WO2009107816A1 - 酵素の反応性を改善する方法 - Google Patents

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WO2009107816A1
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trehalose
dna
reaction
enzyme
carrier
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美樹 小島
ピエロ カルニンチ
林崎　良英
マティアス ハーベス
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独立行政法人理化学研究所
株式会社ダナフォーム
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    • C12N9/96—Stabilising an enzyme by forming an adduct or a composition; Forming enzyme conjugates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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    • C12Q1/6869—Methods for sequencing

Definitions

  • the present invention relates to a method for increasing the reactivity of an enzyme to a target substance immobilized on a carrier using at least one substance selected from the group consisting of sugars, amino acids, polyhydric alcohols and derivatives thereof, and sugars, amino acids
  • the present invention relates to a method for mitigating or suppressing the effect of inhibiting the reactivity of an enzyme to a target substance by using at least one substance selected from the group consisting of polyhydric alcohols and derivatives thereof.
  • a target DNA is synthesized from template DNA or RNA using a biotin-labeled primer, and the obtained target DNA is purified and recovered using paramagnetic streptavidin beads.
  • This method by utilizing the specific and stable binding characteristics of streptavidin and biotin, high-purity cDNA can be efficiently recovered simply by washing the beads and aggregating by magnetism. Therefore, if this method is applied to the preparation of a cDNA library, it can be expected to efficiently produce a highly pure cDNA library, and if this method is applied to a sequencing reaction, it can be expected to perform sequencing efficiently.
  • GSC Gene Signature Cloning
  • the present inventors succeeded in recovering the target DNA simply and in a short time by applying the method for purifying and recovering the target DNA using the magnetic streptavidin beads to the GSC method.
  • the recovery amount of the target DNA was very low compared with the amount expected in the liquid phase homogeneous system.
  • the present inventors applied a method for purifying and recovering target DNA using a streptavidin plate instead of beads to a DNA synthesis reaction. A sufficient amount of target DNA could not be recovered compared to the amount to be produced.
  • the present inventors have not sufficiently performed the enzyme reaction in the enzyme reaction in which the enzyme is allowed to act on the target DNA immobilized on a carrier such as a bead or a plate, and therefore the recovery rate of the target DNA is low. I thought it would decrease. Furthermore, by increasing the reactivity of the enzyme to the target DNA immobilized on a carrier such as a bead or plate, and reducing or suppressing the inhibitory effect of the enzyme reaction by the carrier, the recovery rate of the target DNA can be increased under the above conditions. I thought it could be improved.
  • an object of the present invention is to provide a method for increasing the reactivity of an enzyme with respect to a target substance immobilized on a carrier and a method for reducing or suppressing the inhibitory effect of the enzyme reaction by the carrier.
  • the present inventors complemented DNA fragments with a SOLEXA sequencing system that performs template amplification reaction and sequencing reaction on a DNA microarray-like ultra-high-density flow cell, or oligo primers immobilized on beads in an oil-water emulsion.
  • a SOLEXA sequencing system that performs template amplification reaction and sequencing reaction on a DNA microarray-like ultra-high-density flow cell, or oligo primers immobilized on beads in an oil-water emulsion.
  • the present invention has been completed based on the above findings.
  • the following method is provided: (1) A method for increasing the reactivity of an enzyme with respect to a target substance immobilized on a carrier by causing at least one substance selected from the group consisting of saccharides, amino acids, polyhydric alcohols and derivatives thereof to exist. (2) The presence of at least one substance selected from the group consisting of saccharides, amino acids, polyhydric alcohols and derivatives thereof inhibits the reactivity of the enzyme to the target substance by the carrier on which the target substance is immobilized. A method of reducing or suppressing the effect.
  • the saccharide is trehalose, maltose, glucose, sucrose, lactose, xylobiose, agarobiose, cellobiose, levanbiose, chitobiose, 2- ⁇ -glucuronosyl glucuronic acid, allose, altrose, galactose, gulose, idose, mannose,
  • the amino acid or derivative thereof is N e -acetyl- ⁇ -lysine, alanine, ⁇ -aminobutyric acid, betaine, glycine betaine, N a -carbamoyl-L-glutamine-1-amide, choline, dimethyl tetin,
  • nucleic acid is single-stranded or double-stranded DNA or RNA.
  • nucleic acid is a nucleic acid obtained by hybridizing DNA and RNA.
  • the enzyme is at least one enzyme selected from the group consisting of a transferase, a hydrolase, and a synthetic enzyme.
  • the enzyme is DNA polymerase, RNase, or DNA ligase.
  • the enzyme is reverse transcriptase, DNA polymerase, RNase and DNA ligase.
  • a simple, safe and inexpensive method in which at least one substance selected from the group consisting of saccharides such as trehalose, amino acids, polyhydric alcohols and derivatives thereof is simply added at a predetermined concentration.
  • the reactivity of the enzyme to the target substance immobilized on the carrier can be improved, and the inhibitory effect on the reactivity of the enzyme to the target substance by the carrier on which the target substance is immobilized can be alleviated or suppressed. That is, according to the present invention, a DNA synthesis reaction, a restriction enzyme reaction, a nucleic acid degradation reaction, a sequence reaction, etc. with respect to a target DNA immobilized on a carrier can be promoted simply, safely and inexpensively.
  • the reactivity of DNA synthesis near the carrier surface can be improved, so that subsequent high-purity recovery and specific separation of DNA, simplification of purification, shortening of operation time, etc. are possible. It becomes. Furthermore, according to the present invention, it can be applied to enzyme reactions under various conditions with respect to target substances such as nucleic acids and peptides immobilized on a carrier, and even when it is difficult to maintain the reactivity of the enzyme with the carrier, Can have an advantageous effect. Therefore, the present invention can be applied not only to cDNA library preparation and GSC method but also to large-scale and automatic sequence systems such as SOLEXA sequence system and 454 sequence system, and further improvement of these performances. Is expected to lead to
  • FIG. 1 shows the result of measuring the change in the amount of 50 bp DNA fragment depending on the trehalose concentration.
  • FIG. 2 shows the results of measuring the amount of double-stranded cDNA synthesis.
  • FIG. 3 shows the results of measuring various restriction enzyme reaction efficiencies.
  • FIG. 4 shows the measurement results of cDNA phage library titer.
  • FIG. 5 shows the results of measuring restriction enzyme reaction efficiency on the surface of each carrier.
  • FIG. 6A shows the results of measuring the distance from each carrier reaction surface to the DNA cleavage reaction position and the reaction efficiency and comparing the shape of the carrier for each distance.
  • FIG. 6B shows the results of measuring the distance from each carrier reaction surface to the DNA cleavage reaction position and the reaction efficiency, and comparing the distance for each shape of the carrier.
  • FIG. 6A shows the results of measuring the distance from each carrier reaction surface to the DNA cleavage reaction position and the reaction efficiency, and comparing the distance for each shape of the carrier.
  • FIG. 6A shows the results of
  • FIG. 7 shows the results of measuring the enzyme reaction efficiency under each reaction condition.
  • FIG. 8 shows a state after 3 hours from the bead-immobilized DNA restriction enzyme stationary reaction.
  • FIG. 9 shows the results of measuring the difference in activity of the cleavage reaction between the bead surface and the plate surface due to the enzyme.
  • FIG. 10 shows the measurement results by the SOLEXA sequence system.
  • FIG. 11 shows a DNA fragment obtained by PCR amplification of cDNA obtained by reverse transcription of ShortRNA.
  • FIG. 12 shows the results of comparison of the number of DNA amplification wells in the 454 sequence system.
  • FIG. 13 shows the results from the 454 sequence system.
  • FIG. 14 shows the evaluation results of the sequence Read number and the cDNA Tag number with respect to the influence of trehalose in the emulsion PCR of the 454 sequence system.
  • FIG. 15 shows the results of evaluating the influence of trehalose in a liquid phase homogeneous system by changing the size of the DNA fragment.
  • FIG. 16 shows the results of electrophoresis evaluation of the influence of trehalose in a liquid phase homogeneous system.
  • FIG. 17 shows the results of measuring enzyme reaction efficiency in the presence of various concentrations of additive reagents in Example 13.
  • FIG. 18 shows the measurement results of the 454 sequence system in Example 14.
  • FIG. 19 shows the measurement results of the 454 sequence system in Example 14.
  • FIG. 20 shows the measurement results of the SOLEXA sequence system in Example 15.
  • FIG. 21 shows the measurement results of the SOLEXA sequence system in Example 15.
  • FIG. 22 shows the measurement results of the SOLEXA sequence system in Example 16.
  • FIG. 23 shows the measurement results of the SOLEXA sequence system in Example 16.
  • FIG. 24 shows the measurement results of the SOLiD sequence system in Example 17.
  • FIG. 25 shows the measurement results of the 454 sequence system in Example 18.
  • the method of the present invention is a method for increasing the reactivity of an enzyme to a target substance immobilized on a carrier by the presence of at least one substance selected from the group consisting of sugars, amino acids, polyhydric alcohols and derivatives thereof, And the presence of at least one substance selected from the group consisting of saccharides, amino acids, polyhydric alcohols and derivatives thereof, the effect of inhibiting the reactivity of the enzyme to the target substance by the carrier on which the target substance is immobilized. It is a method of mitigating or suppressing.
  • saccharides, amino acids, polyhydric alcohols and derivatives thereof compared to a case where at least one substance selected from the group consisting of saccharides, amino acids, polyhydric alcohols and derivatives thereof does not exist, saccharides, amino acids, polyhydric alcohols and The presence of at least one substance selected from the group consisting of these derivatives can improve the reactivity of the enzyme with the target substance immobilized on the carrier.
  • saccharides include oligosaccharides and monosaccharides. Specific examples of the saccharide include trehalose, maltose, glucose, sucrose, lactose, xylobiose, agarobiose, cellobiose, levanbiose, chitobiose, 2- ⁇ -glucuronosyl glucuronic acid, allose, altrose, galactose, gulose and idose. , Mannose, talose, sorbitol, levulose, xylitol, arabitol and the like can be mentioned without limitation, among which trehalose, glucose, sorbitol and the like are preferably used. Saccharides may be used alone or in combination of two or more.
  • the above amino acids may be used alone or in combination of two or more.
  • betaine and sarcosine are preferably used.
  • polyhydric alcohol examples include glycerol, ethylene glycol, polyethylene glycol, and the like. Among them, ethylene glycol is preferable.
  • the polyhydric alcohols may be used alone or in combination of two or more.
  • saccharide amino acid, polyhydric alcohol and derivatives thereof, any of synthetic products and commercially available products can be used, and any of anhydrous products and hydrates may be used.
  • the amount of sugars, amino acids, polyhydric alcohols and their derivatives used is not particularly limited, and can be adjusted as appropriate depending on the amount of enzyme and the inhibitory effect of enzyme reactivity by the carrier.
  • trehalose or sorbitol alone can be used.
  • the final concentration of trehalose or sorbitol in the solution is 0.1-1M, preferably 0.4-0.8M, more preferably 0.6M.
  • target substance in the present specification is not particularly limited as long as it is a substance that is a target of the enzyme used, and examples thereof include nucleic acids, peptides, sugars, fatty acids, and the like, preferably nucleic acids, More preferred are nucleic acids in which RNA and DNA are hybridized, and single-stranded and double-stranded DNA.
  • enzyme used in the present specification is not particularly limited in the meaning usually used.
  • oxidoreductase EC 1
  • transferase EC 2
  • hydrolase EC 3
  • dehydrogenase EC 4
  • isomerase EC 5
  • synthetic enzyme EC 6
  • T4 DNA ligase E. coli DNA ligase
  • DNA ligase such as E. coli DNA ligase
  • RNA ligase such as T4 RNA ligase
  • Polynucleotide kinase such as T4 polynucleotide kinase and polynucleotide kinase
  • Alkaline phosphatase E.
  • DNA polymerase such as DNA polymerase I and T4 DNA polymerase; Reverse transcriptase such as prime script reverse transcriptase, reverse transcriptase XL and M-MLV reverse transcriptase; terminal Deoxynucleotidyl transferase; SP6 RNA RNA polymerases such as limerase and T7 RNA polymerase; poly (A) polymerase; nucleases such as S1 nuclease, manbean nuclease, micrococcal nuclease and BAL 31 nuclease; exonucleases such as exonuclease I and exonuclease III; deoxyribonuclease I DNase I; RNases such as RNase H and RNase A; DNA topoisomerase I; DNA methyltransferase; DNA
  • Preferred examples of the enzyme include a DNA polymerase that is a transferase, more preferably DNA polymerase I; an RNase that is a hydrolase, more preferably RNase H, and a DNA ligase that is a synthase, more preferably E. coli. Examples thereof include, but are not limited to, E. coli DNA ligase; and transcriptase which is a reverse transcriptase, more preferably M-MLV reverse transcriptase.
  • restriction enzymes can include any restriction enzyme used in genetic engineering. Examples include StyI, EcoRI, MluI, NcoI, DNaseI, RNaseI, NdeI, PvuII, PstI, DraI, XhoI, NotI, HindIII, HincII, and the like. However, it is not limited to these.
  • the temperature can be set in accordance with the optimum temperature and deactivation temperature of the enzyme used, but it is usually 1-100 ° C., preferably 5-60 ° C. Preferably, it can be carried out at a temperature of 10 to 40 ° C.
  • the enzyme contains E. coli.
  • the method of the present invention can be performed at a temperature of 16 ° C.
  • the method of the present invention can be carried out at a temperature of 37 ° C.
  • target substance immobilized on a carrier and “carrier on which a target substance is immobilized” are targets in which at least a part of the carrier and at least a part of the target substance are attached. It is not particularly limited as long as it is a substance and a carrier, but in order to form such a state, ionic bond, hydrogen bond, hydrophobic bond, covalent bond, van der Waals bond, hydrophobic bond, affinity bond, physical and chemisorption, etc. Can be used.
  • the method of attaching the carrier and the target substance is not particularly limited, for example, whether the target substance is attached on the surface of the carrier or the target substance is embedded in the carrier.
  • the “carrier” in the present specification is not particularly limited as long as a target substance can be attached thereto, but the shape can include beads, plates, fibers, tubes, containers (test tubes and vials), and among them beads And plates are preferred.
  • the material of the carrier may be either inorganic or organic.
  • glass or cement ceramics such as ceramics or new ceramics, polyethylene terephthalate, cellulose acetate, bisphenol A polycarbonate, polystyrene, polymethyl methacrylate, or other polymers, silicon, activated carbon , Porous glass, porous ceramics, porous silicon, porous activated carbon, woven fabric, knitted fabric, nonwoven fabric, filter paper, short fiber, porous material such as membrane filter, conductive material such as gold, etc.
  • the surface of the carrier may be subjected to a treatment for introducing a functional group such as an amino group, a carboxyl group or a hydroxy group or a polymer such as streptavidin.
  • a functional group such as an amino group, a carboxyl group or a hydroxy group or a polymer such as streptavidin.
  • Specific examples of such carriers include streptavidin beads, streptavidin plates, and DNA microarray plates.
  • the size of the carrier is not particularly limited, but is preferably such a size that the enzyme reaction is confirmed to be reduced by the carrier.
  • the diameter is usually 0.5 ⁇ m or more, preferably 1 ⁇ m or more, more preferably 1.5 ⁇ m or more, further preferably 2 ⁇ m or more, and still more preferably 2.5 ⁇ m or more. Can do.
  • the upper limit of the diameter of the carrier is not particularly limited, but in the case of a bead-like carrier, it is about 10 to 100 ⁇ m.
  • Specific examples of the bead-shaped carrier include TAKARA's MAGNOTEX-SA, and the bead-shaped carrier has a diameter of 2.3 ⁇ 0.3 ⁇ m.
  • the distance between the carrier and the reaction site for the enzyme of the target substance immobilized on the carrier is, for example, when the target substance is a nucleic acid, the reaction site is 1 to 200 bases from the carrier, preferably 5 It is sufficient that the distance is ⁇ 150 bases, more preferably 5 to 100 bases, more preferably 10 to 80 bases, still more preferably 10 to 50 bases, and most preferably 10 to 20 bases. However, the distance may vary depending on the target substance and the type of enzyme.
  • the enzyme is a restriction enzyme
  • the target substance is a double-stranded DNA whose restriction enzyme site is 20 bases, 50 bases or 100 bases away from the carrier, Or, regardless of the plate, the reactivity of the enzyme tends to improve in the order of double-stranded DNA 20 bases away from the carrier, double-stranded DNA 50 bases away, and double-stranded DNA 100 bases away. is there.
  • the method of the present invention can be applied to a method for preparing a ⁇ phage cDNA library.
  • mRNA is reverse-transcribed with a biotinylated primer, and the synthesized cDNA / mRNA hybrid is immobilized with streptavidin beads or a streptavidin plate, and then double-stranded cDNA is obtained by applying the method of the present invention.
  • Examples include a method of synthesizing and then ligating the recovered cDNA to a ⁇ phage vector to prepare a ⁇ phage cDNA library.
  • the titer of the ⁇ phage cDNA library thus prepared can be expected to show a higher value than when the method of the present invention is not applied.
  • the method of the present invention can be applied to, for example, the GSC method.
  • the GSC method is a kind of cDNA library preparation method. By using this method, the 5 ′ end and 3 ′ end of the cDNA can be minimized, and a large number of cDNA information can be obtained in one sequence reaction. it can.
  • the outline of the GSC method using beads will be described according to the following scheme.
  • Single-stranded cDNA is synthesized from mRNA using 1st Gsul-T14 primer with biotinylated 5 'end (1 to 4 in the above figure).
  • GS 5 ′ Adapter is ligated to the synthesized cDNA, and then the complementary strand of cDNA is synthesized (5 and 6 in the above figure).
  • GS 3 ′ Adapter is ligated to the cDNA, and then XhoI treatment is performed to obtain a cDNA ligated with Adapter at both ends.
  • the obtained cDNA is cloned into a ⁇ -pFLC-III-Fm plasmid through regulation such as packaging with a phage vector (9 in the above figure).
  • the plasmid after cloning is subjected to Mmel treatment, GS Fill-in Adapter ligation, and Mva1269I treatment in order, and then self-ligation to obtain a plasmid construct containing the 5 ′ end and 3 ′ end of the cDNA (see above figure). 10-14 of them).
  • the obtained plasmid construct is PCR amplified using GS primer F1-Biotin and GS primer R1-Biotin with biotinylated ends, and the resulting amplified product is collected with streptavidin beads and then treated with BceAI.
  • GSC diTag which is a DNA fragment containing the 5 ′ end and 3 ′ end of cDNA, can be obtained (15 to 17 in the above figure).
  • GSC diTags can be linked together after purification (18 in the above figure).
  • GSC diTag can be obtained in which the 5 'and 3' end nucleotide sequences of cDNA are minimized, and GSC diTag is linked and sequenced to produce a large amount of cDNA in a single sequence. Information can be obtained.
  • the GSC method is a very useful method that can detect a transcription start point and a transcription end point on a large scale by following such a procedure.
  • the method of the present invention can be applied to the step of obtaining single-stranded cDNA (1 to 4 in the above figure) and the step of obtaining GSC diTag (15 to 17 in the above figure) in the GSC method described above. That is, the method of the present invention can be applied to the GSC method by setting the target substance immobilized on the carrier to the above-mentioned single-stranded cDNA and GSC diTag, which are target substances of the GSC method.
  • the recovery rate of the single-stranded cDNA and GSC diTag can be improved.
  • the methods described in the examples can be given.
  • the method of the present invention can be used for a DNA synthesis reaction such as PCR or a sequencing reaction on a carrier.
  • a DNA microarray plate is used as a carrier
  • the target substance is a single-stranded DNA on the carrier
  • the enzyme is a DNA polymerase
  • the method of the present invention can be applied to a cluster amplification reaction by bridge PCR in the SOLEXA sequence system.
  • the SOLEXA sequencing system is a sequencing system provided by Illumina (see http://www.illuminakk.co.jp/, the description of which is specifically incorporated herein by reference). It is a large-scale sequencer that can determine the base sequence of many DNA fragments in parallel.
  • the method of the present invention is applied to, for example, the bridge PCR of the SOLEXA sequence system based on the description of the examples, the cluster amplification of the template DNA is improved by improving the reactivity of the DNA polymerase in the DNA synthesis. The number rises. In addition, the fluorescence intensity of each base increases, resulting in an increase in the amount of sequence determined.
  • the enzyme activity in the sequencing reaction is increased, and the extension reaction of more molecules takes place, improving the decrease in fluorescence emission intensity associated with the reaction cycle, and sequencing. The mapping rate to the genome of the sequence was increased.
  • the method of the present invention can be applied to a sequencing system using a 454 sequencer (Roche). More specifically, the method of the present invention can be applied to each of emulsion PCR and sequencing reaction in which PCR is performed on beads in a 454 sequencing system.
  • Sequencer (Genome Sequencer FLX System) is an innovative method for rapidly decoding and assembling whole genome sequences. It is one of the large-scale sequencers that provides overwhelming processing power in terms of read length and number of reads. is there. Since the average length of 200 to 300 bases per read is decoded and the base sequence of 400,000 reads is decoded, sequence data of 100 million bases or more can be analyzed in 7.5 hours in one run. Furthermore, each base decoding accuracy of the read sequence exceeding 200 bases is 99.5% or more.
  • This 454 sequence system undergoes a process of adsorbing and fixing a DNA template on a spherical bead, enclosing it in an oil-water emulsion and amplifying it, that is, emulsion PCR.
  • emulsion PCR an oil-water emulsion and amplifying it
  • the enzyme activity in the emulsion PCR is increased, and the sequence analysis amount is significantly improved.
  • the method of the present invention can also be applied to a sequence reaction after emulsion PCR.
  • the method of the present invention can be applied to a sequencing system using a SOLiD sequencer (Applied Biosystems). More specifically, the method of the present invention can be applied to emulsion PCR and sequencing reaction in which PCR is performed on beads in a SOLiD sequencing system, respectively. For example, as shown in the Examples, by applying the present invention to this emulsion PCR, the enzyme activity in the emulsion PCR is increased, and the sequence analysis amount is significantly improved. In addition, even in a sequence reaction after emulsion PCR, an increase in noise can be improved by applying the method of the present invention. In addition to the method described above, the method of the present invention can also be applied to a sequence system using an apparatus such as a next-generation sequencer, for example, a Helicos sequencer (Helicos Biosciences).
  • a next-generation sequencer for example, a Helicos sequencer (Helicos Biosciences).
  • DNA fragment cleavage PCR was performed using pFLCIII vector as a template and a 300 bp DNA fragment biotinylated primer (SEQ ID NOs: 1 and 2), and a 50 bp DNA fragment released by cleavage at the Type II restriction enzyme site BceAI. Detected. Paramagnetic streptavidin beads were washed with the attached 1 ⁇ Binding buffer, recovered with a magnetic stand, the supernatant was removed, and then suspended in the same buffer. The PCR product-containing solution and 2 ⁇ Binding buffer were mixed in an equal volume, further added with a bead solution, and mixed and adsorbed while gently rotating at room temperature for 15 minutes.
  • RNA is reverse transcribed with Unique oligo-dT with various restriction enzyme sites, and the cDNA / RNA hybrid is adsorbed on the beads and double-stranded by Gubler-Hoffman method.
  • the synthesis reaction was performed as follows.
  • RNA single-stranded cDNA synthesis
  • SEQ ID NO: 3 reverse transcription primer labeled with biotin at the 5 ′ end
  • Reverse transcription reaction solution (1 ⁇ GC buffer (TAKARA), 0.3 mM dNTP mix, saturated sorbitol / trehalose solution 30 ul, M-MLV 3000 unit)
  • ⁇ [32P] dGTP add 42 ° C for 30 minutes, 50 ° C For 10 minutes at 56 ° C. for 10 minutes.
  • proteinase K reaction the precipitate was precipitated with CTAB / Urea and redissolved with 7M Gu-HCl. Further EtOH precipitation was performed.
  • Adsorption of biotin-labeled cDNA / RNA hybrid to paramagnetic streptavidin beads Wash the paramagnetic streptavidin beads with the supplied 1x Binding buffer, collect with a magnetic stand, remove the supernatant, and suspend with the same buffer. It became cloudy.
  • the cDNA / RNA hybrid solution and 2 ⁇ Binding buffer were mixed, and the bead solution was added and mixed and adsorbed while gently rotating at room temperature for 15 minutes.
  • the sample adsorbing beads were collected with a magnetic stand and washed 3 times with 1 ⁇ Binding buffer.
  • Double-stranded cDNA synthesis (Gubler-Hoffman method) The cDNA / RNA hybrid-adsorbed streptavidin beads were washed once with a double-stranded synthesis reaction buffer (10 ⁇ Ecoli. Ligase buffer Invitrogen). For the reaction solution (1 x Ecoli. Ligase buffer, 0.2 mM dNTP mix, E. coli. DNA Ligase 10 units, E. coli. DNA polymerase I 40 units, E. coli. RNase H 2 units), add final concentration 0.6MD (+) trehalose. Two types of trehalose (+) and trehalose (-) not added were prepared.
  • FIG. 3 shows the measurement results of the recovered amount of free cDNA. In both cases, Trehalose (+) showed higher recovery.
  • the beads after the reaction are washed 3 times with 0.1 ⁇ TE, and further washed once with 1 ⁇ Ligation buffer.
  • Ligation reaction solution (1 ⁇ T4 DNA Ligation buffer, 0.6 M trehalose, 5′-end BamH I protruding adapter 2 ug, T4 DNA Ligase 800 unit) was added and reacted at 16 ° C. overnight.
  • the beads were washed 3 times with 0.1 ⁇ TE and further washed once with 1 ⁇ Xho I buffer.
  • a restriction enzyme Xho I reaction solution (1 ⁇ Xho I buffer, 0.6 M trehalose, Xho I 40 unit) was added, and the mixture was incubated at 37 ° C. for 3 hours.
  • ⁇ phage host bacteria C600 was inoculated into 30 ml of LBMM liquid medium (no antibiotics, 10 mM MgSO4, 0.2% Maltose) and cultured at 37 ° C. for 14 hours. The cultured cells were collected by centrifugation and resuspended in 10 ml of 20 mM MgSO4. The phage sample solution was diluted 100-fold, and 10 ul and 100 ul were mixed with the C600 / MgSO4 suspension to infect the phage.
  • the infection solution was added to M-soft agar and vortexed quickly, and the surface was spread evenly on LB agar medium (without antibiotics).
  • the cells were cultured at 37 ° C for 14 to 16 hours, and the plaques that appeared were counted to calculate the titer (Scheme 3).
  • Biotin-labeled DNA fragment III (SEQ ID NO: 6; Scheme 4.) was cleaved at the restriction enzyme site PstI on the streptavidin bead surface to detect a free DNA fragment of 104 bp.
  • An equal volume of 2 ⁇ Binding buffer was mixed with DNA fragment III (500 ng), a bead solution suspended in 1 ⁇ Binding buffer was further added, and mixed and adsorbed while gently rotating at room temperature for 15 minutes. The sample adsorbing beads were collected with a magnetic stand and washed 3 times with 1 ⁇ Binding buffer. Wash once more with 1x PstI buffer.
  • reaction solution (1 ⁇ PstI Buffer, 1 ⁇ BSA, 40 units of restriction enzyme), prepare two types, a system Trehalose (+) to which a final concentration of 0.6 M D (+) trehalose is added and a system Trehalose ( ⁇ ) to which it is not added.
  • Each reaction solution was added to the washed beads and mixed, and reacted at 37 ° C. for 3 hours. Beads are collected with a magnetic stand, and the supernatant containing the DNA fragments released by cleavage with a restriction enzyme is subjected to proteinase K reaction, phenol / chloroform treatment, and ethanol precipitation. The resulting DNA fragments are precipitated with 1 ⁇ TE ( The solution was dissolved at pH 7.5) and analyzed by Bioanalyzer DNA1000 assay (Agilent technologies).
  • Biotin-labeled DNA fragment III (SEQ ID NO: 6; Scheme 4.) was cleaved at the restriction enzyme site PstI on the horizontal surface of streptavidin-coated plate to detect 104 bp of free DNA fragment. . 2 ⁇ Binding buffer was mixed with DNA fragment III (500 ng) in an equal volume, added to the wells of the plate washed with 1 ⁇ Binding buffer, and mixed and adsorbed while gently shaking at room temperature for 15 minutes. The supernatant was removed, and washing was performed 3 times with 1 ⁇ Binding buffer. The plate was further washed once with 1 ⁇ PstI buffer.
  • reaction solution (1 ⁇ PstI Buffer, 1 ⁇ BSA, restriction enzyme 40 unit)
  • two types were prepared: a system Trehalose (+) to which a final concentration of 0.6 M D (+) trehalose was added and a system Trehalose ( ⁇ ) to which no final concentration was added.
  • Each reaction solution was added to the washed well and reacted at 37 ° C. for 3 hours.
  • the supernatant containing the DNA fragments released by cutting with the restriction enzyme is recovered, subjected to proteinase K reaction, phenol / chloroform treatment, and ethanol precipitation, and the resulting DNA fragment precipitate is dissolved in 1 ⁇ TE (pH 7.5).
  • analysis was performed by Bioanalyzer DNA1000 assay (Agilent technologies).
  • Each reaction solution was added to the washed beads and mixed, and reacted at 37 ° C. for 3 hours. Collect the beads on a magnetic stand, cleave with a restriction enzyme, and remove the supernatant containing DNA of each size by proteinase K reaction, phenol / chloroform treatment, and ethanol precipitation.
  • the sample was dissolved in TE (pH 7.5) and analyzed by Bioanalyzer DNA1000 assay (Agilent technologies).
  • PstI cleavage reaction when the distance from the plate horizontal surface to the DNA cleavage reaction position is different .
  • Three biotin-labeled DNA fragments I, II, and III (SEQ ID NOs: 4 to 6; Scheme 4.) are added to their respective restriction enzyme sites PstI. And free DNA fragments of each size were detected.
  • Add 3 types of biotin-labeled DNA fragments (500 ng) mixed with an equal volume of 2 ⁇ Binding buffer to each well of the plate washed with 1 ⁇ Binding buffer, and mix and adsorb while gently shaking for 15 minutes at room temperature. It was. Remove the supernatant and wash 3 times with 1x Binding buffer. The plate was further washed once with 1 ⁇ PstI buffer.
  • reaction solution (1 ⁇ PstI Buffer, 1 ⁇ BSA, restriction enzyme 40 unit)
  • two types were prepared: a system Trehalose (+) to which a final concentration of 0.6 M D (+) trehalose was added and a system Trehalose ( ⁇ ) to which no final concentration was added.
  • Each reaction solution was added to the washed well and reacted at 37 ° C. for 3 hours.
  • the supernatant containing the DNA fragments released by cutting with the restriction enzyme is recovered, subjected to proteinase K reaction, phenol / chloroform treatment, and ethanol precipitation, and the resulting DNA fragment precipitate is dissolved in 1 ⁇ TE (pH 7.5).
  • analysis was performed by Bioanalyzer DNA1000 assay (Agilent technologies).
  • the distance from the enzyme reaction surface to the DNA cleavage reaction position and the influence of trehalose were set in three stages in order of the cleavage site from the DNA adsorption surface.
  • the distance from the surface to the cleavage site was set at 20 bp, 50 bp, and 100 bp, and the amounts recovered for the three types of DNA fragments 104 bp, 81 bp, and 22 bp that were cleaved and released were compared (Scheme 6).
  • Scheme 6 the amounts recovered for the three types of DNA fragments 104 bp, 81 bp, and 22 bp that were cleaved and released were compared.
  • the enzyme reaction was closer to the surface, the activity decreased and the DNA yield decreased, but the improvement was observed by the addition of trehalose.
  • the difference was more prominent the closer to the reaction surface (FIG. 6A).
  • the same tendency was shown whether the reaction surface shape was a sphere (bead) or a flat surface (
  • reaction solutions such as final concentration 0.6M trehalose + 2M betaine, 0.6M trehalose + 0.6M glucose, 0.6M trehalose + 0.6M sorbitol were also prepared.
  • Each reaction solution was added to the washed beads and mixed, and reacted at 37 ° C. for 3 hours. Collect the beads on a magnetic stand, cleave with a restriction enzyme, and remove the supernatant containing DNA of each size by proteinase K reaction, phenol / chloroform treatment, and ethanol precipitation.
  • the sample was dissolved in TE (pH 7.5) and analyzed by Bioanalyzer DNA1000 assay (Agilent technologies).
  • reaction solution (1 ⁇ HindIII Buffer, restriction enzyme 40 units), a system Trehalose (+) to which a final concentration of 0.6 M D (+) trehalose was added, a system Trehalose ( ⁇ ) to which no final concentration was added, and a system to which a final concentration of 0.6 M sorbitol was added were prepared.
  • Each reaction solution was added to the washed well and reacted at 37 ° C. for 3 hours.
  • the supernatant containing the DNA fragments released by cutting with the restriction enzyme is recovered, subjected to proteinase K reaction, phenol / chloroform treatment, and ethanol precipitation, and the resulting DNA fragment precipitate is dissolved in 1 ⁇ TE (pH 7.5).
  • analysis was performed by Bioanalyzer DNA1000 assay (Agilent technologies).
  • FIG. 8 shows the state of the bead reaction solution after 3 hours of restriction enzyme reaction as a reference. Similar to the addition of trehalose, the uniformity of the beads in the solution was maintained when sorbitol was added. This is considered to be due to the properties of trehalose and sorbitol such as viscosity and diffusion effect. Under each reaction condition, enzyme activity was shown to be high on any reaction surface even when sorbitol was added, although not as much as when trehalose was added.
  • Biotin-labeled DNA fragments I, II and III can be cleaved with various restriction enzymes on the bead surface. went. A free 80 bp DNA fragment was detected by a cleavage reaction at the XhoI and PstI sites of DNA fragments I and II (at a distance of 50 bp from the bead surface). A free 104 bp DNA fragment was detected by a cleavage reaction at the EcoRI site of DNA fragment I, the HindIII site of DNA fragment II, and the PstI site of DNA fragment III (all at a distance of 20 bp from the bead surface).
  • the paramagnetic streptavidin beads were washed with the attached 1 ⁇ Binding buffer, recovered with a magnetic stand, the supernatant was removed, and then suspended in the same buffer.
  • Each DNA fragment I, II, III 500 ng was mixed with 2 ⁇ Binding buffer in an equal volume, further added with a bead solution, and mixed and adsorbed while gently rotating at room temperature for 15 minutes.
  • the sample adsorbing beads were collected with a magnetic stand and washed 3 times with 1 ⁇ Binding buffer. Each DNA fragment was further washed once with 1 ⁇ XhoI buffer, 1 ⁇ PstI buffer, 1 ⁇ HindIII buffer, and 1 ⁇ EcoRI buffer.
  • Each reaction solution (1 ⁇ XhoI Buffer, 1 ⁇ BSA, restriction enzyme 40unit), (1 ⁇ PstI Buffer, 1 ⁇ BSA, restriction enzyme 40unit), (1 ⁇ HindIII Buffer, restriction enzyme 40unit), (1 ⁇ EcoRI Buffer, Regarding the restriction enzyme (40 units), a system Trehalose (+) to which a final concentration of 0.6 MD (+) trehalose was added and a system Trehalose (-) to which no final concentration was added were prepared. Each reaction solution was added to the washed beads and mixed, and reacted at 37 ° C. for 3 hours.
  • DNA fragment cleavage reaction with different restriction enzymes on the horizontal surface of the plate Cleavage reaction of biotin-labeled DNA fragments II and III (SEQ ID NOs: 5 and 6; Scheme 4.) from the different restriction enzymes on the horizontal surface of the streptavidin-coated plate Went.
  • a free 104 bp DNA fragment was detected by a cleavage reaction at the HindIII site of DNA fragment II and the PstI site of DNA fragment III (both at a distance of 20 bp from the plate surface).
  • trehalose in the carrier-fixed DNA enzyme reaction not only inhibits the aggregation of substances by beads in the reaction solution, but also acts as a surface reaction enzyme or substrate DNA, or a complex of both. It may have some direct influence.
  • DNA is bound to oligo primers fixed to beads by complementary interaction, and encapsulated in an oil-water emulsion to form a microreactor with one bead and one DNA fragment, and DNA polymerase
  • Each DNA fragment is amplified to several million copies per bead by the amplification reaction according to 1.
  • An amplification reaction was performed by adding trehalose at a final concentration of 0.6 M to this reaction solution, and the influence on the sequence analysis results was examined (Scheme 11).
  • the sample used this time is a DNA fragment obtained by PCR amplification of cDNA obtained by reverse transcription of Short RNA (FIG. 11). The results obtained by this reaction are shown in FIGS.
  • trehalose (+) results in an increase in DNA amplification wells (FIG. 12). Furthermore, in the sequence analysis results, the number of sequences decoded by trehalose (+) and its region are mutually increased compared to trehalose ( ⁇ ) (FIG. 13).
  • trehalose has an effective characteristic that affects the efficiency of the enzyme reaction (DNA extension reaction) on the reaction surface such as beads and promotes the activity of the enzyme.
  • DNA extension reaction enzyme reaction
  • Such characteristics of trehalose are expected to be applied to a large-scale sequencing system in which an enzyme reaction is carried out on a carrier, leading to further improvement in performance.
  • the supernatant containing each size of DNA released by cleavage with a restriction enzyme is subjected to proteinase K reaction, phenol / chloroform treatment, and ethanol precipitation, and the resulting DNA fragment precipitate is dissolved in 1 ⁇ TE (pH 7.5). Then, analysis was performed by Bioanalyzer DNA1000 assay (Agilent technologies) (FIGS. 15 and 16).
  • the paramagnetic streptavidin beads were washed with the attached 1 ⁇ Binding buffer, recovered with a magnetic stand, the supernatant was removed, and then suspended in the same buffer.
  • An equal volume of 2 ⁇ Binding buffer was mixed with DNA fragment I (1 ⁇ g), a bead solution was further added, and the mixture was mixed and adsorbed while gently rotating at room temperature for 20 minutes.
  • the sample adsorbing beads were collected with a magnetic stand and washed 3 times with 1 ⁇ Binding buffer. Further washing was performed with 1 ⁇ HindIII buffer.
  • reaction solutions (1 ⁇ HindIII Buffer, restriction enzyme 40 units, and added reagents at various concentrations described below), a system not added (SDW) and a system to which added reagents at various concentrations were added, were prepared.
  • SDW system not added
  • Each reaction solution was added to the washed beads and mixed, and reacted at 37 ° C. for 3 hours. Collect the beads with a magnetic stand, perform ethanol precipitation on the supernatant containing each size of DNA released by cleavage with restriction enzymes, and dissolve the resulting DNA fragment precipitate with 1 ⁇ TE (pH 7.5). Analysis was performed using Bioanalyzer DNA1000 assay (Agilent technologies).
  • Reagents at various concentrations have final concentrations of 0.1, 0.3, 0.5, 0.6M Trehalose, 0.6M Sorbitol, 0.1, 0.3, 0.6, 0.8M Glucose, 0.5M Betain, 0.3M Ethylene glycol, 0.5MGlycin + 0.5M Betain, 0.6M Trehalose + 0.6M Sorbitol, 0.3M Trehalose + 0.3M Sorbitol, 0.6M Trehalose + 0.6M Glucose, 0.3M Trehalose + 0.3M Glucose, 0.5M Trehalose + 0.5M Betain, 0.3M Trehalose + 0.3M It was prepared to be + 0.5M Glycine, 0.3M Trehalose + 0.3M Glycin, 0.5M Trehalose + 0.5M Glycin + 0.5M Betain, 0.3M Trehalose + 0.3M Glycin + 0.3M Betain.
  • the mixture was gently mixed by inversion at room temperature for 10 minutes while keeping the light shielded, and the solution was visually checked for dissolution, followed by filter filtration (filter pore system 0.22 ⁇ m). Only 42 ml of the required amount was collected from the mixed solution after filtration, and then the work proceeded according to manufacturer's protocol.
  • FIG. 22 is created by calculating the average value of the PhiX control for each run.
  • the fluorescence intensity decrease rate in the trehalose ( ⁇ ) and trehalose (+) sequences shows an overall significant difference under the conditions of trehalose (+), and is compared at the 35th cycle where the fluorescence intensity is the lowest. Even there was a difference of about 20% or more.
  • Trehalose (-) error bars indicate Max and Min values to indicate the degree of variation.
  • FIG. 23 shows the mapping rate of the PhiX control, and this also showed a difference superior to trehalose ( ⁇ ) as a whole.
  • D (+)-trehalose dihydrate (201-02253 reagent special grade) (Wako) was used as D (+) trehalose.
  • D (+) trehalose addition conditions D (+)-trehalose dihydrate (201-02253 reagent special grade) (Wako) was added to the buffer CB of the reagent included in the GS LR 25 Sequencing Kit (502906) as follows. An aliquot was added.
  • filter filtration (filter pore system 0.22 ⁇ m) was performed. Only 2 x 1000 ml of the required amount was collected from the mixed solution after filtration, and then the work proceeded according to manufacturer's protocol.
  • the number of sequences increased with the addition of trehalose. Therefore, the addition of trehalose increased the enzyme activity in the sequence extension reaction, indicating that the number of sequences that can be decoded increased.

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Abstract

本発明の目的は、担体に固定化された標的物質に対する酵素の反応性を高める方法及び担体による酵素反応の阻害効果を緩和又は抑制する方法を提供することにある。上記目的は、糖類、アミノ酸、多価アルコール及びそれらの誘導体からなる群から選ばれる少なくとも一種の物質を存在させることにより、担体に固定化された標的物質に対する酵素の反応性を高める方法、並びに、糖類、アミノ酸、多価アルコール及びそれらの誘導体からなる群から選ばれる少なくとも一種の物質を存在させることにより、標的物質を固定化させた担体による前記標的物質に対する酵素の反応性を阻害する効果を緩和又は抑制する方法を提供することにより解決される。

Description

酵素の反応性を改善する方法 関連出願の相互参照
　本出願は、２００８年２月２９日出願の日本特願２００８－５０７４４号の優先権を主張し、その全記載は、ここに特に開示として援用される。
　本発明は、糖類、アミノ酸、多価アルコール及びそれらの誘導体からなる群から選ばれる少なくとも一種の物質を用いて、担体に固定化された標的物質に対する酵素の反応性を高める方法、及び糖類、アミノ酸、多価アルコール及びそれらの誘導体からなる群から選ばれる少なくとも一種の物質を用いて、担体による酵素の標的物質への反応性を阻害する効果を緩和又は抑制する方法に関する。
背景技術
　ＤＮＡを精製・回収する方法として、ビオチン標識したプライマーを使って鋳型のＤＮＡ又はＲＮＡから標的となるＤＮＡを合成し、得られた標的ＤＮＡを常磁性のストレプトアビジンビーズによって精製・回収する方法がこれまでに広く用いられている。本方法によれば、ストレプトアビジンとビオチンの特異かつ安定な結合特性を利用することにより、ビーズの洗浄と磁気による凝集だけで、高純度のｃＤＮＡを効率よく回収することができる。したがって、本方法をｃＤＮＡライブラリー作製に応用すれば、高純度のｃＤＮＡライブラリーを効率よく作製することが期待でき、本方法をシークエンス反応に応用すれば、効率よく配列決定することが期待できる。さらに、本発明者らが確立した、ｃＤＮＡの５’末端と３’末端を最小化でき、かつ１度のシーケンス反応で多くのｃＤＮＡの情報を得ることができる、ＧＳＣ（Ｇｅｎｅ　Ｓｉｇｎａｔｕｒｅ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）法に、本方法を応用することもまた可能である（小島ら、第30回日本分子生物学会年会・第80回日本生化学会大会合同大会公演要旨集、p.495を参照、これらの記載は、ここに特に開示として援用される）。
　一方、標的ＤＮＡの回収率を高める手段として、酵素反応において酵素の活性を高める種々の方法がこれまでに試みられている。特に、液相均一系の酵素反応において、高温下で酵素を活性化させる方法が知られている。この方法によれば、トレハロースなどの糖、ベタイン、サルコシンなどのシャペロン作用のある物質を共存させることにより、高温下で酵素を活性化させることができる（特許第３２０６８９４号公報及び特許第３５３６０５２号公報、並びにPiero Carninci et. al, (1998), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 95, Issue 2, 520-524； Y. Nagasawa et al., (2003), Cryobio. Cryotech. 49, 87-95；及びLei Chena,b,1 et al., (2007), Journal of Biotechnology, 127, 402-407を参照、これらの記載は、ここに特に開示として援用される）。
発明の開示
　本発明者らは、上記ＧＳＣ法に上記磁気ストレプトアビジンビーズを利用した標的ＤＮＡの精製・回収方法を応用させてみたところ、簡便かつ短時間で標的ＤＮＡを回収することに成功した。しかし、標的ＤＮＡの回収量は、液相均一系で予想される量と比べて非常に低いものであった。さらに、本発明者らは、ビーズではなく、ストレプトアビジンプレートを用いた標的ＤＮＡの精製・回収方法をＤＮＡ合成反応に応用してみたところ、ビーズを用いた系と同じく、液相均一系で予想される量と比べて十分量の標的ＤＮＡを回収することができなかった。
　以上の結果から、本発明者らは、ビーズやプレートなどの担体に固定化された標的ＤＮＡに酵素を作用させる酵素反応においては、酵素反応が十分に行われず、そのために標的ＤＮＡの回収率が低下するのではないかと考えた。さらに、ビーズやプレート等の担体に固定化された標的ＤＮＡに対する酵素の反応性を高めることや、担体による酵素反応の阻害効果を緩和又は抑制することで、上記条件下で標的ＤＮＡの回収率を高めることができるのではないかと考えた。
　しかし、担体に固定化されたＤＮＡなどの標的物質に対する酵素の反応性を高める方法や担体による酵素反応の阻害効果を緩和又は抑制する方法についてはこれまでに知られていない。
　そこで、本発明は、上記方法を提供することを解決すべき課題とした。すなわち、本発明は、担体に固定化された標的物質に対する酵素の反応性を高める方法や担体による酵素反応の阻害効果を緩和又は抑制する方法を提供することを解決すべき課題とした。
課題を解決するための手段
　上記課題を解決するために、本発明者らが鋭意検討したところ、担体に固定化された標的物質に対する酵素反応系において、トレハロースなどの糖類、アミノ酸、多価アルコール及びそれらの誘導体からなる群から選ばれる少なくとも一種の物質を添加することにより酵素の反応性が向上することを見出した。本発明者らは、得られた知見に基づいて、上記物質の存在下で担体上でのｃＤＮＡライブラリーの作製、制限酵素反応、ＤＮＡ合成反応、上記ＧＳＣ法等を実施したところ、いずれにおいても酵素反応が改善し、高い回収率で標的ＤＮＡを精製・回収することに成功した。さらに、本発明者らは、ＤＮＡマイクロアレイ様の超高密度フローセル上で鋳型増幅反応及びシークエンス反応を実施するＳＯＬＥＸＡシークエンスシステムや、油水エマルジョンにおいてビーズに固定化されたオリゴプライマーにＤＮＡ断片を相補的に相互作用させてＰＣＲを行う、いわゆるエマルジョンＰＣＲを利用した４５４シークエンスシステム等において、それらの反応液中に上記物質を添加したところ、反応効率を向上させることに成功した。したがって、本発明は、上記知見に基づいて完成された発明である。
　すなわち、本発明によれば、以下の方法が提供される：
（１）糖類、アミノ酸、多価アルコール及びそれらの誘導体からなる群から選ばれる少なくとも一種の物質を存在させることにより、担体に固定化された標的物質に対する酵素の反応性を高める方法。
（２）糖類、アミノ酸、多価アルコール及びそれらの誘導体からなる群から選ばれる少なくとも一種の物質を存在させることにより、標的物質を固定化させた担体による前記標的物質に対する酵素の反応性を阻害する効果を緩和又は抑制する方法。
（３）前記糖類が、トレハロース、マルトース、グルコース、スクロース、ラクトース、キシロビオース、アガロビオース、セロビオース、レバンビオース、キトビオース、２－β－グルクロノシルグルクロン酸、アロース、アルトロース、ガラクトース、グロース、イドース、マンノース、タロース、ソルビトール、レブロース、キシリトール及びアラビトールからなる群から選ばれる糖である、上記（１）又は（２）に記載の方法。
（４）前記アミノ酸又はその誘導体が、Ne －アセチル－β－リジン、アラニン、γ－アミノブチル酸、ベタイン、グリシンベタイン、Na －カルバモイル－Ｌ－グルタミン－１－アミド、コリン、ジメチルテチン、エコトイン、グルタメート、β－グルタミン、グリシン、オクトパイン、プロリン、サルコシン、タウリン及びトリメチルアミンＮ－オキシドからなる群から選ばれる上記（１）～（３）のいずれかに記載の方法。
（５）前記標的物質が核酸である上記（１）～（４）のいずれかに記載の方法。
（６）前記核酸が一本鎖又は二本鎖のＤＮＡ若しくはＲＮＡである上記（５）に記載の方法。
（７）前記核酸がＤＮＡとＲＮＡとがハイブリダイズした核酸である上記（５）に記載の方法。
（８）前記酵素が、転移酵素、加水分解酵素及び合成酵素からなる群から選ばれる少なくとも１種の酵素である上記（１）～（７）のいずれかに記載の方法。
（９）前記酵素が、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮａｓｅ及びＤＮＡリガーゼである上記（１）～（７）のいずれかに記載の方法。
（１０）前記酵素が、逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮａｓｅ及びＤＮＡリガーゼである上記（１）～（７）のいずれかに記載の方法。
（１１）前記酵素が制限酵素である上記（１）～（７）のいずれかに記載の方法。
（１２）前記担体がビーズ状担体又はプレート状担体である上記（１）～（１１）のいずれかに記載の方法。
（１３）前記ビーズ状担体がストレプトアビジンビーズである上記（１２）に記載の方法。
（１４）前記プレート状担体がストレプトアビジンプレート又はＤＮＡマイクロアレイ用プレートである上記（１２）に記載の方法。
（１５）前記方法が担体上でのｃＤＮＡライブラリー作製、シークエンス反応若しくはＤＮＡ合成反応又はＧＳＣ法に用いられる方法である上記（１）～（１４）のいずれかに記載の方法。
（１６）前記ＤＮＡ合成反応がエマルジョンＰＣＲ又はブリッジＰＣＲである、上記（１５）に記載の方法。
発明の効果
　本発明によれば、トレハロースなどの糖類、アミノ酸、多価アルコール及びそれらの誘導体からなる群から選ばれる少なくとも一種の物質を所定の濃度で添加するだけという簡便、安全かつ安価な方法により、担体に固定化された標的物質に対する酵素の反応性を向上すること、及び標的物質を固定化させた担体による前記標的物質に対する酵素の反応性の阻害効果を緩和又は抑制することができる。すなわち、本発明によれば、簡便、安全かつ安価に、担体に固定化された標的ＤＮＡに対するＤＮＡ合成反応、制限酵素反応、核酸分解反応、シークエンス反応等を促進することができる。
　本発明によれば、担体表面付近でのＤＮＡ合成の反応性を向上させることができるので、その後に続くＤＮＡの高純度回収と特異的分離、精製の簡易性、操作時間の短縮化などが可能となる。さらに、本発明によれば、担体に固定化された核酸やペプチドなどの標的物質に対する様々な条件下での酵素反応に応用でき、担体により酵素の反応性を保持することが困難な局面でも、有利な効果をもたらし得る。したがって、本発明は、ｃＤＮＡライブラリーの作製やＧＳＣ法に応用できるだけでなく、大規模かつ自動で行われるシークエンスシステム、例えば、ＳＯＬＥＸＡシークエンスシステムや４５４シークエンスシステム等に応用でき、これらのさらなる性能の向上につながることが期待される。
図１は、トレハロース濃度に依存する５０ｂｐＤＮＡ断片量の変化を測定した結果を示す。 図２は、２本鎖ｃＤＮＡ合成量を測定した結果を示す。 図３は、各種制限酵素反応効率を測定した結果を示す。 図４は、ｃＤＮＡファージライブラリー力価の測定結果を示す。 図５は、各担体表面上での制限酵素反応効率を測定した結果を示す。 図６Ａは、各担体反応表面からＤＮＡ切断反応位置までの距離とその反応効率を測定し、距離ごとに担体の形状を比較した結果を示す。 図６Ｂは、各担体反応表面からＤＮＡ切断反応位置までの距離とその反応効率を測定し、担体の形状ごとに距離を比較した結果を示す。 図７は、各反応条件下における酵素反応効率を測定した結果を示す。 図８は、ビーズ固定化ＤＮＡ制限酵素静置反応３時間後の様子を示す。 図９は、ビーズ表面及びプレート表面における切断反応の酵素による活性の差異を測定した結果を示す。 図１０は、ＳＯＬＥＸＡシークエンスシステムによる測定結果を示す。 図１１は、ＳｈｏｒｔＲＮＡを逆転写したｃＤＮＡをＰＣＲによって増幅したＤＮＡ断片を示す。 図１２は、４５４シークエンスシステムにおける、ＤＮＡ増幅ウェル数を比較した結果を示す。 図１３は、４５４シークエンスシステムによる結果を示す。 図１４は、４５４シークエンスシステムのエマルジョンＰＣＲにおけるトレハロースの影響について、シークエンスＲｅａｄ数及びｃＤＮＡ　Ｔａｇ数の評価結果を示す。 図１５は、液相均一系におけるトレハロースの影響について、ＤＮＡ断片の大きさを変えて評価した結果を示す。 図１６は、液相均一系におけるトレハロースの影響について、電気泳動により評価した結果を示す。 図１７は、実施例１３における各種各濃度の添加試薬の存在下における、酵素反応効率を測定した結果を示す。 図１８は、実施例１４における４５４シークエンスシステムの測定結果を示す。 図１９は、実施例１４における４５４シークエンスシステムの測定結果を示す。 図２０は、実施例１５におけるＳＯＬＥＸＡシークエンスシステムの測定結果を示す。 図２１は、実施例１５におけるＳＯＬＥＸＡシークエンスシステムの測定結果を示す。 図２２は、実施例１６におけるＳＯＬＥＸＡシークエンスシステムの測定結果を示す。 図２３は、実施例１６におけるＳＯＬＥＸＡシークエンスシステムの測定結果を示す。 図２４は、実施例１７におけるSOLiDシークエンスシステムの測定結果を示す。 図２５は、実施例１８における４５４シークエンスシステムの測定結果を示す。
発明を実施するための形態
　以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
　本発明の方法は、糖類、アミノ酸、多価アルコール及びそれらの誘導体からなる群から選ばれる少なくとも一種の物質を存在させることにより、担体に固定化された標的物質に対する酵素の反応性を高める方法、及び糖類、アミノ酸、多価アルコール及びそれらの誘導体からなる群から選ばれる少なくとも一種の物質を存在させることにより、標的物質を固定化させた担体による前記標的物質に対する酵素の反応性を阻害する効果を緩和又は抑制する方法である。本発明によれば、上記いずれの方法においても、糖類、アミノ酸、多価アルコール及びそれらの誘導体からなる群から選ばれる少なくとも一種の物質が存在しない場合に比べて、糖類、アミノ酸、多価アルコール及びそれらの誘導体からなる群から選ばれる少なくとも一種の物質を存在させることにより、担体に固定化された標的物質に対する酵素の反応性を改善することができる。
　糖類としては、例えば、オリゴ糖類や単糖類を挙げることができる。さらに糖類の具体例としては、例えば、トレハロース、マルトース、グルコース、スクロース、ラクトース、キシロビオース、アガロビオース、セロビオース、レバンビオース、キトビオース、２－β－グルクロノシルグルクロン酸、アロース、アルトロース、ガラクトース、グロース、イドース、マンノース、タロース、ソルビトール、レブロース、キシリトール及びアラビトールなどを限定せずに挙げることができ、その中でもトレハロース、グルコース、ソルビトールなどが好ましく用いられる。糖類は、単独で用いても、２種以上を併用してもよい。
　アミノ酸又はその誘導体として、Ne －アセチル－β－リジン、アラニン、γ－アミノブチル酸、ベタイン、グリシンベタイン、Na －カルバモイル－Ｌ－グルタミン－１－アミド、コリン、ジメチルテチン、エコトイン、グルタメート、β－グルタミン、グリシン、オクトパイン、プロリン、サルコシン、タウリン及びトリメチルアミンＮ－オキシドを挙げることができる。上記アミノ酸類は、単独で用いても、２種以上を併用しても良い。なお、特に、ベタイン及びサルコシンが好ましく用いられる。
　多価アルコールとしては、上記糖類も含まれるが、それ以外の多価アルコールの例としては、例えば、グリセロール、エチレングリコール、ポリエチレングリコール等を挙げることができ、その中でもエチレンクリコールが好ましい。上記多価アルコールは、単独で用いても、２種以上を併用しても良い。
　糖類、アミノ酸、多価アルコール及びそれらの誘導体は、合成品及び市販品のいずれのものも用いることができ、無水和物及び水和物のいずれのものを用いてもよい。糖類、アミノ酸、多価アルコール及びそれらの誘導体の使用量は特に制限されず、酵素量や担体による酵素の反応性の阻害効果などにより適宜調整することができるが、例えば、トレハロースやソルビトールを単独で用いる場合、溶液中でのトレハロースやソルビトールの最終濃度は０．１～１Ｍ、好ましくは０．４～０．８Ｍ、より好ましいのは０．６Ｍである。
　本明細書にいう「標的物質」としては、用いられる酵素の標的となる物質であれば特に制限されないが、例えば、核酸、ペプチド、糖、脂肪酸などを挙げることができ、好ましくは核酸であり、より好ましくはＲＮＡとＤＮＡとがハイブリダイズした核酸並びに一本鎖及び二本鎖のＤＮＡである。
　本明細書にいう「酵素」とは、通常用いられる意味において特に制限がなく、例えば、酸化還元酵素（ＥＣ　１）、転移酵素（ＥＣ　２）、加水分解酵素（ＥＣ　３）、脱離酵素（ＥＣ　４）、異性化酵素（ＥＣ　５）、合成酵素（ＥＣ　６）を挙げることができる。そのような酵素として、下記の酵素を例示することができる：Ｔ４　ＤＮＡリガーゼ及びＥ．ｃｏｌｉ　ＤＮＡリガーゼなどのＤＮＡリガーゼ；Ｔ４　ＲＮＡリガーゼなどのＲＮＡリガーゼ；Ｔ４　ポリヌクレオチドキナーゼ及びポリヌクレオチドキナーゼなどのポリヌクレオチドキナーゼ；アルカリンフォスファターゼ（Ｅ．ｃｏｌｉ　Ｃ７５）、アルカリンフォスファターゼ（Ｃａｌｆ　Ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ）及びアルカリンフォスファターゼ（Ｓｈｒｉｍｐ）などのアルカリンフォスファターゼ；ＤＮＡポリメラーゼＩ及びＴ４　ＤＮＡポリメラーゼなどのＤＮＡポリメラーゼ；プライムスクリプトリバーストランスクリプターゼ、リバーストランスクリプターゼＸＬ及びＭ－ＭＬＶリバーストランスクリプターゼなどのリバーストランスクリプターゼ；ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ；ＳＰ６　ＲＮＡポリメラーゼ及びＴ７　ＲＮＡ　ポリメラーゼなどのＲＮＡポリメラーゼ；ポリ（Ａ）ポリメラーゼ；Ｓ１ヌクレアーゼ、マンビーンヌクレアーゼ、ミクロコッカルヌクレアーゼ及びＢＡＬ　３１ヌクレアーゼなどのヌクレアーゼ；エキソヌクレアーゼＩ及びエキソヌクレアーゼＩＩＩなどのエキソヌクレアーゼ；デオキシリボヌクレアーゼＩ；ＤＮａｓｅＩ；ＲＮａｓｅＨ及びＲＮａｓｅＡなどのＲＮａｓｅ；ＤＮＡトポイソメラーゼＩ；ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ；ＤＮＡグルコシラーゼ；並びにメチラーゼ。
　上記酵素の好ましい例としては、転移酵素であるＤＮＡポリメラーゼ、より好ましくはＤＮＡポリメラーゼＩ；加水分解酵素であるＲＮａｓｅ、より好ましくはＲＮａｓｅＨ、合成酵素であるＤＮＡリガーゼ、より好ましくはＥ．ｃｏｌｉ　ＤＮＡリガーゼ；並びに逆転写酵素であるトランスクリプターゼ、より好ましくはＭ－ＭＬＶリバーストランスクリプターゼを挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
　上記酵素の好ましい例には、制限酵素が含まれる。制限酵素としては、遺伝子工学で使用されるあらゆる制限酵素を挙げることができる。例えば、ＳｔｙＩ 、ＥｃｏＲＩ 、ＭｌｕＩ 、ＮｃｏＩ 、ＤＮａｓｅＩ 、ＲＮａｓｅＩ 、ＮｄｅＩ 、ＰｖｕＩＩ 、ＰｓｔＩ 、ＤｒａＩ 、ＸｈｏＩ、ＮｏｔＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ 、ＨｉｎｃＩＩ 等を挙げることができる。ただし、これらに限定されるものではない。
　本発明の方法は、用いられる酵素の有する最適温度及び失活温度などに合わせて温度を設定することができるが、通常１～１００℃の温度下、好ましくは５～６０℃の温度下、より好ましくは１０～４０℃の温度下で行うことができる。具体的には、酵素にＥ．ｃｏｌｉ　ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡポリメラーゼＩ及びＲＮａｓｅＨを用いてＧｕｂｌｅｒ－Ｈｏｆｆｍａｎ法により二本鎖ｃＤＮＡを合成する場合、本発明の方法は１６℃の温度下で行うことができる。さらに、酵素に制限酵素を用いて制限酵素反応をする場合、本発明の方法は、３７℃の温度下で行うことができる。
　本明細書にいう「担体に固定化された標的物質」及び「標的物質を固定化させた担体」としては、担体の少なくとも一部と標的物質の少なくとも一部とが付された状態にある標的物質及び担体であれば特に制限されないが、そのような状態を形成するためには、イオン結合、水素結合、疎水結合、共有結合、ファンデルワールス結合、疎水結合、アフィニティー結合、物理及び化学吸着などが利用され得る。担体と標的物質との付され方は、例えば、標的物質が担体の表面上に付されていても、標的物質が担体に埋め込まれていても、どちらでもよく、特に制限されない。
　本明細書にいう「担体」とは、標的物質を付すことができれば特に制限されないが、形状はビーズ、プレート、繊維、管、容器（試験管やバイアル）などを挙げることができ、その中でもビーズ及びプレートが好ましい。担体の材質は、無機及び有機のいずれでもよく、例えば、ガラス、セメント、陶磁器等のセラミックスもしくはニューセラミックス、ポリエチレンテレフタレート、酢酸セルロース、ビスフェノールＡのポリカーボネート、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート等のポリマー、シリコン、活性炭、多孔質ガラス、多孔質セラミックス、多孔質シリコン、多孔質活性炭、織物、編み物、不織布、濾紙、短繊維、メンブレンフィルター等の多孔質物質、金などの導電性材料などを挙げることができ、その中でもガラス及びシリコンが好ましい。担体の表面は、例えば、アミノ基、カルボキシル基、ヒドロキシ基などの官能基やストレプトアビジンなどの高分子を導入する処理が施されていてもよい。このような担体の具体例として、ストレプトアビジンビーズ、ストレプトアビジンプレート及びＤＮＡマイクロアレイ用プレートなどを挙げることができる。担体の大きさは特に制限されないが、その担体によって酵素反応が低下することが確認される程度の大きさが好ましい。例えば、ビーズ状の担体を用いる場合、通常０．５μｍ以上、好ましくは１μｍ以上、より好ましくは１．５μｍ以上、さらに好ましくは２μｍ以上、なおさらに好ましくは２．５μｍ以上の直径のものを挙げることができる。担体の直径の上限については特に制限されないが、ビーズ状担体の場合は１０～１００μｍ程度である。ビーズ状の担体の具体例として、TAKARAのMAGNOTEX-SAを挙げることができ、このビーズ状担体の直径は２．３±０．３μｍである。
　本発明の方法における、担体と担体に固定化された標的物質の酵素に対する反応部位との距離は、例えば、標的物質が核酸である場合、上記反応部位は担体から１～２００塩基、好ましくは５～１５０塩基、より好ましくは５～１００塩基、さらに好ましくは１０～８０塩基、なおさらに好ましくは１０～５０塩基、最も好ましくは１０～２０塩基離れていればよい。ただし、上記距離は標的物質及び酵素の種類によって変わりうる。
　一般に、担体と担体に固定化された標的物質の反応部位との位置が近接しているほど酵素の反応性は低減する。しかし、本発明の方法によれば、上記位置が近接しているほど、担体の形状や材料によらず、酵素の反応性の向上がみられる傾向にある。例えば、本発明の方法において、担体をビーズ又はプレートとし、酵素を制限酵素とし、かつ標的物質を担体から制限酵素部位が２０塩基、５０塩基又は１００塩基離れた二本鎖ＤＮＡとした場合、ビーズ又はプレートに関係なく、担体から制限酵素部位が２０塩基離れた二本鎖ＤＮＡ、５０塩基離れた二本鎖ＤＮＡ及び１００塩基離れた二本鎖ＤＮＡの順に、酵素の反応性は向上する傾向にある。
　本発明の方法をｃＤＮＡライブラリーの作製法に適用する場合、高品質のｃＤＮＡが効率よく回収できる傾向にある。例えば、本発明の方法は、λファージｃＤＮＡライブラリー作製法に適用できる。その具体例として、ｍＲＮＡをビオチン化したプライマーで逆転写し、合成されたｃＤＮＡ／ｍＲＮＡハイブリッドをストレプトアビジンビーズ又はストレプトアビジンプレートで固定化させ、次いで、本発明の方法を適用して二本鎖ｃＤＮＡを合成し、次いで、回収されたｃＤＮＡをλファージベクターにライゲーションしてλファージｃＤＮＡライブラリーを作製する方法が挙げられる。このようにして作製されたλファージｃＤＮＡライブラリーの力価は、本発明の方法を適用しない場合と比べて高い値を示すことが期待できる。
　本発明の方法は、例えば、ＧＳＣ法に適用することができる。ＧＳＣ法とはｃＤＮＡライブラリー作製方法の一種であり、この方法を用いれば、ｃＤＮＡの５’末端と３’末端を最小化でき、かつ１度のシーケンス反応で多くのｃＤＮＡの情報を得ることができる。ビーズを利用したＧＳＣ法の概略を以下のスキームにそって説明する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000003
　５’末端をビオチン化した１ｓｔ　Ｇｓｕｌ－Ｔ１４　ｐｒｉｍｅｒを用いてｍＲＮＡから一本鎖ｃＤＮＡを合成する（上記図中の１～４）。合成して得たｃＤＮＡにＧＳ　５'Ａｄａｐｔｏｒをライゲートし、次いで、ｃＤＮＡの相補鎖を合成する（上記図中の５及び６）。得られた二本鎖ｃＤＮＡをＧｓｕｌで処理した後に、ｃＤＮＡにＧＳ　３'Ａｄａｐｔｏｒをライゲートし、次いで、ＸｈｏＩ処理することにより、両末端にＡｄａｐｔｏｒをライゲートしたｃＤＮＡを得ることができる。得られたｃＤＮＡを、ファージベクターでパッケージングするなどの調節を経て、λ－ｐＦＬＣ－ＩＩＩ－Ｆｍプラスミドにクローニングする（上記図中の９）。クローニング後のプラスミドについて、Ｍｍｅｌ処理、ＧＳ　Ｆｉｌｌ－ｉｎ　Ａｄａｐｔｏｒのライゲーション及びＭｖａ１２６９Ｉ処理を順に施し、その後セルフライゲーションすることによりｃＤＮＡの５’末端及び３’末端を含むプラスミド構築物を得ることができる（上記図中の１０～１４）。得られたプラスミド構築物を末端がビオチン化されたＧＳ　ｐｒｉｍｅｒ　Ｆ１－Ｂｉｏｔｉｎ及びＧＳ　ｐｒｉｍｅｒ　Ｒ１－Ｂｉｏｔｉｎを用いてＰＣＲ増幅し、得られた増幅産物をストレプトアビジンビーズで捕集し、次いで、ＢｃｅＡＩ処理することによりｃＤＮＡの５’末端及び３’末端を含むＤＮＡ断片であるＧＳＣ　ｄｉＴａｇを得ることができる（上記図中の１５～１７）。ＧＳＣ　ｄｉＴａｇは精製後互いに連結することができる（上記図中の１８）。上記手順に従えば、ｃＤＮＡの５’末端及び３’末端の塩基配列を最小化させたＧＳＣ　ｄｉＴａｇを得ることができ、さらにＧＳＣ　ｄｉＴａｇを連結してシーケンスすることにより、一度のシーケンスで大量のｃＤＮＡ情報を得ることができる。上記ＧＳＣ法は、このような手順を踏むことで、転写開始点と転写終結点を大規模に検出することができる、非常に有用な方法である。
　本発明の方法は、上記したＧＳＣ法において、一本鎖ｃＤＮＡを得る工程（上記図中の１～４）及びＧＳＣ　ｄｉＴａｇを得る工程（上記図中の１５～１７）に適用することができる。すなわち、担体に固定化された標的物質をＧＳＣ法の標的物質である上記一本鎖ｃＤＮＡ及びＧＳＣ　ｄｉＴａｇとすることにより、本発明の方法をＧＳＣ法に適用することができる。このように本発明の方法をＧＳＣ法に適用することにより、上記一本鎖ｃＤＮＡ及びＧＳＣ　ｄｉＴａｇの回収率を向上させることができる。上記適用の具体的な方法として、実施例に記載の方法を挙げることができる。
　さらに、本発明の方法は、担体上でのＰＣＲなどのＤＮＡ合成反応又はシークエンス反応に用いられ得る。例えば、ＤＮＡマイクロアレイ用プレートを担体とし、標的物質を担体上の一本鎖ＤＮＡとし、かつ酵素をＤＮＡポリメラーゼとした場合、本発明の方法はSOLEXAシークエンスシステムにおけるブリッジＰＣＲによるクラスター増幅反応に適用することができる。SOLEXAシークエンスシステムとは、Illumina社（http://www.illuminakk.co.jp/を参照、これらの記載は、ここに特に開示として援用される）により提供されるシークエンスシステムであり、数百万もの多量のDNA断片を同時並行に塩基配列を決定することができる大規模シークエンサーである。安定性及び正確性が非常に高いため、大量シークエンスデータの獲得と、生産性、経済性及び正確性が備わった大規模なDNA解析を提供することができる有効なシークエンスシステムである。本発明の方法を、例えば、実施例の記載に基づき、SOLEXAシークエンスシステムのブリッジＰＣＲに適用した場合、クラスター増幅反応、すなわち、ＤＮＡ合成におけるＤＮＡポリメラーゼの反応性が向上することによってテンプレートDNAのクラスター増幅数が上昇する。また、各塩基の蛍光発色強度が強くなる、それらの結果として配列決定されたシークエンス量が上昇する。さらに、SOLEXAシークエンスシステムのシークエンス反応に適用した場合、シークエンス反応での酵素活性が上昇され、より多くの分子の伸長反応が起きることにより、反応サイクルに伴う蛍光発光強度の減少が改善され、配列決定されたシークエンスのゲノムへのmapping rateが上昇した。
　別の例としては、本発明の方法は、４５４シークエンサー（４５４Ｌｉｆｅ　ｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｒｏｃｈｅ）を用いたシークエンスシステムに応用できる。より詳細には、本発明の方法は、４５４シークエンスシステムにおける、ビーズ上でＰＣＲを行うエマルジョンＰＣＲおよびシークエンス反応、それぞれに応用できる。
　４５４シークエンサー（Ｇｅｎｏｍｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ　ＦＬＸ　Ｓｙｓｔｅｍ）とは、全ゲノムシークエンスを迅速に解読・アセンブリするための革新的なメソッドとして、リード長、リード数において圧倒的な処理能力を提供する大規模シークエンサーの一つである。１リードあたり平均２００～３００塩基長を解読し、４０万リードの塩基配列を解読するため、１ランで１億塩基以上の配列データを７．５時間で解析することができる。さらに、判読された２００塩基を超える配列の各塩基解読精度は９９．５％以上である。この４５４シークエンスシステムは、ＤＮＡ鋳型を球状のビーズに吸着、固定し、油水エマルジョンの中に包み込み増幅する過程、すなわちエマルジョンＰＣＲを経る。例えば、実施例で示すように、このエマルジョンＰＣＲにおいて本発明を適用することで、エマルジョンＰＣＲにおける酵素活性を上昇させ、シークエンス解析量が格段に向上する。また、エマルジョンＰＣＲ後のシークエンス反応においても、本発明の方法を適用することもできる。
　さらに別の例としては、本発明の方法は、ＳＯＬｉＤシークエンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いたシークエンスシステムに応用できる。より詳細には、本発明の方法は、ＳＯＬｉＤシークエンスシステムにおける、ビーズ上でＰＣＲを行うエマルジョンＰＣＲおよびシークエンス反応、それぞれに応用できる。例えば、実施例で示すように、このエマルジョンＰＣＲにおいて本発明を適用することで、エマルジョンＰＣＲにおける酵素活性を上昇させ、シークエンス解析量が格段に向上する。また、エマルジョンＰＣＲ後のシークエンス反応においても、本発明の方法を適用することでノイズ上昇を改善できる。
　本発明の方法は、上記した以外にも、次世代シークエンサー、例えば、Helicosシークエンサー (Helicos Biosciences社)などの装置を用いたシークエンスシステムなどにも適用することができる。
　本発明を以下の実施例でさらに詳しく説明するが、本発明はこれに限定されない。種々の変更、修飾が当業者には可能であり、これらの変更、修飾も本発明に含まれる。
１．実験材料
　D（＋）トレハロースはFluka Biochemika 90208を、D（＋）ソルビトールはFluka Biochemika （85529）、D(+)グルコースはWAKO（041-00595）、ベタインはWAKO（023-10862）を使用した。ストレプトアビジンビーズはTAKARAのMAGNOTEX-SA 9088を、ストレプトアビジンプレートは、Thermo ScienceのBioBind Streptavidine coat plate (FN-95029263)を使用した。各種酵素は、次のものを使用した。M-MLV reverse transcriptase(Promega 90208)、RNaseH(NEB M0297S)、E coli DNA polymeraseI(NEB0209S)、E. coli DNA ligase (NEB M0205S)、Xho I (NEB R0146S)、Pst I (NEB R0140S)、HindIII (NEB R0104S)、Not I (NEB R0189S) 、EcoRI(Fermentas ER0273)。ファージパッケージングにはEpicentreのMAXplax Packaging Extract MP5120を使用した。使用したＤＮＡは配列表の配列番号１～６に示した。
２．D（＋）トレハロース存在下でのDNA断片の切断
　ビオチン標識300bpのDNA断片を、ストレプトアビジンビーズに吸着させたまま、制限酵素BceAI反応を行う系について、添加するトレハロースの最終濃度を変えて以下の通りに検討した。
DNA断片の切断
　pFLCIIIベクターを鋳型に、300bpのDNA断片をビオチン標識したプライマー（配列番号１及び２）を用いてPCRを行い、TypeIIの制限酵素サイトBceAIで切断して遊離する50bpのDNA断片を検出した。常磁性のストレプトアビジンビーズを付属の1×Binding bufferで洗浄し、マグネチックスタンドで回収して上清を取り除いた後、同Bufferで懸濁した。PCR産物含溶液と2×Binding bufferを等容量で混合し、ビーズ溶液をさらに加えて室温で15分間緩やかに転倒回転しながら混合、吸着させた。マグネチックスタンドでサンプル吸着ビーズを回収し、1×Binding bufferで3回洗浄作業を行う。1×BceAI bufferでさらにもう一度洗浄した。反応溶液（1×BceAI Buffer、1×BSA、制限酵素20unit）について、最終濃度0.6M D(+)トレハロースを加える系Trehalose(+)、加えない系Trehalose(-)の2種類を調製した。それぞれの反応溶液を洗浄済みのビーズに加えて混合し37℃で3時間反応させた。マグネチックスタンドでビーズを回収し、制限酵素で切断して遊離したcDNAを含む上清をProteinase K反応、フェノール・クロロホルム処理、エタノール沈殿を行い、得られたcDNA沈殿を0.1×TE（pH7.5）で溶解して12％PAGE電気泳動を行った。
結果
　その結果、切断され遊離してくる50bp断片は、トレハロース添加時に収量が向上し、0M、0.3M、0.6M、0.8Mの中で0.6Mから変化が見られなかった（図1）。そこで、0.6Mを最適濃度として後の反応に設定した。
３．2本鎖cDNA合成効率の比較
　各種制限酵素サイトを持ったUnique oligo-dTによってRNAを逆転写し、cDNA/RNAハイブリットとなったものをビーズに吸着させたままGubler-Hoffman法により2本鎖合成反応を以下の通りに行った。
RNAの逆転写（1本鎖cDNAの合成）
　Total RNA（Mouse embrio17.5 ♀）12ugに対し、５’末端にビオチン標識した逆転写用のプライマー（配列番号３）15ugを使用した。逆転写反応溶液（1×GC buffer（TAKARA）、0.3mM dNTP mix、飽和ソルビトール/トレハロース溶液30ul、M-MLV 3000unit）を加え、α[32P]dGTPを添加して42℃で30分間、50℃で10分間、56℃で10分間反応させた。Proteinase K反応後、CTAB/Ureaで沈殿させ、7M Gu-HClで再溶解した。さらにEtOH沈殿を行った。
常磁性ストレプトアビジンビーズへのビオチン標識cDNA/RNAハイブリットの吸着
　常磁性のストレプトアビジンビーズを付属の1×Binding bufferで洗浄し、マグネチックスタンドで回収して上清を取り除いた後、同Bufferで懸濁した。cDNA/RNAハイブリッド溶液と2×Binding bufferを混合し、ビーズ溶液を加えて室温で15分間緩やかに転倒回転しながら混合、吸着させた。マグネチックスタンドでサンプル吸着ビーズを回収し、1×Binding bufferで3回洗浄作業を行った。
2本鎖cDNA合成（Gubler-Hoffman法）
　cDNA/RNAハイブリット吸着ストレプトアビジンビーズを、2本鎖合成用反応Buffer（10×Ecoli. Ligase buffer Invitrogen）で1回洗浄した。反応溶液（1×Ecoli. Ligase buffer、0.2ｍM dNTP mix、E coli.DNA Ligase 10unit、E coli.DNA polymerase I 40unit、E coli.RNase H 2unit）について、最終濃度0.6M D(+)トレハロースを加える系Trehalose(+)、加えない系Trehalose(-)の2種類を調製した。それぞれの反応溶液を洗浄済みのビーズと混合し、α[32P]dGTPを加えて16℃で3時間反応させた。1×Binding bufferで3回の洗浄し、液体シンチレーションカウンターにて測定、2本鎖cDNAの合成率とその収量を計算した（Scheme 1）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
結果
　その結果、Trehalose(+)、Trehalose(-)の条件での2本鎖合成効率を比較したところ、Trehalose(+)での合成率がTrehalose(-)に比べ1.25倍の上昇を示した（図2）。これによって、ビーズ表面上でのRNAニック反応、DNA伸長反応、DNA Ligation反応など様々な酵素反応がトレハロースによって促進されることが示された。
４．ストレプトアビジンビーズ固定ビオチン標識cDNAの各種制限酵素反応
制限酵素反応
　2本鎖cDNAが吸着したままのストレプトアビジンビーズを、各種制限酵素のBufferにて洗浄する。制限酵素はXho I、Pst I、Hind III、Not Iを使用した。反応溶液（各種1×Buffer、酵素によって1×BSA、制限酵素40unit）について、最終濃度0.6M D(+)トレハロースを加える系Trehalose(+)、加えない系Trehalose(-)の2種類を調製した。それぞれの反応溶液を洗浄済みのビーズに加えて混合し37℃で3時間反応した。マグネチックスタンドでビーズを回収し、制限酵素で切断して遊離したcDNAを含む上清を液体シンチレーションカウンターにて測定した。RIカウント数値から、cDNA収量と制限酵素効率を計算した（Scheme 2）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
結果
　その結果、ビーズに固定して2本鎖合成を行ったcDNAについて、1本鎖合成で使用したUnique Oligo-dT上の各種制限酵素サイト（3‘末端側）をそれぞれ切断した。遊離するcDNAの回収量の測定結果を図3に示す。いずれもTrehalose(+)の方が回収量の上昇がみられた。
５．cDNAファージライブラリー作製におけるトレハロースの影響評価
λファージcDNAライブラリーの作製
　ストレプトアビジンビーズに固定したcDNA/RNAハイブリットサンプルについて、Trehalose(+)、Trehalose(-)の条件でそれぞれ2本鎖合成したものを用い、λファージcDNAライブラリーの作製を行った。2本鎖cDNAを合成後、ビーズをBlunting buffer(T4 DNA polymerase buffer)で洗浄した。Blunting反応溶液（1×T4 DNA polymerase buffer、0.6Mトレハロース、0.1ｍM dNTP mix、T4 DNA polymerase 5unit）を加え、12℃で20分間温置した。反応後のビーズを0.1×TEで3回洗浄した後、1×Ligation bufferでさらにもう一度洗浄する。Ligation反応溶液（1×T4 DNA Ligation buffer、0.6Mトレハロース、5'末端BamH I突出アダプター 2ug、T4 DNA Ligase 800unit）を加え、16℃で一晩反応させた。ビーズを0.1×TEで3回洗浄し、1×Xho I用 bufferでさらにもう一度洗浄した。制限酵素Xho I反応溶液（1×Xho I buffer、0.6Mトレハロース、Xho I 40unit）を加え、37℃で3時間温置した。ビーズをマグネチックスタンドで回収し、Xho Iカットされて遊離したcDNAを含む上清を分離した。Proteinase K反応、フェノール・クロロホルム処理、エタノール沈殿を行い、得られたcDNA沈殿を0.1×TE（pH7.5）で溶解した。モル濃度比（cDNA：λファージベクター＝1：1）でライゲーションを行った。Ligation反応溶液（cDNA、λファージベクター、T4 DNA Ligase 200unit）を16℃で一晩反応させた。λファージパッケージング溶液（Epicentre）を加え、室温で1時間45分間静置した。SM bufferとクロロホルム2～3滴を加えて4℃で保存した。前日にλファージのホストバクテリアC600をLBMM液体培地（抗生物質無し、10mM MgSO4、0.2％ Maltose）30mlに植菌し、37℃で14時間培養した。培養した菌体を遠心分離によって集菌し、20mM MgSO4 10mlに再懸濁した。ファージサンプル溶液を100倍希釈し、そのうち10ul、100ulをC600/MgSO4懸濁液にそれぞれ混合してファージ感染させた。感染溶液をM-soft agarに加えて手早くボルテックスし、LB寒天培地（抗生物質無し）に表面を均一にムラなく流し広げた。37℃で14～16時間培養し、出現するプラークをカウントして力価を計算した（Scheme 3）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
cDNAファージライブラリー作製結果
　ビーズに固定したcDNA/RNAハイブリットサンプルについて、Trehalose(+)、Trehalose(-)の条件でそれぞれ2本鎖合成したものを用い、λファージcDNAライブラリーの作製を行った。λファージにパッケージングし、形成されたプラークの数からファージライブラリーの力価を計算したところ、Trehalose(+)で作製したサンプルのほうが明らかに良い結果を示していた（図4）。トレハロース添加条件下で精製されたcDNAの構造は、各反応においてその活性の促進だけでなく、高い精度を保っており、最終的なベクターライゲーションの反応系で大きな差を示すことになった。
　ストレプトアビジンビーズに吸着させたビオチン標識DNAに、D(+)トレハロースを最終濃度0.6Mで加えた各種酵素反応溶液では、トレハロースを添加することにより、長時間の反応でもそれまで底に凝集していたストレプトアビジンビーズが溶液中に拡散し、反応溶液の均一性をより保つようになった。そのため酵素活性にムラができず、各酵素反応が促進される結果となり、それに伴って目的DNAの回収量も上昇した。
　トレハロース存在下でDNA断片を切断する反応について、反応表面形体、切断位置、添加する試薬の関係を検討するため、新たに設計したDNAの断片反応を様々な条件下で以下の通りにおこなった。
６．トレハロース存在下におけるDNA断片の反応表面形体評価
　ビオチン標識DNA断片を、様々な形状の担体表面上で制限酵素反応を行った。このとき反応条件としてトレハロースの有無の系を設定し、遊離するDNA断片の回収量の差に連動する酵素活性が、反応表面の形状にどう関係し、トレハロースがどのような影響を及ぼしているのかを以下の通りに検討した。
溶液中のPstI切断反応
　ビオチン標識されたDNA断片III（配列番号６；Scheme 4.）を、溶液中において制限酵素サイトPstIで切断し、遊離するDNA断片104bpを検出した。反応溶液（DNA断片III 500ng、1×PstI Buffer、1×BSA、制限酵素40unit）について、最終濃度0.6M D(+)トレハロースを加える反応溶液Trehalose(+) 計50ul、加えない反応溶液Trehalose(-) 計50ul、の2種類を調製した。37℃で3時間反応後、Proteinase K反応、フェノール・クロロホルム処理、エタノール沈殿を行い、得られたDNA断片の沈殿を1×TE（pH7.5）で溶解してBioanalyzer DNA1000 assay（Agilent technologies）にて解析を行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
ビーズ球体表面上でのPstI切断反応
　ビオチン標識されたDNA断片III（配列番号６；Scheme 4.）を、ストレプトアビジンビーズ表面において制限酵素サイトPstIで切断し、遊離するDNA断片104bpを検出した。DNA断片III（500ng）に2×Binding bufferを等容量で混合し、1×Binding bufferで懸濁したビーズ溶液をさらに加えて室温で15分間緩やかに転倒回転しながら混合、吸着させた。マグネチックスタンドでサンプル吸着ビーズを回収し、1×Binding bufferで3回洗浄作業を行った。1×PstI bufferでさらにもう一度洗浄する。反応溶液（1×PstI Buffer、1×BSA、制限酵素40unit）について、最終濃度0.6M D(+)トレハロースを加える系Trehalose(+)、加えない系Trehalose(-)の2種類を調製する。それぞれの反応溶液を洗浄済みのビーズに加えて混合し37℃で3時間反応させた。マグネチックスタンドでビーズを回収し、制限酵素で切断して遊離したDNA断片を含む上清をProteinase K反応、フェノール・クロロホルム処理、エタノール沈殿を行い、得られたDNA断片の沈殿を1×TE（pH7.5）で溶解してBioanalyzer DNA1000 assay（Agilent technologies）にて解析を行った。
プレート水平表面上でのPstI切断反応
　ビオチン標識されたDNA断片III（配列番号６；Scheme 4.）を、ストレプトアビジンコートプレート水平表面において制限酵素サイトPstIで切断し、遊離するDNA断片104bpを検出した。DNA断片III（500ng）に2×Binding bufferを等容量で混合し、1×Binding bufferで洗浄したプレートのウェルに加えて室温で15分間緩やかに振とうしながら混合、吸着させた。上清を取り除き、1×Binding bufferで3回洗浄作業を行った。1×PstI bufferでさらにもう一度洗浄した。反応溶液（1×PstI Buffer、1×BSA、制限酵素40unit）について、最終濃度0.6M D(+)トレハロースを加える系Trehalose(+)、加えない系Trehalose(-)の2種類を調製した。それぞれの反応溶液を洗浄済みのウェルに加えて37℃で3時間反応させた。制限酵素で切断して遊離したDNA断片を含む上清を回収し、Proteinase K反応、フェノール・クロロホルム処理、エタノール沈殿を行い、得られたDNA断片の沈殿を1×TE（pH7.5）で溶解してBioanalyzer DNA1000 assay（Agilent technologies）にて解析を行った。
様々な反応表面系上での酵素活性の比較結果
　球体表面としてストレプトアビジンビーズ、水平表面としてストレプトアビジンコートプレート、フリーの系として通常の反応溶液のみ、以上3種類について酵素反応を行った（Scheme 5.）。結果を図５に示す。通常の反応系では、3時間の制限酵素反応において、トレハロース添加、無添加ともに同様の収量を得た。ビーズに吸着させて固定したDNAの切断反応では、トレハロース添加のほうが高い収量を示していた。同様の実験を水平表面系であるプレートを使っても行ったが、やはりトレハロース添加時のほうが高い収量を示した。以上の結果より、通常の反応溶液のみの酵素反応は、トレハロースの有無にかかわらずに進むが、担体表面上での反応では、トレハロース添加によって酵素活性の不活化を阻害し、その働きを促進させていることが示唆された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
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７．トレハロース存在下におけるDNA断片の切断位置評価
　酵素反応表面とDNA認識位置までの距離によって酵素活性に違いがあるかを以下の通りに比較した。
ビーズ球体表面からDNA切断反応位置までの距離が違う場合のPstI切断反応
　ビオチン標識された3つのDNA断片I、II、III（配列番号４～６；Scheme 4.）を、それぞれの制限酵素サイトPstIで切断し、遊離する各サイズのDNA断片を検出した。常磁性のストレプトアビジンビーズを付属の1×Binding bufferで洗浄し、マグネチックスタンドで回収して上清を取り除いた後、同Bufferで懸濁しておいた。3種類のビオチン標識DNA断片（500ng）にそれぞれ2×Binding bufferを等容量で混合し、ビーズ溶液をさらに加えて室温で15分間緩やかに転倒回転しながら混合、吸着させた。マグネチックスタンドでサンプル吸着ビーズを回収し、1×Binding bufferで3回洗浄作業を行った。1×PstI bufferでさらにもう一度洗浄した。反応溶液（1×PstI Buffer、1×BSA、制限酵素40unit）について、最終濃度0.6M D(+)トレハロースを加える系Trehalose(+)、加えない系Trehalose(-)の2種類を調製した。それぞれの反応溶液を洗浄済みのビーズに加えて混合し37℃で3時間反応させた。マグネチックスタンドでビーズを回収し、制限酵素で切断して遊離した各サイズのDNAを含む上清をProteinase K反応、フェノール・クロロホルム処理、エタノール沈殿を行い、得られたDNA断片の沈殿を1×TE（pH7.5）で溶解してBioanalyzer DNA1000 assay（Agilent technologies）にて解析を行った。
プレート水平表面からDNA切断反応位置までの距離が違う場合のPstI切断反応
　ビオチン標識された3つのDNA断片I、II、III（配列番号４～６；Scheme 4.）を、それぞれの制限酵素サイトPstIで切断し、遊離する各サイズのDNA断片を検出した。1×Binding bufferで洗浄したプレートのウェルに、2×Binding bufferを等容量で混合した3種類のビオチン標識DNA断片（500ng）をそれぞれ加え、室温で15分間緩やかに振とうしながら混合、吸着させた。上清を取り除き、1×Binding bufferで3回洗浄作業を行う。1×PstI bufferでさらにもう一度洗浄した。反応溶液（1×PstI Buffer、1×BSA、制限酵素40unit）について、最終濃度0.6M D(+)トレハロースを加える系Trehalose(+)、加えない系Trehalose(-)の2種類を調製した。それぞれの反応溶液を洗浄済みのウェルに加えて37℃で3時間反応させた。制限酵素で切断して遊離したDNA断片を含む上清を回収し、Proteinase K反応、フェノール・クロロホルム処理、エタノール沈殿を行い、得られたDNA断片の沈殿を1×TE（pH7.5）で溶解してBioanalyzer DNA1000 assay（Agilent technologies）にて解析を行った。
酵素反応表面からDNA切断反応位置までの距離とトレハロースの影響
　切断部位をDNA吸着表面から近い順に3段階設定し、それぞれトレハロース有無の条件について切断反応効率を検討した。表面から切断部位までの距離は、20bp、50bp、100bpで設定し、切断されて遊離してくるそれぞれ3種類のDNA断片104bp、81bp、22bpの回収量について比較検討した(Scheme 6)。その結果、酵素反応は表面に近くなるほど活性が低下してDNA収量が減少するが、トレハロース添加によってその向上が見られた。その差は反応表面に近くなるほど顕著に示された（図６Ａ）。また、反応表面形が球体（ビーズ）でも平面（プレート）でも同様の傾向が示された（図６Ｂ）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
８．トレハロース存在下におけるDNA断片の添加試薬影響評価
　酵素の担体表面反応において、トレハロース以外の物質が存在したときの酵素活性について検討した。添加試薬として、ソルビトールを用いた。さらに、トレハロースと混合した、ソルビトール＋トレハロースの反応系についても検討を行った（Scheme 7）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
D（＋）トレハロースをはじめ、その他の物質が存在する条件下でのビーズ球体表面上DNA断片HindIII切断反応
　ビオチン標識されたDNA断片II（配列番号５；Scheme 4.）をビーズ表面において、トレハロース、グルコース、ソルビトール、ベタインを加えてHindIII切断反応を行い、遊離するDNA断片104bpを検出した。常磁性のストレプトアビジンビーズを付属の1×Binding bufferで洗浄し、マグネチックスタンドで回収して上清を取り除いた後、同Bufferで懸濁しておいた。DNA断片II（500ng）に2×Binding bufferを等容量で混合し、ビーズ溶液をさらに加えて室温で15分間緩やかに転倒回転しながら混合、吸着させた。マグネチックスタンドでサンプル吸着ビーズを回収し、1×Binding bufferで3回洗浄作業を行った。1×HindIII bufferでさらにもう一度洗浄した。反応溶液（1×HindIII Buffer、制限酵素40unit）について、最終濃度0.6M D(+)トレハロースを加える系Trehalose(+)、加えない系Trehalose(-)、最終濃度0.6MD(+)グルコースを加える系、最終濃度0.6Mソルビトールを加える系、最終濃度2Mベタインを加える系の4種類を調製した。さらに最終濃度0.6Mトレハロース＋2Mベタイン、0.6Mトレハロース＋0.6Mグルコース、0.6Mトレハロース＋0.6Mソルビトールなどのコンビネーション反応溶液3種類も調製した。それぞれの反応溶液を洗浄済みのビーズに加えて混合し37℃で3時間反応させた。マグネチックスタンドでビーズを回収し、制限酵素で切断して遊離した各サイズのDNAを含む上清をProteinase K反応、フェノール・クロロホルム処理、エタノール沈殿を行い、得られたDNA断片の沈殿を1×TE（pH7.5）で溶解してBioanalyzer DNA1000 assay（Agilent technologies）にて解析を行った。
D（＋）トレハロースに、その他の物質が存在する条件下でのプレート水平表面上DNA断片HindIII切断反応
　ビオチン標識されたDNA断片II（配列番号５；Scheme 4.）をプレート水平表面において、トレハロース、ソルビトールを加えてHindIII切断反応を行い、遊離するDNA断片104bpを検出した。1×Binding bufferで洗浄したプレートのウェルに、2×Binding bufferを等容量で混合したDNA断片II（500ng）をそれぞれ加え、室温で15分間緩やかに振とうしながら混合、吸着させた。上清を取り除き、1×Binding bufferで3回洗浄作業を行う。1×HindIII bufferでさらにもう一度洗浄した。反応溶液（1×HindIII Buffer、制限酵素40unit）について、最終濃度0.6M D(+)トレハロースを加える系Trehalose(+)、加えない系Trehalose(-)、最終濃度0.6Mソルビトールを加える系を調製した。それぞれの反応溶液を洗浄済みのウェルに加えて37℃で3時間反応させた。制限酵素で切断して遊離したDNA断片を含む上清を回収し、Proteinase K反応、フェノール・クロロホルム処理、エタノール沈殿を行い、得られたDNA断片の沈殿を1×TE（pH7.5）で溶解してBioanalyzer DNA1000 assay（Agilent technologies）にて解析を行った。
トレハロース以外の物質を添加したときの酵素活性の比較結果
　球体（ビーズ）、水平（プレート）表面上において各物質存在下で制限酵素の切断反応を行った結果、回収されるDNAの収量を図７に示す。制限酵素反応を3時間行った後のビーズ反応溶液の様子を参考として図８に示す。トレハロース添加時と同様に、ソルビトール添加時にはビーズの溶液中均一性が保持されていた。これはトレハロースやソルビトールの粘度と拡散効果などの特性によるものと考えられる。各反応条件において、トレハロース添加時ほどではなかったにせよ、ソルビトール添加時においても酵素活性がどの反応表面上でも高く示されていた。
９．トレハロース存在下におけるDNA断片の制限酵素影響評価
　各反応表面形と、トレハロース有無の条件反応において、酵素の種類によって活性の違いがみられるか検討した。制限酵素は、XhoI、PstI、HindIII、EcoRIを用い、DNA断片の同じ位置を違う酵素で切断する反応を行った（Scheme 8）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
ビーズ球体表面上での様々な制限酵素によるDNA切断反応
　ビオチン標識されたDNA断片I、II、III（配列番号４～６；Scheme 4.）をビーズ表面上において、様々な制限酵素より切断反応を行った。DNA断片I、IIのXhoI、PstI部位（ビーズ表面から50bpの距離）での切断反応により、遊離する80bpのDNA断片を検出した。DNA断片IのEcoRI部位、DNA断片IIのHindIII部位、DNA断片IIIのPstI部位（いずれもビーズ表面から20bpの距離）での切断反応より、遊離する104bpのDNA断片を検出した。常磁性のストレプトアビジンビーズを付属の1×Binding bufferで洗浄し、マグネチックスタンドで回収して上清を取り除いた後、同Bufferで懸濁しておいた。DNA断片I、II、III（500ng）それぞれに2×Binding bufferを等容量で混合し、ビーズ溶液をさらに加えて室温で15分間緩やかに転倒回転しながら混合、吸着させた。マグネチックスタンドでサンプル吸着ビーズを回収し、1×Binding bufferで3回洗浄作業を行った。各DNA断片に対して、1×XhoI buffer、1×PstI buffer、1×HindIII buffer、1×EcoRI bufferでさらにもう一度洗浄した。各反応溶液（1×XhoI Buffer、1×BSA、制限酵素40unit）、（1×PstI Buffer、1×BSA、制限酵素40unit）、（1×HindIII Buffer、制限酵素40unit）、（1×EcoRI Buffer、制限酵素40unit）について、最終濃度0.6M D(+)トレハロースを加える系Trehalose(+)、加えない系Trehalose(-)を調製した。それぞれの反応溶液を洗浄済みのビーズに加えて混合し37℃で3時間反応させた。マグネチックスタンドでビーズを回収し、制限酵素で切断して遊離した各サイズのDNAを含む上清をProteinase K反応、フェノール・クロロホルム処理、エタノール沈殿を行い、得られたDNA断片の沈殿を1×TE（pH7.5）で溶解してBioanalyzer DNA1000 assay（Agilent technologies）にて解析を行った。
プレート水平表面上での異なる制限酵素によるDNA断片切断反応
　ビオチン標識されたDNA断片II、III（配列番号5、６；Scheme 4.）をストレプトアビジンコートプレート水平表面上において、異なる制限酵素より切断反応を行った。DNA断片IIのHindIII部位、DNA断片IIIのPstI部位（いずれもプレート表面から20bpの距離）での切断反応より、遊離する104bpのDNA断片を検出した。1×Binding bufferで洗浄したプレートのウェルに、2×Binding bufferを等容量で混合したDNA断片II、III（500ng）をそれぞれ加え、室温で15分間緩やかに振とうしながら混合、吸着させた。上清を取り除き、1×Binding bufferで3回洗浄作業を行う。それぞれのDNA断片に対して、1×HindIII buffer、1×PstI bufferでさらにもう一度洗浄した。それぞれの反応溶液（1×HindIII Buffer、制限酵素40unit）、（1×PstI Buffer、1×BSA、制限酵素40unit）について、最終濃度0.6M D(+)トレハロースを加える系Trehalose(+)、加えない系Trehalose(-)を調製した。それぞれの反応溶液を洗浄済みのウェルに加えて37℃で3時間反応させた。制限酵素で切断して遊離したDNA断片を含む上清を回収し、Proteinase K反応、フェノール・クロロホルム処理、エタノール沈殿を行い、得られたDNA断片の沈殿を1×TE（pH7.5）で溶解してBioanalyzer DNA1000 assay（Agilent technologies）にて解析を行った。
酵素の違いによる反応表面上の酵素活性の比較結果
　上記の結果を図９に示す。球形（ビーズ）、水平（プレート）表面上での切断反応において、酵素によって活性の違いが見られたが、いずれもトレハロース添加による活性の向上が示された。
　担体表面上の酵素反応に対するトレハロースの影響は、表面形状が球状、水平面状に関わらず反応の促進、または酵素活性の保持・向上に関すると考えられる。また、担体表面から酵素の基質となるDNA断片の反応認識部位までの距離と酵素活性の関係では、表面近くになるほど活性の低下が生じるが、トレハロースを添加することによってその活性が向上する。また、酵素によって表面近くの活性状況に差があることから、酵素の立体的な構造、および認識部位の特異性などもトレハロースと相互的に関係していると考えられる。以上の結果を合わせると、担体固定DNA酵素反応におけるトレハロースの作用は、反応溶液中のビーズなどによる物質の凝集阻害効果だけでなく、表面反応の酵素または基質となるDNA、もしくは両者の複合体に直接何らかの影響を及ぼしていることが考えられる。
１０．ＤＮＡチップ上におけるＤＮＡシークエンスシステムのトレハロースの影響評価
　SOLEXAシークエンスシステムは、DNA鋳型を平面形Chip上で吸着、固定、増幅する過程を経る。SOLEXAシークエンスシステムの鋳型増幅反応において、トレハロース添加によりシークエンス解析量にどのような変化がみられるのか検討した。
　SOLEXAシークエンスシステムを進める過程において、DNA固定Chip上で行われる、クラスター増幅反応に注目した。この反応は、Chip上に固定化されたDNAをDNA polymeraseにより増幅し、クラスターと呼ばれる同一断片を得るものである（Scheme 9）。この反応溶液に最終濃度0.6Mトレハロースを添加して増幅を行い、無添加の場合と結果を比較した（図１０）。今回使用したサンプルは、CAGE法（cDNAの5' 末端の27bpのみを切断して得るもの）によって作製した27bpのDNA断片である。その後のシークエンス反応によって得られた結果を表１に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
 Scheme 9. トレハロースを添加した条件下での鋳型増幅反応
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
　トレハロース添加でクラスターの増幅反応を行ったほうが、配列決定されたシークエンス量は上昇していた。解析されたDNA断片の中身についても、CAGE法で作製された領域（CAGE tag）をより多く含んでいた（図１０）。また、クラスター増幅反応後の塩基配列の読み取り過程では、トレハロース添加条件で進めたDNAサンプルの方が、各塩基の蛍光発色強度が強く表示されていた（Data not shown）。これらの結果より、トレハロースは水平表面上での酵素反応（今回はDNA伸長反応）の効率に影響を及ぼすことから、酵素の活性に関わる有効な特性を持つことが示された。
１１．エマルジョンＰＣＲを伴うＤＮＡシークエンスシステムにおけるトレハロースの影響評価
　454シークエンスシステム（Scheme 10）は、ＤＮＡ鋳型を球状のビーズに吸着、固定し、油水エマルジョンの中に包み込み増幅する過程（エマルジョンＰＣＲ）を経る。そこで、このエマルジョンＰＣＲにおいて、トレハロースを添加したとき、シークエンス解析量にどのような変化がみられるのか検討した。
　このエマルジョンＰＣＲは、ビーズに固定されたオリゴプライマーにDNAを相補的相互作用によって結合させ、油水エマルジョンの中に包み込みこむことにより、ビーズ1つとDNAフラグメント1つを持つマイクロリアクターを形成させ、DNAポリメラーゼによる増幅反応によって各DNAフラグメントが１ビーズあたり数百万コピーにまで増幅されるものである。この反応溶液に最終濃度0.6Mトレハロースを添加して増幅反応を行い、シークエンス解析結果にどのような影響を及ぼすか検討した（Scheme 11）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
　今回使用したサンプルは、Short RNAを逆転写したcDNAをPCRによって増幅したDNA断片である（図１１）。この反応によって得られた結果を図１２、１３及び１４並びに表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
　エマルジョンＰＣＲにおいてトレハロース（－）に比べて、トレハロース（＋）は、ＤＮＡ増幅ウェルの増加をもたらす結果となっている（図１２）。さらに、シークエンス解析結果では、トレハロース（－）に比べてトレハロース（＋）の方が解読されるシークエンス数とその領域が相互に増大する結果になっている（図１３）。
　トレハロース添加でエマルジョンＰＣＲを行ったサンプルDNAのシークエンスRead数は、トレハロース無添加に比べ、約1.6倍の上昇を示していた（図１４(a)）。解析されたDNA断片(Tag)の精度についても良い結果を示しており、目的領域をより多く含んでいた(図１４(b))。以上の結果より、トレハロースはやはりビーズなど反応表面上における酵素反応（DNA伸長反応）の効率に影響を及ぼし、酵素の活性の促進などに関わる有効な特性を持つことが示された。このようなトレハロースの特性は、担体上で酵素反応を行う大規模シークエンスシステムに応用され、さらなる性能の向上につながることが期待される。
１２．液相均一系におけるトレハロースの影響評価
　上記７と同様に、ビオチン標識された3つのDNA断片I、II、III（配列番号４～６.）を、それぞれの制限酵素サイトPstIで切断し、遊離する各サイズのDNA断片を検出した。反応溶液（1×PstI Buffer、1×BSA、制限酵素40unit）について、最終濃度0.6M D(+)トレハロースを加える系Trehalose(+)、加えない系Trehalose(-)の2種類を調製した。それぞれの反応溶液を加えて混合し37℃で3時間反応させた。制限酵素で切断して遊離した各サイズのDNAを含む上清をProteinase K反応、フェノール・クロロホルム処理、エタノール沈殿を行い、得られたDNA断片の沈殿を1×TE（pH7.5）で溶解してBioanalyzer DNA1000 assay（Agilent technologies）にて解析を行った（図１５及び図１６）。
　その結果、トレハロースの有無によって、遊離したDNA断片の回収量に変化はなかった（図１５及び図１６）。この結果と上記７の結果とを合わせると、トレハロースの添加は、担体に固定化された標的DNAに対する酵素の反応性を高めるか、又は担体による酵素の標的物質への反応性の阻害を緩和又は抑制することが明らかになった。
　１３．糖類、アミノ酸、多価アルコール及びこれらの組み合わせの存在下におけるＤＮＡ断片の添加試薬影響評価
D（＋）トレハロースをはじめ、その他の物質が存在する条件下でのビーズ球体表面上DNA断片HindIII切断反応
　上記８と同様に、ビオチン標識されたDNA断片I（配列番号4；Scheme 4.）をビーズ表面において、トレハロース、ソルビトール、グルコース、ベタイン、エチレングリコール、グリシンを加えてHindIII切断反応を行い、遊離するDNA断片104bpを検出した。常磁性のストレプトアビジンビーズを付属の1×Binding bufferで洗浄し、マグネチックスタンドで回収して上清を取り除いた後、同Bufferで懸濁しておいた。DNA断片I（1μg）に2×Binding bufferを等容量で混合し、ビーズ溶液をさらに加えて室温で20分間緩やかに転倒回転しながら混合、吸着させた。マグネチックスタンドでサンプル吸着ビーズを回収し、1×Binding bufferで3回洗浄作業を行った。1×HindIII bufferでさらにもう一度洗浄した。反応溶液（1×HindIII Buffer、制限酵素40unit、及び以下の各種各濃度の添加試薬）について、加えない系(SDW)、各種各濃度の添加試薬を加える系の合計23種類を調製した。それぞれの反応溶液を洗浄済みのビーズに加えて混合し37℃で3時間反応させた。マグネチックスタンドでビーズを回収し、制限酵素で切断して遊離した各サイズのDNAを含む上清についてエタノール沈殿を行い、得られたDNA断片の沈殿を1×TE（pH7.5）で溶解してBioanalyzer DNA1000 assay（Agilent technologies）にて解析を行った。
　各種各濃度の添加試薬は、最終濃度がそれぞれ0.1、0.3、0.5、0.6M Trehalose、0.6M Sorbitol、0.1、0.3、0.6、0.8M Glucose、0.5M Betain、0.3M Ethylene glycol、0.5MGlycin+0.5M Betain、0.6M Trehalose+0.6M Sorbitol、0.3Ｍ Trehalose＋0.3Ｍ Sorbitol、0.6M Trehalose+0.6M Glucose、0.3Ｍ Trehalose＋0.3Ｍ Glucose 、0.5M Trehalose+0.5M Betain、0.3Ｍ Trehalose＋0.3Ｍ Betain 、0.5M Trehalose+0.5M Glycine、0.3Ｍ Trehalose＋0.3Ｍ Glycin 、0.5M Trehalose+0.5M Glycin+0.5M Betain、0.3Ｍ Trehalose＋0.3Ｍ Glycin＋0.3Ｍ Betainとなるように調製した。
　上記解析の結果を図１７に示した。今回使用したいずれの各種各濃度の添加試薬及びそれらの組み合わせにおいても、これらの無添加時と比べて、ＤＮＡ断片の回収量は増加した。
１４．エマルジョンＰＣＲを伴うＤＮＡシークエンスシステムにおけるトレハロースの影響評価（２）
　上記１１に記載の４５４シークエンスシステムにおいて、反応溶液に最終濃度0.3Mトレハロースを添加して増幅反応を行い、シークエンス量にどのような影響を及ぼすかを検討した。その結果を、図１８及び図１９に示す。
　図１８が示す通り、トレハロースの添加によりシークエンス数が増えたことから、トレハロースを添加するとエマルジョンPCRによって増えるDNAがさらに多くなる、つまり、トレハロースによってエマルジョンPCRにおける酵素活性が増加したことが示された。
　また、エマルジョンPCRでは、長いものより短いものが優先的に増えてしまうとの課題があった。しかし、シークエンスの長さにおけるトレハロース添加の効果をみると（図１９を参照）、トレハロースを添加することによって短いもの(a)が減り、長いもの(b)が増えた。つまり、トレハロースを添加すると、エマルジョンPCRにおける上記課題が改善されることがわかった。
１５．ＤＮＡチップ上におけるＤＮＡシークエンスシステムのトレハロースの影響評価（２）
　上記１０と同様にして、SOLEXAシークエンスシステムについて、反応溶液に最終濃度0.3Mトレハロースを添加して増幅を行い、無添加の場合と結果を比較した。今回使用したサンプルは、上記１０と異なるCAGE法（cDNAの5' 末端の27bpのみを切断して得るもの）によって作製した27bpのDNA断片である。このシークエンスシステムによって得られた結果を図２０及び図２１に示した。
　トレハロース添加でクラスター増幅反応を行った方が、シークエンス量は上昇した（図２０を参照）。また、クラスター増幅反応後のシークエンス反応では、トレハロース添加条件で進めたCAGEサンプルの方が、各塩基の蛍光発色強度が強く表示されていた（図２１を参照）。これらの結果より、トレハロース添加によって水平表面上での酵素活性（今回はDNA伸長活性）が上昇したことが示された。
１６．Solexaシークエンスシステムのシークエンス反応におけるトレハロースの影響評価
（１）方法
　Genome Analyzer system(GAＩ)の酵素反応液にD(+)トレハロースを添加し、その効果を測定した。D(+)トレハロースは終濃度0.15M,0.3M,0.51Mの三種類で実験を行った。比較項目は、サイクルごとに算出される蛍光強度をクラスター数で割った平均値を元に、その減少割合を用いた。
（２）使用材料
　D(+)トレハロースはD(+)-Trehalose(90208 BioChemika, ≧99.5% (HPLC) (Fluka)を使用した。Genome Analyzer(illumina社)のシーケンスには36-cycle Illumina Sequencing Kit (FC-204-2036)を使用した。今回使用したサンプルはPhiX コントロール(CT-901-1001)である。
（３）D(+)トレハロースの添加条件
　36-Cycle SBS Reagent Kit v2(illumina catalog # FC-204-2036)に含まれるSBS Kit, Box 2のIMX36(42ml)を融解後、D(+)-Trehaloseを表３の分量で加えた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000017
　添加後は遮光させた状態を保ちながら10分間室温で緩やかに転倒混和し、溶解を目視で確認後にフィルターろ過(フィルター孔系0.22μm)を行った。ろ過後の混合液から必要量の42mlだけを採取し、その後はmanufacturer's protocolどおりに作業を進めた。
（４）結果（図２２及び図２３）
　図２２は、各runのPhiXコントロールの平均値を計算して作成したものである。図２２が示す通り、トレハロース(-)、トレハロース(+)のシーケンスにおける蛍光強度減少率はトレハロース(+)の条件下で全体的に優位な差を示し、蛍光強度が一番低い35cycle目で比較しても約20%以上の差があった。Trehalose(-)のエラーバーはばらつき度合いを示すためにMaxとMinの値を示している。図２３には、PhiXコントロールのマッピング率（mapping rate）を示してあり、こちらも全体的にトレハロース(-)よりも優位な差が見られた。
　これらの結果から、蛍光強度減少率が低いことから、トレハロースの存在下では酵素の活性が上昇し、トレハロース(-)より多くの分子の伸長反応が行われていると考えられる。その結果として、マッピング率の向上にも繋がり、酵素の活性化が示された。
１７．SOLiDシークエンスシステムのシークエンス反応におけるトレハロースの影響評価
（１）方法
　SOLiD system 2.0のライゲーション酵素反応液にD(+)トレハロースを添加し、その効果を測定した。D(+)トレハロースは終濃度0.3Mで実験を行った。比較項目は、サイクルごとに出るノイズとシグナル比(N2S)を用いた。N2Sとは2番目に明るい蛍光強度を最も明るい蛍光強度で割ったものである。
（２）使用材料
　D(+)トレハロースは、D（＋）－トレハロースニ水和物（201-02253 試薬特級）（Wako）を使用した。SOLiD system(Applied Biosystems)のシーケンスにはSOLiD（登録商標）フラグメント ライブラリ シーケンシング キット v2(4400466)を使用した。今回使用したサンプルはSOLiD（登録商標）DH10B フラグメント ライブラリ コントロール キット(4391889)である。
（３）D(+)トレハロースの添加条件
　SOLiD（登録商標）フラグメント ライブラリ シーケンシング キット v2(4400466)に含まれる試薬で作製するProbe Mix A及びB、Bridge Probeに1.7Mに調整したD(+)-Trehalose(90208 BioChemika, ≧99.5% (HPLC) (Fluka)を1シーケンスプライマーあたり下記の分量加えた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000018
 　添加後はmanufacturer's protocolどおりに作業を進めた。
　SOLiDシークエンスシステムでは、サイクルが進むたびにノイズが上がる課題があったが、図２４が示す通り、トレハロースの添加によりノイズ上昇が減っており、この課題が改善されたことが示された。
１８．４５４シークエンスシステムのシークエンス反応におけるトレハロースの影響評価
　上記１１に記載の４５４シークエンスシステムにおいて、反応溶液に最終濃度0.3Mトレハロースを添加してシークエンス反応を行い、シークエンス量にどのような影響を及ぼすかを検討した。その結果を、図２５に示す。
（１）方法
　Genome Sequencer FLX systemシーケンス酵素反応液にD(+)トレハロースを添加し、その効果を測定した。D(+)トレハロースは終濃度0.15M,0.3Mの二種類で実験を行った。比較項目は、読み取り長の長さと解読可能サンプルの割合を用いた。
（２）使用材料
　D(+)トレハロースは、D(+)-トレハロースニ水和物(201-02253 試薬特級)(Wako)を使用した。　Genome Sequencer FLX systemのシーケンスにはGS LR 25 Sequencing Kit(502906)を使用した。今回使用したサンプルは自家調整したPolyA minus full length cDNA libraryとmanufacture's protocolどおりに作製したHuman genomeを用いた。
（３）D(+)トレハロースの添加条件
　GS LR 25 Sequencing Kit (502906)に含まれる試薬のBuffer CBにD(+)-トレハロースニ水和物(201-02253 試薬特級)(Wako)を下記の分量加えた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000019
　マグネチックスターラーで攪拌、溶解を目視で確認後にフィルターろ過(フィルター孔系0.22μm)を行った。ろ過後の混合液から必要量の2×1000mlだけを採取し、その後はmanufacturer's protocolどおりに作業を進めた。
　図２５が示す通り、トレハロースの添加によりシークエンス数が増えたことから、トレハロースを添加するとシークエンス伸長反応における酵素活性が上昇し、解読できるシークエンス数がより多くなることが示された。

Claims (16)

  1. 糖類、アミノ酸、多価アルコール及びそれらの誘導体からなる群から選ばれる少なくとも一種の物質を存在させることにより、担体に固定化された標的物質に対する酵素の反応性を高める方法。
  2. 糖類、アミノ酸、多価アルコール及びそれらの誘導体からなる群から選ばれる少なくとも一種の物質を存在させることにより、標的物質を固定化させた担体による前記標的物質に対する酵素の反応性を阻害する効果を緩和又は抑制する方法。
  3. 前記糖類が、トレハロース、マルトース、グルコース、スクロース、ラクトース、キシロビオース、アガロビオース、セロビオース、レバンビオース、キトビオース、２－β－グルクロノシルグルクロン酸、アロース、アルトロース、ガラクトース、グロース、イドース、マンノース、タロース、ソルビトール、レブロース、キシリトール及びアラビトールからなる群から選ばれる糖である、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 前記アミノ酸又はその誘導体が、Ne－アセチル－β－リジン、アラニン、γ－アミノブチル酸、ベタイン、グリシンベタイン、Na－カルバモイル－Ｌ－グルタミン－１－アミド、コリン、ジメチルテチン、エコトイン、グルタメート、β－グルタミン、グリシン、オクトパイン、プロリン、サルコシン、タウリン及びトリメチルアミンＮ－オキシドからなる群から選ばれる請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 前記標的物質が核酸である請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 前記核酸が一本鎖又は二本鎖のＤＮＡ若しくはＲＮＡである請求項５に記載の方法。
  7. 前記核酸がＤＮＡとＲＮＡとがハイブリダイズした核酸である請求項５に記載の方法。
  8. 前記酵素が、転移酵素、加水分解酵素及び合成酵素からなる群から選ばれる少なくとも１種の酵素である請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。
  9. 前記酵素が、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮａｓｅ及びＤＮＡリガーゼである請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。
  10. 前記酵素が、逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮａｓｅ及びＤＮＡリガーゼである請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。
  11. 前記酵素が制限酵素である請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。
  12. 前記担体がビーズ状担体又はプレート状担体である請求項１～１１のいずれか１項に記載の方法。
  13. 前記ビーズ状担体がストレプトアビジンビーズである請求項１２に記載の方法。
  14. 前記プレート状担体がストレプトアビジンプレート又はＤＮＡマイクロアレイ用プレートである請求項１２に記載の方法。
  15. 前記方法が担体上でのｃＤＮＡライブラリー作製、シークエンス反応若しくはＤＮＡ合成反応又はＧＳＣ法に用いられる方法である請求項１～１４のいずれか１項に記載の方法。
  16. 前記ＤＮＡ合成反応がエマルジョンＰＣＲ又はブリッジＰＣＲである、請求項１５に記載の方法。
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