WO2005030958A1 - 酵素が固定されている支持体、印刷物、試薬キット、該支持体の製造法、酵素の保存法及び酵素の再生法 - Google Patents

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WO2005030958A1
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enzyme
support
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dna polymerase
dna
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PCT/JP2004/014245
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Yoshihide Hayashizaki
Mamoru Kamiya
Original Assignee
Riken
Kabushiki Kaisha Dnaform
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C12N9/1252—DNA-directed DNA polymerase (2.7.7.7), i.e. DNA replicase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
    • C12N11/10—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a carbohydrate
    • C12N11/12—Cellulose or derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/96—Stabilising an enzyme by forming an adduct or a composition; Forming enzyme conjugates

Definitions

  • the present invention relates to a support on which an enzyme is immobilized, a printed matter, a reagent kit, and a method for producing the support.
  • Enzymes are proteins having catalytic activity, and contribute to the maintenance of life by controlling various biological reactions.
  • Enzymes are unstable at room temperature when they contain water. Therefore, they are stored frozen or stored in liquid with stabilizers at temperatures below 20 ° C.
  • PCR polymerase chain reaction
  • DNA polymerase is usually stored in a buffer at a temperature of 20 ° C. For such storage, a freezer is required. When this enzyme is delivered from the supplier to the user, it is packed in a container such as styrofoam together with dry ice.
  • An object of the present invention is to provide a simple method for storing an enzyme.
  • the present inventors have found that the PCR reaction proceeds when the DNA polymerase is immobilized on a support in the state of being mixed with trehalose and stored, and then the PCR reaction proceeds. Reached.
  • the gist of the present invention is as follows.
  • the protective agent is selected from the group consisting of compounds having trehalose and derivatives thereof.
  • the support according to (1) which is at least one compound.
  • the support according to (6) further comprising a primer for amplifying a target nucleic acid in a nucleic acid amplification reaction using the DNA polymerase.
  • a nucleic acid to be used in the nucleic acid amplification reaction using the DNA polymerase comprising:
  • a printed matter comprising the support according to any one of (1) to (8).
  • a reagent kit comprising the support according to any one of (1) to (8).
  • the present invention also provides a method of storing an enzyme in a state of being fixed to a support as a mixture with a protective agent.
  • the present invention provides a method of disposing the support according to the above (7) in a liquid
  • Eluting a DNA polymerase and at least one selected from the group consisting of a nucleic acid to be type III, a primer for amplifying the nucleic acid, and a buffer for a nucleic acid amplification reaction is intended to provide a method for amplifying a nucleic acid, which comprises performing a nucleic acid amplification reaction using the DNA polymerase and a nucleic acid and / or a primer that becomes type II.
  • the present invention provides a support on which an enzyme and a protective agent for the enzyme are immobilized.
  • the enzyme may be any enzyme having some catalytic activity. Examples thereof include DNA polymerase, RNA polymerase, reverse transcriptase, RNase, restriction enzyme, methylase, modification enzyme, ligase, Examples include, but are not limited to, proteases, kinases, phosphatases, transfectases, glycosylases, topoisomerases, clonase, and the like.
  • the protective agent may be any one that can protect the enzyme in drying power and can be stored stably, such as trehalose and its derivatives, polysaccharides, PEG, dextran, Ficol, dalycerol, and surfactants. , PVA and derivatives thereof. Of these, trehalose and its derivatives are effective.
  • the protective agent may be a commercially available one, or may be one synthesized according to a known method.
  • Trehalose is a non-reducing disaccharide in which two molecules of D-glucose are bonded in a 1, 1 bond, and has three types of bonding, ⁇ , ⁇ -, ⁇ , ⁇ -, ⁇ , ⁇ -. There are isomers.
  • trehalose derivative examples include trehalose acid esters (eg, fatty acid esters such as lauric ester, oleic acid ester, linoleic acid ester, linolenic acid ester, stearic acid ester, palmitic acid ester, myristic acid ester, etc.).
  • trehalose acid esters eg, fatty acid esters such as lauric ester, oleic acid ester, linoleic acid ester, linolenic acid ester, stearic acid ester, palmitic acid ester, myristic acid ester, etc.
  • acetic acid esters examples include acetic acid esters, carboxylic acid esters such as benzoic acid esters, sulfate esters, etc.
  • alkyl ethers eg, ethers with alkyl having 8 to 25 carbon atoms
  • halides nitrogen-containing derivatives, sulfur-containing derivatives and the like.
  • Trehalose and its derivatives are commercially available, but may be produced by known methods! The method of preparing trehalose and its derivatives is as follows:
  • 10 5 - 10 ⁇ preferably 10 4 - 10-protecting agents may be added Caro to mixed-.
  • the support may further have an enzyme reaction promoter immobilized thereon.
  • the enzyme reaction accelerator is a substance that has the effect of promoting the enzyme reaction, the effect of promoting the enzyme reaction includes the effect of suppressing the inhibition of the enzyme reaction.
  • the enzyme reaction accelerator include sodium oxalate, potassium oxalate, sodium masonate, sodium maleate, dimethyl sulfoxide, betaine, glycerol, albumin, and surfactants (for example, tween20, Triton X100, NP40, etc.).
  • Polyamines eg, ethylenediamine, trimethylenediamine, spermine, spermidine, diethylenetriamine, triethylenetetramine, tetraethylenepentamine, pentaethylenehexamine, 1,4-bis (3-aminopropyl) -piperazine, 1— ( 2-aminoethyl) pirazine, 1- (2-aminoethyl) piperidine, 1,4,10,13-tetraoxa-1,16-diazacyclooctadecane and tris (2-aminoethyl) amine ), Sugars (eg, glucose, fructose, galactose) , Maltose, sucrose, ratatose, and other polysaccharides), sulfated polysaccharides and their salts (eg, heparin, dextran sulfate, etc.), dithiothreitol, polyaone (eg, DNA, RNA, etc.
  • Amide, hexafluorenium bromide, methyl azolidium bromide, etc. examples include Ampdirect (R) (manufactured by Shimadzu Corporation) and the like, which is effective for promoting the reaction of DNA polymerase.
  • the enzyme reaction promoter supports an appropriate amount of the enzyme reaction promoter so that, for example, in the case of a polyamine, the enzyme reaction accelerator is present at about 10 to 0.5 OlmM, preferably 2 to 0.5 mM. It should be fixed to the body.
  • the enzyme reaction accelerator is the same as the mixture of the enzyme and the protective agent. It may be immobilized on the support, or may be immobilized on the support at a different position from the enzyme and the protective agent.
  • the support may be any as long as it can fix a mixture of an enzyme and a protective agent.
  • the support include paper (for example, 60MDP paper (manufactured by Mishima Paper), copy paper, high-quality paper, Medium paper, Kent paper, drawing paper, kraft paper, inkjet paper, tracing paper, Japanese paper, cardboard, filter paper, etc.), glass substrate, silicon substrate, beads, column filler, silica gel, nitrocellulose membrane, nylon membrane, PVA A force that can exemplify a film or the like is not limited to these.
  • the thickness of the support may be, for example, 1 mm or less. If the thickness is made extremely thin (for example, about 0.1 mm), the workability is improved even when a large number of supports on which enzymes and protective agents are fixed are stacked and distributed.
  • the support includes, in addition to enzymes and protective agents, polynucleotides (eg, DNA, RNA, their derivatives, modified products, etc.) and oligonucleotides (eg, DNA, RNA, their derivatives, modified products, etc.) , Proteins (eg, antibodies, hormones, etc.), polypeptides, oligopeptides, polysaccharides, oligosaccharides, PNA, low molecular weight compounds (eg, EDTA, salts contained in PCR buffer compositions, Mg 2+ , dNTP mixtures, etc.) ), Mixtures thereof and the like may be fixed.
  • polynucleotides eg, DNA, RNA, their derivatives, modified products, etc.
  • oligonucleotides eg, DNA, RNA, their derivatives, modified products, etc.
  • Proteins eg, antibodies, hormones, etc.
  • polypeptides eg, oligopeptides
  • Components other than the enzyme and the protective agent may be fixed on the support at the same position as the mixture of the enzyme and the protective agent, or may be fixed to the support at a position different from the enzyme and the protective agent.
  • the present invention which claims that an abtamer for an enzyme is immobilized on a support, also provides a support on which an enzyme and an abtamer for the enzyme are immobilized.
  • a support is a primer for amplifying a target nucleic acid in a nucleic acid amplification reaction using the DNA polymerase, in addition to the DNA polymerase and the protecting agent for the DNA polymerase. including.
  • a support can be used for genotyping and species identification.
  • the support may further include an accelerator for the enzymatic reaction.
  • the support in addition to the DNA polymerase and the protective agent for the DNA polymerase, may be a nucleic acid that is a type II nucleic acid amplification reaction (eg, PCR) using the DNA polymerase. , A primer for amplifying the nucleic acid, and a nucleic acid amplification reaction A buffer for the at least one that is selected.
  • the support may further include an enzyme reaction promoter.
  • the paper when a DNA polymerase is fixed and stored on paper (support), the paper contains, in addition to the DNA polymerase and the protective agent, a primer set (oligonucleotide), (Synthetic single-stranded or double-stranded DNA may be used, or a vector obtained by closing cDNA).
  • a primer set oligonucleotide
  • Abtamer for DNA polymerase functional RNA
  • Each component in PCR reaction solution ie, Tris-HCU KC1 , MgCl, dNTP mixture, etc.
  • EDTA and the like may be immobilized.
  • DNA, Tris-HCl and EDTA which will be the type II of the PCR reaction, may be immobilized on paper as separate spots with DNA polymerase, protective agent and primer set as one spot, or (2) ) DNA polymerase, protecting agent and primer set, if necessary, aptamer for DNA polymerase may be fixed as one spot on paper, or (3) all components necessary for PCR reaction (i.e. If necessary, the DNA polymerase, primer set, Tris-HCU KC1, MgCl, dNTP mixture, etc. may be immobilized on a piece of paper together with a protecting agent as one spot, if necessary.
  • a dye to the components to be spotted so that it can be seen that components such as DNA polymerase are spotted on the paper.
  • the dye include, but are not limited to, cresol red, bromophenol blue, xylenesanol, and the like.
  • the amount of the enzyme immobilized on the support may be appropriately adjusted so that a desired enzyme reaction is performed. For example, in order to perform a PCR reaction, it is preferable that 5 ng or more of DNA polymerase is fixed per spot.
  • a support on which a mixture of an enzyme and a protective agent for the enzyme is immobilized can be produced as follows. First, a mixed solution of an enzyme and a protective agent is prepared. The mixing ratio of the enzyme and the protective agent is as described above. The solvent may be water. Further, the above-mentioned components other than the enzyme and the protective agent may be added to this mixed solution. Next, a mixed solution of the enzyme and the protecting agent is applied to the support. For example, when the support is paper, a mixed solution is used using a dropper, a 96 pin-tool (Multi 96-multiblot replicator VP409, Bio Medical Science Inc., US), a taste-possible type pin-tool, or the like. Can be spotted on paper it can. Thereafter, the mixture of the enzyme and the protective agent is immobilized on the support by drying the support. The support on which the mixture of the enzyme and the protective agent is immobilized should be substantially free of water.
  • the enzyme can be stably stored by fixing the enzyme to the support as a mixture with the protective agent.
  • As storage conditions it is preferable to store at room temperature, avoiding high humidity, and shielded from light.
  • the enzyme is a DNA polymerase
  • a shelf life of at least 6 and a half months has been confirmed when the DNA polymerase is stored as a mixture with trehalose on 60MDP paper at room temperature. Is ongoing).
  • the support immobilized with the mixture of the enzyme and the protective agent is immersed in a liquid, and the enzyme is immersed in the liquid. May be eluted.
  • the liquid in which the support is immersed may be any liquid as long as it can regenerate the enzyme, and examples thereof include water and an aqueous solution containing components other than water.
  • the present invention is not limited to these.
  • the enzyme immobilized on the support is DNA polymerase
  • the liquid in which the support is immersed is water, a PCR reaction solution (i.e., an aqueous solution containing Tris-HCU KC1, MgCl, dNTP mixture, etc.). Good.
  • the immersion may be performed at room temperature under atmospheric pressure for 13 minutes.
  • the DNA polymerase When a DNA polymerase is immobilized on a support, the DNA polymerase is eluted from the support by disposing the support in a liquid, and a nucleic acid amplification reaction is performed using the DNA polymerase. Thereby, the nucleic acid can be amplified.
  • the present invention also provides a printed material including a support on which an enzyme and a protective agent for the enzyme are immobilized.
  • Printed materials include textbooks and other books, handbooks, catalogs, periodicals, magazines, dissertations, booklets, booklets, leaflets, pamphlets, reports, posters, cards, labels, and the like. However, it is not limited to these.
  • FIG. 1 shows an example of paper (support) on which a mixture of an enzyme (DNA polymerase) and trehalose is spotted in the printed matter of the present invention.
  • DNA polymerase and trehalose contain primer sets, cDNA Components (ie, Tris-HCU KC1, MgCl, each dNTP, and if necessary, an aptamer for DNA polymerase) are spotted (hereinafter, this spot is referred to as “DNA SpotJ 1”).
  • paper 6 contains the name of the protein encoded by the cDNA clone (such as malate dehydrogenase), the identification number of the cDNA clone (Clone ID), and the nucleotide sequence of the cDNA clone (DNA sequence). ), Explanation 5 (Procedures) of the procedure of the experiment (PCR reaction) is printed!
  • FIG. 2 shows a journal 13 in which an academic paper 12 with the paper 6 having the DNA spot 1 shown in FIG. 1 attached as a separate paper is published.
  • FIG. 3 shows a book 22 in which the paper 6 having the DNA spot 1 shown in FIG. 1 is bound.
  • the book should also include a table of contents.
  • Fig. 4 shows another embodiment of a book in which a mixture of an enzyme (DNA polymerase) and trehalose is spotted and bound with V-paper (support).
  • DNA polymerase an enzyme
  • trehalose On each grid on page 34 where a mixture of enzyme (DNA polymerase) and trehalose is spotted, DNA polymerase and trehalose are required for primer sets, cDNA clones that are the type II PCR reaction, and other PCR reactions.
  • These components are spotted together with various components (ie, Tris-HCU KC1, MgCl, each dNTP, and, if necessary, an aptamer for DNA polymerase) (hereinafter, this spot is referred to as “DNA Spot” 31).
  • a symbol (column number) 32 and (row number) 33 for identifying the spot are printed on the page 34 having the spot 31, a symbol (column number) 32 and (row number) 33 for identifying the spot are printed.
  • the identification number 30 (Rearray PLATE ID) of the page where the DNA was spotted is printed.
  • Information on the spotted cDNA clone eg, EC number of the enzyme encoded by the cDNA clone, name of the enzyme encoded by the cDNA clone (Gene name), ID number of the clone (RIKEN Clone ID), deposit number ( Accesion Number), cDNA clone insert length (cDNA Insert), PCR reaction product length (After PCR), description of reactions involving enzymes encoded by cDNA clones, etc.
  • primer sets e.g., The primer sequences, etc.
  • CD-ROM36 which may be a medium such as FD or MO instead of CD-ROM
  • the CD-ROM 36 is put in a bag 37 and attached to a book 35 in a state where it is sealed with a seal 38.
  • the book also includes a table of contents, cDNA clones and primers. Instructions on how to use the spot including the merset and how to access the information recorded on the recording medium are printed and include a page.
  • the forms of the printed matter include: 1) a comprehensive encyclopedia type (for example, FANTOM clone, human metabolome, etc.), 2) a separate volume for each field (for example, by function or organ, etc.), 3) Themes can be further exemplified by themes or the content of each page can be divided into several pages (for example, loose-leaf type), and 4) Card types that are intended for a smaller number of pasted items.
  • a comprehensive encyclopedia type for example, FANTOM clone, human metabolome, etc.
  • a separate volume for each field for example, by function or organ, etc.
  • Themes can be further exemplified by themes or the content of each page can be divided into several pages (for example, loose-leaf type), and 4) Card types that are intended for a smaller number of pasted items.
  • the present invention provides a reagent kit including a support on which an enzyme and a protective agent for the enzyme are immobilized.
  • the reagent kit of the present invention can be used for various experiments, tests, diagnoses, and the like as a nucleic acid amplification reaction (eg, PCR) kit, a protein generation kit, an antibody kit, and other kits.
  • a nucleic acid amplification reaction eg, PCR
  • the reagent kit of the present invention may take the form of a printed material as described above, but examples of other forms are shown in FIGS. 6-9.
  • FIG. 6 shows an example of paper (support) on which a mixture of an enzyme (DNA polymerase) and trehalose is spotted in the reagent kit of the present invention.
  • This paper shows that DNA polymerase and trehalose contain primer sets and other components necessary for the PCR reaction (that is, Tris-HC1, KC1, MgCl, dNTPs, and, if necessary, an aptamer for DNA polymerase).
  • primer sets and other components necessary for the PCR reaction that is, Tris-HC1, KC1, MgCl, dNTPs, and, if necessary, an aptamer for DNA polymerase.
  • this spot is spotted at an appropriate position on the paper (hereinafter, this spot is referred to as “DNA spot” 41).
  • FIG. 7 shows an example of a reagent kit including the paper 42 having the DNA spot 41 shown in FIG.
  • the paper 42 having the DNA spots 41 is put in a light-shielding bottle 51, sealed with a lid 52, and stored or distributed.
  • Reagent kits also include the contents of the kit (eg, components included in the kit-amount, purpose of use, storage method, expiration date, packaging unit, etc.), instructions for use, precautions for use and handling, contact information, etc. It should include a description 53 with information on:
  • the instructions 53 may be placed in the light-shielding bottle 51 or in a packaging box (not shown) in which the light-shielding bottle 51 is placed.
  • an instruction may be printed on a label, and the label may be attached to the light shielding bin 51.
  • FIG. 8 shows the relationship between the enzyme (DNA polymerase) and trehalose in the reagent kit of the present invention.
  • 1 shows an example of a paper (support) on which a mixture is spotted.
  • This paper 62 contains the DNA polymerase and trehalose together with the primer set and other components required for the PCR reaction (ie, Tris-HCU KC1, MgCl, each dNTP, and, if necessary, the aptamer for DNA polymerase).
  • This spot is referred to as “DNA Spot” 61 below.
  • FIG. 9 shows an example of a reagent kit including a paper 62 having a DNA Spot 61.
  • the paper 62 having the DNA spot 61 is placed in a packaging pack 71 and stored or distributed in a sealed state.
  • Reagent kits also include the kit contents (eg, components included in the kit, intended use, storage method, expiration date, packaging unit, etc.), instructions for use, precautions for use and handling, and inquiries. It should include a description 72 with information such as the information.
  • the instructions 72 may be placed in the packaging pack 71, or may be placed in a packaging box (not shown) containing the packaging pack 71. Alternatively, the instruction manual 72 may be printed on a label, and the label may be attached to the packaging pack 71 or the packaging box.
  • the present invention has been described with respect to an embodiment in which a DNA polymerase is combined with DNA.
  • the present invention is not limited to this embodiment, and can be applied to various enzymes.
  • one indicates a range including numerical values described before and after it as a minimum value and a maximum value, respectively.
  • the present invention has provided a simple method for storing an enzyme.
  • FIG. 1 shows an example of paper (support) in which a mixture of DNA polymerase and trehalose is spotted together with DNA (cDNA, primers, aptamers, etc.).
  • FIG. 2 This shows a journal that contains an academic paper attached with a paper in which a mixture of DNA polymerase and trehalose is spotted with DNA (cDNA, primers, aptamers, etc.) as a separate sheet.
  • cDNA, primer, 1 shows an example of a book in which paper spotted together with a marker is bound.
  • FIG. 4 shows another embodiment of a book in which a mixture of DNA polymerase and trehalose is spotted with DNA (cDNA, primers, aptamers, etc.) and bound with a paper (support).
  • FIG. 5 This shows a form in which a CD-ROM in which information on cDNA spotted on the paper of FIG. 4 is recorded is put in a bag, attached to a book in a state of being sealed with a seal, and the like.
  • FIG. 6 shows an example of paper (support) in which a mixture of DNA polymerase and trehalose is spotted with DNA (cDNA, primers, aptamers, etc.).
  • FIG. 7 shows an example of a reagent kit including the paper of FIG.
  • FIG. 8 shows an example of paper (support) in which a mixture of DNA polymerase and trehalose is spotted with DNA (cDNA, primers, aptamers, etc.).
  • FIG. 9 shows an example of a reagent kit including the paper of FIG.
  • FIG. 10 shows the construction of a pFLC vector in which mouse malate dehydrogenase cDNA was cloned.
  • FIG. 11 shows a 60 MDP paper having a spot of a cDNA solution of mouse malate dehydrogenase and a spot of a single solution of polymerase and primer.
  • FIG. 12 shows the results of electrophoresis of a reaction product of a PCR reaction performed using the spots in FIG.
  • FIG. 13 shows a 60MDP paper having a spot of primer + aptamer + polymerase solution.
  • FIG. 14 shows the results of electrophoresis of a reaction product of a PCR reaction performed using the spots of FIG.
  • FIG. 15 cDNA of mouse malate dehydrogenase, mouse isoquenate dehydrogenase (NADP), mouse disoquate dehydrogenase (NAD) or mouse oxoglutarate dehydrogenase + primer + aptamer + polymerase + Shown is a 60MDP paper having a spot of a buffer composition solution for PCR.
  • NADP mouse isoquenate dehydrogenase
  • NAD mouse disoquate dehydrogenase
  • primer + aptamer + polymerase + Shown is a 60MDP paper having a spot of a buffer composition solution for PCR.
  • FIG. 16 The results of electrophoresis of the reaction product of the PCR reaction performed using the spots in FIG. Show.
  • FIG. 17 shows the results of electrophoresis of a reaction product of a PCR reaction performed using spots of cDNA + primer + reaction accelerator (spermidine) + polymerase + PCR buffer composition solution.
  • a primer set having the following sequence was synthesized by a conventional method.
  • PFLC vector (clone ID: 1500012M15, 1758 bp) cloned from the mouse malate dehydrogenase cDNA represented by the following nucleotide sequence from the RIKEN clone (http: @ fantom.gs riken.go.jp/) Figure 10) was dissolved in TE (10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA) to a concentration of 0.1 g / 1.
  • the cDNA solution and polymerase + primer solution prepared on 60MDP paper were spotted using a 96-pin-tool (Multi 96-multiblot replicator VP409, Bio Medical Science Inc., US) as shown in Fig. 11. Was spotted so that the position and type of the can be determined.
  • the cDNA solution was adjusted to 0.5 / zlZ spot and the polymerase + primer solution was adjusted to 11 1 spot.
  • 60MDP paper was cut to a size of 4 mm x 4 mm to contain the spotted cDNA and polymerase + primer, and placed in a PCR microtube. 25 ⁇ l of a PCR reaction solution (10 mM Tris-HCl (pH 8.3), 50 mM KC1, 5.3 mM MgCl, 200 ⁇ M each dNTP) was added to the tube, and PCR was performed under the following conditions.
  • a PCR reaction solution (10 mM Tris-HCl (pH 8.3), 50 mM KC1, 5.3 mM MgCl, 200 ⁇ M each dNTP
  • Fig. 12 shows the results of electrophoresis on a 1% agarose gel after taking an appropriate amount from the tube after the reaction.
  • the band seen around 1800 bp was considered to be the target fragment, and DNA was eluted from the 60MDP paper, indicating that the DNA could be amplified by PCR.
  • Primer set 1 (Primer set for amplifying human luteinizing hormone gene exon 1) HsLHIF: CCAGGGGCTGCTGCTGTTG (SEQ ID NO: 4)
  • HsLH 1 R CATGGTGGGGCAGTAGCC (SEQ ID NO: 5)
  • Primer set 2 (primer set for amplifying human luteinizing hormone gene exon 2)
  • HsLH2F ATGCGCGTGCTGCAGGCG (SEQ ID NO: 6)
  • HsLH2R TGCGGATTGAGAAGCCTTTATTG (SEQ ID NO: 7)
  • Oligonucleotides having the following sequences, which are Jayasena Inhibition of Multiple Thermostable DNA Polymerases by a Heterodimenc Aptamer Journal of Molecular Biology (1997), Vol. 27, Issue 1, pages 100-11), were synthesized by a conventional method.
  • the primer + abtamer + polymerase solution prepared above was applied to 60MDP paper (manufactured by Mishima Paper) using a 96 pin-tool (Multi 96-multiblot replicator VP409, Bio Medical Science Inc., US) as shown in Fig. 13. , Spots were spotted so that the position and type of spot could be determined. The spotting solution was made to be 11Z spot.
  • PCR reaction solution (10 mM Tris-HCl (pH 8.3), 50 mM KC1, 5.3 mM MgCl, 200 ⁇ M each dNTP) 25 1 and 50 ng template DNA (human genomic DNA, BD Biosciences Clontech, US)
  • PCR was performed under the following conditions.
  • Figure 14 shows the results of electrophoresis on a 1% agarose gel after taking an appropriate amount from the tube after the reaction.
  • the bands seen around 184 bp and 343 bp are considered to be the target DNA fragments of exons 1 and 2, respectively.
  • the target fragments should be able to amplify the target fragments by PCR using template DNA immobilized primers on 60MDP paper. I understood.
  • comparing the presence or absence of an aptamer to Taq DNA polymerase it was found that the reaction including the aptamer can suppress non-specific amplification.
  • a primer set having the following sequence was synthesized by a conventional method.
  • Mouse malate dehydrogenase cDNA (clone ID: 1500012M15, 1758 bp) represented by the following nucleotide sequence from the RIKEN clone (http: @ fantom.gs riken.go.jp/), mouse isogenate dehydrogenation Cloning enzyme (NADP) (clone ID: 1500012E04, 2440bp), mouse isoquenate dehydrogenase (NAD) (clone ID: E030024J03, 2160bp), mouse oxoglutarate dehydrogenase (clone ID: E430020N12, 3554bp)
  • NADP mouse isogenate dehydrogenation Cloning enzyme
  • NAD mouse isoquenate dehydrogenase
  • E430020N12, 3554bp mouse oxoglutarate dehydrogenase
  • the obtained pFLC vector (FIG. 10) was dissolved in TE (10 mM Tri
  • NADP Mouse isoquenate dehydrogenase
  • cDNA + primer + aptamer + polymerase + PCR buffer Above cDNA, primer set 1, aptamer for Taq DNA polymerase, and Taq DNA polymearse, final concentration, 5 ⁇ primer set 1, 5 ⁇ M aptamer for Taq DNA polymerase, 50 U / 1 Taq DNA polymerase, 0.1 M trehalose , 250 mM Tris-HCl (pH 8.3), 1.25 M KC1, 132.5 mM MgCl, and 5 ⁇ M dNTP.
  • PCR was performed under the following conditions.
  • Figure 16 shows the results of electrophoresis on a 1% agarose gel after taking an appropriate amount from the tube after the reaction.
  • Lane 1 is the malate dehydrogenase cDNA
  • Lane 2 is the isoenzyne dehydrogenase (NADP) cDNA
  • Lane 3 is the isoquensan dehydrogenase (NAD) cDNA
  • Lane 4 is the oxoglutarate dehydrogenase cDNA
  • the left end shows a size marker. Fragments of the desired length were obtained for each of the four cDNAs, and PCR amplification was performed by adding only water to the cDNA, primers, aptamers, polymerase, and PCR buffer composition fixed on 60MDP paper. It turned out to be possible.
  • a pFLC vector (FIG. 10) in which the same mouse malate dehydrogenase cDNA clone (clone ID: 1500012M15, 1758 bp) used in Example 3 was cloned into TE (10 mM Tris- HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA).
  • cDNA 0.005 ⁇ g / ⁇ ⁇ , 5 ⁇ primer set, 50 U / ⁇ 1 Taq DNA polymerase, supermidine 100 mM, 0.1 M trehalose, 250 mM Tris-HCl (pH 8.3), 1.25 M KC1, 132.5 mM MgCl, and 5 M were adjusted to each dNTP.
  • PCR was performed under the following conditions.
  • Lane 17 shows the results.
  • Lanes 1 and 2 are samples in which cDNA, primers, polymerase, spermidine, a type of polyamine as a reaction promoter, and a PCR buffer composition were immobilized on 60MDP paper.
  • Lane3 is a sample in which the composition excluding spermidine alone is fixed. In both cases, it was found that the immobilized DNA can be amplified by adding water, and the amplification reaction was accelerated in the sample in which the reaction accelerator was immobilized.
  • the support of the present invention can be used for storage and distribution of enzymes. It can also be applied to printed materials and reagent kits.
  • SEQ ID NO: 1 shows the nucleotide sequence of Primer-21M13.
  • SEQ ID NO: 2 shows the nucleotide sequence of primer 1233-Rv.
  • SEQ ID NO: 3 shows the nucleotide sequence of mouse malate dehydrogenase cDNA.
  • SEQ ID NO: 4 shows the nucleotide sequence of primer HsLHIF.
  • SEQ ID NO: 5 shows the nucleotide sequence of primer HsLHIR.
  • SEQ ID NO: 6 shows the nucleotide sequence of primer HsLH2F.
  • SEQ ID NO: 7 shows the nucleotide sequence of primer HsLH2R.
  • SEQ ID NO: 8 shows the nucleotide sequence of aptamer for Taq DNA polymerase.
  • SEQ ID NO: 9 shows the nucleotide sequence of mouse isoquinate dehydrogenase (NADP) cDNA.
  • SEQ ID NO: 10 shows the nucleotide sequence of mouse isoquenate dehydrogenase (NAD) cDNA.
  • SEQ ID NO: 11 2 shows the nucleotide sequence of the cDNA of oxodaltalate dehydrogenase.

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Abstract

　酵素を簡便な方法で保存可能とする。 　酵素と当該酵素の保護剤とが固定されている支持体。該支持体を含む印刷物及び試薬キット。該支持体を製造する方法。該支持体に固定された酵素を再生する方法。酵素を保護剤との混合物として支持体に固定した状態で保存する方法。

Description

明 細 書
酵素が固定されている支持体、印刷物、試薬キット、該支持体の製造法、 酵素の保存法及び酵素の再生法
技術分野
[0001] 本発明は、酵素が固定されている支持体、印刷物、試薬キット、該支持体の製造法
、酵素の保存法及び酵素の再生法に関する。
背景技術
[0002] 酵素は触媒活性を有するタンパク質であり、種々の生体反応を司ることにより、生命 の維持に貢献している。
[0003] 酵素は、水分を含有した状態では室温で不安定である。それ故、凍結状態で保存 されるカゝ、あるいは 20°C以下の温度で安定化剤とともに液体中で保存される。
[0004] ポリメラーゼ連鎖反応 (PCR)は、 DNAポリメラーゼという酵素により触媒される核酸 増幅反応であるが、 DNAポリメラーゼは通常バッファ一中で 20°Cの温度で保存さ れる。このような保存のためには、冷凍庫が必要である。また、この酵素が供給者から 使用者に配送されるにあたっては、ドライアイスとともに発泡スチロールなどの容器に 箱詰めされる。これらの保存'配送方法は、特別の設備や作業を要するため、操作が 煩雑で費用の力かるものである。
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0005] 本発明は、酵素を保存するための簡便な方法を提供することを目的とする。
課題を解決するための手段
[0006] 本発明者らは、 DNAポリメラーゼをトレハロースと混合した状態で支持体に固定し て保存した後、 PCRを行ったところ、 PCR反応が進行することを見出し、本発明を完 成させるに至った。
[0007] 本発明の要旨は以下の通りである。
[0008] (1) 酵素と当該酵素の保護剤とが固定されている支持体。
[0009] (2) 上記保護剤がトレハロース及びその誘導体力もなる化合物群より選択される少 なくとも一種類の化合物である（1)記載の支持体。
[0010] (3) 酵素反応の促進剤をさらに含む（1)又は（2)に記載の支持体。
[0011] (4) 上記酵素に対するアブタマ一をさらに含む（1)ないし（3)の何れか一項に記載 の支持体。
[0012] (5) 酵素と当該酵素に対するアブタマ一とが固定されている支持体。
[0013] (6) 上記酵素が DNAポリメラーゼである（1)ないし（5)の何れか一項に記載の支持 体。
[0014] (7) さらに、上記 DNAポリメラーゼを用いた核酸増幅反応で目的とする核酸を増幅 するためのプライマーを含んでなる（6)記載の支持体。
[0015] (8) さらに、上記 DNAポリメラーゼを用いた核酸増幅反応の铸型となる核酸、当該 核酸を増幅するためのプライマー、及び核酸増幅反応のためのバッファ一力 選択 される少なくとも一つを含んでなる（6)に記載の支持体。
[0016] (9) (1)ないし (8)の何れか一項に記載の支持体を含む印刷物。
[0017] (10) (1)ないし (8)の何れか一項に記載の支持体を含む試薬キット。
[0018] (11) (1)記載の支持体を製造する方法であって、酵素及び保護剤の混合溶液を 調製し、該溶液を支持体に適用し、該支持体を乾燥することにより、前記酵素及び保 護剤の混合物を支持体に固定することを含む前記の方法。
[0019] (12) (1)ないし (8)の何れか一項に記載の支持体を液体に浸漬させることにより、 該液体中に酵素を溶出させることを含む、支持体に固定された酵素を再生する方法
[0020] (13) (6)ないし (8)の何れか一項に記載の支持体を液体中に配置して当該支持 体より DNAポリメラーゼを溶出させる工程と、当該 DNAポリメラーゼを用いて核酸増幅 反応を行うことを特徴とする、核酸の増幅方法。
[0021] また、本発明は、酵素を保護剤との混合物として支持体に固定した状態で保存する 方法を提供する。
[0022] さらに、本発明は、上記（7)に記載の支持体を液体中に配置して当該支持体より
DNAポリメラーゼと、铸型となる核酸、当該核酸を増幅するためのプライマー及び核酸 増幅反応のためのバッファ一力 選択される少なくとも一つとを溶出させる工程と、当 該 DNAポリメラーゼと铸型となる核酸および/またはプライマーとを用いて核酸増幅反 応を行うことを特徴とする、核酸の増幅方法を提供する。
[0023] 以下、本発明を詳細に説明する。
[0024] 本発明は、酵素と当該酵素の保護剤とが固定されている支持体を提供する。
[0025] 酵素は、何らかの触媒活性を有するものであればいかなるものであってもよぐ例え ば、 DNAポリメラーゼ、 RNAポリメラーゼ、逆転写酵素、 RNase、制限酵素、メチラ ーゼ、修飾酵素、ライゲース、プロテアーゼ、キナーゼ、フォスファターゼ、トランスフ エラーゼ、グリコシラーゼ、トポイソメラーゼ、クロナーゼなどを例示することができるが 、これらに限定されることはない。
[0026] 保護剤は、酵素を乾燥力 保護し、安定に保存できるものであればいかなるもので あってもよぐトレハロース及びその誘導体、多糖類、 PEG,デキストラン、 Ficol、ダリ セロール、界面活性剤、 PVA及びその誘導体などを例示することができる。このうち 、トレハロース及びその誘導体が効果的である。
[0027] 保護剤は市販されているものであっても、公知の方法に従って合成したものであつ てもよい。
[0028] トレハロースは、 2分子の D-グルコースが 1 , 1結合した非還元性二糖であり、結合様 式としては、 α , α -、 α , β -、 β , β -の 3種の異性体がある。
[0029] トレハロースの誘導体としては、トレハロースの酸エステル（例えば、ラウリン酸エス テル、ォレイン酸エステル、リノール酸エステル、リノレン酸エステル、ステアリン酸ェ ステル、パルミチン酸エステル、ミリスチン酸エステルなどの脂肪酸エステル、酢酸ェ ステル、安息香酸エステルなどのカルボン酸エステル、硫酸エステルなど）、アルキル エーテル (例えば、炭素数 8— 25のアルキルとのエーテルなど）、ハライド、含窒素誘 導体、含硫黄誘導体などを例示することができるが、これら〖こ限定されることはない。
[0030] トレハロース及びその誘導体は市販されて 、るが、公知の方法で製造してもよ!/、。ト レハロース及びその誘導体の製法は、シ一.ケ一.リー『デベロップメンッ'イン'フード
'カルボハイドレート』、 1980年、アプライッド'サイエンス'パブリツシヤーズ社発行、 第 1乃至 89頁ゃケ一'ヨシモトら『ケミカル ·アンド 'ファーマシューティカル ·ブレティン 』、第 30卷、第 4号、第 1 , 169乃至 1 , 174頁（1982年）、特開平 8-157491号などに 記載されている。
[0031] 酵素 1Uに対して、 10— 5— 10^、好ましくは、 10— 4— 10— の保護剤を添カロして混 合するとよい。
[0032] 支持体には、さらに、酵素反応の促進剤が固定されていてもよい。酵素反応の促進 剤は、酵素反応を促進する効果がある物質であればよぐ酵素反応を促進する効果 には、酵素反応阻害を抑制する効果も含まれる。酵素反応の促進剤としては、例え ば、シユウ酸ナトリウム、シユウ酸カリウム、マソン酸ナトリウム、マレイン酸ナトリウム、ジ メチルスルホキシド、ベタイン、グリセロール、アルブミン、界面活性剤（例えば、 tween20, Triton X100, NP40など）、ポリアミン（例えばエチレンジァミン、トリメチレン ジァミン、スペルミン、スペルミジン、ジエチレントリァミン、トリエチレンテトラミン、テトラ エチレンペンタミン、ペンタエチレンへキサミン、 1, 4—ビス（3—ァミノプロピル）ーピぺ ラジン、 1— (2—アミノエチル）ピぺラジン、 1— (2—アミノエチル）ピぺリジン、 1, 4, 10, 13—テトラオキサ一 7, 16—ディアザサイクロォクタデカンおよびトリス（2—アミノエチル )ァミンなど）、糖類 (例えば、グルコース、フルクトース、ガラクトース、マルトース、スク ロース、ラタトース、その他多糖など)、硫酸ィ匕多糖およびその塩類 (例えば、へパリン ,デキストランサルフェイトなど）、ジチオスレィトール、ポリア-オン（例えば DNA,RNA など）、多価アルコール（例えば、エチレングリコール、プロピレングリコール、ブタンジ オール、へキサンジオール、オクタンジオール、グリセリン、ソルビタン、トリメチロール プロパン、ネオペンチルグリコールなどの脂肪族多価アルコール、ジエチレングリコー ル、トリエチレングリコール、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール等）、硫 酸アンモ-ゥム、第四級アンモ-ゥム塩 (例えば、へキサデシルトリメチルアンモ-ゥ ムブロミド、へキサデシルピリジ -ゥムクロライド、へキサジメチリンブ口
ミド、へキサフルォレニウムブロミド、メチルァゾリ-ゥムブロミドなど）などを例示するこ とができる力 これらに限定されることはない。酵素反応促進剤としては、 Ampdirect(R) (島津製作所社製)などが挙げられ、 DNAポリメラーゼの反応促進に有効である。
[0033] 酵素反応促進剤は、反応液中に、例えばポリアミンであれば、 10— 0. OlmM程度 、好ましくは 2— 0. 5mMで存在するように、適当な量の酵素反応促進剤を支持体に 固定するとよい。酵素反応促進剤は、酵素及び保護剤の混合物と同 Cf立置で支持体 上に固定されてもよいし、酵素及び保護剤とは異なる位置で支持体に固定されてもよ い。
[0034] 支持体は、酵素及び保護剤の混合物を固定できるものであれば 、かなるものであ つてもよく、例えば、紙 (例えば、 60MDP紙 (三島製紙製)、コピー用紙、上質紙、中質 紙、ケント紙、画用紙、クラフト紙、インクジェット専用紙、トレーシングペーパー、和紙 、ボール紙、濾紙など）、ガラス基板、シリコン基板、ビース、カラム充填剤、シリカゲル 、ニトロセルロース膜、ナイロン膜、 PVA膜などを例示することができる力 これらに限 定されることはない。
[0035] 支持体の厚さは、例えば、 1mm以下とすることができる。この厚さを非常に薄くすれ ば (例えば 0.1mm程度）、酵素及び保護剤を固定した支持体を多数枚積層して配布 する場合にも、嵩張らないので、その作業性は向上する。
[0036] 支持体には、酵素及び保護剤の他、ポリヌクレオチド (例えば、 DNA、 RNA、それら の誘導体、修飾体など）、オリゴヌクレオチド (例えば、 DNA、 RNA、それらの誘導体、 修飾体など）、タンパク質 (例えば、抗体、ホルモンなど）、ポリペプチド、オリゴぺプチ ド、多糖、オリゴ糖、 PNA、低分子化合物（例えば、 EDTA、 PCR用バッファー組成に 含まれる塩、 Mg2+、 dNTP混合物など）、それらの混合物などが固定されていてもよい 。酵素及び保護剤以外の成分は、酵素及び保護剤の混合物と同じ位置で支持体上 に固定されてもよいし、酵素及び保護剤とは異なる位置で支持体に固定されてもよい 。特に、酵素に対するアブタマ一が支持体に固定されているとよぐ本発明は、酵素 と当該酵素に対するアブタマ一とが固定されている支持体も提供するものである。
[0037] 本発明の好ましい態様の一つにおいて、支持体は、 DNAポリメラーゼと当該 DNAポ リメラーゼの保護剤の他、当該 DNAポリメラーゼを用いた核酸増幅反応で目的とする 核酸を増幅するためのプライマーを含む。このような支持体は、 genotypingや種の同 定などに使用することができる。支持体は、さらに、酵素反応の促進剤を含んでもよ い。
[0038] 本発明の別の好ましい態様の一つにおいて、支持体は、 DNAポリメラーゼと当該 DNAポリメラーゼの保護剤の他、当該 DNAポリメラーゼを用いた核酸増幅反応 (PCR など）の铸型となる核酸、当該核酸を増幅するためのプライマー、及び核酸増幅反応 のためのバッファ一力 選択される少なくとも一つを含む。支持体は、さらに、酵素反 応の促進剤を含んでもよい。
[0039] 例えば、 DNAポリメラーゼを紙 (支持体）に固定して保存する場合には、紙には、 DNAポリメラーゼ及び保護剤の他、プライマーセット (オリゴヌクレオチド）、 PCR反応 の铸型となる DNA (合成の 1本鎖又は 2本鎖 DNAでもよいし、 cDNAをクローユングし たベクターでもよい）、 DNAポリメラーゼに対するアブタマ一 (機能性 RNA)、 PCR反応 溶液中の各成分（すなわち、 Tris-HCU KC1、 MgCl、 dNTP混合物など）、 EDTAなどを 固定してもよい。この場合、（l) DNAポリメラーゼ、保護剤及びプライマーセットを 1ス ポットとして、 PCR反応の铸型となる DNA、 Tris-HCl及び EDTAを別のスポットとして紙 に固定してもよいし、（2) DNAポリメラーゼ、保護剤及びプライマーセット、必要により 、 DNAポリメラーゼに対するァプタマ一を 1スポットとして紙に固定してもよいし、 (3) PCR反応に必要なすべての成分 (すなわち、 PCR反応の铸型となる DNA、 DNAポリメ ラーゼ、プライマーセット、 Tris-HCU KC1、 MgCl、 dNTP混合物など、必要により、 DNAポリメラーゼに対するアブタマ一）を保護剤とともに 1スポットとして紙に固定して もよ 、。紙に DNAポリメラーゼなどの成分がスポッティングされて 、ることがわかるよう に、スポッティングする成分に色素を添加しておくとよい。色素としては、クレゾ一ルレ ッド、ブロモフエノールブルー、キシレンシァノールなどを例示することができる力 こ れらに限定されるわけではない。
[0040] 支持体に固定する酵素の量は、 目的とする酵素反応が行われるように適宜調整す るとよい。例えば、 PCR反応が行われるようにするためには、 1スポット当たり 5 ng以上 の DNAポリメラーゼが固定されるとよい。
[0041] 酵素及び当該酵素の保護剤の混合物が固定されている支持体は以下のようにして 製造することができる。まず、酵素及び保護剤の混合溶液を調製する。酵素と保護剤 の混合比は上記の通りである。溶媒は水であるとよい。さらに、この混合溶液に、酵素 及び保護剤以外の上記の成分を添加してもよい。次いで、酵素及び保護剤の混合 溶液を支持体に適用する。例えば、支持体が紙である場合には、スポイト、 96 pin-tool (Multi 96- multiblot replicator VP409, Bio Medical Science Inc., US)、テイス ポーザブルタイプの pin-toolなどを用いて、混合溶液を紙にスポッティングすることが できる。その後、支持体を乾燥することにより、酵素及び保護剤の混合物を支持体に 固定する。酵素及び保護剤の混合物を固定した支持体は実質的に水を含まないも のであるとよい。
[0042] 上記のように、酵素を保護剤との混合物として支持体に固定した状態にすることに よって、酵素を安定に保存することができる。保存条件としては、室温で、高湿度を避 け、遮光下に保存することが好ましい。例えば、酵素が DNAポリメラーゼである場合、 DNAポリメラーゼをトレハロースとの混合物として 60MDP紙に固定した状態で室温で 保存したとき、少なくとも 6か月半の保存寿命が確認されている（現在、まだ保存試験 は続行中である）。
[0043] 上記のように、保護剤との混合物として支持体に固定した酵素を再生するには、酵 素と保護剤との混合物を固定した支持体を液体に浸漬させ、該液体中に酵素を溶出 させればよい。支持体を浸漬させる液体は、酵素の再生を可能とするものであればい 力なるものであってもよいが、例えば、水、水以外の成分を含有する水溶液などを例 示することができるが、これらに限定されるわけではない。例えば、支持体に固定した 酵素が DNAポリメラーゼである場合、支持体を浸漬させる液体は、水、 PCR反応溶液 (すなわち、 Tris-HCU KC1、 MgCl、 dNTP混合物などを含有する水溶液)などであると よい。浸漬は、室温にて大気圧下で、 1一 3分間行えばよい。
[0044] 支持体に DNAポリメラーゼが固定されている場合には、この支持体を液体中に配 置して当該支持体より DNAポリメラーゼを溶出させ、当該 DNAポリメラーゼを用いて核 酸増幅反応を行うことにより、核酸を増幅することができる。
[0045] また、本発明は、酵素と当該酵素の保護剤とが固定されている支持体を含む印刷 物を提供する。
[0046] 印刷物としては、教科書などの成書、ハンドブック、カタログ、定期刊行物、雑誌、 論文、冊子、小冊子、リーフレット、パンフレット、報告書、ポスター、カード、ラベルな どを例示することができる力 これらに限定されるわけではない。
[0047] 図 1は、本発明の印刷物における、酵素（DNAポリメラーゼ）及びトレハロースの混 合物がスポッティングされている紙 (支持体)の一例を示す。紙 6には、 DNAポリメラー ゼ及びトレハロースが、プライマーセット、 PCR反応の铸型となる cDNAクローン及びそ の他の PCR反応に必要な成分（すなわち、 Tris-HCU KC1、 MgCl、各 dNTP、必要によ り、 DNAポリメラーゼに対するァプタマ一）とともにスポッティングされている（以下、こ のスポットを「DNA SpotJ 1という）。紙 6には、 DNA Spotlの他に、 cDNAクローンがコ ードするタンパク質の名前 2 (malate dehydrogenaseなど）、 cDNAクローンの識別番号 3 (Clone ID)、 cDNAクローンの塩基配列 4 (DNA sequence)、実験（PCR反応）の手 順の説明文 5 (Procedures)が印刷されて!、る。
[0048] 図 2は、図 1に示す DNA Spotlを有する紙 6を別紙として添付している学術論文 12 が掲載されている雑誌 13を示す。
[0049] 図 3は、図 1に示す DNA Spotlを有する紙 6を綴じ込んだ書籍 22を示す。この書籍 には、さらに、 目次が含まれているとよい。
[0050] 図 4は、酵素（DNAポリメラーゼ)及びトレハロースの混合物がスポッティングされて Vヽる紙 (支持体)を綴じ込んだ書籍の別の態様を示す。酵素 (DNAポリメラーゼ)及び トレハロースの混合物がスポッティングされている頁 34の各格子には、 DNAポリメラー ゼ及びトレハロースが、プライマーセット、 PCR反応の铸型となる cDNAクローン及びそ の他の PCR反応に必要な成分（すなわち、 Tris-HCU KC1、 MgCl、各 dNTP、必要によ り、 DNAポリメラーゼに対するァプタマ一）とともに、スポッティングされている（以下、こ のスポットを「DNA Spot」31という。 ) oこれらのスポット 31を有する頁 34には、スポット を識別するための記号 (列番号） 32及び (行番号） 33が印刷されている。さらに、 DNAをスッポッティングした頁の識別番号 30 (Rearray PLATE ID)が印刷されている 。スポッティングされている cDNAクローンに関する情報（例えば、 cDNAクローンがコ ードする酵素の EC number, cDNAクローンがコードする酵素の名前（Gene name)、ク ローンの ID番号 (RIKEN Clone ID)、寄託番号 (Accesion Number), cDNAクローンイン サートの長さ (cDNA Insert), PCR反応産物の長さ (After PCR), cDNAクローンがコー ドする酵素が関与する反応の説明など)及びプライマーセットに関する情報 (例えば、 プライマーの塩基配列など）は CD- ROM36 (CD- ROMの代わりに FD、 MOなどの媒 体でもよい）に記録されており、これらの記録媒体が書籍に付録として添付されている (図 5)。図 5においては、 CD- ROM36は袋 37に入れられ、シール 38で封をした状態 で書籍 35に添付されている。この書籍には、さらに、 目次、 cDNAクローン及びプライ マーセットを含むスポットの使用説明、記録媒体に記録されている情報へのアクセス 方法が印刷されて 、る頁が含まれて 、るとよ!、。
[0051] 印刷物の形態としては、 1)百科事典タイプの網羅的なもの（例えば、 FANTOMクロ ーン、ヒトメタボロームなど）、 2)分野ごと (例えば、機能別或いは臓器別等)の分冊型 、 3)更にテーマというか内容を細分化した 1ページ力も数ページのもの（例えば、ル ーズリーフタイプ）、 4)より少数の貼付物を想定したカードタイプを例示することができ る。
[0052] さらに、本発明は、酵素と当該酵素の保護剤とが固定されている支持体を含む試 薬キットを提供する。
[0053] 本発明の試薬キットは、核酸増幅反応 (例えば、 PCR)キット、蛋白発生キット、抗体 キット、その他のキットとして、種々の実験、検査、診断などに利用することができる。
[0054] 本発明の試薬キットは、上記のような印刷物の形態をとつてもよいが、それ以外の形 態の例を図 6— 9に示す。
[0055] 図 6は、本発明の試薬キットにおける、酵素（DNAポリメラーゼ）及びトレハロースの 混合物がスポッティングされている紙 (支持体)の一例を示す。この紙には、 DNAポリ メラーゼ及びトレハロースが、プライマーセット、その他の PCR反応に必要な成分 (す なわち、 Tris- HC1、 KC1、 MgCl、各 dNTP、必要により、 DNAポリメラーゼに対するァプ タマ一）とともに、紙の適当な位置にスポッティングされている（以下、このスポットを「 DNA Spot」41という）。
[0056] 図 7は、図 6に示す DNA Spot41を有する紙 42を含む試薬キットの一例を示す。
DNA Spot41を有する紙 42は遮光ビン 51に入れられ、蓋 52で密栓をして保管あるい は流通される。試薬キットには、さらに、キットの内容 (例えば、キットに含まれる成分- 分量、使用目的、保管方法，有効期限、包装単位など)、使用方法、使用上及び取 扱い上の注意、問合せ先などの情報が記載された説明書 53を含むとよい。説明書 5 3は遮光ビン 51に入れてもよいし、遮光ビン 51を入れた包装箱（図示せず）に入れて もよい。あるいは、説明書をラベルに印刷して、このラベルを遮光ビン 51に貼り付け てもよい。
[0057] 図 8は、本発明の試薬キットにおける、酵素（DNAポリメラーゼ)及びトレハロースの 混合物がスポッティングされている紙 (支持体）の一例を示す。この紙 62には、 DNA ポリメラーゼ及びトレハロースが、プライマーセット、その他の PCR反応に必要な成分（ すなわち、 Tris-HCU KC1、 MgCl、各 dNTP、必要により、 DNAポリメラーゼに対するァ プタマー）とともに、紙の適当な位置にスポッティングされている（以下、このスポットを 「DNA Spot」61という）。
[0058] 図 9は、 DNA Spot61を有する紙 62を含む試薬キットの一例を示す。 DNA Spot61 を有する紙 62は包装パック 71に入れられ、密封して保管あるいは流通される。試薬 キットには、さらに、キットの内容 (例えば、キットに含まれる成分'分量、使用目的、保 管方法，有効期限、包装単位など)、使用方法、使用上及び取扱い上の注意、問合 せ先などの情報が記載された説明書 72を含むとよい。説明書 72は包装パック 71に 入れてもよいし、包装パック 71を入れた包装箱（図示せず）に入れてもよい。あるいは 、説明書 72をラベルに印刷して、このラベルを包装パック 71又は包装箱に貼り付け てもよい。
[0059] 以上、 DNAポリメラーゼを DNAと組み合わせた態様にっ 、て、本発明を説明したが 、本発明はこの態様に限定されるわけではなぐ種々の酵素への適用が可能である。
[0060] なお、本明細書において、「一」はその前後に記載される数値をそれぞれ最小値お よび最大値として含む範囲を示す。
発明の効果
[0061] 本発明により、酵素を保存するための簡便な方法が提供された。
[0062] 本明細書は、本願の優先権の基礎である日本国特許出願、特願 2003-339542号の 明細書および Zまたは図面に記載される内容を包含する。
図面の簡単な説明
[0063] [図 1]DNAポリメラーゼ及びトレハロースの混合物が DNA(cDNA、プライマー、ァプタ マーなど）とともにスポッティングされて 、る紙 (支持体)の一例を示す。
[図 2]DNAポリメラーゼ及びトレハロースの混合物が DNA(cDNA、プライマー、ァプタ マーなど）とともにスポッティングされた紙が別紙として添付された学術論文が掲載さ れている雑誌を示す。
[図 3]DNAポリメラーゼ及びトレハロースの混合物が DNA(cDNA、プライマー、ァプタ マーなど）とともにスポッティングされた紙を綴じ込んだ書籍の一例を示す。
[図 4]DNAポリメラーゼ及びトレハロースの混合物が DNA(cDNA、プライマー、ァプタ マーなど）とともにスポッティングされて 、る紙 (支持体)を綴じ込んだ書籍の別の態様 を示す。
[図 5]図 4の紙にスポッティングされている cDNAに関する情報が記録されている CD-ROMが袋に入れられ、シールで封をした状態で書籍に添付されて 、る形態を示 す。
[図 6]DNAポリメラーゼ及びトレハロースの混合物が DNA(cDNA、プライマー、ァプタ マーなど）とともにスポッティングされて 、る紙 (支持体)の一例を示す。
[図 7]図 6の紙を含む試薬キットの一例を示す。
[図 8]DNAポリメラーゼ及びトレハロースの混合物が DNA(cDNA、プライマー、ァプタ マーなど）とともにスポッティングされて 、る紙 (支持体)の一例を示す。
[図 9]図 8の紙を含む試薬キットの一例を示す。
[図 10]マウスリンゴ酸脱水素酵素の cDNAをクローユングした pFLCベクターの構成を 示す。
[図 11]マウスリンゴ酸脱水素酵素の cDNA溶液のスポット及びポリメラーゼ +プライマ 一溶液のスポットを有する 60MDP紙を示す。
[図 12]図 11のスポットを用いて行った PCR反応の反応生成物を電気泳動した結果を 示す。
[図 13]プライマー +ァプタマ一 +ポリメラーゼ溶液のスポットを有する 60MDP紙を示 す。
[図 14]図 13のスポットを用 Vヽて行った PCR反応の反応生成物を電気泳動した結果を 示す。
[図 15]マウスリンゴ酸脱水素酵素、マウスイソクェン酸脱水素酵素 (NADP)、マウスィ ソクェン酸脱水素酵素（NAD)又はマウスォキソグルタル酸脱水素酵素の cDNA+プ ライマー +ァプタマ一 +ポリメラーゼ + PCR用バッファー組成溶液のスポットを有す る 60MDP紙を示す。
[図 16]図 15のスポットを用いて行った PCR反応の反応生成物を電気泳動した結果を 示す。
[図 17]cDNA+プライマー +反応促進剤（スペルミジン） +ポリメラーゼ + PCR用バッ ファー組成溶液のスポットを用いて行った PCR反応の反応生成物を電気泳動した結 果を示す。
符号の説明
1:DNA Spots
2: cDNAクローンがコードするタンパク質（malate dehydrogenaseなどの酵素）の名前
3： cDNAクローンの識別番号
4： cDNAクローンの塩基配列
5:実験の手順の説明文
6:DNAポリメラーゼ及びトレハロースの混合物が DNA(cDNA、プライマー、ァプタマ 一など）とともにスポッティングされて 、る紙
12:学術論文
13:雑誌
30： DNAがスポッティングされて!/、る頁の識別番号
31:DNA Spots
32：スポットを認識するための記号 1 (列番号）
33：スポットを認識するための記号 2 (行番号）
34:DNAポリメラーゼ及びトレハロースの混合物が DNA(cDNA、プライマー、ァプタマ 一など）とともにスポッティングされている頁
35:書籍
36: CD-ROM
37:袋
38:シール
41:DNA Spot
42:紙 (支持体）
51:遮光ビン 52 :蓋
53 :説明書
61 : DNA Spots
62 :紙 (支持体）
71 :包装パック
72 :説明書
発明を実施するための最良の形態
[0065] 以下、本発明を実施例によって具体的に説明する。なお、これらの実施例は、本発 明を説明するためのものであって、本発明の範囲を限定するものではない。
実施例
[0066] [実施例 1]
cDNAクローンとポリメラーゼをスポットした DNAブック
《プライマーの合成》
下記配列のプライマーセットを従来法により合成した。
プライマーセット 1
—21M13： 5， -TGTAAAACGACGGCCAGT-3 ' (配列番号 1)
1233- Rv: 5 ' -AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3， （配列番号 2)
《cDNA溶液の調整》
理研クローン（http：〃 fantom.gs riken.go.jp/)の中から下記の塩基配列で表される マウスリンゴ酸脱水素酵素の cDNA (クローン ID : 1500012M15, 1758bp)をクローニン グした pFLCベクター（図 10)を 0.1 g/ 1となるように TE (10 mM Tris— HCl(pH8.0), 1 mM EDTA)に溶解した。
マウスリンゴ酸脱水素酵素 1500012M15
1 cccggttctc tcccagagtc tgttccgctg tagaggtgac ctgactgctg gagactgcct Dl tttgcaggtg cagagatcgg ccttgcagtt tgcaataatg tctgaaccaa tcagagtcct
121 tgtgactgga gcagctggtc aaattgcata ttcactgttg tacagtattg gaaatggatc
181 tgtctttggg aaagaccagc ccatcattct tgtgctgttg gacatcaccc ccatgatggg
241 tgttctggac ggtgtcctga tggaactgca agactgtgcc cttccccttc tgcaggatgt 301 cattgcaacg gacaaagaag agattgcctt caaagacctg gatgtggctg tcctagtggg
361 ctccatgcca ataagggaag gcatggagag gaaggaccta ctgaaagcca atgtgaaaat
421 cttcaaatcc cagggcacag ccttggagaa atacgccaag aaatcagtta aggtcattgt
481 tgtgggaaac ccagccaata cgaactgcct gacagcctcc aagtcagcgc catcgatccc
541 caaggagaat ttcagttgcc tgactcgctt ggaccacaac cgagcaaaat ctcaaattgc
601 tcttaaactc ggtgtaaccg ctgatgatgt aaagaatgtc attatctggg gaaatcattc
661 atcgacccag tatccagatg tcaatcatgc caaggtgaaa ctgcaaggaa aggaagtcgg
721 tgtgtatgaa gccctgaaag acgacagctg gctgaaggga gagttcatca cgactgtgca
781 acagcgtggt gctgctgtca tcaaggctcg gaagctgtcc agtgcaatgt ctgctgcgaa
841 agccatcgca gaccacatca gagacatctg gtttggaacc ccagagggag agttcgtgtc
901 gatgggtgtt atctctgatg gcaactccta tggtgtccct gatgacctgc tctactcatt
961 ccctgtcgtg atcaagaata agacctggaa gtttgttgaa ggcctcccca ttaatgactt
1021 ctcccgtgaa aagatggacc tgacagcaaa ggagctgacc gaggaaaagg agaccgcttt
1081 tgagtttctc tcctctgcgt gactagacac tcgttttgac atcagcagac agccgaaggc
1141 tgaggaatca aaatgtcgtc tttgagccta gtaccaaaca gtaataatgc tacattcaaa
1201 ttgtgaacag caaaatattt taaatagtgt gtgctttatg atttgtgaaa gtctatcatg
12bl ttgttagtgc tgcaatctaa ataaaagtat attcaagtga aaatctctca gactctgttt
1321 ctactttata tttagtatct tcaggaaaac aagtttgccc aatagattat aattttactt
1381 ttttaattga ctaaaagaaa taaagatgga aaatattatg aagtaaagca ttagtctcta
1441 acataaacaa ggaagcccaa tcaatttcag agggatccca ttacttaagt ccttaaaggt
1501 tggttcatgt tttgctcata atttgatttt aaaattagct gtaagaaggt tgcagataat
1561 ctatcttctt tatattctat agcagaataa tgaagtcatt aatatttgat agccaataat
1621 accacactat taatatttgt aagctaagat tattagaaac ataaaactgt ttttgagtca
1681 gtctgttttc catgagaaga catgcatcat ctttgtgtgt tttgtgcatt actcagtgca
1741 ataaataacc ataatctc (酉己列番号 3)
《ポリメラーゼ +プライマー溶液の調整》
KOD plus (東洋糸方製），トレハロース，プライマーセット 1を混合し，最終濃度 25 υ/ μ 1 KOD plus DNA polymeraseゝ 0.1 Mトレハロース， 2 Mプライマーセット 1となるよう に調整した。
《DNAのスポッティング》
60MDP紙 (三島製紙製）に調整した cDNA溶液とポリメラーゼ +プライマー溶液を 96 pin-tool (Multi 96— multiblot replicator VP409, Bio Medical Science Inc., US)を用い て，図 11に示すように，スポットの位置および種類が判別できるようにスポットした。 cDNA溶液は 0.5 /z lZスポット，ポリメラーゼ +プライマー溶液は 1 1Ζスポットとなる ようにした。
《DNAの回収と増幅》
スポッティングした用紙を 30分以上室温にて乾燥させた後，スポットした cDNAおよび ポリメラーゼ +プライマーを含むようにそれぞれ 4 mm X 4 mmの大きさに 60MDP紙を 切り取り PCR用マイクロチューブに入れた。 PCR反応溶液（10 mM Tris- HCl(pH8.3), 50 mM KC1, 5.3 mM MgCl, 200 μ M各 dNTP) 25 μ 1をチューブに加え，次の条件で PCRを行った。
2min at 94°C
(1 min at 94°C, 1 min at 55°C, 75sec at 68°C) 29サイクル
15 min at 74°C
反応後のチューブより適量を取り， 1%ァガロースゲルで電気泳動した結果を図 12に 示す。 1800bp付近に見られるバンドが目的とする断片と考えられ， 60MDP紙から DNA が溶出し，その DNAは PCRにより増幅可能であることが判った。
[実施例 2]
#黄体ホルモン遺伝子を使ったアブタマ一 +ポリメラーゼの実験
《プライマーの合成》
下記配列のプライマーを従来法により合成した。
プライマーセット 1 (ヒト黄体形成ホルモン遺伝子ェクソン 1増幅するプライマーセット） HsLHIF: CCAGGGGCTGCTGCTGTTG (配列番号 4)
HsLH 1 R： CATGGTGGGGCAGTAGCC (配列番号 5)
プライマーセット 2 (ヒト黄体形成ホルモン遺伝子ェクソン 2増幅するプライマーセット） HsLH2F： ATGCGCGTGCTGCAGGCG (配列番号 6) HsLH2R： TGCGGATTGAGAAGCCTTTATTG (配列番号 7)
《アブタマ一の合成》
次に既知の Taq DNA polymeraseに対するァプタマ一（Yun Lin, Sumedha D.
Jayasena Inhibition of Multiple Thermostable DNA Polymerases by a Heterodimenc Aptamer Journal of Molecular Biology (1997), Vol. 27, Issue 1 , pages 100- 11)で ある下記配列を持つオリゴヌクレオチドを従来法により合成した。
GCCGGCCAATGTACAGTATTGGCCGGC (配列番号 8)
《プライマー +アブタマ一 +ポリメラーゼ溶液の調整》
2種類のスポッティング用溶液を調整した。
上記のプライマーセット， Taq DNA polymeraseに対するァプタマ一，および Taq DNA polymearseを最終濃度， 2 Mプライマーセット， 2 M Taq DNA polymeraseに対 するァプタマ一， 25 U/ ^ 1 Taq DNA polymerase, 0.1 Mトレハロースとなるように混合 ,調整したした溶液，およびこの組成より Taq DNA polymeraseに対するァプタマ一の みを除！、た組成の溶液を調整した。
《DNAのスポッティング》
60MDP紙 (三島製紙製）に上記により調整したプライマー +アブタマ一 +ポリメラーゼ 溶液を 96 pin-tool (Multi 96- multiblot replicator VP409, Bio Medical Science Inc. , US)を用いて，図 13に示すように，スポットの位置および種類が判別できるようにスポ ットした。スポッティング用溶液は 1 1Zスポットとなるようにした。
《DNAの増幅》
スポッティングした用紙を 30分以上室温にて乾燥させた後，スポット部分を含むように 4 mm X 4 mmの大きさに 60MDP紙を切り取り PCR用マイクロチューブに入れた。 PCR 反応溶液（10 mM Tris— HCl(pH8.3), 50 mM KC1, 5.3 mM MgCl, 200 μ M各 dNTP) 25 1と 50 ngテンプレート DNA (ヒトゲノム DNA, BD Biosciences Clontech, US社製）を チューブに加え，次の条件で PCRを行った。
3min at 94。し
(30 sec at 94°C, 30 sec at 40°C, 30 sec at 72°C) 50サイクル
15 min at 72°C 反応後のチューブより適量を取り， 1%ァガロースゲルで電気泳動した結果を図 14に 示す。 184bpおよび 343bp付近に見られるバンドがそれぞれェクソン 1および 2の目的 とする DNA断片と考えられ， 60MDP紙に固定されたプライマーを用いてテンプレート DNA力ら PCRにより目的とする断片を増幅可能であることが判った。また， Taq DNA polymeraseに対するァプタマ一の有無を比較すると，ァプタマ一を含む反応の方が 非特異的な増幅を抑えることが出来ることが判った。
[実施例 3]
#理研 cDNAクローン + PCR溶液をスポットした DNAブック
《プライマーの合成》
下記配列のプライマーセットを従来法により合成した。
プライマーセット 1
—21M13： 5， -TGTAAAACGACGGCCAGT-3 ' (配列番号 1)
1233- Rv: 5 ' -AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3，（配列番号 2)
《cDNA溶液の調整》
理研クローン（http：〃 fantom.gs riken.go.jp/)の中から下記の塩基配列で表される マウスリンゴ酸脱水素酵素の cDNA (クローン ID : 1500012M15, 1758bp) ,マウスイソク ェン酸脱水素酵素（NADP) (クローン ID : 1500012E04, 2440bp) ,マウスイソクェン酸 脱水素酵素（NAD) (クローン ID : E030024J03, 2160bp) ,マウスォキソグルタル酸脱水 素酵素（クローン ID： E430020N12, 3554bp)をクローユングした pFLCベクター（図 10) を 1 g/ /z 1となるように TE (10 mM Tris— HCl(pH8.0), 1 mM EDTA)に溶解した。 マウスリンゴ酸脱水素酵素 1500012M15
1 cccggttctc tcccagagtc tgttccgctg tagaggtgac ctgactgctg gagactgcct
61 tttgcaggtg cagagatcgg ccttgcagtt tgcaataatg tctgaaccaa tcagagtcct
121 tgtgactgga gcagctggtc aaattgcata ttcactgttg tacagtattg gaaatggatc
181 tgtctttggg aaagaccagc ccatcattct tgtgctgttg gacatcaccc ccatgatggg
241 tgttctggac ggtgtcctga tggaactgca agactgtgcc cttccccttc tgcaggatgt
301 cattgcaacg gacaaagaag agattgcctt caaagacctg gatgtggctg tcctagtggg
361 ctccatgcca ataagggaag gcatggagag gaaggaccta ctgaaagcca atgtgaaaat 421 cttcaaatcc cagggcacag ccttggagaa atacgccaag aaatcagtta aggtcattgt 481 tgtgggaaac ccagccaata cgaactgcct gacagcctcc aagtcagcgc catcgatccc 541 caaggagaat ttcagttgcc tgactcgctt ggaccacaac cgagcaaaat ctcaaattgc 601 tcttaaactc ggtgtaaccg ctgatgatgt aaagaatgtc attatctggg gaaatcattc 661 atcgacccag tatccagatg tcaatcatgc caaggtgaaa ctgcaaggaa aggaagtcgg 721 tgtgtatgaa gccctgaaag acgacagctg gctgaaggga gagttcatca cgactgtgca 781 acagcgtggt gctgctgtca tcaaggctcg gaagctgtcc agtgcaatgt ctgctgcgaa 841 agccatcgca gaccacatca gagacatctg gtttggaacc ccagagggag agttcgtgtc 901 gatgggtgtt atctctgatg gcaactccta tggtgtccct gatgacctgc tctactcatt 961 ccctgtcgtg atcaagaata agacctggaa gtttgttgaa ggcctcccca ttaatgactt 1021 ctcccgtgaa aagatggacc tgacagcaaa ggagctgacc gaggaaaagg agaccgcttt 1081 tgagtttctc tcctctgcgt gactagacac tcgttttgac atcagcagac agccgaaggc 1141 tgaggaatca aaatgtcgtc tttgagccta gtaccaaaca gtaataatgc tacattcaaa 1201 ttgtgaacag caaaatattt taaatagtgt gtgctttatg atttgtgaaa gtctatcatg 12bl ttgttagtgc tgcaatctaa ataaaagtat attcaagtga aaatctctca gactctgttt 1321 ctactttata tttagtatct tcaggaaaac aagtttgccc aatagattat aattttactt 1381 ttttaattga ctaaaagaaa taaagatgga aaatattatg aagtaaagca ttagtctcta 1441 acataaacaa ggaagcccaa tcaatttcag agggatccca ttacttaagt ccttaaaggt 1501 tggttcatgt tttgctcata atttgatttt aaaattagct gtaagaaggt tgcagataat 1561 ctatcttctt tatattctat agcagaataa tgaagtcatt aatatttgat agccaataat 1621 accacactat taatatttgt aagctaagat tattagaaac ataaaactgt ttttgagtca 1681 gtctgttttc catgagaaga catgcatcat ctttgtgtgt tttgtgcatt actcagtgca 1741 ataaataacc ataatctc (酉己列番号 3)
マウスイソクェン酸脱水素酵素（NADP) 1500012E04
1 gggtgttgcc gctgtcgccg cggtgaggga agtggacgcg atggccgggt ccgcgtgggt 61 gtccaaggtc tctcggctgc tgggtgcatt ccacaacaca aaacaggtga caagaggttt 121 tgctggtggt gttcagacag taactttaat tcctggagat ggaattggcc cagaaatttc 181 agcctcagtc atgaagattt ttgatgctgg ccaaagcacc tattcagtgg gaggagcgca 241 atgtcacagc aattcaagga ccaggaggaa agtgggatga tccctccaga agccaaggag 301 tccatggata agaacaagat gggcttgaaa ggcccactaa agaccccaat agccgctggc 361 catccatcta tgaatctgtt gcttcgtaag acatttgacc tttatgccaa tgtccggcca 421 tgtgtctcaa ttgaaggtta taaaacccct tacacggatg taaatatcgt caccatccga 481 gagaacacgg aaggagaata cagtggaatt gagcatgtga tcgttgatgg ggttgtgcag 541 agcatcaagc tcatcaccga agaagcaagc aagcgcattg cagagtttgc cttcgagtac 601 gctcggaaca accaccggag caacgtcaca gctgtgcaca aagctaacat catgaggatg 661 tcagatgggc tctttctgca aaaatgcagg gaagttgcgg agaactgtaa agacattaaa 721 tttaacgaga tgtaccttga tactgtatgt ttaaatatgg tacaagaccc atcccagttt 781 gatgttcttg tcatgccaaa tttatacgga gacatcctta gtgatctgtg tgcaggactg 841 attggaggtc ttggggtgac tccaagtggc aatattggag ccaacggtgt tgccatcttt 901 gaatcggttc atggaacagc cccggacatt gcaggcaagg acatggccaa ccccacggcc 961 ctcctgctta gtgctgtgat gatgcttcgc cacatgggac tttttgacca tgcagcaaaa 1021 atcgaggctg catgttttgc tacaattaag gatggaaaga gcttaacaaa agatctggga 1081 ggcaacgcga agtgctctga cttcacagaa gaaatctgtc gtagagtcaa agacttagat 1141 tagcactcct gctggtggat ttgctgcagt cagtcaatca ctccaaaagg ataccctgta 1201 atcctccttg agggcgccca ccattggttt gcttgcttct tgacagagta cgttttttga 12bl atctggcctt ttcttaacaa aacccttgca atggatgcac atgatggccc caggccttca 1321 ttcaaagggt tttcccaagt gctggttgta tttattgtcc gtctggtaaa ccttattttg 1381 taaactgtaa gtgaactgta tcatttatca ttgttaaccc attttacact tcaggcaaaa 1441 tcattttcct caactgtaaa tattctgata cagaattaat aagagaagat atttaacttt 1501 ttaacaaaag ccctggattt ttggtttatg aaaaacaaac tgggaataaa acagggtttc 1561 aacaatcgca caagataaca ttattctaat actaatgggt acaaaagaaa tttactggga 1621 aagttcacag caaaaaactg gtatatttct taaaaatatg gaaataaagt atttgtccta 1681 tacatgaatt actattaata aaaatgtaag ctccaagaaa tccataatga atgatgtaat 1741 tttgttacta catcggtaat ccttgtcaag gccccggatg ctctctgtgt atttgattct 1801 ttggttacct tgagattcac tatttggggg gaagagcttt cagataaggg agatcactcc 1861 tcactagaca gatcgtcagc attgcgagct gtcagccatg agagccagcc actgcagatc 1921 ccctcccacg tggccacact ccagccagtg ctgcaggtga ccctggaaag gcctggctgc 1981 cccttgactt tccctaaagc aaccagtcac tgccttctgc cccagtagca cccattacag 2041 acttaattgc cgaggtggag ctgactcagc ccacgctcat acaaatcagg ccaagcgggg 2101 gcctgtgtta ccagctgctg accatcaggt tctgcccctc attcttccca cagcctctgc 2161 tccacagcat gaacctagcc tttggcccac accaaagcca agctgtcttc ccttagccct 2221 tgcactagtt tgcaaactcg tggctttgca taatgtaccc tggtcccaag gggatttctt 2281 aacaacagat gtccctgtct gggtcatttt tttaaagctt ttatttggac ttacaatctt 2341 ctgtgtattt tactttaaaa ctgctgcttt ccctgtctca ctggattgtt ctggttagca 2401 gtggctttgg gttcacagta ataaagaact taagaact (酉己列番号 9)
II
マウスイソクェン酸脱水素酵素（NAD) E030024J03
1 ggatctaact ggggccggct tattacagct tgtgtgtacg cgcgggtgtg agccgggtta 61 ttgaagtaaa aatgtccaga aaaatccaag gaggttctgt ggtggagatg caaggagatg 121 aaatgacacg aatcatttgg gaattgatta aggaaaaact tattcttccc tatgtggaac 181 tggatctgca tagctatgat ttaggcatag agaatcgtga tgccaccaat gaccaggtca 241 ccaaagatgc tgcagaggct ataaagaaat acaacgtggg cgtcaagtgt gctaccatca 301 cccccgatga gaagagggtt gaagaattca agttgaaaca aatgtggaaa tccccaaatg 361 gcaccatccg aaacattctg ggtggcactg tcttcaggga agctattatc tgcaaaaata 421 tcccccggct agtgacaggc tgggtaaaac ccatcatcat tggccgacat gcatatgggg 481 accaatacag agcaactgat tttgttgttc ctgggcctgg aaaagtagag ataacctaca 541 caccaaaaga tggaactcag aaggtgacat acatggtaca tgactttgaa gaaggtggtg 601 gtgttgccat gggcatgtac aaccaggata agtcaattga agactttgca cacagttcct 661 tccaaatggc tctgtccaag ggctggcctt tgtatctcag caccaagaac actattctga 721 agaagtatga tgggcgtttc aaagacatct tccaggagat ctatgacaag aaatacaagt 781 cccagtttga agctcagaag atctgctatg aacacaggct catagatgac atggtggccc 841 aagctatgaa gtccgaggga ggcttcatct gggcctgtaa gaattacgat ggggatgtgc 901 agtcagactc agtcgcccaa ggttatggct cccttggcat gatgaccagt gtgctgattt 961 gtccagatgg taagacggta gaagcagagg ctgcccatgg cactgtcaca cgtcactacc 1021 gcatgtacca gaaagggcaa gagacgtcca ccaaccccat tgcttccatt tttgcctggt 1081 cccgagggtt agcccacaga gcaaagcttg ataacaatac tgagctcagc ttcttcgcaa 1141 aggctttgga agacgtctgc attgagacca ttgaggctgg ctttatgact aaggacttgg 1201 ctgcttgcat taaaggctta cccaatgtac aacgttctga ctacttgaat acatttgagt 1261 ttatggacaa acttggagaa aacttgaagg ccaaattagc tcaggcccaa actttaaggt 1321 caaacctggg cttagaatga gtctttgcgg taactaggtc cacaggttta cgtatttttt 1381 tttttttttt tagtaacact caagattaaa aacaaaaatc attttgtaat tggtttagaa 1441 gacaaagttg aacttttata tatgtttaca gtcttttttc tttttcatac agttattgcc 1501 accttaatga atgtggtggg gaaatttttt taattgtatt ttattgtgta gtagcagtgt 1561 aggaattatg ttagtacctg ttcacaatta actgtcatgt tttctcatgc tctaatgtaa 1621 atgaccaaaa tcagaagtgc tccaagggtg aacaatagct acagtatggt tccccataag 1681 gggaaaagag aaactcactt cccctgttgt ccatgagtgt gaacactggg gcctttgtac 1741 gcaaatgttg tactgtgtgt gggagagcta tacagtaagc tcacataaga ctggaacaga 1801 taggatgtgt gtagctaaaa tgcatggcag acgtgtttat aaagagcatg tatgtgtcca 1861 atatactagt tatattttaa gaccactgga gaattccaag tctagaataa atgcagactg 1921 gaggattctg ctctttgatt tctcttctcc tgtgacccag cctaagtatt atcctacccc 1981 aagcagtaca tttcacccat gggcaataat gggagctgta ccgtttggat ttctgctgac 2041 ctgctgcatt tcttttatat aaatgtgact tttttttccc agaagttgat attaaacact 2101 attccagtct agtccttcta aactgttaat tttaattaaa atgaagtact aatgactctt (配列番号 10)〃
マウスォキソグルタル酸脱水素酵素 E430020N12
1 gggggtggag ctgaacggga gacaggtact tgtggaaggc ttcaggacaa aatgtttcat 61 ttaaggactt gtgctgctaa gttaaggcca ttgacagcct cccagactgt taagacattt 121 tcacaaaaca aaccagcagc aattaggacg tttcaacaga ttcggtgcta ttctgcacct 181 gtagctgctg aaccatttct tagtgggact agttcgaact atgtggagga aatgtactgt 241 gcctggttgg agaatcccaa aagtgtacat aagtcatggg acattttttt ccgaaacacc 301 aatgctggag ccccaccggg cactgcctac cagagccccc tttccctgag tcgaagctcc 361 ctggctacca tggcccatgc acagtccctg gtggaagcac aacctaacgt cgacaaactc gtggaggacc acttggcggt gcagtctctc atcagggcat atcagatacg agggcaccat gtagcacagc tggaccccct ggggattttg gatgctgatc tggactcctc cgtgcccgct gacattatct catccacaga caaacttggg ttctatggcc tacacgagtc tgaccttgac aaggtcttcc acttacccac caccactttc atcgggggac aggagccagc acttcctctt cgggagatca tccgtcggct ggagatggcc tactgccagc acattggtgt ggagttcatg ttcattaatg atttggaaca atgccagtgg atccgacaga agtttgagac ccctggaatc atgcagttca ccaatgagga gaagcggacc ttgctggcca ggcttgtacg atccaccagg tttgaggagt tcctacagcg aaagtggtcc tcggagaagc gttttggtct ggaaggctgt gaggtgctga tccctgccct caagacaatc attgatatgt caactcagat gaccctgaag ctgtcatgta tgtatgcaag gtggcagctg agtggagaaa caccttccac aaggatgttg tagttgatct ggtgtgttat cgacgaaatg gccacaatga gatggacgaa cctatgttta cacagccact catgtacaag cagatccgca agcagaagcc tgtactgcag aagtatgcag aattgctagt ctcccagggt gtcgtcaatc agcctgagta cgaggaggaa atctccaagt atgataagat ctgtgaggaa gcatttacca gatccaaaga tgagaagatc ttgcacatca agcactggct ggattccccc tggcctggct ttttcaccct ggatggacag cccaggagca tgacctgccc ctccactggc ctggaggagg atgtcttgtt ccacattgga aaggtggcca gctctgtacc tgtggagaac tttactatcc atggagggct gagccggatc ttgaagaccc gcagagagct tgtgacgaac cggactgtgg actgggccct ggcagagtac atggcatttg gctcactgct gaaggaaggc atccatgtgc ggctgagtgg ccaggatgtg gagcggggca ccttcagcca tcgccaccat gtgctccatg atcagaatgt tgacaaaaga acctgcatcc ccatgaacca cctttggcca aatcaggccc cttacactgt atgcaacagc tcgctgtctg agtacggtgt cctgggcttt gagctgggct ttgccatggc tagccctaat gctctggttc tctgggaggc ccagtttggt gacttcaaca acatggcaca gtgcatcatt gaccagttca tctgcccagg acaggcaaag tgggtgcggc agaatggcat tgtgctcctg ctgcctcatg gcatggaagg catgggtccc gagcattcct ctgaccgccc agagcggttt ctgcatatgt gcaatgatga cccatatgtc ctgcgtgact tgcaggaaga actctttgac atcaatcagc tatatgactg caactggatt gttgtcagct gttccacccg tggcaacttc ttccatgtgc tgcgacaaca gatcttgctg cccttccgta agccgttaat agtcttcact cccaaatccc 210 tcttgcgcca ccgtgaggca agaactatct ttgacgatat gttgccagga acgcacttcc 216 agcgtgtgat cccagaaaat ggacatgcag ctcaggaccc tcacaaagtc aagagacttc 222 tcttctgcac tgggaaggtg tactatgacc tcacccgaga gcgcaaagcc aggaacatga 228 aggaggaggt ggctattaca aggattgagc agctatcacc attccccttt gacctcctgt 234 tgaaagaggc tcagaagtat cccaatgctg agctggcctg gtgccaggaa gagcacaaga 240 accaaggcta ctatgactat gtcaagccaa gacttcgtac caccattgac cgtgctaagc 246 ctgtctggta tgctgtccga gacccggcag ctgctccagc cactggcaac aagaaaacac 252 acctgacaga gctgcagcgc tttctggaca cagcctttga cctggacgca ttcaagaaat 258 tctcttagat gctcctggag ttgatgaggc catggccccc atgtccatga cgctctttgc
264 ttctcaacta aagaatagtg cctcagcact gtccacacgt cccttcgctg tgccacacca 270 cccctgttct cataggaatt aagttgtcca ctgcagtgct cagctgctcc ccggtcacat
276 gctgcccagc ctgtgccgac ttctctcagg ctgcacaccg ttcatggaga ccggaaggag 282 cagaataagg aaagggcccc tctcaggaca tcctagagaa ggaaggcagc tctggcccca 288 cccatgcccc cagtgcaatc ctccagggta ggaacagaac cctatgtggc ttcccagggt 294 actagcactc agccctcgtc acccatcaag tcgcagattc aaggccagga gtagtttcat 300 cttgctaggg ccaagctgag agctcatgga ggaactatag ctgccaggat ttgggagtca 306 tcaggatgtt gtgtgaatag agattgtcat ggggtattta gaggacttta gcagtgatgt
312 tagtctagcc ctgctaccct tcttgggttt gggctgtatg tgggaaactt accccagcta
318 ccacgcctgg agagcttggc tctgagtacg gcccagaagc tccattggct cccaacgcca 324 ggcactgctg cctcttggtc ctgctgcctc tgctctcctg acccctcccc agtcacttca
330 ttttctctgt tgttcccttg aacacacaga agctgttgac gaattctttt ttttgctgtg
336 ccaaggcagg tcaaaagcag atcagtggat aagagcaagt tgtcccaagg agccagctgt 342 ccttcctccc tcttttgacc tccactggga cacacctgat ttatttattt tggttaaaaa
348 aaaaaaggaa atgaaaaaag aacaaccacc tttgcattgc atcggcttga cccataaact 354 aagttatcat ggtc (酉己列番号 11)
//
〈く cDNA +プライマー +ァプタマ一 +ポリメラーゼ + PCR用バッファ一糸且成溶液の調 上記 cDNA ,プライマーセット 1, Taq DNA polymeraseに対するァプタマ一，および Taq DNA polymearseを最終濃度， 5 μ Μプライマーセット 1, 5 ^ M Taq DNA polymeraseに対するァプタマ一， 50 U/ 1 Taq DNA polymerase, 0.1 Mトレハロース , 250 mM Tris- HCl(pH8.3), 1.25 M KC1, 132.5 mM MgCl, 5 ^ M各 dNTPとなるよう に調整した。
《DNAのスポッティング》
60MDP紙（三島製紙製）に上記により調整した溶液を 96 pin-tool (Multi 96-multiblot replicator VP409, Bio Medical Science Inc., US)を用いて，図 15に示すように，スポ ットの位置および種類が判別できるようにスポットした。スポッティング用溶液は 1 μ ΐ Ζスポットとなるようにした。
《DNAの増幅》
スポッティングした用紙を 30分以上室温にて乾燥させた後，スポット部分を含むように 4 mm X 4 mmの大きさに 60MDP紙を切り取り PCR用マイクロチューブに入れ，そこに 水 25 μ 1を加え，次の条件で PCRを行った。
2min at 94°C
(1 min at 94°C, 1 min at 55°C, 75sec at 68°C) 29サイクル
15 min at 74°C
反応後のチューブより適量を取り， 1%ァガロースゲルで電気泳動した結果を図 16に 示す。 Lane 1はリンゴ酸脱水素酵素の cDNA、 Lane 2はイソクェンサン脱水素酵素（ NADP)の cDNA、 Lane 3はイソクェンサン脱水素酵素 (NAD)の cDNA、 Lane 4はォキ ソグルタル酸脱水素酵素の cDNA、左端はサイズマーカーを示す。 4種類の cDNAに ついてそれぞれ目的とする長さの断片が得られ， 60MDP紙に固定した cDNA,プライ マー，ァプタマ一，ポリメラーゼ，および PCR用バッファー組成物に水のみを加えるこ とにより PCR増幅が可能であることが判った。
反応後のチューブより適量を取り， 1%ァガロースゲルで電気泳動した結果を 108に 示す。 184bpおよび 343bp付近に見られるバンドがそれぞれェクソン 1および 2の目的 とする DNA断片と考えられ， 60MDP紙に固定されたプライマーを用いてテンプレート DNA力ら PCRにより目的とする断片を増幅可能であることが判った。また， Taq DNA polymeraseに対するァプタマ一の有無を比較すると，ァプタマ一を含む反応の方が 非特異的な増幅を抑えることが出来ることが判った。
[実施例 4]
《cDNA溶液の調整》
実施例 3で使用したのと同じマウスリンゴ酸脱水素酵素の cDNAクローン (クローン ID : 1500012M15, 1758bp)をクローユングした pFLCベクター（図 10)を 1 g/ 1となるよ うに TE ( 10 mM Tris— HCl(pH8.0), 1 mM EDTA)に溶解した。
〈く cDNA +プライマー +反応促進剤（スペルミジン） +ポリメラーゼ + PCR用バッファー 組成溶液の調整》
上記 cDNA,プライマーセット 1 ,スペルミジンおよび Taq DNA polymearseを最終濃度 , cDNA 0.005 μ g/ μ \, 5 μ Μプライマーセット， 50 U/ ^ 1 Taq DNA polymerase,ス ペルミジン 100 mM, 0.1 Mトレハロース， 250 mM Tris- HCl(pH8.3), 1.25 M KC1, 132.5 mM MgCl, 5 M各 dNTPとなるように調整した。
《DNAのスポッティング》
60MDP紙（三島製紙製）に上記により調整した溶液を 96 pin-tool (Multi 96-multiblot replicator VP409, Bio Medical Science Inc. , US)を用いて，図 15に示すように，スポ ットの位置および種類が判別できるようにスポットした。スポッティング用溶液は 1 μ ΐ Ζスポットとなるようにした。
《DNAの増幅》
スポッティングした用紙を 30分以上室温にて乾燥させた後，スポット部分を含むように 4 mm X 4 mmの大きさに 60MDP紙を切り取り PCR用マイクロチューブに入れ，そこに 水 25 μ 1を加え，次の条件で PCRを行った。
2min at 94°C
(1 min at 94°C, 1 min at 55°C, 75sec at 68°C) 29サイクル
15 min at 74°C
反応後のチューブより適量を取り， 1 %ァガロースゲルで電気泳動した結果を図 17に 示す。 Lane 1および 2は cDNA,プライマー，ポリメラーゼ，反応促進剤としてポリアミ ンの一種であるスペルミジン，および PCR用バッファー組成物を 60MDP紙固定したサ ンプルで， Lane3はスペルミジンのみ除いた組成を固定したサンプルである。どちらも ,水を加えることにより，固定された DNAを増幅することが可能であり，また，反応促進 剤を固定したサンプルでは，増幅反応が促進されて 、ることが判った。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本 明細書にとり入れるものとする。
産業上の利用可能性
[0067] 本発明の支持体は、酵素の保存や流通に利用することができる。また、印刷物及び 試薬キットへの応用も可能である。
配列表フリーテキスト
[0068] 配列番号 1は、プライマ一- 21M13の塩基配列を示す。
配列番号 2は、プライマー 1233-Rvの塩基配列を示す。
配列番号 3は、マウスリンゴ酸脱水素酵素の cDNAの塩基配列を示す。 配列番号 4は、プライマー HsLHIFの塩基配列を示す。
配列番号 5は、プライマー HsLHIRの塩基配列を示す。
配列番号 6は、プライマー HsLH2Fの塩基配列を示す。
配列番号 7は、プライマー HsLH2Rの塩基配列を示す。
配列番号 8は、 Taq DNA polymeraseに対するァプタマ一の塩基配列を示す。 配列番号 9は、マウスイソクェン酸脱水素酵素（NADP)の cDNAの塩基配列を示す 配列番号 10は、マウスイソクェン酸脱水素酵素（NAD)の cDNAの塩基配列を示す 配列番号 11は、マウスォキソダルタル酸脱水素酵素の cDNAの塩基配列を示す。

Claims

請求の範囲
[I] 酵素と当該酵素の保護剤とが固定されている支持体。
[2] 上記保護剤がトレハロース及びその誘導体力もなる化合物群より選択される少なくと も一種類の化合物である請求項 1記載の支持体。
[3] 酵素反応の促進剤をさらに含む請求項 1又は 2に記載の支持体。
[4] 上記酵素に対するアブタマ一をさらに含む請求項 1ないし 3の何れか一項に記載の 支持体。
[5] 酵素と当該酵素に対するアブタマ一とが固定されている支持体。
[6] 上記酵素が DNAポリメラーゼである請求項 1な 、し 5の何れか一項に記載の支持体。
[7] さらに、上記 DNAポリメラーゼを用いた核酸増幅反応で目的とする核酸を増幅するた めのプライマーを含んでなる請求項 6記載の支持体。
[8] さらに、上記 DNAポリメラーゼを用いた核酸増幅反応の铸型となる核酸、当該核酸を 増幅するためのプライマー、及び核酸増幅反応のためのノ ッファー力も選択される 少なくとも一つを含んでなる請求項 6に記載の支持体。
[9] 請求項 1な!、し 8の何れか一項に記載の支持体を含む印刷物。
[10] 請求項 1な!ヽし 8の何れか一項に記載の支持体を含む試薬キット。
[I I] 請求項 1記載の支持体を製造する方法であって、酵素及び保護剤の混合溶液を調 製し、該溶液を支持体に適用し、該支持体を乾燥することにより、前記酵素及び保護 剤の混合物を支持体に固定することを含む前記の方法。
[12] 請求項 1ないし 8の何れか一項に記載の支持体を液体に浸漬させることにより、該液 体中に酵素を溶出させることを含む、支持体に固定された酵素を再生する方法。
[13] 請求項 6な 、し 8の何れか一項に記載の支持体を液体中に配置して当該支持体より DNAポリメラーゼを溶出させる工程と、当該 DNAポリメラーゼを用いて核酸増幅反応を 行うことを特徴とする、核酸の増幅方法。
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