酵素がビオチン化形態において有用である。このよう
なトロンビン−様酵素は、トロンビン又は、アクチン(Acutin)、ベンザイム(V
enzyme)、アンクロッド(Ancrod)、アスペラーゼ(Asperase)、(B.Altrox,
B.Moojeni又はB.Maranhao由来の)バトロキソビ
ン(Batroxobin)、ボトロパーゼ(Botropase)、クロトラーゼ(Crotolase)、フラ
ボクソジン(Flavoxogin)及びガボナーゼ(Gabonase)を含む。他のビオチン化
生体分子の非限定的な例は、ビオチン化レクチン、抗体、マイトジェン、DNA,R
NA,tRNA,rRNA断片、ヌクレオソーム、膜、膜タンパク質、糖タンパク質及び合
成ペプチドを含む。
ビオチン化生体分子のビオチン成分は、ビオチン又はそのいずれかの誘導体化
形態又はアナログ、又はモノマー・アビジン、ストレプトアビジンを含むアビジ
ン、又はビオチン結合特性をもついずれかのタンパク質についてのアフィニティ
ーをもついずれかの分子であって、上記のものの中のいずれかの組換え形態を含
むものであることができる。本願発明に使用するためのさまざまなスペーサー、
連結基その他を含むさまざまなビオチン化合物が特許及び文献中に十分に記載さ
れている。非限定的な例は、M.D.Savage,et al.(1992),Pierce Chemical C
o.,Avidin-Biotin Chemistry:A Hand book;DE 3629194,U.S.5,180,828,U.
S.4,709,037及びU.S.5,252,743,U.S.4,798,795,U.S.4,794,082,WO85/056
38(これらを援用する。)中に見られる。
新規のビオチン組成物の生体分子保護剤は、その生体分子の所望の活性を保護
することができ、そしてそれによりその生体分子組成物に安定性を付与すること
ができるいずれかの剤である。生体分子は、非限定的に、トレハロース、グリセ
ロール、硫酸アンモニウム及びアミノ酸を含む。好ましくは、上記生体分子保護
剤は、アミノ酸であり、そしてより好ましくは、そのアミノ酸は、単純な両性イ
オン、例えば、グリシン、アラニン及びバリンであり、グリシンが最も好ましい
。
本ビオチン組成物のバッファー手段は、所望のレベルにおいて上
記組成物のpHを維持するために好適ないずれかの便利なバッファーであることが
できる。EP 592242のフィブリン・モノマー・プロセスにおいては、約pH7にそ
のビオチン化生体分子を維持することが望ましく、それ故、ナトリウム・バルビ
タール、シトレート、ナトリウム・バルビタール・ホスフェート、リン酸カリウ
ム、イミダゾール−HCl、ピペラジン、重炭酸ナトリウム−5%CO2、トリエタノ
・アミノ−HCl−NaOH、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン及びリン酸ナ
トリウム・バッファーが有用であり、リン酸ナトリウムが好ましい。
本ビオチン−生体分子組成物のバルキング剤は、水溶性の、非イオン性ポリマ
ーから選ばれる。このバルキング剤は、本組成物に化学的安定性と物理的安定性
の両方を提供し、例えば、それは、凍結乾燥ケーキの形態にあるとき新規組成物
が崩壊することを防ぐ。この非イオン性水溶性ポリマーは、上記生体分子に対す
る保護をも提供する。デキストラン及び類似の多糖類は、本組成物の安定性を高
めることが見い出されている。このようなバルキング剤の非限定的な例は、ギキ
ストラン、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコ
ール、加水分解デンブン及びデキストランを含む多糖類(例えば、ラクトース、
グルコース、マルトース、マンニトール、等)を含み、特に、50,000と100,000
ダルトンの間の分子量をもつデキストラン(例えば、Pharmacia Co.からのDext
ran T−70)が好ましい。
任意の最終滅菌保護剤は、抗酸化剤、フリー・ラジカル除去剤及び還元剤から
選ばれる。好ましいのは抗酸化剤、例えば、還元型グルタチオン、α−トコフェ
ロール、N,N−ジメチル−p−フェニレンジアミン及びアスコルビン酸ナトリ
ウムであり、アスコルビン酸ナトリウムが最も好ましい。
ビオチン化分子の調製は、知られた技術により達成される。例えば、(先に討
議したように、スペーサー・アーム及び/又は脱離基をもついずれかの所望のビ
オチン化合物であることができる)ビオチン誘導体、例えば、N−ヒドロキシス
クシンイミド−ビオチン(NHS−ビオチン)を、溶媒中及びバッファーの存在下で
、所望の生体分子、例えば、可溶性酵素バトロキソビンと反応させることができ
る。このNHSは、脱離基として機能して、上記のように形成されたビオチン・バ
トロキソビンを提供する。これは、標準的な方法論を使用して、例えば、上記ビ
オチン・バトロキソビンをSephadexTMクロマトグラフィー・カラム上の精製に供
して、遊離のビオチン、NHS−ビオチン及び他の低分子量溶質を除去することに
より精製されることができる。
その後、上記組成物の成分、すなわち、ビオチン化生体分子、生体分子保護剤
、バッファー手段及びバルキング剤を含む水溶液が調製される。好ましくは、上
記精製段階は、その最終製品中に存在することが望まれるバッファーを使用する
ことができ、これは、水及びバルキング剤が上記ビオチン化生体分子及びバッフ
ァーに添加されて、上記水溶液を形成することを提供する。
本発明に係る水溶液は:
0.01〜50重量%の生体分子保護剤;
1〜50重量%のバルキング剤;
特定の適用に従って選ばれた濃度におけるビオチン化生体分子;
水;及び
所望のpHを維持するために必要なバッファー、を含んで成る。
上記溶液又は懸濁液は、上記ビオチン化生体分子の有用で、安定な形態でもあ
り、そしてそれ自体、本発明の一部と考えられる。無菌性が要求される場合、上
記は、無菌的に調製されることができ、
又は最終滅菌、例えば、ガンマ線照射が使用される予定である場合、任意の最終
滅菌保護剤を含むことができる。この最終滅菌保護剤は、典型的には、約0.01%
〜約10%の量で、上記水溶液中に存在する。
上記範囲は、上記組成物1ml当り、0.1〜約1.0mgの酵素又は生体分子を含有す
る組成物について特に有用であり、そして上記組成物1ml当り5mgまでの酵素を
含有する組成物にかなりの保護をも提供するであろう。好ましくは、1mg/mlを
超える酵素を含有する組成物については、そして特に、5mg/mlを超えるもの含
有する組成物については、各成分のパーセンテージは、酵素濃度における増加に
凡そ比例するように、増加するはずである。
好ましい本発明に係る水性組成物は、約2%の生体分子保護剤、約2%のバル
キング剤、約50mMのバッファー、約0.25%の最終滅菌保護剤及び要求される濃度
(好ましくは、0.1〜0.5mg/ml)の生体分子を含んで成る。
最も好ましいのは、その生体分子が、溶液1ミリリッター当り約50〜200活性
単位の量で存在するバトロキソビンであるとき、その組成物は、2重量%のグリ
シン、(pH7を維持するための)50ミリモルのリン酸ナトリウム・バッファー、
2重量%のデキストラン及び0.25重量%のアスコルビン酸ナトリウムを含む。
本発明の好ましい態様においては、上記水溶液は、典型的にはケーキの形態に
ある便利な粉末組成物を提供するために凍結乾燥される。凍結乾燥技術は周知で
あり、そして好適な技術のいずれも使用されることができる。1の好適な凍結乾
燥(lyophilization)、すなわち、凍結乾燥(freeze drying)プロセスは、−45
℃へのその凍結乾燥装置の事前冷却、−40℃へのその溶液の冷凍、−25℃へのそ
の製品の暖め、そして11時間以上にわたる保持、−43℃へのその製
品の冷却、約0.1ミリバールへの減圧(すなわち、真空)の導入、そして水蒸気
の放散の停止により確認されるような乾燥が完結するまで、−43℃において減圧
を維持し、30℃まで5℃/時の増分においてその温度を上昇させながら、最低の
設定までその圧力を減少させ、そして少なくとも5時間にわたり30℃において、
そのように処理された製品を保持することを含む。
トロンビン又はトロンビン−様酵素、例えば、バトロキソビンのビオチン化形
態を含む本発明に係る組成物は、フィブリノーゲン又はフィブリノーゲン含有組
成物を、フィブリン・モノマー又はフィブリン・モノマー含有組成物に変換する
ために有用である。従って、本発明は、例えば、フィブリン接着剤の調製におい
て有用なフィブリン・モノマーを調製するための新規の方法をさらに含む。この
新規の方法は、本明細書中に定義するような安定な、ビオチン化トロンビン又は
トロンビン様酵素組成物にフィブリノーゲン源を供してフィブリノーゲンをフィ
ブリン・モノマーに変換させ、アビジン材料を用いてこのビオチン化酵素を“捕
獲”し、そしてこのように形成されたビオチン/アビジン複合体の一部である酵
素を除去することを含む。
理想的な環境においては、アビジンのいくつかはそのアガロース(又は他の不
活性な)支持体から浸出するはずであり、そして望ましくは、そのビオチン化生
体分子の全てがアビジン/不活性支持体材料により捕獲されるであろうが、これ
は、常にそうであることはできないと理解される。その不活性支持体から浸出し
た遊離のアビジンは、ビオチン化生体分子(例えば、バキソトロビン)とカップ
リングすることができ、又はその逆であることができ、溶液からの上記酵素複合
体の捕獲及び除去を可能にすることが今般発見された。従って、本組成物及び方
法の信頼性は、本明細書中に記載する自
己除去メドニウム(self-scavenging medonium)によりさらに高められる。
本発明に係る組成物は、処理装置、例えば、先に定義したようなフィブリン・
モノマーを調製するための自動遠心分離装置内にさらに取り込まれることができ
る。このビオチン化生体分子組成物は、粉末形態で上記処理装置内に事前ロード
されることができ、又はその装置内でその場で凍結乾燥され、又はその装置の制
御された放出区画内で凍結乾燥されることができる。
上記生体分子のビオチン化は、先に討議したように、公知のビオチン化プロセ
スのいずれかにより、達成されることができる。ビオチン対生体分子の比を注意
深く制御することは、その生体分子の最終的に所望される性能において重要であ
ることが発見された。例えば、EP 592242におけるフィブリン・モノマーの製造
プロセスにおいて使用されるビオチン化バトロキソビンに関しては、フィブリノ
ーゲンをフィブリン・モノマーに効率的に変換するために十分な活性を、そのバ
トロキソビンが保持していることが重要である。そのフィブリン・モノマー製品
からのその酵素の完全分離のために、そのビオチン化バトロキソビンがアビジン
材料により容易に捕獲されることも重要である。バトロキソビンの場合には、理
論的には、14のビオチン分子がその酵素に結合されることができる。本発明によ
って、1の組成物中のバトロキソビン分子当りのビオチン分子の平均数は、5〜
12の範囲内、そして好ましくは6〜8の範囲内にあるべきであることが発見され
た。その平均が約5未満である場合、かなりの数のバトロキソビン分子が実際に
ビオチン化されておらず、不完全な酵素捕獲がもたらされると信じられる。その
平均が約8を超える場合、バトロキソビン活性が減少されることも発見された。
これは、他の生体分子にも同様に、特にトロンビン及びトロンビン
様酵素にも適用されると信じられる。従って、ビオチン化試薬と反応することが
できる生体分子当り10以上の結合部位をもつ生体分子を含む組成物は、少なくと
も5、そして好ましくは、6ビオチン/生体分子の平均数をもつべきである。生
体分子当りのビオチンの上記の好ましい範囲は、その生体分子上の表面反応部位
のいずれかが超活性である場合、又はそのビオチン化のプロセスが、例えば、そ
の生体分子を固体表面に可逆的に結合させることにより、(ビオチン化剤)から
その生体分子表面の一部の物理的保護を含む場合に、減少されることができると
いうことは当業者に理解されるはずである。
本発明に係るビオチン化生体分子組成物は、顕著な量の生体分子の完全性及び
アビジン分子による優れた取り込みを維持しながら、凍結乾燥、最終滅菌に耐え
ることができる安定な組成物である。本発明を以下の実施例によりさらに説明す
るが、本発明は、そこに記載する細目により限定されるべきではない。
実施例1
0.2Mの重炭酸(炭酸水素)ナトリウム・バッファー、pH8.5(1.6ml)中のバ
トロキソビン(10.75mg;3560単位)の溶液に、水(1.6ml)を、その後、DMSO(1m
l)中にヒドロキシスクシンイミド・ビオチン(13.5mg)を含む溶液0.08mlを添
加した。この混合物を、20℃で1時間撹拌し、次に、10mMリン酸ナトリウム・バ
ッファー、pH7.0とグリシン(1% w/v)を含む溶液中で事前に平衡化され
たSephadex G-25クロマトグラフィー媒質のカラム(直径1cm×40cm)に直接適
用した。ビオチン−バトロキソビンを、0.4ml/分の流速で上記カラムから溶出
した。上記カラムから溶出されるべき最初のUV吸収ピークは、残存ビオチン化試
薬及び関連分解生成物の
いずれをも含んでいないことが測定された、精製されたビオチン・バトロキソビ
ンを含んでいた。これらは、上記カラムから溶出されるべき第2のUV吸収ピーク
中に存在した。この精製されたビオチン−バトロキソビンは、バトロキソビンの
1モル当り6.9モルのビオチンを含んでいた。この精製されたビオチン化バトロ
キソビンが、20℃で5分間、0.2M酢酸ナトリウム・バッファー、pH4.0中のアビ
ジン・アガロース・ゲルの懸濁液と混合されたとき、その精製されたビオチン化
バトロキソビンの>99.5%が捕獲された。
実施例2
実施例1に記載したように調製された精製ビオチン−バトロキソビンを、l0mM
リン酸ナトリウム・バッファー、pH7.0及びグリシン(1% w/v)を含む溶
液で溶出させて、1ミリリッター当り235バトロキソビン活性単位を含むビオチ
ン−バトロキソビンの溶液を提供した。この溶液の1容量を、グリシン(3%
w/v)、デキストラン(4% w/v)、アスコルビン酸(0.5% w/v)及
びオルトリン酸2水素ナトリウム(90mM)を含み、水酸化ナトリウムの添加によ
りpH7.0に調製された溶液1容量と混合した。このやり方で配合されたビオチン
−バトロキソビンは、−20℃,4℃及び20℃で1ヶ月保存されるとき酵素活性の
損失を全く示さないことが発見された。
実施例3
実施例2に記載したように調製した配合ビオチン−バトロキソビンを、ガラス
・バイアルに充填し(バイアル当り0.3ml)、そして凍結乾燥装置内に入れた。
この配合ビオチン−バトロキソビンを−40℃に冷却し、次に−25℃に暖め、そし
て11時間この温度に保った。この期間の終わりに、上記配合ビオチン・バトロキ
ソビンを−43℃に冷却し、そしてその圧力を、0.1ミリバールに減少させた。こ
れらの条件を、主乾燥期間の全体にわたり維持し、これは22時間後に完結した。
主乾燥の完結時、その圧力を0.08ミリバールに減少させ、そしてその凍結乾燥さ
れたビオチン・バトロキソビンを、1時間当り5℃の段階的増加において30℃ま
で暖めた。この凍結乾燥されたビオチン−バトロキソビンを、上記凍結乾燥装置
から取り出す前5時間にわたり30℃に保った。
凍結乾燥されたビオチン・バトロキソビンの検査は、その凍結乾燥プロセスの
間にバトロキソビン活性の損失が全く生じなかったことを示した。このやり方で
調製されたビオチン−バトロキソビンの凍結乾燥配合物は、3ヶ月間4℃での保
存後にバトロキソビン活性の損失を全く示さなかった。この凍結乾燥されたビオ
チン−バトロキソビンが水で再構築され、そして0.2M酢酸ナトリウム・バッフ
ァー、pH4.0中のアビジン・アガロース・ゲルの懸濁液と20℃で5分間混合され
たとき、そのビオチン化バトロキソビンの>99.5%が捕獲された。
実施例4
実施例3中に記載するように調製した凍結乾燥ビオチン−バトロキソビンを、
滅菌照射量(25キロ・グレイ)のガンマ線照射に供した。存在する初期活性の10
〜15%を構成するバトロキソビン活性の初期損失後、1ヶ月の期間にわたり、バ
トロキソビン活性のさらなる損失は、観察されなかった。照射されたビオチン−
バトロキソビンの分解は、ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動による電気泳動分
析後にも明らかでなかった。ガンマ線照射された凍結乾燥されたビオチン−バト
ロキソビンが水で再構築され、そして0.2M酢酸ナトリウム・バッファー中アビ
ジン・アガロース・ゲルの懸濁液と20℃で5分間混合されたとき、そのビオチン
化バトロキソビンの>99.5%が捕獲された。
表Iは、実施例1と実施例2の方法により調製されることができる配合ビオチ
ン−バトロキソビン組成物のさらなる例を与える。但し、実施例1におけるカラ
ム平衡バッファーと実施例2における配合バッファーを、表1のII,III及びIV
列内に示す最終的な配合ビオチン−バトロキソビン溶液中に、対応量のデキスト
ラン、グリシン及びアスコルビン酸を提供するように調整した。これらの、ビオ
チン−バトロキソビンの配合溶液を、実施例3の方法に従って凍結乾燥させ、そ
して実施例4の方法に従ってガンマ線照射に供した。ガンマ線照射後に残存する
バトロキソビン活性のパーセンテージを、表1のV列内に与える。本発明の実施
例番号を、表IのI列に与える。
表 I
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 FI テーマコート゛(参考)
G01N 33/53 G01N 33/53
33/531 33/531
(72)発明者 パーソン,ジェイムス シー.
イギリス国,ケンブリッジ シービー4
1ディーエックス,チェスタートン,チャ
ーチ ストリート,ピー テラス 1
(72)発明者 エドワードソン,ピーター エー.,ディ
ー.
イギリス国,チェスター シーエイチ1
4ビーイー,パークゲート ロード 327
(72)発明者 メンジーズ,アラン
イギリス国,コナーズ カイ シーエイチ
5 4エルジー,アッフランズ アベニュ
148
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1.ビオチン化生体分子のための安定な組成物であって: 上記ビオチン化分子; 上記生体分子の所望の活性を実質的に維持することができる生体分子保護剤; 上記組成物のpHを所望の値に維持するためのバッファー手段;及び 1以上の水溶性バルキング剤、 を含んで成る、前記組成物。 2.最終滅菌の間に前記組成物及び生体分子を分解又は不安定化から保護する ための剤をさらに含む、請求項1に記載の組成物。 3.前記ビオチン化生体分子が、ビオチン又はそのアナログ又はその誘導体形 態に結合された酵素又はタンパク質である、請求項1に記載の組成物。 4.前記酵素が、トロンビン、又はトロンビン様酵素であってアクチン(Acut in)、ベンザイム(Venzyme)、アンクロッド(Ancrod)、アスペラーゼ(Asperas e)、(B.Altrox,B.Moojeni又はB.Maranhao由来の)バトロキソビン(Batro xobin)、バトロパーゼ(Batropase)、クロトラーゼ(Crotolase)、フラボキソ ジン(Flavoxogin)及びガボナーゼ(Gabonase)から選ばれた酵素である、請求項 3に記載の組成物。 5.前記ビオチン化生体分子がビオチン−バトロキソビンである、請求項4に 記載の組成物。 6.前記生体分子保護剤が、トレハロース、グリセロール、硫酸アンモニウム 及びアミノ酸から選ばれた、請求項1に記載の組成物。 7.前記アミノ酸が、グリシン、アラニン及びバリンから選ばれた単純な両性 イオンである、請求項6に記載の組成物。 8.前記バッファー手段が、前記組成物のpHを約7に維持することができる剤 を含む、請求項1に記載の組成物。 9.前記バッファーが、リン酸ナトリウム、ナトリウム・バルビタール、シト レート、ナトリウム・バルビタール・ホスフェート、リン酸カリウム、イミダゾ ール−HCl、ピペラジン、重炭酸(炭酸水素)ナトリウム−5%CO2、トリエタノ ・アミン−HCl−NaOH、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン及びリン酸ナ トリウム・バッファーから選ばれ、リン酸ナトリウムが好ましい、請求項8に記 載の組成物。 10.前記最終滅菌保護剤が、抗酸化剤、フリー・ラジカル除去剤及び還元剤か ら選ばれた、請求項2に記載の組成物。 11.前記抗酸化剤が、還元型グルタチオン、α−トコフェロール、N,N−ジ メチル−p−フェニレンジアミン及びアスコルビン酸ナトリウムから選ばれた、 請求項10に記載の組成物。 12.前記バルキング剤が、非イオン性水溶性ポリマーである、請求項1に記載 の組成物。 13.前記ポリマーが、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリエ チレングリコール及び多糖類から選ばれた、請求項12に記載の組成物。 14.前記多糖類が、デキストラン、加水分解デンブン、ラクトース、グルコー ス、マルトース及びマンニトールから選ばれた、請求項13に記載の組成物。 15.前記デキストランが、約50,000と100,000ダルトンの間の分子量をもつ、 請求項14に記載の組成物。 16.水溶液である、請求項1に記載の組成物。 17.前記ビオチン化生体分子が、前記溶液1ml当り約50〜約200活性単位の量 で存在する、請求項16に記載の組成物。 18.前記ビオチン化生体分子が、前記溶液1ml当り約100〜約135活性単位の量 で存在する、請求項17に記載の組成物。 19.約0.01〜約10.0重量%の最終滅菌保護剤をさらに含む、請求項16に記載の 組成物。 20.前記最終滅菌保護剤が、約0.25重量%の量で存在する、請求項19に記載の 組成物。 21.前記1,2及び16に記載の組成物の中のいずれか1の乾燥粉末形態。 22.サンプルをビオチン化生体分子に供するための方法における、請求項1に 記載のビオチン化生体分子組成物の使用方法。 23.フィブリノーゲン含有組成物をビオチン化酵素に供してそのフィブリノー ゲンをフィブリン・モノマーに変換させ; ビオチンについてのアフィニティーをもつ材料を上記のように形成されフィブ リン・モノマー/ビオチン化酵素混合物に導入して、上記アフィニティー材料と ビオチン化酵素の複合体を形成させ;そして 上記のように形成された複合体、そしてそれによる上記酵素を、上記フィブリ ン・モノマー製品から分離する、ことを含むフィブリン・モノマーの製造方法に おいて、上記ビオチン化酵素として請求項1に記載の組成物を使用する方法。 24.安定性及び生体分子活性を維持しながら組成物に無菌性を提供する、ビオ チン化生体分子の最終滅菌方法であって、請求項2に記載の組成物を最終滅菌プ ロセスに供することを含む方法。 25.前記ビオチン化生体分子が、乾燥粉末形態にある、請求項24に記載の方法 。 26.10以上の結合部位をもつ生体分子をビオチン化する方法であって、5〜12 の間の、ビオチン対生体分子の平均値を提供することを含む方法。 27.前記平均値が6〜8の間にある、請求項26に記載の方法。 28.ビオチンをアビジンにカップリングさせ、そしてビオチン化生体分子と不 活性支持体上のアビジンとの複合体を形成させるために、ビオチン化生体分子を 、不活性支持体材料上のアビジンに供することを含むビオチン−アビジン・アフ ィニティーの使用方法において、請求項1に記載のビオチン化生体分子を使用す ることを含む方法。 29.フィブリノーゲン含有組成物をビオチン化酵素に供してそのフィブリノー ゲンをフィブリン・モノマーに変換させ; ビオチンについてのアフィニティーをもつ材料であってその多量が不活性支持 体上に固定化されているものを、上記のように形成されたフィブリン・モノマー /ビオチン化酵素混合物に導入して、上記の固定化されたアフィニティー材料と 上記のビオチン化酵素の第1複合体を形成し; 複合体を形成していないビオチン化酵素と、固定化されていない少量の上記材 料との間で、フィブリン・モノマー/ビオチン化酵素混合物内で第2複合体を形 成し;そして 上記のように形成された第1複合体と第2複合体を上記フィブリン・モノマー 組成物から除去する、 ことを含む、フィブリン・モノマーの製造方法。 30.ビオチン−アビジン・アフィニティー機構を使用する方法であって; ビオチン化生体分子を、アビジンであってその多量のものが不活性支持体上に 固定化されているものに供して、上記ビオチン化生体 分子と上記固定化されたアビジンとの間に第1複合体を形成させ;そして 上記の複合体を形成していないビオチン化生体分子と固定化されていない少量 のアビジンとの間で第2複合体を形成させる、 ことを含む方法。
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