JPH07194378A - トレハロースによる酵素の安定化法 - Google Patents
トレハロースによる酵素の安定化法Info
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- JPH07194378A JPH07194378A JP35228793A JP35228793A JPH07194378A JP H07194378 A JPH07194378 A JP H07194378A JP 35228793 A JP35228793 A JP 35228793A JP 35228793 A JP35228793 A JP 35228793A JP H07194378 A JPH07194378 A JP H07194378A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 不安定な制限酵素を安定化させて、利用性を
高める方法を提供する。 【構成】 酵素をTris-HCl、その他とからなる緩衝液に
溶解させた酵素保存溶液に 3 w/w％以上のトレハロース
を添加して酵素液とすることを特徴とするトレハロース
による酵素の安定化法。
高める方法を提供する。 【構成】 酵素をTris-HCl、その他とからなる緩衝液に
溶解させた酵素保存溶液に 3 w/w％以上のトレハロース
を添加して酵素液とすることを特徴とするトレハロース
による酵素の安定化法。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、緩衝液に溶解した状態
で保管され、使用されている不安定な酵素の安定性を高
める方法に関し、特に酵素保存溶液にトレハロースを添
加することにより、酵素を安定化すると共に、これを水
分の含有量が 5％程度以下になるまで濃縮することを可
能にしたことを特徴とするものである。
で保管され、使用されている不安定な酵素の安定性を高
める方法に関し、特に酵素保存溶液にトレハロースを添
加することにより、酵素を安定化すると共に、これを水
分の含有量が 5％程度以下になるまで濃縮することを可
能にしたことを特徴とするものである。
【０００２】
【従来の技術】一般に酵素は、生体内にあって、生体内
で特定な分子やその配列、或いは特定なラジカルに反応
して、これを切断したり、結合させたり、組み替えたり
する機能を有している。近年は、生物体から酵素を抽出
して、生体内でだけ作られていた物質を人工的に合成し
たり、医薬品その他の新たな有用物質を創り出そうとす
る試みがなされている。例えば、制限酵素は、ＤＮＡの
塩基配列を認識し、これを切断する機能を有する酵素で
あって、現在Hind 111、EcoR 1、BamH 1、その他約２０
００種ほどが確認されている。これらの酵素は、それぞ
れがＤＮＡの塩基配列の認識する部位が異なっていて、
ＤＮＡの或る特定な塩基配列を認識して、それを切断す
る。そのため、適当な酵素を選択して使用することによ
り、ＤＮＡの所望の箇所を切断することが出来るので、
遺伝子工学に欠かせないものとなっている。
で特定な分子やその配列、或いは特定なラジカルに反応
して、これを切断したり、結合させたり、組み替えたり
する機能を有している。近年は、生物体から酵素を抽出
して、生体内でだけ作られていた物質を人工的に合成し
たり、医薬品その他の新たな有用物質を創り出そうとす
る試みがなされている。例えば、制限酵素は、ＤＮＡの
塩基配列を認識し、これを切断する機能を有する酵素で
あって、現在Hind 111、EcoR 1、BamH 1、その他約２０
００種ほどが確認されている。これらの酵素は、それぞ
れがＤＮＡの塩基配列の認識する部位が異なっていて、
ＤＮＡの或る特定な塩基配列を認識して、それを切断す
る。そのため、適当な酵素を選択して使用することによ
り、ＤＮＡの所望の箇所を切断することが出来るので、
遺伝子工学に欠かせないものとなっている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】ところが、これらの酵
素の多くは生体から抽出した状態では極めて不安定で失
活し易く、殊に、乾燥や高温、凍結などに対して殆んど
抵抗力が無く、短時間で失活するため緩衝溶液にして常
に所定の温度に保って、取り扱われている。然し酵素
は、そのようにしてもなお安定性が低いため、その機能
を充分に発揮させることが出来ない、と云う問題があ
る。例えば制限酵素では、不凍液の役割を果たすグリセ
ロール（50％）を含む緩衝溶液にして、−20℃に冷却し
ておくことゝされている。そのため制限酵素は、取り扱
いや保存が面倒であって、保管装置を要する上に、これ
を運搬したり輸送したりする際には特定な冷却容器を必
要とするなどの問題がある。本発明は、上記した不安定
な制限酵素を安定化させて、利用性を高める方法に関す
るものである。
素の多くは生体から抽出した状態では極めて不安定で失
活し易く、殊に、乾燥や高温、凍結などに対して殆んど
抵抗力が無く、短時間で失活するため緩衝溶液にして常
に所定の温度に保って、取り扱われている。然し酵素
は、そのようにしてもなお安定性が低いため、その機能
を充分に発揮させることが出来ない、と云う問題があ
る。例えば制限酵素では、不凍液の役割を果たすグリセ
ロール（50％）を含む緩衝溶液にして、−20℃に冷却し
ておくことゝされている。そのため制限酵素は、取り扱
いや保存が面倒であって、保管装置を要する上に、これ
を運搬したり輸送したりする際には特定な冷却容器を必
要とするなどの問題がある。本発明は、上記した不安定
な制限酵素を安定化させて、利用性を高める方法に関す
るものである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明は、酵素を所定の
緩衝液に溶解させた酵素保存溶液にトレハロースを添加
して酵素液とすることにより、酵素を安定化することを
特徴とするものである。酵素溶中のトレハロースの濃度
が 3％程度以上になると、酵素が安定化し、37℃で 200
時間以上活性が持続される。トレハロースは、粉体の状
態のまゝで、或いは予じめ適度な濃度の溶液にして酵素
保存溶液に添加することにより、酵素保存溶液中のトレ
ハロースの濃度を調整することができる。又、酵素保存
溶液中に一旦トレハロースを添加した後、水分を乾燥さ
せて、これを水飴状、或いは粉体状になるまで濃縮する
ことが出来る。
緩衝液に溶解させた酵素保存溶液にトレハロースを添加
して酵素液とすることにより、酵素を安定化することを
特徴とするものである。酵素溶中のトレハロースの濃度
が 3％程度以上になると、酵素が安定化し、37℃で 200
時間以上活性が持続される。トレハロースは、粉体の状
態のまゝで、或いは予じめ適度な濃度の溶液にして酵素
保存溶液に添加することにより、酵素保存溶液中のトレ
ハロースの濃度を調整することができる。又、酵素保存
溶液中に一旦トレハロースを添加した後、水分を乾燥さ
せて、これを水飴状、或いは粉体状になるまで濃縮する
ことが出来る。
【０００５】
【実施例１】以下、本発明に係るトレハロースによる酵
素の安定化法を制限酵素に適用した実施例に基づいて具
体的に説明する。尚、本発明においては酵素の残存活性
は、アガロースゲル電気泳動法により測定した。制限酵
素・Hind111 1200 unit/ml、Tris-HCl（pH 7.5) 10mM、
KCl 200mM 、2-ＭＥ（2-mercaptoethanol) 10mM、ＥＤ
ＴＡ(Ethylenediaminetetraacetic acid) 0.1mM、ＢＳ
Ａ(Bovine serum albumine) 0.01 ％、及びグリセロー
ル 5％とからなる酵素保存溶液に20 w/w％のトレハロー
スを添加して酵素液を調整した。この酵素液を37℃で 2
00時間放置した後、酵素の活性を測定したところ、その
活性は酵素液を調整した直後のものと殆んど同一であっ
た。又、この酵素保存溶液に10 w/w％のトレハロースを
添加して酵素液を調整し、これを10〜40℃にて、１×10
-4〜４×102 mmHgの減圧下で、水分の最終の含有量が 5
％程度になるまで濃縮すると共に、夫々の濃縮段階の酵
素液について、上記と同様の条件で酵素の活性を測定し
た。その結果酵素液は、トレハロースの濃度が10％程度
以上に濃縮されると、その活性が酵素液を調整した直後
のものと殆んど同一になった。上記酵素液に、トレハロ
ースの添加量の15〜30％のグリセロールを添加して酵素
液を調整し、これを10〜40℃にて、１×10-4〜４×102
mmHgの減圧下で、水分を濃縮したところ、酵素液は水分
の含量が10％程度以下になると、含量が減少するに従っ
て次第に粘度が上昇し、更に濃縮が進んで水分の含量が
5〜 4％程度にまで減少すると、水飴状、又はソボロ状
になった。夫々の濃縮度の酵素液を37℃で 200時間放置
した後、酵素の活性を測定したところ、酵素液中のグリ
セロールの濃度によっては酵素の活性に影響が認められ
ず、その活性は酵素液を調整した直後のものと殆んど同
一であった。
素の安定化法を制限酵素に適用した実施例に基づいて具
体的に説明する。尚、本発明においては酵素の残存活性
は、アガロースゲル電気泳動法により測定した。制限酵
素・Hind111 1200 unit/ml、Tris-HCl（pH 7.5) 10mM、
KCl 200mM 、2-ＭＥ（2-mercaptoethanol) 10mM、ＥＤ
ＴＡ(Ethylenediaminetetraacetic acid) 0.1mM、ＢＳ
Ａ(Bovine serum albumine) 0.01 ％、及びグリセロー
ル 5％とからなる酵素保存溶液に20 w/w％のトレハロー
スを添加して酵素液を調整した。この酵素液を37℃で 2
00時間放置した後、酵素の活性を測定したところ、その
活性は酵素液を調整した直後のものと殆んど同一であっ
た。又、この酵素保存溶液に10 w/w％のトレハロースを
添加して酵素液を調整し、これを10〜40℃にて、１×10
-4〜４×102 mmHgの減圧下で、水分の最終の含有量が 5
％程度になるまで濃縮すると共に、夫々の濃縮段階の酵
素液について、上記と同様の条件で酵素の活性を測定し
た。その結果酵素液は、トレハロースの濃度が10％程度
以上に濃縮されると、その活性が酵素液を調整した直後
のものと殆んど同一になった。上記酵素液に、トレハロ
ースの添加量の15〜30％のグリセロールを添加して酵素
液を調整し、これを10〜40℃にて、１×10-4〜４×102
mmHgの減圧下で、水分を濃縮したところ、酵素液は水分
の含量が10％程度以下になると、含量が減少するに従っ
て次第に粘度が上昇し、更に濃縮が進んで水分の含量が
5〜 4％程度にまで減少すると、水飴状、又はソボロ状
になった。夫々の濃縮度の酵素液を37℃で 200時間放置
した後、酵素の活性を測定したところ、酵素液中のグリ
セロールの濃度によっては酵素の活性に影響が認められ
ず、その活性は酵素液を調整した直後のものと殆んど同
一であった。
【０００６】
【実施例２】制限酵素・Pst 1 1200 unit/ml 、Tris-H
Cl（pH 7.5) 10mM、KCl 200mM 、2-ＭＥ 10mM 、ＥＤＴ
Ａ0.1mM 、ＢＳＡ 0.01 ％、グリセロール 5％とからな
る酵素保存溶液にトレハロース 10 〜60 w/w％を添加し
て酵素液を調整した。この酵素液を37℃で 200時間放置
した後、酵素の活性を測定したところ、トレハロースの
添加量が30 w/w％以上のものは、活性が酵素液を調整し
た直後のものと殆んど同一になった。又、この酵素保存
溶液に20 w/w％のトレハロースを添加して酵素液を調整
し、これを10〜40℃にて、１×10-4〜４×102 mmHgの減
圧下で、水分の最終の含有量が 5％程度になり、液が水
飴状になるまで濃縮すると共に、夫々の濃縮段階の酵素
液について、上記と同様の条件で酵素の活性を測定し
た。その結果酵素液は、トレハロースの濃度が60 w/w％
程度以上に濃縮されると、その活性が酵素液を調整した
直後のものと殆んど同一になった。
Cl（pH 7.5) 10mM、KCl 200mM 、2-ＭＥ 10mM 、ＥＤＴ
Ａ0.1mM 、ＢＳＡ 0.01 ％、グリセロール 5％とからな
る酵素保存溶液にトレハロース 10 〜60 w/w％を添加し
て酵素液を調整した。この酵素液を37℃で 200時間放置
した後、酵素の活性を測定したところ、トレハロースの
添加量が30 w/w％以上のものは、活性が酵素液を調整し
た直後のものと殆んど同一になった。又、この酵素保存
溶液に20 w/w％のトレハロースを添加して酵素液を調整
し、これを10〜40℃にて、１×10-4〜４×102 mmHgの減
圧下で、水分の最終の含有量が 5％程度になり、液が水
飴状になるまで濃縮すると共に、夫々の濃縮段階の酵素
液について、上記と同様の条件で酵素の活性を測定し
た。その結果酵素液は、トレハロースの濃度が60 w/w％
程度以上に濃縮されると、その活性が酵素液を調整した
直後のものと殆んど同一になった。
【０００７】
【発明の効果】以上詳述したように本発明は、安定性が
極めて低いため、50％程度のグリセロールを含む緩衝溶
液にして、−20℃程度に冷却しておくことゝされていた
酵素保存溶液に数％以上のトレハロースを添加するもの
で、その操作が極めて簡単な上、酵素の安定性が著しく
向上し、常温でも保存することが可能になった。その結
果、特定な冷却容器を必要とするなどの問題がなくな
り、一定の活性を有する酵素を使用することが出来るよ
うになったのである。殊に、酵素液を、水分の含量が数
％程度になるまで濃縮することが可能となったため、酵
素の取り扱いが一段と簡易になったのである。
極めて低いため、50％程度のグリセロールを含む緩衝溶
液にして、−20℃程度に冷却しておくことゝされていた
酵素保存溶液に数％以上のトレハロースを添加するもの
で、その操作が極めて簡単な上、酵素の安定性が著しく
向上し、常温でも保存することが可能になった。その結
果、特定な冷却容器を必要とするなどの問題がなくな
り、一定の活性を有する酵素を使用することが出来るよ
うになったのである。殊に、酵素液を、水分の含量が数
％程度になるまで濃縮することが可能となったため、酵
素の取り扱いが一段と簡易になったのである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 和田 正 熊本県熊本市花園３−５−10 (72)発明者 大口 真央 静岡県静岡市登呂４丁目25番８号
Claims (3)
- 【請求項１】 酵素をTris-HCl、その他とからなる緩衝
液に溶解させた酵素保存溶液に 3 w/w％以上のトレハロ
ースを添加して酵素液とすることを特徴とするトレハロ
ースによる酵素の安定化法。 - 【請求項２】 酵素液を調整した後、これを濃縮して所
望の濃度の酵素液とすることを特徴とする請求項１記載
のトレハロースによる酵素の安定化法。 - 【請求項３】 酵素液には、5 ％以上、又はトレハロー
スの 0.1〜 2倍量のグリセロールを添加することを特徴
とする請求項１、又は２記載のトレハロースによる酵素
の安定化法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP35228793A JPH07194378A (ja) | 1993-12-28 | 1993-12-28 | トレハロースによる酵素の安定化法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP35228793A JPH07194378A (ja) | 1993-12-28 | 1993-12-28 | トレハロースによる酵素の安定化法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07194378A true JPH07194378A (ja) | 1995-08-01 |
Family
ID=18423038
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP35228793A Withdrawn JPH07194378A (ja) | 1993-12-28 | 1993-12-28 | トレハロースによる酵素の安定化法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH07194378A (ja) |
Cited By (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0821058A2 (en) * | 1996-07-25 | 1998-01-28 | The Institute Of Physical & Chemical Research | Method for enhancing enzyme activity at elevated temperature |
| JPH1084954A (ja) * | 1996-07-25 | 1998-04-07 | Rikagaku Kenkyusho | 酵素を熱活性化する方法 |
| EP0865486A1 (en) * | 1995-11-09 | 1998-09-23 | Bristol-Myers Squibb Company | Stable biotinylated biomolecule composition and methods |
| EP0868916A2 (en) * | 1997-03-04 | 1998-10-07 | Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo | Reduction inhibitory agent for active-oxygen eliminating activity |
| JP2007151546A (ja) * | 2005-11-11 | 2007-06-21 | Toyobo Co Ltd | 生体分子の安定化方法および組成物 |
| WO2007148451A1 (ja) * | 2006-06-22 | 2007-12-27 | Kikkoman Corporation | ポリアミンオキシダーゼの安定化方法と基質特異性の改良方法 |
| WO2008136263A1 (ja) * | 2007-04-27 | 2008-11-13 | Toyo Boseki Kabushiki Kaisha | 凍結しないｄｎａリガーゼ反応組成物 |
| KR100880186B1 (ko) * | 2007-01-16 | 2009-01-28 | (주)바이오니아 | 건조 제한효소 조성물 및 이의 제조방법 |
| WO2009107816A1 (ja) * | 2008-02-29 | 2009-09-03 | 独立行政法人理化学研究所 | 酵素の反応性を改善する方法 |
-
1993
- 1993-12-28 JP JP35228793A patent/JPH07194378A/ja not_active Withdrawn
Cited By (19)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0865486A1 (en) * | 1995-11-09 | 1998-09-23 | Bristol-Myers Squibb Company | Stable biotinylated biomolecule composition and methods |
| JP2007295936A (ja) * | 1995-11-09 | 2007-11-15 | Bristol Myers Squibb Co | 安定なビオチン化生体分子の組成物及び方法 |
| JP2000514778A (ja) * | 1995-11-09 | 2000-11-07 | ブリストル−マイヤーズ スクイブ カンパニー | 安定なビオチン化生体分子の組成物及び方法 |
| EP0865486A4 (en) * | 1995-11-09 | 2002-06-26 | Bristol Myers Squibb Co | STABLE COMPOSITIONS BASED ON BIOTINYLATED BIOMOLECULES AND METHODS OF USE THEREOF |
| US6551794B1 (en) | 1995-11-09 | 2003-04-22 | E. R. Squibb & Sons, Inc. | Stable biotinylated biomolecule composition |
| EP0821058A2 (en) * | 1996-07-25 | 1998-01-28 | The Institute Of Physical & Chemical Research | Method for enhancing enzyme activity at elevated temperature |
| JPH1084954A (ja) * | 1996-07-25 | 1998-04-07 | Rikagaku Kenkyusho | 酵素を熱活性化する方法 |
| EP0821058A3 (en) * | 1996-07-25 | 1998-08-05 | The Institute Of Physical & Chemical Research | Method for enhancing enzyme activity at elevated temperature |
| EP0868916A3 (en) * | 1997-03-04 | 2004-09-15 | Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo | Reduction inhibitory agent for active-oxygen eliminating activity |
| US7186824B2 (en) | 1997-03-04 | 2007-03-06 | Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo | Reduction inhibitory agent for active-oxygen eliminating activity |
| EP0868916A2 (en) * | 1997-03-04 | 1998-10-07 | Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo | Reduction inhibitory agent for active-oxygen eliminating activity |
| JP2007151546A (ja) * | 2005-11-11 | 2007-06-21 | Toyobo Co Ltd | 生体分子の安定化方法および組成物 |
| WO2007148451A1 (ja) * | 2006-06-22 | 2007-12-27 | Kikkoman Corporation | ポリアミンオキシダーゼの安定化方法と基質特異性の改良方法 |
| JPWO2007148451A1 (ja) * | 2006-06-22 | 2009-11-12 | キッコーマン株式会社 | ポリアミンオキシダーゼの安定化方法と基質特異性の改良方法 |
| JP5166259B2 (ja) * | 2006-06-22 | 2013-03-21 | キッコーマン株式会社 | ポリアミンオキシダーゼの安定化方法と基質特異性の改良方法 |
| KR100880186B1 (ko) * | 2007-01-16 | 2009-01-28 | (주)바이오니아 | 건조 제한효소 조성물 및 이의 제조방법 |
| WO2008136263A1 (ja) * | 2007-04-27 | 2008-11-13 | Toyo Boseki Kabushiki Kaisha | 凍結しないｄｎａリガーゼ反応組成物 |
| WO2009107816A1 (ja) * | 2008-02-29 | 2009-09-03 | 独立行政法人理化学研究所 | 酵素の反応性を改善する方法 |
| JP5515121B2 (ja) * | 2008-02-29 | 2014-06-11 | 独立行政法人理化学研究所 | 酵素の反応性を改善する方法 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A300 | Withdrawal of application because of no request for examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A300 Effective date: 20010306 |