JP2003519482A - 核酸を保存および合成する方法 - Google Patents
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
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Abstract
(57)【要約】
（ａ）１以上のｍＲＮＡのテンプレートを含むサンプルを、固体担体へ接触させる工程と、（ｂ）上記テンプレート全体にまたは部分的に相補性を有する１以上のｃＤＮＡ分子を合成するのに十分な条件下で、上記テンプレートを１以上の逆転写酵素と接触させる工程とを含む、１以上のｃＤＮＡ分子を生成する方法である。または、（ａ）ＲＮＡ分子を含む細胞を、固体担体へ接触させる工程と、（ｂ）細胞および固体担体を乾燥する工程を含む、ＲＮＡ分子を分類する方法である。
Description
（発明の背景）
（発明の分野）
本発明は、分子生物学の分野に関する。特に、本発明は、核酸の保存、合成、
増幅に関する。特に、発明は固体マトリックスまたは担体上のＲＮＡ（特にｍＲ
ＮＡ）の保存と、そのＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲやｃＤＮＡ合成を含む多くの分子生
物技術によるＲＮＡの操作とに関する。
増幅に関する。特に、発明は固体マトリックスまたは担体上のＲＮＡ（特にｍＲ
ＮＡ）の保存と、そのＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲやｃＤＮＡ合成を含む多くの分子生
物技術によるＲＮＡの操作とに関する。
【０００１】
(関連技術)
（核酸の保存）
多くの研究において、生物試料からの多数のＤＮＡサンプルの生成はルーチン
となっている。多大な収集物を扱い、記録する作業は研究室のロジスティックな
問題となっている。ひとつの解決策は、法医学の研究室で使用されている、血液
保存媒介ＦＴＡ(登録商標)カードである。ＦＴＡ(登録商標)ジーンカード(gene
card)は、続いて起こるＤＮＡ分析に使用する生物サンプルの収集と保存のため
に発案された化学的な処理をされたろ紙である（１−３）。これは血液サンプル
を保存するほかに、ＰＣＲ分析および他のゲノムＤＮＡへの適用のための哺乳類
細胞および組織の保存にも適している（４）。これは、ＰＣＲや、記録されたバ
クテリア菌株およびコロニーを形質転換するためのプラスミドＤＮＡの回収（５
−６）だけでなく、ＤＮＡシークエンシングの応用のためのＭ１３ファージの保
存と回収にも有用である(M.Goldsborough,パーソナルコミュニケーション)。
となっている。多大な収集物を扱い、記録する作業は研究室のロジスティックな
問題となっている。ひとつの解決策は、法医学の研究室で使用されている、血液
保存媒介ＦＴＡ(登録商標)カードである。ＦＴＡ(登録商標)ジーンカード(gene
card)は、続いて起こるＤＮＡ分析に使用する生物サンプルの収集と保存のため
に発案された化学的な処理をされたろ紙である（１−３）。これは血液サンプル
を保存するほかに、ＰＣＲ分析および他のゲノムＤＮＡへの適用のための哺乳類
細胞および組織の保存にも適している（４）。これは、ＰＣＲや、記録されたバ
クテリア菌株およびコロニーを形質転換するためのプラスミドＤＮＡの回収（５
−６）だけでなく、ＤＮＡシークエンシングの応用のためのＭ１３ファージの保
存と回収にも有用である(M.Goldsborough,パーソナルコミュニケーション)。
【０００２】
ＦＴＡ(登録商標)カードキャブ（cab）は、ゲノムＤＮＡを、紙上で細胞が溶
解された、ヒトの全血の乾燥スポットの形で保存するのに用いられる。室温保存
で、ＦＴＡ(登録商標)ペーパー上のゲノムＤＮＡは少なくとも７.５年安定であ
ると報告されている(Burgoyne,et al.,Conventional DNA Collection and Proce
ssing:Disposable Tothbrushed and FTA()paper as a non-threating Buccal-ce
ll collection kit compatible with automatable DNA processing,8th interna
tional symposium on human identification,September 17-20,1997)。捕捉され
たＤＮＡは分析の前に単純な洗浄工程により安定化化合物および酵素反応の細胞
阻害剤を除く。ＤＮＡは紙に残存するのでＤＮＡの精製の操作は単純化され、自
動化しやすい。ＦＴＡ（登録商標）カード上のＤＮＡサンプルは、貴重なフリー
ザー空間に占めるガラスバイラルやプラスチックチューブと比べ、非常にコンパ
クトな記録システムを提供する。乾燥固体媒介におけるＲＮＡの保存も記載され
ている（Burgoyne,米国特許No.5,976,572参照）。
解された、ヒトの全血の乾燥スポットの形で保存するのに用いられる。室温保存
で、ＦＴＡ(登録商標)ペーパー上のゲノムＤＮＡは少なくとも７.５年安定であ
ると報告されている(Burgoyne,et al.,Conventional DNA Collection and Proce
ssing:Disposable Tothbrushed and FTA()paper as a non-threating Buccal-ce
ll collection kit compatible with automatable DNA processing,8th interna
tional symposium on human identification,September 17-20,1997)。捕捉され
たＤＮＡは分析の前に単純な洗浄工程により安定化化合物および酵素反応の細胞
阻害剤を除く。ＤＮＡは紙に残存するのでＤＮＡの精製の操作は単純化され、自
動化しやすい。ＦＴＡ（登録商標）カード上のＤＮＡサンプルは、貴重なフリー
ザー空間に占めるガラスバイラルやプラスチックチューブと比べ、非常にコンパ
クトな記録システムを提供する。乾燥固体媒介におけるＲＮＡの保存も記載され
ている（Burgoyne,米国特許No.5,976,572参照）。
【０００３】
(ＲＮＡ逆転写)
「逆転写酵素」という言葉は、ＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼとして特徴付け
られるポリメラーゼの分類を意義する。知られている逆転写酵素はＲＮＡテンプ
レートからＤＮＡ転写物を合成するのにプライマーを必要とする。歴史的には、
逆転写酵素は初めは、ｍＲＮＡを、ベクターにクローン化して更なる操作を行う
ためのｃＤＮＡに複写することに使用されてきた。
られるポリメラーゼの分類を意義する。知られている逆転写酵素はＲＮＡテンプ
レートからＤＮＡ転写物を合成するのにプライマーを必要とする。歴史的には、
逆転写酵素は初めは、ｍＲＮＡを、ベクターにクローン化して更なる操作を行う
ためのｃＤＮＡに複写することに使用されてきた。
【０００４】
トリ骨髄芽症ウィルス（ＡＭＶ）逆転写酵素は、最初の広く使用されたＲＮＡ
依存ＤＮＡポリメラーゼであった(Verma,Biochim.Biophys.Acta473:1(1977))。
酵素は５´―３´ＲＮＡ方向ＤＮＡポリメラーゼ活性、５´―３´ＤＮＡ方向Ｄ
ＮＡポリメラーゼ活性、およびＲＮase Ｈ活性を有している。ＲＮase Ｈは前進
的な、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドのＲＮＡ鎖特異的な５´および３´リボヌク
レア−ゼである(Perbal,A Practical Guide to Molecular cCloning,New York:
Wiley&Sons(1984))。知られているウィルス逆転写酵素は校正に必要な３´（登
録商標）５´エクソヌクレア−ゼ活性を欠いているため、転写におけるエラーは
逆転写酵素によって修正されることができない(Saunders and Saunders,Microbi
al Genetic Applied to Biotechnology,London:Croom Herm(1987))。ＡＭＶ逆転
写酵素の活性およびその関連するＲＮaseＨ活性のより詳細な研究は、Berger et
al.,Biochemistry22:2365-2372(1983)に示されている。
依存ＤＮＡポリメラーゼであった(Verma,Biochim.Biophys.Acta473:1(1977))。
酵素は５´―３´ＲＮＡ方向ＤＮＡポリメラーゼ活性、５´―３´ＤＮＡ方向Ｄ
ＮＡポリメラーゼ活性、およびＲＮase Ｈ活性を有している。ＲＮase Ｈは前進
的な、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドのＲＮＡ鎖特異的な５´および３´リボヌク
レア−ゼである(Perbal,A Practical Guide to Molecular cCloning,New York:
Wiley&Sons(1984))。知られているウィルス逆転写酵素は校正に必要な３´（登
録商標）５´エクソヌクレア−ゼ活性を欠いているため、転写におけるエラーは
逆転写酵素によって修正されることができない(Saunders and Saunders,Microbi
al Genetic Applied to Biotechnology,London:Croom Herm(1987))。ＡＭＶ逆転
写酵素の活性およびその関連するＲＮaseＨ活性のより詳細な研究は、Berger et
al.,Biochemistry22:2365-2372(1983)に示されている。
【０００５】
他の、分子生物学で広く使用されている逆転写酵素は、モロニーマウス白血病
ウィルス（Ｍ−ＭＬＶ）由来のものである。たとえば、Gerard,G.R.,DNA 5:271-
279(1986)およびKotewicz,M.L., et al., Gene 35:249258(1985))参照。実質的
にＲＮaseＨ活性を欠いている、Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素も記載されてきた。例え
ば、米国特許No.5,244,797参照。
ウィルス（Ｍ−ＭＬＶ）由来のものである。たとえば、Gerard,G.R.,DNA 5:271-
279(1986)およびKotewicz,M.L., et al., Gene 35:249258(1985))参照。実質的
にＲＮaseＨ活性を欠いている、Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素も記載されてきた。例え
ば、米国特許No.5,244,797参照。
【０００６】
（ＲＮＡのＰＣＲ増幅）
逆転写酵素は、ＰＣＲ増幅の前にＲＮＡを逆複写するのに幅広く用いられてき
た。この、たびたびＲＮＡ−ＰＣＲもしくはＲＴ−ＰＣＲと呼ばれている方法は
、ＲＮＡを追跡または定量を行うのに広く用いられている。
た。この、たびたびＲＮＡ−ＰＣＲもしくはＲＴ−ＰＣＲと呼ばれている方法は
、ＲＮＡを追跡または定量を行うのに広く用いられている。
【０００７】
しばしばＲＴ−ＰＣＲに関わる技術的問題への対応を試みるため、（ａ）ＲＮ
Ａの変性とリバースプライマーのハイブリダイゼ−ション：（ｂ）ｃＤＮＡ合成
：（ｃ）ＰＣＲ増幅：という手順の３つの基本的なステップを考慮した多くのプ
ロトコールが発展した。「アンカップルド（uncoupled）」ＲＴ−ＰＣＲ手順と
呼ばれるものでは（例えば、ツーステップＲＴ−ＰＣＲ）、逆転写に最適なバッ
ファー条件を用いて逆転写が独立したステップで行われる。ｃＤＮＡ合成に続い
て、ＭｇＣｌ2およびデオキシリボヌクレオシドトリホスフェート（ｄＮＴＰ）
濃度を、Taq ＤＮＡポリメラーゼ活性反応に最適な条件に減らすために反応液を
希釈し、ＰＣＲを標準的な条件で行った(米国特許Nos.4,683,195および4,683,20
2)。対照的に、「カップルド(coupled)」ＲＴ−ＰＣＲ方法は、通常のまたは妥
協したバッファーを、逆転写酵素およびTaq ＤＮＡポリメラーゼ活性に用いる。
あるバージョンでは、リバースプライマーのアニーリングが、酵素の追加に先立
った別個のステップであり、それから、酵素が１つの反応容器に加えられる。別
のバージョンでは、逆転写酵素活性は耐熱性ＴｔｈＤＮＡポリメラーゼの構成要
素である。アニーリングとｃＤＮＡ合成は、Ｍｎ++の存在下で行われ、キレート
剤によりＭｎ++がが除かれた後、Ｍｇ++の存在下でＰＣＲが行われる。最後に、
「コンテニュアス(continuous)」法（例えば、１ステップＲＴ−ＰＣＲ）は、３
つのＲＴ−ＰＣＲステップをひとつの連続的な反応に統一し、成分や酵素の追加
のため、反応チューブを開くことを避けられる。コンテニュアスＲＴ−ＰＣＲは
、耐熱性Taq ＤＮＡポリメラーゼおよびＴｔｈポリメラーゼの逆転写酵素活性を
用いた１酵素システムとして、および65℃のＲＮＡ変性ステップが省かれたＡＭ
Ｖ−ＲＴおよびTaq ＤＮＡポリメラーゼを用いた２酵素システムとして、記載さ
れる。
Ａの変性とリバースプライマーのハイブリダイゼ−ション：（ｂ）ｃＤＮＡ合成
：（ｃ）ＰＣＲ増幅：という手順の３つの基本的なステップを考慮した多くのプ
ロトコールが発展した。「アンカップルド（uncoupled）」ＲＴ−ＰＣＲ手順と
呼ばれるものでは（例えば、ツーステップＲＴ−ＰＣＲ）、逆転写に最適なバッ
ファー条件を用いて逆転写が独立したステップで行われる。ｃＤＮＡ合成に続い
て、ＭｇＣｌ2およびデオキシリボヌクレオシドトリホスフェート（ｄＮＴＰ）
濃度を、Taq ＤＮＡポリメラーゼ活性反応に最適な条件に減らすために反応液を
希釈し、ＰＣＲを標準的な条件で行った(米国特許Nos.4,683,195および4,683,20
2)。対照的に、「カップルド(coupled)」ＲＴ−ＰＣＲ方法は、通常のまたは妥
協したバッファーを、逆転写酵素およびTaq ＤＮＡポリメラーゼ活性に用いる。
あるバージョンでは、リバースプライマーのアニーリングが、酵素の追加に先立
った別個のステップであり、それから、酵素が１つの反応容器に加えられる。別
のバージョンでは、逆転写酵素活性は耐熱性ＴｔｈＤＮＡポリメラーゼの構成要
素である。アニーリングとｃＤＮＡ合成は、Ｍｎ++の存在下で行われ、キレート
剤によりＭｎ++がが除かれた後、Ｍｇ++の存在下でＰＣＲが行われる。最後に、
「コンテニュアス(continuous)」法（例えば、１ステップＲＴ−ＰＣＲ）は、３
つのＲＴ−ＰＣＲステップをひとつの連続的な反応に統一し、成分や酵素の追加
のため、反応チューブを開くことを避けられる。コンテニュアスＲＴ−ＰＣＲは
、耐熱性Taq ＤＮＡポリメラーゼおよびＴｔｈポリメラーゼの逆転写酵素活性を
用いた１酵素システムとして、および65℃のＲＮＡ変性ステップが省かれたＡＭ
Ｖ−ＲＴおよびTaq ＤＮＡポリメラーゼを用いた２酵素システムとして、記載さ
れる。
【０００８】
（ｃＤＮＡおよびｃＤＮＡライブラリー）
生物個体、組織、もしくは細胞の構造や生理を試験するうえで、遺伝子の内容
を決定することが要求される。生物個体の遺伝的フレームワークは、生物個体の
体細胞および生殖細胞のに含まれるデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）におけるヌクレ
オチド塩基の2本鎖配列にコードされている。特定のＤＮＡ断片もしくは遺伝子
の遺伝子の内容は、遺伝子がコードするタンパク質の生成でのみ明らかにされる
。タンパク質を生成するために、ＤＮＡダブルへリックスの一方の鎖（「コーデ
ィング」鎖）の相補コピーがポリメラーゼ酵素により生成され、結果として特定
のリボ核酸（ＲＮＡ）の配列が生成される。この特定のタイプのＲＮＡは、タン
パク質生成のためのＤＮＡからの遺伝メッセージが含まれているので、メッセン
ジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）と呼ばれる。
を決定することが要求される。生物個体の遺伝的フレームワークは、生物個体の
体細胞および生殖細胞のに含まれるデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）におけるヌクレ
オチド塩基の2本鎖配列にコードされている。特定のＤＮＡ断片もしくは遺伝子
の遺伝子の内容は、遺伝子がコードするタンパク質の生成でのみ明らかにされる
。タンパク質を生成するために、ＤＮＡダブルへリックスの一方の鎖（「コーデ
ィング」鎖）の相補コピーがポリメラーゼ酵素により生成され、結果として特定
のリボ核酸（ＲＮＡ）の配列が生成される。この特定のタイプのＲＮＡは、タン
パク質生成のためのＤＮＡからの遺伝メッセージが含まれているので、メッセン
ジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）と呼ばれる。
【０００９】
特定の細胞、組織、生物個体では、無数のｍＲＮＡ種が存在し、各々別個の特
定のタンパク質をコードしている。この事実は、組織または細胞における遺伝子
発現の研究に興味を持つ研究者に有力な道具を提供する−ｍＲＮＡ分子が単離さ
れ、さらに様々な分子生物学的な技術により操作され、これにより完全に機能的
な細胞、組織もしくは生物個体の遺伝子内容の解明ができる。
定のタンパク質をコードしている。この事実は、組織または細胞における遺伝子
発現の研究に興味を持つ研究者に有力な道具を提供する−ｍＲＮＡ分子が単離さ
れ、さらに様々な分子生物学的な技術により操作され、これにより完全に機能的
な細胞、組織もしくは生物個体の遺伝子内容の解明ができる。
【００１０】
遺伝子発現の研究へのひとつの通常のアプローチは、相補鎖ＤＮＡ（ｃＤＮＡ
）クローンの生成である。この技術では、生物個体のｍＲＮＡ分子は、生物個体
の細胞または組織の抽出液から単離される。この単離には、セルロース、セファ
ロースのような、固体のクロマトグラフィーマトリックスが用いられ、そこにチ
ミジン（Ｔ）のオリゴマーが複合している。すべての真核ｍＲＮＡ分子の3´末
端はアデノシン（Ａ）塩基の列を有し、またＡはＴと結合することから、ｍＲＮ
Ａ分子は迅速に組織または細胞抽出液中の他の分子、物質から精製される。これ
らの精製されたｍＲＮＡ分子から、逆転写酵素（ＲＴ）活性を有する酵素を用い
てｃＤＮＡコピーをつくって、結果としてｍＲＮＡテンプレートのすべてにまた
は部分的に相補な１本鎖ｃＤＮＡ分子を生成する。ｃＤＮＡ１本鎖を適切な条件
で保温することで２本鎖ＤＮＡの合成をさせ、２本鎖ＤＮＡはプラスミドやベク
ターに挿入されてもよい。
）クローンの生成である。この技術では、生物個体のｍＲＮＡ分子は、生物個体
の細胞または組織の抽出液から単離される。この単離には、セルロース、セファ
ロースのような、固体のクロマトグラフィーマトリックスが用いられ、そこにチ
ミジン（Ｔ）のオリゴマーが複合している。すべての真核ｍＲＮＡ分子の3´末
端はアデノシン（Ａ）塩基の列を有し、またＡはＴと結合することから、ｍＲＮ
Ａ分子は迅速に組織または細胞抽出液中の他の分子、物質から精製される。これ
らの精製されたｍＲＮＡ分子から、逆転写酵素（ＲＴ）活性を有する酵素を用い
てｃＤＮＡコピーをつくって、結果としてｍＲＮＡテンプレートのすべてにまた
は部分的に相補な１本鎖ｃＤＮＡ分子を生成する。ｃＤＮＡ１本鎖を適切な条件
で保温することで２本鎖ＤＮＡの合成をさせ、２本鎖ＤＮＡはプラスミドやベク
ターに挿入されてもよい。
【００１１】
この、ｍＲＮＡ単離からｃＤＮＡのプラスミドまたはベクターへの挿入、単離
された遺伝子を含むホスト細胞の細胞群の成長までの全プロセスは、「ｃＤＮＡ
クローニング」と呼ばれる。もし、ｃＤＮＡが多数の異なるｍＲＮＡから得られ
たものならば、結果的にできるｃＤＮＡのセットは「ｃＤＮＡライブラリー」と
呼ばれるが、これはｃＤＮＡのセットが、供給源の細胞、組織、または生物個体
に存在する異なる機能的遺伝情報（遺伝子）の集合を表しているので、適切な用
語である。ｃＤＮＡライブラリーの遺伝子型分析は、由来の生物個体の構造、機
能における多くの情報を生み出す。
された遺伝子を含むホスト細胞の細胞群の成長までの全プロセスは、「ｃＤＮＡ
クローニング」と呼ばれる。もし、ｃＤＮＡが多数の異なるｍＲＮＡから得られ
たものならば、結果的にできるｃＤＮＡのセットは「ｃＤＮＡライブラリー」と
呼ばれるが、これはｃＤＮＡのセットが、供給源の細胞、組織、または生物個体
に存在する異なる機能的遺伝情報（遺伝子）の集合を表しているので、適切な用
語である。ｃＤＮＡライブラリーの遺伝子型分析は、由来の生物個体の構造、機
能における多くの情報を生み出す。
【００１２】
伝統的な生成方法では、ｃＤＮＡ分子はサイズ分画、複合フェノール／クロロ
ホルム抽出、エタノール沈降が行われていた。これらの各要件には、生成物の損
失、複合的な抽出／沈降によるｃＤＮＡ産出量の制限などの固有の欠点があった
(Lambert, K.N., and Williamson,V.M., Nucl. Acids Res. 21(3):775-776(1993
))。
ホルム抽出、エタノール沈降が行われていた。これらの各要件には、生成物の損
失、複合的な抽出／沈降によるｃＤＮＡ産出量の制限などの固有の欠点があった
(Lambert, K.N., and Williamson,V.M., Nucl. Acids Res. 21(3):775-776(1993
))。
【００１３】
これらの欠点は、部分的に文献で取り組まれている。例えば、何人かの研究者
が、オリゴ（ｄＴ）と結合したラテックスまたは常磁性ビーズをｍＲＮＡと結合
させることで、細胞および組織サンプルからポリＡ＋ｍＲＮＡを単離する方法を
報告している；ｃＤＮＡ分子の１本鎖は、これらの固定されたｍＲＮＡ分子の逆
転写により生成されてもよい(Lambert, K.N., and Williamson,V.M., Nucl. Aci
ds Res. 21(3):775-776(1993);Kuribayashi-Ohta,K.,et al.,Biochim.Biophys.A
cta 1156:204-212(1993);Sasaki,Y.F.,et al.,Nucl.Acids Res.22(6):987-992(1
994));Meszaros,M.,and Morton, D.B., Biotechniques 20(3):413-419(1996);Fe
llman,F.,et al.,BioTechniques21(5):766-770(1996))。このような固体相の合
成方法は、伝統的な方法の抽出／沈降ステップより産出量の制限が少なくなる傾
向にある。
が、オリゴ（ｄＴ）と結合したラテックスまたは常磁性ビーズをｍＲＮＡと結合
させることで、細胞および組織サンプルからポリＡ＋ｍＲＮＡを単離する方法を
報告している；ｃＤＮＡ分子の１本鎖は、これらの固定されたｍＲＮＡ分子の逆
転写により生成されてもよい(Lambert, K.N., and Williamson,V.M., Nucl. Aci
ds Res. 21(3):775-776(1993);Kuribayashi-Ohta,K.,et al.,Biochim.Biophys.A
cta 1156:204-212(1993);Sasaki,Y.F.,et al.,Nucl.Acids Res.22(6):987-992(1
994));Meszaros,M.,and Morton, D.B., Biotechniques 20(3):413-419(1996);Fe
llman,F.,et al.,BioTechniques21(5):766-770(1996))。このような固体相の合
成方法は、伝統的な方法の抽出／沈降ステップより産出量の制限が少なくなる傾
向にある。
【００１４】
しかしながら、これらの方法はまだいくつかの重要な制限がある。例えば、こ
れらの方法はｃＤＮＡ分子のクローニングに先立ったＰＣＲ増幅を基にしており
、ｃＤＮＡライブラリーに偏りがしばしば生じる結果となっている（例えば、低
量で発現している配列に優性で、高度に発現している配列）。加えて、これらの
方法はしばしば、プライマー−アダプターのテンプレートへの溶液ハイブリダイ
ゼ−ションを使用した、伝統的なｃＤＮＡ合成方法よりも効果的でない（例えば
、ハイブリダイゼ−ション率を上げるために、ローテーションの拡散が必要であ
る；Schmitz,K.S.,and Schurr,J.M.,J.Phys. Chem.76:534-545(1972);Ness,J.V.
,andHahn,W.E.,Nucl.Acids Res.10(24):8061-8077(1982)）。最後に、上述した
テクニックは、更なる加工を行う場合に固体相から新生ののｃＤＮＡを開放する
ため、熱または化学的な変性を行っており、これは生成物の損失および／または
ダメージを生じる結果となる。 （発明の概要） 本発明は、固体媒体、もしくは核酸（例えば、ＤＮＡ、またはＲＮＡ、リボソ
ーマルＲＮＡ、またはメッセンジャーＲＮＡ）の保存（好ましくは長期間の保存
）における使用のための担体に関し、特にこの固体媒体または担体の使用を含む
ポリＡ ＲＮＡまたはｍＲＮＡに関する。特に、本発明は、核酸の固体媒体から
の回収、および／または固体媒体から得られた、または固体媒体に含まれた核酸
の使用または操作のみならず、固体媒体における上記核酸の保存および輸送の方
法に関する。上記の使用または操作は、例えば、消化（例えば、１以上のヌクレ
アーゼ、エクソヌクレア−ゼ、または制限酵素などのエンドヌクレア−ゼ）、合
成（例えば、１以上のポリメラーゼおよび／または逆転写酵素）、増幅（例えば
、１以上のポリメラーゼを使用した、１以上のポリメラーゼチェイン反応）、シ
ークエンシング（１以上のポリメラーゼ）、または例えば科学的に反応能のある
、または電気的に反応能のある細胞を用いた、または周知の形質移入の試薬およ
び技術を用いた、１以上のホスト細胞への形質転換または形質移入を含む。好ま
しくは、上記操作は、固体媒体から得られた、もしくは固体媒体に含まれたＲＮ
Ａからの、ＲＴ−ＰＣＲ、ｃＤＮＡ合成、あるいはｃＤＮＡライブラリー構築を
含む。発明に従ったこのような操作は、担体上での核酸の保存の後に行われても
、保存することなく直接に行われてもよい。好ましい媒体または担体はマトリッ
クスに結合することで核酸の劣化を防ぐマトリックスである。このようなマトリ
ックスは、吸収性のあるセルロースを主成分とするマトリックスまたは紙、もし
くは米国特許No.5,496,562および5,976,572に記載されるような合成プラスチッ
ク素材のマイクロメッシュを含んでいてもよい。好ましくは、マトリックスは弱
塩基、キレート剤、陰イオン界面活性剤、陰イオン洗剤、および任意に尿酸また
は尿酸塩を含む構成を含んでおり、上記マトリックスに上記構成が吸収されてあ
るいは結合していてもよい。ＦＴＡ（登録商標）ペーパー（ライフテクノロジー
ズインク）およびその派生物、変形物、改良物がこのような担体に含まれる。ワ
ットマンで入手可能なGenPrepTMおよびGenSpinTM、シュライヒャーアンドシュル
で入手可能なIsoCode も本発明に従って使用してもよい。
れらの方法はｃＤＮＡ分子のクローニングに先立ったＰＣＲ増幅を基にしており
、ｃＤＮＡライブラリーに偏りがしばしば生じる結果となっている（例えば、低
量で発現している配列に優性で、高度に発現している配列）。加えて、これらの
方法はしばしば、プライマー−アダプターのテンプレートへの溶液ハイブリダイ
ゼ−ションを使用した、伝統的なｃＤＮＡ合成方法よりも効果的でない（例えば
、ハイブリダイゼ−ション率を上げるために、ローテーションの拡散が必要であ
る；Schmitz,K.S.,and Schurr,J.M.,J.Phys. Chem.76:534-545(1972);Ness,J.V.
,andHahn,W.E.,Nucl.Acids Res.10(24):8061-8077(1982)）。最後に、上述した
テクニックは、更なる加工を行う場合に固体相から新生ののｃＤＮＡを開放する
ため、熱または化学的な変性を行っており、これは生成物の損失および／または
ダメージを生じる結果となる。 （発明の概要） 本発明は、固体媒体、もしくは核酸（例えば、ＤＮＡ、またはＲＮＡ、リボソ
ーマルＲＮＡ、またはメッセンジャーＲＮＡ）の保存（好ましくは長期間の保存
）における使用のための担体に関し、特にこの固体媒体または担体の使用を含む
ポリＡ ＲＮＡまたはｍＲＮＡに関する。特に、本発明は、核酸の固体媒体から
の回収、および／または固体媒体から得られた、または固体媒体に含まれた核酸
の使用または操作のみならず、固体媒体における上記核酸の保存および輸送の方
法に関する。上記の使用または操作は、例えば、消化（例えば、１以上のヌクレ
アーゼ、エクソヌクレア−ゼ、または制限酵素などのエンドヌクレア−ゼ）、合
成（例えば、１以上のポリメラーゼおよび／または逆転写酵素）、増幅（例えば
、１以上のポリメラーゼを使用した、１以上のポリメラーゼチェイン反応）、シ
ークエンシング（１以上のポリメラーゼ）、または例えば科学的に反応能のある
、または電気的に反応能のある細胞を用いた、または周知の形質移入の試薬およ
び技術を用いた、１以上のホスト細胞への形質転換または形質移入を含む。好ま
しくは、上記操作は、固体媒体から得られた、もしくは固体媒体に含まれたＲＮ
Ａからの、ＲＴ−ＰＣＲ、ｃＤＮＡ合成、あるいはｃＤＮＡライブラリー構築を
含む。発明に従ったこのような操作は、担体上での核酸の保存の後に行われても
、保存することなく直接に行われてもよい。好ましい媒体または担体はマトリッ
クスに結合することで核酸の劣化を防ぐマトリックスである。このようなマトリ
ックスは、吸収性のあるセルロースを主成分とするマトリックスまたは紙、もし
くは米国特許No.5,496,562および5,976,572に記載されるような合成プラスチッ
ク素材のマイクロメッシュを含んでいてもよい。好ましくは、マトリックスは弱
塩基、キレート剤、陰イオン界面活性剤、陰イオン洗剤、および任意に尿酸また
は尿酸塩を含む構成を含んでおり、上記マトリックスに上記構成が吸収されてあ
るいは結合していてもよい。ＦＴＡ（登録商標）ペーパー（ライフテクノロジー
ズインク）およびその派生物、変形物、改良物がこのような担体に含まれる。ワ
ットマンで入手可能なGenPrepTMおよびGenSpinTM、シュライヒャーアンドシュル
で入手可能なIsoCode も本発明に従って使用してもよい。
【００１５】
発明の実施においてはどのような固体担体を使用してもよい。好ましいこのよ
うな固体担体は、ニトロセルロース、セルロース、ディアゾセルロース、カルボ
キシメチルセルロース、親水性ポリマー（例えば、ポリエステル、ポリアミド、
カルボハイドレートポリマー）、ポリテトラフルオロエチレン、ファイバーグラ
ス、多孔性セラミックス、ポリスチレン、ポリビニルクロライド、ポリプロピレ
ン、ポリエチレン、デキストラン、セファロース、寒天、スターチ、およびナイ
ロンを含むがこれに限定されない。
うな固体担体は、ニトロセルロース、セルロース、ディアゾセルロース、カルボ
キシメチルセルロース、親水性ポリマー（例えば、ポリエステル、ポリアミド、
カルボハイドレートポリマー）、ポリテトラフルオロエチレン、ファイバーグラ
ス、多孔性セラミックス、ポリスチレン、ポリビニルクロライド、ポリプロピレ
ン、ポリエチレン、デキストラン、セファロース、寒天、スターチ、およびナイ
ロンを含むがこれに限定されない。
【００１６】
本発明に従えば、どのような核酸分子（例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡおよび特にポ
リＡ+ＲＮＡ、ｍＲＮＡ）が記録されて、後に１以上の核酸を運ぶサンプル（例
えば、細胞、組織、細胞の材料など）が固体媒体（好ましくは、ＦＴＡ（登録商
標）ペーパー、またはその派生物、変形物、改良物）に接続されている、単純で
効果的な方法で回収および／または操作されてもよい。他の解釈では、精製され
た核酸分子を用いてもよく、好ましい解釈では１以上の核酸分子を含むクルード
試料（精製されていないｍＲＮＡ試料や細胞溶解物）が固体媒介または担体に接
触していてもよい。したがって、どのようなサンプルが、ホスト細胞、ウィルス
、ウィルスのプラーク、および／または生物の材料（ホスト細胞またはウィルス
の抽出液、溶解液、デブリ（debri）、加水分解物など）から得たクルード試料
などの担体に接触または結合する核酸分子を提供してもよい。このような固体担
体もしくはマトリックスから得られた、または含まれる核酸分子は、消化、シー
クエンシング、増幅、合成または、形質転換／形質移入反応のような、１以上の
標準的分子生物学技術において使用または操作されることができる。好ましくは
、固体担体から得られた、または含まれるｍＲＮＡは、ＲＴ−ＰＣＲまたは、ｃ
ＤＮＡ合成および特にｃＤＮＡライブラリー構築に用いられる。他の好ましい実
施例では、発明にしたがって得られたＲＮＡがノーザンブロットに用いられても
よく、または他のチップなどの固体担体に貼り付けられて遺伝子プロファイリン
グ適用に使用してもよい。特に好ましい解釈では、単離され、保存され、および
／または操作される核酸分子を含む、１以上のホスト細胞を、媒介か担体にに直
接に接続させることができる。本発明に従うと、プレートから得たホスト細胞株
、またはコロニーを用いてもよい。発明に使用する好ましいホスト細胞は、原核
または真核ホスト細胞を含み、特にグラム陽性およびグラム陰性バクテリア、植
物細胞、動物細胞(ヒトを含む)、昆虫細胞などが含まれる。
リＡ+ＲＮＡ、ｍＲＮＡ）が記録されて、後に１以上の核酸を運ぶサンプル（例
えば、細胞、組織、細胞の材料など）が固体媒体（好ましくは、ＦＴＡ（登録商
標）ペーパー、またはその派生物、変形物、改良物）に接続されている、単純で
効果的な方法で回収および／または操作されてもよい。他の解釈では、精製され
た核酸分子を用いてもよく、好ましい解釈では１以上の核酸分子を含むクルード
試料（精製されていないｍＲＮＡ試料や細胞溶解物）が固体媒介または担体に接
触していてもよい。したがって、どのようなサンプルが、ホスト細胞、ウィルス
、ウィルスのプラーク、および／または生物の材料（ホスト細胞またはウィルス
の抽出液、溶解液、デブリ（debri）、加水分解物など）から得たクルード試料
などの担体に接触または結合する核酸分子を提供してもよい。このような固体担
体もしくはマトリックスから得られた、または含まれる核酸分子は、消化、シー
クエンシング、増幅、合成または、形質転換／形質移入反応のような、１以上の
標準的分子生物学技術において使用または操作されることができる。好ましくは
、固体担体から得られた、または含まれるｍＲＮＡは、ＲＴ−ＰＣＲまたは、ｃ
ＤＮＡ合成および特にｃＤＮＡライブラリー構築に用いられる。他の好ましい実
施例では、発明にしたがって得られたＲＮＡがノーザンブロットに用いられても
よく、または他のチップなどの固体担体に貼り付けられて遺伝子プロファイリン
グ適用に使用してもよい。特に好ましい解釈では、単離され、保存され、および
／または操作される核酸分子を含む、１以上のホスト細胞を、媒介か担体にに直
接に接続させることができる。本発明に従うと、プレートから得たホスト細胞株
、またはコロニーを用いてもよい。発明に使用する好ましいホスト細胞は、原核
または真核ホスト細胞を含み、特にグラム陽性およびグラム陰性バクテリア、植
物細胞、動物細胞(ヒトを含む)、昆虫細胞などが含まれる。
【００１７】
発明の実施においては、発明の固体担体から得られたまたは固体担体に含まれ
る１以上の核酸テンプレート（例えば、ｍＲＮＡまたはポリＡ＋ＲＮＡ分子）を
、テンプレート全体にまたは部分的に相補な１以上の核酸分子を合成するのに好
ましい条件下で、ポリメラーゼ活性および／または逆転写酵素活性を有する１以
上のポリペプチド混合することで、核酸分子および特にｃＤＮＡ分子またはｃＤ
ＮＡライブラリーが作製される。
る１以上の核酸テンプレート（例えば、ｍＲＮＡまたはポリＡ＋ＲＮＡ分子）を
、テンプレート全体にまたは部分的に相補な１以上の核酸分子を合成するのに好
ましい条件下で、ポリメラーゼ活性および／または逆転写酵素活性を有する１以
上のポリペプチド混合することで、核酸分子および特にｃＤＮＡ分子またはｃＤ
ＮＡライブラリーが作製される。
【００１８】
本発明で使用される逆転写酵素および／またはポリメラーゼ活性を有する好ま
しいポリペプチド（例えば酵素）は、モロニーマウス白血病ウィルス（Ｍ−ＭＬ
Ｖ）逆転写酵素、ラウス肉腫ウィルス（ＲＳＶ）逆転写酵素、トリ骨髄芽球症（
ＡＭＶ）逆転写酵素、ラウスアソシエーテッドウィルス（ＲＡＶ）逆転写酵素、
骨髄芽球症アソシエーテッドウィルス（ＭＡＶ）逆転写酵素、ヒト免疫不全ウィ
ルス（ＨＩＶ）逆転写酵素、レトロウィルス逆転写酵素、レトロトランスポゾン
逆転写酵素、Ｂ型肝炎逆転写酵素、カリフラワーモザイク逆転写酵素、バクテリ
ア逆転写酵素、Thermus thermophilus(Tth)ＤＮＡポリメラーゼ、Thermus aquat
icus(Taq)ＤＮＡポリメラーゼ、Thermotoga neopolitana(Tne)ＤＮＡポリメラー
ゼ、Thermotoga maritima(Tma)ＤＮＡポリメラーゼ、Thermococcus litoralis(T
li,例えば、VENT(登録商標)ブランド)ＤＮＡポリメラーゼ、Pyrococcus furiosu
s(Pfu)ＤＮＡポリメラーゼ、Pyrococcus species GB-D(例えば、DEEPVENTTMブラ
ンド)ＤＮＡポリメラーゼ、Pyrococcus woosii(Pwo)ＤＮＡポリメラーゼ、Bacil
lus sterothermophilus(Bst)ＤＮＡポリメラーゼ、Sulfolobus acidocaldarius(
Sac)ＤＮＡポリメラーゼ、Thermoplasma acidophilum(Tac)ＤＮＡポリメラーゼ
、Thermus flavus(Tfl/Tub)ＤＮＡポリメラーゼ、Thermus ruber(Tru)ＤＮＡポ
リメラーゼ、Thermus brockianus(例えば、DYNAZYME(登録商標)ブランド)ＤＮＡ
ポリメラーゼ、Methanobacterium thermoautotrohicum(Mth)ＤＮＡポリメラーゼ
ＤＮＡ、その変異体、変形体、派生体を含むがこれに限定されるものではない。
特に、発明の使用に好ましいこれらの酵素の変形体は、実質的にＲＮaseＨ活性
を弱めたものである。発明に使用するのに好ましい逆転写酵素は、インビトロジ
ェンコーポレイション（InvitrogenCorporation）(Rockvellr,MD)の事業所であ
るライフテクノロジー(Life Technologies)から入手可能な逆転写酵素のSUPERSC
RIPTTM,SUPERSCRIPUTMII,THERMOSCRIPTTMブランドが含まれ、他の逆転写酵素は
、米国特許5,244,797およびWO98/47912に記載される。「実質的にＲＮaseＨ活性
を弱められた」酵素とは、野生型または野生型Ｍ−ＭＬＶやＡＭＶ逆転写酵素の
ような「ＲＮaseＨ+」酵素のＲＮaseＨ活性よりも、約２０％より低いより好ま
しくは、約１５％、１０％、もしくは５％よりも低い、そして最も好ましくは約
２％より低いＲＮaseＨ活性を有するものを意味する。いずれのＲＮaseＨ活性も
、例えば、米国特許No.5,244,797やkotewicz,M.L.,et al.,Nucl.Acids Res.16:2
65(1988)やGerard,G.F.,et al.,FOCUS14(5):91(1992)に記載される種々のアッセ
イにより決定されることができる。すべての開示は参照にこのなかに組み込まれ
ている。
しいポリペプチド（例えば酵素）は、モロニーマウス白血病ウィルス（Ｍ−ＭＬ
Ｖ）逆転写酵素、ラウス肉腫ウィルス（ＲＳＶ）逆転写酵素、トリ骨髄芽球症（
ＡＭＶ）逆転写酵素、ラウスアソシエーテッドウィルス（ＲＡＶ）逆転写酵素、
骨髄芽球症アソシエーテッドウィルス（ＭＡＶ）逆転写酵素、ヒト免疫不全ウィ
ルス（ＨＩＶ）逆転写酵素、レトロウィルス逆転写酵素、レトロトランスポゾン
逆転写酵素、Ｂ型肝炎逆転写酵素、カリフラワーモザイク逆転写酵素、バクテリ
ア逆転写酵素、Thermus thermophilus(Tth)ＤＮＡポリメラーゼ、Thermus aquat
icus(Taq)ＤＮＡポリメラーゼ、Thermotoga neopolitana(Tne)ＤＮＡポリメラー
ゼ、Thermotoga maritima(Tma)ＤＮＡポリメラーゼ、Thermococcus litoralis(T
li,例えば、VENT(登録商標)ブランド)ＤＮＡポリメラーゼ、Pyrococcus furiosu
s(Pfu)ＤＮＡポリメラーゼ、Pyrococcus species GB-D(例えば、DEEPVENTTMブラ
ンド)ＤＮＡポリメラーゼ、Pyrococcus woosii(Pwo)ＤＮＡポリメラーゼ、Bacil
lus sterothermophilus(Bst)ＤＮＡポリメラーゼ、Sulfolobus acidocaldarius(
Sac)ＤＮＡポリメラーゼ、Thermoplasma acidophilum(Tac)ＤＮＡポリメラーゼ
、Thermus flavus(Tfl/Tub)ＤＮＡポリメラーゼ、Thermus ruber(Tru)ＤＮＡポ
リメラーゼ、Thermus brockianus(例えば、DYNAZYME(登録商標)ブランド)ＤＮＡ
ポリメラーゼ、Methanobacterium thermoautotrohicum(Mth)ＤＮＡポリメラーゼ
ＤＮＡ、その変異体、変形体、派生体を含むがこれに限定されるものではない。
特に、発明の使用に好ましいこれらの酵素の変形体は、実質的にＲＮaseＨ活性
を弱めたものである。発明に使用するのに好ましい逆転写酵素は、インビトロジ
ェンコーポレイション（InvitrogenCorporation）(Rockvellr,MD)の事業所であ
るライフテクノロジー(Life Technologies)から入手可能な逆転写酵素のSUPERSC
RIPTTM,SUPERSCRIPUTMII,THERMOSCRIPTTMブランドが含まれ、他の逆転写酵素は
、米国特許5,244,797およびWO98/47912に記載される。「実質的にＲＮaseＨ活性
を弱められた」酵素とは、野生型または野生型Ｍ−ＭＬＶやＡＭＶ逆転写酵素の
ような「ＲＮaseＨ+」酵素のＲＮaseＨ活性よりも、約２０％より低いより好ま
しくは、約１５％、１０％、もしくは５％よりも低い、そして最も好ましくは約
２％より低いＲＮaseＨ活性を有するものを意味する。いずれのＲＮaseＨ活性も
、例えば、米国特許No.5,244,797やkotewicz,M.L.,et al.,Nucl.Acids Res.16:2
65(1988)やGerard,G.F.,et al.,FOCUS14(5):91(1992)に記載される種々のアッセ
イにより決定されることができる。すべての開示は参照にこのなかに組み込まれ
ている。
【００１９】
発明は、したがって、１以上の核酸テンプレート（好ましくは、１以上のＲＮ
Ａテンプレート、および最も好ましくは１以上のｍＲＮＡ）の、逆転写酵素活性
を有する１以上のポリペプチドとの混合と、１以上の核酸テンプレート全体にま
たは部分的に相補な１以上の１番目の核酸分子を生成するのに十分な条件下での
混合物の保温とを含む、１以上の核酸分子を作製するための方法である。このよ
うな条件は好ましくは、１以上のプライマー（好ましくはオリゴｄＴ）の使用と
、１以上のヌクレオチドとを含んでなる。好ましい実施例では、１番目の核酸分
子は１本鎖ｃＤＮＡである。発明のこの解釈によれば、逆転写に適した核酸テン
プレートは、どのような核酸分子でも、どのような核酸分子の集合でも（好まし
くはＲＮＡ、最も好ましくはｍＲＮＡ）よく、特に細胞または組織由来のものが
よい。発明によれば、好ましい解釈では、ｍＲＮＡ分子の集合（いくつかの異な
るｍＲＮＡ分子、典型的には細胞または組織から得られたもの）はｃＤＮＡライ
ブラリーを作製するのに用いられる。核酸テンプレートの好ましい由来細胞源は
バクテリア細胞、菌細胞、植物細胞、動物細胞を含む。
Ａテンプレート、および最も好ましくは１以上のｍＲＮＡ）の、逆転写酵素活性
を有する１以上のポリペプチドとの混合と、１以上の核酸テンプレート全体にま
たは部分的に相補な１以上の１番目の核酸分子を生成するのに十分な条件下での
混合物の保温とを含む、１以上の核酸分子を作製するための方法である。このよ
うな条件は好ましくは、１以上のプライマー（好ましくはオリゴｄＴ）の使用と
、１以上のヌクレオチドとを含んでなる。好ましい実施例では、１番目の核酸分
子は１本鎖ｃＤＮＡである。発明のこの解釈によれば、逆転写に適した核酸テン
プレートは、どのような核酸分子でも、どのような核酸分子の集合でも（好まし
くはＲＮＡ、最も好ましくはｍＲＮＡ）よく、特に細胞または組織由来のものが
よい。発明によれば、好ましい解釈では、ｍＲＮＡ分子の集合（いくつかの異な
るｍＲＮＡ分子、典型的には細胞または組織から得られたもの）はｃＤＮＡライ
ブラリーを作製するのに用いられる。核酸テンプレートの好ましい由来細胞源は
バクテリア細胞、菌細胞、植物細胞、動物細胞を含む。
【００２０】
発明は、１以上の２本鎖核酸分子を生成する方法にも関する。このような方法
は、（ａ）１以上の核酸テンプレート（好ましくは、ＲＮＡまたはｍＲＮＡ、よ
り好ましくはｍＲＮＡテンプレートの集合）の、１以上の逆転写酵素活性を有す
るポリペプチドの混合、（ｂ）１以上のテンプレート全体に、もしくは部分的に
に相補的な、１以上の１番目の核酸分子を生成するのに十分な条件での混合物の
保温、（ｃ）１番目の核酸分子と全体に、もしくは部分的に相補的な１以上の２
番目の核酸分子を生成するのに十分な条件下での、１番目の核酸分子の保温、を
含んでなるものであり、これにより１番目のおよび２番目の核酸分子を含む１以
上の２本鎖核酸分子を形成することができる。このような方法は、１以上の２本
鎖核酸分子を作製する工程の一部として、１以上のＤＮＡポリメラーゼ（および
好ましくは１以上のプライマーとヌクレオチド）の使用を含んでいてもよい。
は、（ａ）１以上の核酸テンプレート（好ましくは、ＲＮＡまたはｍＲＮＡ、よ
り好ましくはｍＲＮＡテンプレートの集合）の、１以上の逆転写酵素活性を有す
るポリペプチドの混合、（ｂ）１以上のテンプレート全体に、もしくは部分的に
に相補的な、１以上の１番目の核酸分子を生成するのに十分な条件での混合物の
保温、（ｃ）１番目の核酸分子と全体に、もしくは部分的に相補的な１以上の２
番目の核酸分子を生成するのに十分な条件下での、１番目の核酸分子の保温、を
含んでなるものであり、これにより１番目のおよび２番目の核酸分子を含む１以
上の２本鎖核酸分子を形成することができる。このような方法は、１以上の２本
鎖核酸分子を作製する工程の一部として、１以上のＤＮＡポリメラーゼ（および
好ましくは１以上のプライマーとヌクレオチド）の使用を含んでいてもよい。
【００２１】
発明は核酸分子の増幅の方法にも関連する。このような増幅方法は、上述した
ように生成された２本鎖核酸分子を１以上のＤＮＡポリメラーゼと混合し、２本
鎖核酸分子を増幅するのに十分な条件で混合物を保温する肯定を含む。第１の好
ましい実施例では、発明は１以上の核酸分子を増幅する方法に関連しており、方
法は（ａ）１以上の核酸テンプレート（好ましくは、１以上のＲＮＡまたはｍＲ
ＮＡテンプレート、より好ましくはｍＲＮＡテンプレートの集合）の、１以上の
逆転写酵素活性を有するポリペプチドと、１以上のＤＮＡポリメラーゼとの混合
、（ｂ）１以上のテンプレートと全体に、もしくは部分的に相補的な核酸分子を
増幅するのに十分な条件での混合物の保温、を含んでなるものである。
ように生成された２本鎖核酸分子を１以上のＤＮＡポリメラーゼと混合し、２本
鎖核酸分子を増幅するのに十分な条件で混合物を保温する肯定を含む。第１の好
ましい実施例では、発明は１以上の核酸分子を増幅する方法に関連しており、方
法は（ａ）１以上の核酸テンプレート（好ましくは、１以上のＲＮＡまたはｍＲ
ＮＡテンプレート、より好ましくはｍＲＮＡテンプレートの集合）の、１以上の
逆転写酵素活性を有するポリペプチドと、１以上のＤＮＡポリメラーゼとの混合
、（ｂ）１以上のテンプレートと全体に、もしくは部分的に相補的な核酸分子を
増幅するのに十分な条件での混合物の保温、を含んでなるものである。
【００２２】
発明は、上述した方法に従って作製された核酸分子（特に、１本鎖または２本
鎖ｃＤＮＡ分子）、または増幅された核酸分子、これらの核酸分子または増幅さ
れた核酸分子を含むベクター（特に発現ベクター）に関する。
鎖ｃＤＮＡ分子）、または増幅された核酸分子、これらの核酸分子または増幅さ
れた核酸分子を含むベクター（特に発現ベクター）に関する。
【００２３】
発明は、さらに発明の方法を実施する間に作製される、または用意される構成
に関する。このような構成には、発明の固体担体、１以上のｍＲＮＡ分子および
／または上記ｍＲＮＡから作成された１以上のｃＤＮＡ分子を含む。
に関する。このような構成には、発明の固体担体、１以上のｍＲＮＡ分子および
／または上記ｍＲＮＡから作成された１以上のｃＤＮＡ分子を含む。
【００２４】
発明は、さらに発明の方法において使用するキットに関する。このようなキッ
トは、発明にしたがって核酸分子（１本鎖または２本鎖）を生成または増幅する
のに用いられる。発明のキットは、箱、カートンなどの運搬手段と、その中に厳
重に拘束された１以上の、バイアル、チューブ、ビンなどの収容手段とを含んで
なる。発明のキットは、１以上の逆転写酵素（好ましくは、１以上のＲＮase Ｈ
活性を弱めた、または実質的に弱めた酵素）、１以上の固体担体、１以上のプラ
イマー、１以上のヌクレオチド、１以上の反応バッファーを含んでいてもよい。
発明のキットは、発明の方法を実施する説明書を含む。
トは、発明にしたがって核酸分子（１本鎖または２本鎖）を生成または増幅する
のに用いられる。発明のキットは、箱、カートンなどの運搬手段と、その中に厳
重に拘束された１以上の、バイアル、チューブ、ビンなどの収容手段とを含んで
なる。発明のキットは、１以上の逆転写酵素（好ましくは、１以上のＲＮase Ｈ
活性を弱めた、または実質的に弱めた酵素）、１以上の固体担体、１以上のプラ
イマー、１以上のヌクレオチド、１以上の反応バッファーを含んでいてもよい。
発明のキットは、発明の方法を実施する説明書を含む。
【００２５】
本発明のその他の好ましい実施例は、以下の図面、発明および請求項の詳細を
考慮して、通常の技術のひとつに明示されるだろう。 （発明の詳細な説明） （定義づけ） 以下の記載では、多くの組換え遺伝子技術用語が広範囲にわたって使用されて
いる。このような用語に与えられた範囲を含む、明細書および請求項の、明確で
より一貫性のある理解を得るために、以下の定義づけを行った。
考慮して、通常の技術のひとつに明示されるだろう。 （発明の詳細な説明） （定義づけ） 以下の記載では、多くの組換え遺伝子技術用語が広範囲にわたって使用されて
いる。このような用語に与えられた範囲を含む、明細書および請求項の、明確で
より一貫性のある理解を得るために、以下の定義づけを行った。
【００２６】
増幅。次に使用されるように、「増幅」は、ポリメラーゼを使用し、ヌクレオ
チド配列のコピー数を増やす、あらゆるインビトロの方法を意味する。核酸増幅
により、結果として、ヌクレオチドが、核酸（例えばＤＮＡ）分子またはプライ
マーへ結合し、これにより核酸テンプレートに相補な新しい核酸分子を形成する
。形成された核酸分子およびそのテンプレートは、さらなる核酸分子の合成のテ
ンプレートとして使用できる。ここに使用されるように、ひとつの増幅反応は多
くの核酸合成のラウンドによりなる。増幅反応は、例えば、ポリメラーゼチェイ
ン反応（ＰＣＲ）を含む。ひとつのＰＣＲ反応は、５から１００回の核酸の変性
および合成の「サイクル」からなっていてもよい。
チド配列のコピー数を増やす、あらゆるインビトロの方法を意味する。核酸増幅
により、結果として、ヌクレオチドが、核酸（例えばＤＮＡ）分子またはプライ
マーへ結合し、これにより核酸テンプレートに相補な新しい核酸分子を形成する
。形成された核酸分子およびそのテンプレートは、さらなる核酸分子の合成のテ
ンプレートとして使用できる。ここに使用されるように、ひとつの増幅反応は多
くの核酸合成のラウンドによりなる。増幅反応は、例えば、ポリメラーゼチェイ
ン反応（ＰＣＲ）を含む。ひとつのＰＣＲ反応は、５から１００回の核酸の変性
および合成の「サイクル」からなっていてもよい。
【００２７】
本発明に有効なポリメラーゼ(ＤＮＡポリメラーゼおよびＲＮＡポリメラーゼ
を含む)は、Thermus thermophilus(Tth)ＤＮＡポリメラーゼ、Thermus aquaticu
s(Taq)ＤＮＡポリメラーゼ、Thermotoga neopolitana(Tne)ＤＮＡポリメラーゼ
、Thermotoga maritima(Tma)ＤＮＡポリメラーゼ、Thermococcus litoralis(Tli
,例えば、VENT(登録商標)ブランド)、Pyrococcus furiosus(Pfu)ＤＮＡポリメラ
ーゼ、Pyrococcus species GB-D(例えば、DEEPVENTTMブランド)ＤＮＡポリメラ
ーゼ、Pyrococcus woosii(Pwo)ＤＮＡポリメラーゼ、Bacillus sterothermophil
us(Bst)ＤＮＡポリメラーゼ、Bacillus caldophilus(Bca)ＤＮＡポリメラーゼ、
Sulfolobus acidocaldarius(Sac)ＤＮＡポリメラーゼ、Thermoplasma acidophil
um(Tac)ＤＮＡポリメラーゼ、Thermus flavus(Tfl/Tub)ＤＮＡポリメラーゼ、Th
ermus ruber(Tru)ＤＮＡポリメラーゼ、Thermus brockianus(DYNAZYMEa)ＤＮＡ
ポリメラーゼ、Methanobacterium thermoautotrohicum(Mth)ＤＮＡポリメラーゼ
ＤＮＡ、マイコバクテリウムＤＮＡポリメラーゼ(Mtb,Mlep)、その変異体、変形
体、派生体を含むがこれに限定されるものではない。Ｔ３，Ｔ５およびＳＰ６、
その変異体、変形体、派生体のようなＲＮＡポリメラーゼを発明に用いてもよい
。
を含む)は、Thermus thermophilus(Tth)ＤＮＡポリメラーゼ、Thermus aquaticu
s(Taq)ＤＮＡポリメラーゼ、Thermotoga neopolitana(Tne)ＤＮＡポリメラーゼ
、Thermotoga maritima(Tma)ＤＮＡポリメラーゼ、Thermococcus litoralis(Tli
,例えば、VENT(登録商標)ブランド)、Pyrococcus furiosus(Pfu)ＤＮＡポリメラ
ーゼ、Pyrococcus species GB-D(例えば、DEEPVENTTMブランド)ＤＮＡポリメラ
ーゼ、Pyrococcus woosii(Pwo)ＤＮＡポリメラーゼ、Bacillus sterothermophil
us(Bst)ＤＮＡポリメラーゼ、Bacillus caldophilus(Bca)ＤＮＡポリメラーゼ、
Sulfolobus acidocaldarius(Sac)ＤＮＡポリメラーゼ、Thermoplasma acidophil
um(Tac)ＤＮＡポリメラーゼ、Thermus flavus(Tfl/Tub)ＤＮＡポリメラーゼ、Th
ermus ruber(Tru)ＤＮＡポリメラーゼ、Thermus brockianus(DYNAZYMEa)ＤＮＡ
ポリメラーゼ、Methanobacterium thermoautotrohicum(Mth)ＤＮＡポリメラーゼ
ＤＮＡ、マイコバクテリウムＤＮＡポリメラーゼ(Mtb,Mlep)、その変異体、変形
体、派生体を含むがこれに限定されるものではない。Ｔ３，Ｔ５およびＳＰ６、
その変異体、変形体、派生体のようなＲＮＡポリメラーゼを発明に用いてもよい
。
【００２８】
発明にしたがって用いられるポリメラーゼは、核酸テンプレートからの核酸分
子合成ができるどのような酵素でもよく、典型的には５´から３´方向のものが
ある。本発明で使用される核酸ポリメラーゼは、中温性もしくは好熱性のもので
もよいが、高熱性が好ましい。好ましい中温性ＤＮＡポリメラーゼは、Ｔ７ＤＮ
Ａポリメラーゼ、Ｔ５ＤＮＡポリメラーゼ、クレノー断片ＤＮＡポリメラーゼ、
ＤＮＡポリメラーゼIIIなどである。発明の方法に使用するのに好ましい好熱性
ＤＮＡポリメラーゼは、Taq,Tne,Tma,Pfl,Tth.Stoffel断片,Tli(例えば、VENT(
登録商標)ブランド), Pyrococcus species GB-D ＤＮＡ(例えば、DEEPVENTTMブ
ランド)ポリメラーゼ、その変異体、変形体、派生体を含む(米国特許No.5,436,1
49; 米国特許No.4,889,818;米国特許No.4,965,188;米国特許No.5,270,179;米国
特許No.5,047,342;米国特許5,512,462;WO92/06200;WO96/10640;Barnes,W.M.,Gen
e112:29-35(1992);Lawyer,F.C.,et al.,PCR Meth.Appl.2:275-287(1993);Flaman
,J.-M,et al.,Nucl.Acids Res.22(15):3259-3260(1994))。長い核酸分子 (例え
ば、約３−５Ｋｂの長さより長い核酸分子)を増幅するには、少なくとも２つの
ＤＮＡポリメラーゼ(実質的に３´エクソヌクレア−ゼ活性を型もの、およびも
うひとつの３´エクソヌクレア−ゼ活性を有したもの)が典型的に用いられる。
米国特許No.5,436,149,米国特許No.5,512,462;Barnes,W.M.,Gene112:29-35(1992
)を参照。この開示は、全体がここに組み込まれている。実質的に３´エクソヌ
クレア−ゼ活性を欠いたＤＮＡポリメラーゼの例は、Taq,Tne(exo-),Tma(exo-),
Pfu(exo-),Pwo(exo-)およびTthＤＮＡポリメラーゼ、その変異体、変形体、派生
体を含むがこれに限定されるものではない。
子合成ができるどのような酵素でもよく、典型的には５´から３´方向のものが
ある。本発明で使用される核酸ポリメラーゼは、中温性もしくは好熱性のもので
もよいが、高熱性が好ましい。好ましい中温性ＤＮＡポリメラーゼは、Ｔ７ＤＮ
Ａポリメラーゼ、Ｔ５ＤＮＡポリメラーゼ、クレノー断片ＤＮＡポリメラーゼ、
ＤＮＡポリメラーゼIIIなどである。発明の方法に使用するのに好ましい好熱性
ＤＮＡポリメラーゼは、Taq,Tne,Tma,Pfl,Tth.Stoffel断片,Tli(例えば、VENT(
登録商標)ブランド), Pyrococcus species GB-D ＤＮＡ(例えば、DEEPVENTTMブ
ランド)ポリメラーゼ、その変異体、変形体、派生体を含む(米国特許No.5,436,1
49; 米国特許No.4,889,818;米国特許No.4,965,188;米国特許No.5,270,179;米国
特許No.5,047,342;米国特許5,512,462;WO92/06200;WO96/10640;Barnes,W.M.,Gen
e112:29-35(1992);Lawyer,F.C.,et al.,PCR Meth.Appl.2:275-287(1993);Flaman
,J.-M,et al.,Nucl.Acids Res.22(15):3259-3260(1994))。長い核酸分子 (例え
ば、約３−５Ｋｂの長さより長い核酸分子)を増幅するには、少なくとも２つの
ＤＮＡポリメラーゼ(実質的に３´エクソヌクレア−ゼ活性を型もの、およびも
うひとつの３´エクソヌクレア−ゼ活性を有したもの)が典型的に用いられる。
米国特許No.5,436,149,米国特許No.5,512,462;Barnes,W.M.,Gene112:29-35(1992
)を参照。この開示は、全体がここに組み込まれている。実質的に３´エクソヌ
クレア−ゼ活性を欠いたＤＮＡポリメラーゼの例は、Taq,Tne(exo-),Tma(exo-),
Pfu(exo-),Pwo(exo-)およびTthＤＮＡポリメラーゼ、その変異体、変形体、派生
体を含むがこれに限定されるものではない。
【００２９】
ホスト細胞。どのような原核細胞でも、真核細胞でもよい。このような細胞は
、反復可能な発現ベクター、またはクローニングベクターのレシピエントでもよ
い。「ホスト」や「ホスト細胞」や「細胞」のような文言は、ここでは置き換え
可能に使用されていてもよい。例えば、このようなホストは、Manistis et al.,
Molecular Cloning:Alaboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory , Co
ld Spring Harbor,NY(1982)を参照すれば良い。好ましい原核ホストは、Escheri
chia属(例えば、E,coli),Bacillus属,Staphylococcus属,Agrobacter(A.tumefaci
ens)属,Streptomyces属,Pseudomonas属,Salmonella属,Serratia,Caryophanonn等
が挙げられるがこれに限定されるものではない。最も好ましい原核ホストは、E.
coliである。本発明で特に興味深いバクテリアホストは、E.coli K12,DH10B,DH5
αおよびHB101である。好ましい真核ホストは、菌類、魚細胞、酵母細胞、植物
細胞、動物細胞が含まれるがこれに限定されるものではない。特に好ましい動物
細胞は、ショウジョウバエ、スポドプテラ(Spodoptera)Ｓｆ９およびＳｆ２１細
胞、トリコプルサ(Trichoplusa)Ｈｉｇｈ−Ｆｉｖｅ細胞のような昆虫細胞；C.e
legans細胞のような線虫細胞、およびＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、ＶＥＲＯ細胞、
２９３細胞、ＰＥＲＣ６細胞、ＢＨＫ細胞、およびヒト細胞のような哺乳類細胞
が挙げられるがこれに限定されるものではない。
、反復可能な発現ベクター、またはクローニングベクターのレシピエントでもよ
い。「ホスト」や「ホスト細胞」や「細胞」のような文言は、ここでは置き換え
可能に使用されていてもよい。例えば、このようなホストは、Manistis et al.,
Molecular Cloning:Alaboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory , Co
ld Spring Harbor,NY(1982)を参照すれば良い。好ましい原核ホストは、Escheri
chia属(例えば、E,coli),Bacillus属,Staphylococcus属,Agrobacter(A.tumefaci
ens)属,Streptomyces属,Pseudomonas属,Salmonella属,Serratia,Caryophanonn等
が挙げられるがこれに限定されるものではない。最も好ましい原核ホストは、E.
coliである。本発明で特に興味深いバクテリアホストは、E.coli K12,DH10B,DH5
αおよびHB101である。好ましい真核ホストは、菌類、魚細胞、酵母細胞、植物
細胞、動物細胞が含まれるがこれに限定されるものではない。特に好ましい動物
細胞は、ショウジョウバエ、スポドプテラ(Spodoptera)Ｓｆ９およびＳｆ２１細
胞、トリコプルサ(Trichoplusa)Ｈｉｇｈ−Ｆｉｖｅ細胞のような昆虫細胞；C.e
legans細胞のような線虫細胞、およびＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、ＶＥＲＯ細胞、
２９３細胞、ＰＥＲＣ６細胞、ＢＨＫ細胞、およびヒト細胞のような哺乳類細胞
が挙げられるがこれに限定されるものではない。
【００３０】
ベクター。ベクターはホスト細胞で自立的に複製する能力がある核酸分子(好
ましくはＤＮＡ)である。このようなベクターは、このような配列が生物的機能
を損なうことなしに切断される部位である、少数のエンドヌクレアーゼ制限サイ
トを有し、その複製およびクローニングを起こすためにそこに核酸分子が組みつ
ながれることにより特徴づけられてもよい。例は、プラスミド、自律的複製配列
（ＡＲＳ）セントロメア、コスミド、ファージミドを含む。ベクターは、さらに
、例えばＰＣＲのためのプライマー部位、転写および／または翻訳の開始、およ
び／または制御部位、組換えシグナル、レプリコンなどを提供することができる
。ベクターはさらに、ベクターにより細胞が形質転換や形質移入をされたかを検
出するための使用に適した１以上の選択可能なマーカーを有することができ、こ
れは例えばカナマイシン、テトラサイクリン、アンプリシリンなどである。
ましくはＤＮＡ)である。このようなベクターは、このような配列が生物的機能
を損なうことなしに切断される部位である、少数のエンドヌクレアーゼ制限サイ
トを有し、その複製およびクローニングを起こすためにそこに核酸分子が組みつ
ながれることにより特徴づけられてもよい。例は、プラスミド、自律的複製配列
（ＡＲＳ）セントロメア、コスミド、ファージミドを含む。ベクターは、さらに
、例えばＰＣＲのためのプライマー部位、転写および／または翻訳の開始、およ
び／または制御部位、組換えシグナル、レプリコンなどを提供することができる
。ベクターはさらに、ベクターにより細胞が形質転換や形質移入をされたかを検
出するための使用に適した１以上の選択可能なマーカーを有することができ、こ
れは例えばカナマイシン、テトラサイクリン、アンプリシリンなどである。
【００３１】
発明に従えば、どのようなベクターを使用してもよい。特にこの技術分野で知
られ、市販されている（およびその変形体、派生体）ベクターを発明に従って使
用してもよい。このようなベクターは、例えば、Vector Laboratories Inc.,Inv
itrogen,Promega,Novagen,NEB,Clontech,Boehringer,Mannheim,Pharmacia,EpiCe
nter,OriGenes Technologies Inc.,Strategene,Perkin Eomer,Pharmingen,Life
Technologies,Inc.,およびResearch Geneticsから得られる。このようなベクタ
ーは、例えば重要な核酸をクローニングまたはサブクローニングするのに用いて
もよい。特に重要なベクターの一般分類は、原核および／または真核クローニン
グベクター、発現ベクター、融合ベクター、ツーハイブリッドまたは逆ツーハイ
ブリッドベクター、異なるホストに用いるにはシャトルベクター、変異誘発ベク
ター、転写ベクター、大きな挿入を受け取るベクターなどが含まれる。
られ、市販されている（およびその変形体、派生体）ベクターを発明に従って使
用してもよい。このようなベクターは、例えば、Vector Laboratories Inc.,Inv
itrogen,Promega,Novagen,NEB,Clontech,Boehringer,Mannheim,Pharmacia,EpiCe
nter,OriGenes Technologies Inc.,Strategene,Perkin Eomer,Pharmingen,Life
Technologies,Inc.,およびResearch Geneticsから得られる。このようなベクタ
ーは、例えば重要な核酸をクローニングまたはサブクローニングするのに用いて
もよい。特に重要なベクターの一般分類は、原核および／または真核クローニン
グベクター、発現ベクター、融合ベクター、ツーハイブリッドまたは逆ツーハイ
ブリッドベクター、異なるホストに用いるにはシャトルベクター、変異誘発ベク
ター、転写ベクター、大きな挿入を受け取るベクターなどが含まれる。
【００３２】
他の重要なベクターは、ウィルス由来ベクター（Ｍ１３ベクター、バクテリア
ルファージベクター、バキュロウィルスベクター、アデノウィルスベクター、お
よびレトロウィルスベクター）、コピー数の多い、少ない、および調節可能なベ
クター、ひとつのホストにおいて組み合わせで使用するための適合性レプリコン
を有するベクター（ｐＡＣＹＣ１８４およびｐＢＲ３２２）および真核エピソー
ム複製ベクター（ｐＣＤＭ８）。
ルファージベクター、バキュロウィルスベクター、アデノウィルスベクター、お
よびレトロウィルスベクター）、コピー数の多い、少ない、および調節可能なベ
クター、ひとつのホストにおいて組み合わせで使用するための適合性レプリコン
を有するベクター（ｐＡＣＹＣ１８４およびｐＢＲ３２２）および真核エピソー
ム複製ベクター（ｐＣＤＭ８）。
【００３３】
保存。ここで用いる「保存」とは、重要なある温度または複数の温度で、一定
期間、担体／核酸を維持することを言う。好ましくは、保存は約２０から３０℃
（好ましくは室温、例えば２５℃）で行われるが、必要に応じてより高い、また
は低い温度であってもよい。より低い保存温度は約０から２０℃、−２０℃から
０℃、および−８０°から２０℃の範囲であってもよい。発明に従えば、長期の
保存は１年以上、好ましくは２年以上、より好ましくは３年以上、より好ましく
は５年以上、より好ましくは１０年以上、最も好ましくは１５年以上である。
期間、担体／核酸を維持することを言う。好ましくは、保存は約２０から３０℃
（好ましくは室温、例えば２５℃）で行われるが、必要に応じてより高い、また
は低い温度であってもよい。より低い保存温度は約０から２０℃、−２０℃から
０℃、および−８０°から２０℃の範囲であってもよい。発明に従えば、長期の
保存は１年以上、好ましくは２年以上、より好ましくは３年以上、より好ましく
は５年以上、より好ましくは１０年以上、最も好ましくは１５年以上である。
【００３４】
ここに用いられた、組換えＤＮＡ技術および分子および細胞生物学の分野の他
の文言は、応用技術での通常技術のひとつにより一般的に理解されるであろう。
の文言は、応用技術での通常技術のひとつにより一般的に理解されるであろう。
【００３５】
（ｃＤＮＡ分子の製造）
（核酸分子の源）
本発明に従って、種々の核酸テンプレート分子からｃＤＮＡ分子（１本鎖また
は２本鎖）を作製することができる。本発明の使用に好ましい核酸分子は、２本
鎖のＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドと同様に、１本鎖または２本鎖の、ＤＮＡおよ
びＲＮＡ分子が含まれる。より好ましい核酸分子は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍ
ＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、およびリボソーマルＲＮＡ（ｒ
ＲＮＡ）分子を含むが、発明によればｍＲＮＡ分子が好ましいテンプレートであ
る。
は２本鎖）を作製することができる。本発明の使用に好ましい核酸分子は、２本
鎖のＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドと同様に、１本鎖または２本鎖の、ＤＮＡおよ
びＲＮＡ分子が含まれる。より好ましい核酸分子は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍ
ＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、およびリボソーマルＲＮＡ（ｒ
ＲＮＡ）分子を含むが、発明によればｍＲＮＡ分子が好ましいテンプレートであ
る。
【００３６】
ｃＤＮＡ分子の作製に用いられる核酸分子は、本発明の方法によれば、通常の
技術のひとつとして知られる、標準の有機化学合成法に従った合成により得られ
る。より好ましくは、核酸分子は種々の細胞、組織、器官、もしくは生物のよう
な、自然源から得てもよい。核酸分子の源として使用することのできる細胞は、
原核生物(Escherichia,Bacillus, Serratia, Salmonella,Staphylococcus,Strep
tococcus,Clostridium,Chlamydia,Neisseria,Treponema,Mycoplasma,Borrelia.L
egionella,Pseudomonas.Mycobacterium,Helicobacter,Erwinia,Agrobacterium,R
hizobium,Xanthomonas,Streptomycesの各属の種を含むが、これに限定されない
バクテリア細胞）、または真核細胞（菌類（特に酵母菌）、植物、原生生物およ
びその他の寄生生物、およびショウジョウバエ（Drosophila spp.）細胞を含む
がこれに限定されない昆虫、スポドプテラ(Spodoptera)Ｓｆ９およびＳｆ２１細
胞、トリコプルサ(Trichoplusa)Ｈｉｇｈ−Ｆｉｖｅ細胞；線虫（特にCaenorhab
ditis elegans細胞）、およびＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、ＶＥＲＯ細胞、２９３
細胞、ＰＥＲＣ６細胞、ＢＨＫ細胞、およびその他のマウスおよびヒト細胞のよ
うな哺乳類細胞が挙げられる。
技術のひとつとして知られる、標準の有機化学合成法に従った合成により得られ
る。より好ましくは、核酸分子は種々の細胞、組織、器官、もしくは生物のよう
な、自然源から得てもよい。核酸分子の源として使用することのできる細胞は、
原核生物(Escherichia,Bacillus, Serratia, Salmonella,Staphylococcus,Strep
tococcus,Clostridium,Chlamydia,Neisseria,Treponema,Mycoplasma,Borrelia.L
egionella,Pseudomonas.Mycobacterium,Helicobacter,Erwinia,Agrobacterium,R
hizobium,Xanthomonas,Streptomycesの各属の種を含むが、これに限定されない
バクテリア細胞）、または真核細胞（菌類（特に酵母菌）、植物、原生生物およ
びその他の寄生生物、およびショウジョウバエ（Drosophila spp.）細胞を含む
がこれに限定されない昆虫、スポドプテラ(Spodoptera)Ｓｆ９およびＳｆ２１細
胞、トリコプルサ(Trichoplusa)Ｈｉｇｈ−Ｆｉｖｅ細胞；線虫（特にCaenorhab
ditis elegans細胞）、およびＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、ＶＥＲＯ細胞、２９３
細胞、ＰＥＲＣ６細胞、ＢＨＫ細胞、およびその他のマウスおよびヒト細胞のよ
うな哺乳類細胞が挙げられる。
【００３７】
いくつかの好ましい実施例においては、本発明に従って保存された核酸はウィ
ルス由来であってもよい。
ルス由来であってもよい。
【００３８】
核酸の源として用いられる哺乳類体細胞は、血液細胞（網状赤血球および白血
球）、内皮細胞、上皮細胞、神経細胞（中枢または末梢神経システム由来）、筋
細胞（骨格筋、平滑筋、または心筋由来のミオサイトおよび筋原細胞を含む）、
結合組織細胞（線維芽細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、軟骨芽細胞、骨細胞、造血細
胞を含む）および他の間質の細胞（例えば、マクロファージ、樹上細胞、シュワ
ン細胞）を含む。哺乳類生殖細胞（精母細胞および卵母細胞）も、上記体細胞お
よび生殖細胞になる前駆物質、前駆体、および幹細胞として、発明に使用する核
酸の源として用いることができる。核酸の源としての使用が好ましいものは、脳
、腎臓、肝臓、すい臓、血液、骨髄、筋肉、神経、皮膚、尿生殖器、循環器、リ
ンパ、胃腸、結合組織の源に由来する哺乳類の組織、または器官が挙げられ、ま
た、哺乳類（ヒトを含む）の胚や胎児に由来するものでもよい。
球）、内皮細胞、上皮細胞、神経細胞（中枢または末梢神経システム由来）、筋
細胞（骨格筋、平滑筋、または心筋由来のミオサイトおよび筋原細胞を含む）、
結合組織細胞（線維芽細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、軟骨芽細胞、骨細胞、造血細
胞を含む）および他の間質の細胞（例えば、マクロファージ、樹上細胞、シュワ
ン細胞）を含む。哺乳類生殖細胞（精母細胞および卵母細胞）も、上記体細胞お
よび生殖細胞になる前駆物質、前駆体、および幹細胞として、発明に使用する核
酸の源として用いることができる。核酸の源としての使用が好ましいものは、脳
、腎臓、肝臓、すい臓、血液、骨髄、筋肉、神経、皮膚、尿生殖器、循環器、リ
ンパ、胃腸、結合組織の源に由来する哺乳類の組織、または器官が挙げられ、ま
た、哺乳類（ヒトを含む）の胚や胎児に由来するものでもよい。
【００３９】
上記原核または真核細胞、組織および器官は、いずれも正常、異常でもよく、
癌化、株化されていても、前駆体、前駆物質でも、胎児、または胚性のものでも
よい。異常細胞は、例えば、感染症（バクテリア、菌類または酵母菌、ウィルス
（ＡＩＤＳ，ＨＩＶ，ＨＴＬＶ、ヘルペス、肝炎などを含む）または寄生生物に
よる）、遺伝的または生化学的疾患（例えば、嚢胞性繊維症、血友病、アルツハ
イマー病、筋ジストロフィー、多発性硬化症）または癌の進行を生じているもの
を含んでいてもよい。癌化、もしくは株化された動物細胞株は、ＣＯＳ細胞、Ｃ
ＨＯ細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＨｅｐＧ２細胞、Ｋ５６
２細胞、２９３細胞、Ｌ９２９細胞、Ｆ９細胞などである。他の本発明に使用さ
れる核酸の源として適した細胞、細胞株、組織、器官、および生物は、技術の通
常の知識のひとつにも明らかである。
癌化、株化されていても、前駆体、前駆物質でも、胎児、または胚性のものでも
よい。異常細胞は、例えば、感染症（バクテリア、菌類または酵母菌、ウィルス
（ＡＩＤＳ，ＨＩＶ，ＨＴＬＶ、ヘルペス、肝炎などを含む）または寄生生物に
よる）、遺伝的または生化学的疾患（例えば、嚢胞性繊維症、血友病、アルツハ
イマー病、筋ジストロフィー、多発性硬化症）または癌の進行を生じているもの
を含んでいてもよい。癌化、もしくは株化された動物細胞株は、ＣＯＳ細胞、Ｃ
ＨＯ細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＨｅｐＧ２細胞、Ｋ５６
２細胞、２９３細胞、Ｌ９２９細胞、Ｆ９細胞などである。他の本発明に使用さ
れる核酸の源として適した細胞、細胞株、組織、器官、および生物は、技術の通
常の知識のひとつにも明らかである。
【００４０】
始動の細胞、組織、期間、もしくは他のサンプルが得られたら、核酸分子（ｍ
ＲＮＡのような）はそこから随意に周知の技術で単離すればよい（例えば、Mani
atis, T.,et al.,Cell 15:687-701(1978); Okayama, H., and Berg, P., Mol. C
ell. Biol. 2:161-170(1982); Gubler, U., and Hoffman, B.J., Gene 25:263-2
69(1983)参照）。このようにして単離された核酸分子は発明の固体担体に直接接
触していてもよい。あるいは、細胞、組織などが担体に直接に接触していてもよ
い。
ＲＮＡのような）はそこから随意に周知の技術で単離すればよい（例えば、Mani
atis, T.,et al.,Cell 15:687-701(1978); Okayama, H., and Berg, P., Mol. C
ell. Biol. 2:161-170(1982); Gubler, U., and Hoffman, B.J., Gene 25:263-2
69(1983)参照）。このようにして単離された核酸分子は発明の固体担体に直接接
触していてもよい。あるいは、細胞、組織などが担体に直接に接触していてもよ
い。
【００４１】
発明の実施において、ｃＤＮＡ分子またはｃＤＮＡライブラリーは、１以上の
上述したようにして得た核酸分子を混合することで作製されるが、核酸分子は、
核酸分子の逆転写に適した条件で、酵素の作用により１以上のｃＤＮＡ分子（１
本鎖または２本鎖）を形成するための逆転写酵素活性を有する１以上のポリペプ
チドを伴ったｍＲＮＡの集合のような１以上のｍＲＮＡが好ましい。従って、発
明の方法は、（ａ）１以上の核酸テンプレート（好ましくは、ｍＲＮＡ分子の集
合のような、１以上のＲＮＡまたはｍＲＮＡテンプレート）の、１以上の逆転写
酵素との混合、（ｂ）１以上のテンプレートすべてに、もしくは一部に相補的な
１以上の核酸分子を精製するのに十分な条件での混合物の保温、を含んでなるも
のである。このような方法は、１以上のＤＮＡポリメラーゼを含んでいてもよい
。発明は、後述の実施例に記載されるような、またはその他の周知技術の方法（
例えば、Gubler, U., and Hoffman, B.J., Gene 25:263-269(1983)；Krug,M.S.,
and Berger,S.L.,Meth.Enzymol.152:316-325(1987);Sambrook,J.,et al.,Molecu
lar Cloning:A Laboratory Manual,2nded., Cold Spring Harbor,NY: Cold Spri
ng Harbor Laboratory Press, pp.8.60-8.63(1989);and WO98/51699参照）であ
る、ｃＤＮＡ合成方法と組み合わせて使用し、ｃＤＮＡ分子またはライブラリー
を作製してもよい。好ましい実施例としては、ｃＤＮＡは米国特許シリアル番号
09/076,115、および／または1999年3月2日にファイルされた米国仮出願シリアル
番号60/122,395に詳述される方法を使用して精製するのがよい。
上述したようにして得た核酸分子を混合することで作製されるが、核酸分子は、
核酸分子の逆転写に適した条件で、酵素の作用により１以上のｃＤＮＡ分子（１
本鎖または２本鎖）を形成するための逆転写酵素活性を有する１以上のポリペプ
チドを伴ったｍＲＮＡの集合のような１以上のｍＲＮＡが好ましい。従って、発
明の方法は、（ａ）１以上の核酸テンプレート（好ましくは、ｍＲＮＡ分子の集
合のような、１以上のＲＮＡまたはｍＲＮＡテンプレート）の、１以上の逆転写
酵素との混合、（ｂ）１以上のテンプレートすべてに、もしくは一部に相補的な
１以上の核酸分子を精製するのに十分な条件での混合物の保温、を含んでなるも
のである。このような方法は、１以上のＤＮＡポリメラーゼを含んでいてもよい
。発明は、後述の実施例に記載されるような、またはその他の周知技術の方法（
例えば、Gubler, U., and Hoffman, B.J., Gene 25:263-269(1983)；Krug,M.S.,
and Berger,S.L.,Meth.Enzymol.152:316-325(1987);Sambrook,J.,et al.,Molecu
lar Cloning:A Laboratory Manual,2nded., Cold Spring Harbor,NY: Cold Spri
ng Harbor Laboratory Press, pp.8.60-8.63(1989);and WO98/51699参照）であ
る、ｃＤＮＡ合成方法と組み合わせて使用し、ｃＤＮＡ分子またはライブラリー
を作製してもよい。好ましい実施例としては、ｃＤＮＡは米国特許シリアル番号
09/076,115、および／または1999年3月2日にファイルされた米国仮出願シリアル
番号60/122,395に詳述される方法を使用して精製するのがよい。
【００４２】
本発明に好適に使用されるｃＤＮＡ合成の他の方法は周知の技術のひとつとし
て明白である。
て明白である。
【００４３】
この方法に従ってｃＤＮＡ分子、またはライブラリーを得たあと、これらのｃ
ＤＮＡは単離されて更なる分析や、操作を行ってもよい。ｃＤＮＡ精製の詳細な
方法は、ＧＥＮＥＴＲＡＰＰＥＲTMマニュアル（Life Technologies, Inc.; Roc
kville, Maryland）に記載されており、その全体の関連に基づいてここに組み込
まれているが、代わりの周知技術である標準的ｃＤＮＡ単離技術を用いてもよい
（例えば、Sambrook,J.,et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2nded
., Cold Spring Harbor,NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press, pp.8.60-8
.63(1989)参照）。
ＤＮＡは単離されて更なる分析や、操作を行ってもよい。ｃＤＮＡ精製の詳細な
方法は、ＧＥＮＥＴＲＡＰＰＥＲTMマニュアル（Life Technologies, Inc.; Roc
kville, Maryland）に記載されており、その全体の関連に基づいてここに組み込
まれているが、代わりの周知技術である標準的ｃＤＮＡ単離技術を用いてもよい
（例えば、Sambrook,J.,et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2nded
., Cold Spring Harbor,NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press, pp.8.60-8
.63(1989)参照）。
【００４４】
発明の他の見方では、発明は核酸分子の増幅の方法として用いてもよい。発明
のこの解釈に従った核酸増幅方法は、１ステップ（例えば、１ステップＲＴ−Ｐ
ＣＲ）もしくは２ステップ（例えば、２ステップＲＴ−ＰＣＲ）反応でもよい。
発明によると、１ステップＲＴ−ＰＣＲタイプ反応がひとつのチューブで実施さ
れてもよく、これによりコンタミネーションの可能性が下がる。このような１ス
テップ反応は、（ａ）核酸テンプレート（例えば、ｍＲＮＡ）の、１以上の逆転
写酵素活性を有するポリペプチド、および１以上のＤＮＡポリメラーゼとの混合
、（ｂ）１以上のテンプレート全体に、もしくは一部に相補的な、１以上の核酸
分子を増幅するのに十分な条件での混合物の保温、を含んでなるものである。あ
るいは、増幅は、テンプレートを、１以上の逆転写酵素活性を有する（および、
任意的にＤＮＡポリメラーゼ活性を有する）ポリペプチドと混合することにより
行ってもよい。このような反応混合液を適切な条件下で保温することで、テンプ
レートの全体とあるいは部分的に相補である核酸分子の増幅を行うことができる
。このような増幅は、逆転写酵素活性だけにより、またはＤＮＡポリメラーゼ活
性との組み合わせにより行うことができる。２ステップＲＴ−ＰＣＲ反応は、別
個の２つのステップで行われる。このような方法は、（ａ）核酸テンプレート（
例えば、ｍＲＮＡ）の、１以上の逆転写酵素との混合、（ｂ）テンプレート全体
に、もしくは一部に相補的な、核酸分子（例えば、ＤＮＡ分子）を生成するのに
十分な条件での混合物の保温（ｃ）核酸分子の、１以上のＤＮＡポリメラーゼと
の混合、および（ｄ）ステップ（ｃ）の混合液の、核酸分子が増幅するのに十分
な条件下での保温、を含んでなる。長い核酸分子（すなわち、長さが約３−５Ｋ
ｂを超えるもの）の増幅のためには、３´エクソヌクレア−ゼ活性を有するＤＮ
Ａポリメラーゼと、３´エクソヌクレア−ゼ活性が実質的に弱まった別のＤＮＡ
ポリメラーゼのような、ＤＮＡポリメラーゼの組み合わせを用いてもよい。別の
２ステップの手順は、別個の逆転写活性酵素とＤＮＡポリメラーゼとを加えるの
ではなく、逆転写酵素活性およびＤＮＡポリメラーゼ活性を有する１以上のポリ
ペプチド（例えば、Tth,TmaもしくはTne ＤＮＡポリメラーゼなど）の使用を含
んでなる。
のこの解釈に従った核酸増幅方法は、１ステップ（例えば、１ステップＲＴ−Ｐ
ＣＲ）もしくは２ステップ（例えば、２ステップＲＴ−ＰＣＲ）反応でもよい。
発明によると、１ステップＲＴ−ＰＣＲタイプ反応がひとつのチューブで実施さ
れてもよく、これによりコンタミネーションの可能性が下がる。このような１ス
テップ反応は、（ａ）核酸テンプレート（例えば、ｍＲＮＡ）の、１以上の逆転
写酵素活性を有するポリペプチド、および１以上のＤＮＡポリメラーゼとの混合
、（ｂ）１以上のテンプレート全体に、もしくは一部に相補的な、１以上の核酸
分子を増幅するのに十分な条件での混合物の保温、を含んでなるものである。あ
るいは、増幅は、テンプレートを、１以上の逆転写酵素活性を有する（および、
任意的にＤＮＡポリメラーゼ活性を有する）ポリペプチドと混合することにより
行ってもよい。このような反応混合液を適切な条件下で保温することで、テンプ
レートの全体とあるいは部分的に相補である核酸分子の増幅を行うことができる
。このような増幅は、逆転写酵素活性だけにより、またはＤＮＡポリメラーゼ活
性との組み合わせにより行うことができる。２ステップＲＴ−ＰＣＲ反応は、別
個の２つのステップで行われる。このような方法は、（ａ）核酸テンプレート（
例えば、ｍＲＮＡ）の、１以上の逆転写酵素との混合、（ｂ）テンプレート全体
に、もしくは一部に相補的な、核酸分子（例えば、ＤＮＡ分子）を生成するのに
十分な条件での混合物の保温（ｃ）核酸分子の、１以上のＤＮＡポリメラーゼと
の混合、および（ｄ）ステップ（ｃ）の混合液の、核酸分子が増幅するのに十分
な条件下での保温、を含んでなる。長い核酸分子（すなわち、長さが約３−５Ｋ
ｂを超えるもの）の増幅のためには、３´エクソヌクレア−ゼ活性を有するＤＮ
Ａポリメラーゼと、３´エクソヌクレア−ゼ活性が実質的に弱まった別のＤＮＡ
ポリメラーゼのような、ＤＮＡポリメラーゼの組み合わせを用いてもよい。別の
２ステップの手順は、別個の逆転写活性酵素とＤＮＡポリメラーゼとを加えるの
ではなく、逆転写酵素活性およびＤＮＡポリメラーゼ活性を有する１以上のポリ
ペプチド（例えば、Tth,TmaもしくはTne ＤＮＡポリメラーゼなど）の使用を含
んでなる。
【００４５】
増幅方法はＰＣＲ（米国特許Noｓ.4,683,195および4,683,202）、ストランド
置換増幅（Strand Displacement Amplification(SDA);米国特許No.5,455,166;EP
0 684 315）、および核酸シークエンスベースド増幅（Nucleic Acid Sequence-
Based Amplification(NASBA);米国特許No.5,409,818; EP 0 329 822） （キット） 別の実施例で、本発明を組み合わせて、核酸分子の逆転写または増幅に用いる
キットとしてもよい。発明のこの解釈に従ったキットは、箱、カートン、チュー
ブなどの運搬手段と、その中に厳重に拘束された１以上の、バイアル、チューブ
、アンプル、ビンなどの収容手段と含んでなる。発明のキットは、逆転写酵素、
１以上のＤＮＡポリメラーゼ、１以上の適切なバッファー、１以上のヌクレオチ
ド、１以上の固体担体（特にＦＴＡ（登録商標）または派生物またはその変形）
および／または１以上のプライマーから選ばれる、１以上の構成を含んでなる。
置換増幅（Strand Displacement Amplification(SDA);米国特許No.5,455,166;EP
0 684 315）、および核酸シークエンスベースド増幅（Nucleic Acid Sequence-
Based Amplification(NASBA);米国特許No.5,409,818; EP 0 329 822） （キット） 別の実施例で、本発明を組み合わせて、核酸分子の逆転写または増幅に用いる
キットとしてもよい。発明のこの解釈に従ったキットは、箱、カートン、チュー
ブなどの運搬手段と、その中に厳重に拘束された１以上の、バイアル、チューブ
、アンプル、ビンなどの収容手段と含んでなる。発明のキットは、逆転写酵素、
１以上のＤＮＡポリメラーゼ、１以上の適切なバッファー、１以上のヌクレオチ
ド、１以上の固体担体（特にＦＴＡ（登録商標）または派生物またはその変形）
および／または１以上のプライマーから選ばれる、１以上の構成を含んでなる。
【００４６】
発明の特異的な解釈では、逆転写および増幅のキットは、１以上の逆転写酵素
活性を有するポリペプチド、１以上の担体、１以上の核酸の合成に必要なヌクレ
オチド、および／または１以上のプライマー（例えば、逆転写のためのオリゴ（
dT））を含む構成のうちの、１以上の構成を（混合されて、もしくは別個に）含
んでなる。このような、逆転写および増幅キットはさらに、１以上のＤＮＡポリ
メラーゼを含んでいてもよい。好ましい、逆転写酵素活性を有するポリペプチド
、ＤＮＡポリメラーゼ、ヌクレオチド、プライマー、および発明の逆転写および
増幅キットでの使用に適した他の構成は、上記したものが含まれる。本発明のこ
の特徴を含むキットは、さらに標準的な核酸逆転写を行うのに、または増幅プロ
トコールに必要な追加の試薬および化合物を含んでいてもよい。このような、逆
転写酵素活性を有するポリペプチド、ＤＮＡポリメラーゼ、ヌクレオチド、プラ
イマー、および追加の試薬、構成物、または化合物は、１以上のコンテナに収容
されてもよく、このようなコンテナに２つ以上の上記した構成が混合されていて
もよく、または別々のコンテナの発明のキットに収納されていてもよい。
活性を有するポリペプチド、１以上の担体、１以上の核酸の合成に必要なヌクレ
オチド、および／または１以上のプライマー（例えば、逆転写のためのオリゴ（
dT））を含む構成のうちの、１以上の構成を（混合されて、もしくは別個に）含
んでなる。このような、逆転写および増幅キットはさらに、１以上のＤＮＡポリ
メラーゼを含んでいてもよい。好ましい、逆転写酵素活性を有するポリペプチド
、ＤＮＡポリメラーゼ、ヌクレオチド、プライマー、および発明の逆転写および
増幅キットでの使用に適した他の構成は、上記したものが含まれる。本発明のこ
の特徴を含むキットは、さらに標準的な核酸逆転写を行うのに、または増幅プロ
トコールに必要な追加の試薬および化合物を含んでいてもよい。このような、逆
転写酵素活性を有するポリペプチド、ＤＮＡポリメラーゼ、ヌクレオチド、プラ
イマー、および追加の試薬、構成物、または化合物は、１以上のコンテナに収容
されてもよく、このようなコンテナに２つ以上の上記した構成が混合されていて
もよく、または別々のコンテナの発明のキットに収納されていてもよい。
【００４７】
（核酸の使用）
本発明の方法により得られた核酸分子またはｃＤＮＡライブラリーは、例えば
クローニングおよびシークエンシング（すなわち、核酸分子のヌクレオチド配列
の決定）により、またはシークエンシング方法（例えば、ＤＮＡシークエンシン
グの方法について記載されている米国特許Nos.4,962,022および5,498,523参照）
により、さらに特徴づけられてもよい。あるいは、これらの核酸分子はＲＰＡ、
ノーザンブロット、または、周知技術の方法によるハイブリダーゼーションプロ
ーブのような産業上のプロセスにおける、種々の物質の製造のためのチップに接
着して用いてもよい。ｃＤＮＡからのハイブリダイゼ−ションプローブの作製に
より、例えば、医療分野における、患者の細胞や組織に、癌、感染症、遺伝的病
気のマーカー、あるいは胚発生のマーカーなどの特定の遺伝子マーカーの存在の
検査への利用の可能性を提供する。さらに、このようなハイブリダイゼーション
プローブは、さらなる特徴付けのために、異なった細胞、組織または生物から得
たゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリーからの、ＤＮＡ断片の単離にも用い
ることができる。
クローニングおよびシークエンシング（すなわち、核酸分子のヌクレオチド配列
の決定）により、またはシークエンシング方法（例えば、ＤＮＡシークエンシン
グの方法について記載されている米国特許Nos.4,962,022および5,498,523参照）
により、さらに特徴づけられてもよい。あるいは、これらの核酸分子はＲＰＡ、
ノーザンブロット、または、周知技術の方法によるハイブリダーゼーションプロ
ーブのような産業上のプロセスにおける、種々の物質の製造のためのチップに接
着して用いてもよい。ｃＤＮＡからのハイブリダイゼ−ションプローブの作製に
より、例えば、医療分野における、患者の細胞や組織に、癌、感染症、遺伝的病
気のマーカー、あるいは胚発生のマーカーなどの特定の遺伝子マーカーの存在の
検査への利用の可能性を提供する。さらに、このようなハイブリダイゼーション
プローブは、さらなる特徴付けのために、異なった細胞、組織または生物から得
たゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリーからの、ＤＮＡ断片の単離にも用い
ることができる。
【００４８】
本発明の核酸分子は、組換えＤＮＡの方法論における使用の合成物を得ること
にも使用される。それゆえ、本発明は、本発明のｃＤＮＡまたは増幅された核酸
分子を含む組換えベクターに、組換えベクターにより遺伝子操作されたホスト細
胞、これらのベクターおよびホスト細胞を用いた、組換えポリペプチドの作成方
法、およびこれらの方法を用いて作成された組換えポリペプチドに関する。
にも使用される。それゆえ、本発明は、本発明のｃＤＮＡまたは増幅された核酸
分子を含む組換えベクターに、組換えベクターにより遺伝子操作されたホスト細
胞、これらのベクターおよびホスト細胞を用いた、組換えポリペプチドの作成方
法、およびこれらの方法を用いて作成された組換えポリペプチドに関する。
【００４９】
組換えベクターは、発明のこの解釈によると、周知の技術による方法を用い、
１以上の本発明に従って得た、ｃＤＮＡ分子または増幅された核酸分子をベクタ
ーに挿入して作製してもよい。発明のこの解釈でのベクターは、例えば、ファー
ジまたはプラスミド、好ましくはプラスミドがよい。興味深いポリペプチドをコ
ードする核酸には、シス作動性の制御領域を含むベクターが好ましい。適切なト
ランス作動性の因子はホストから提供されてもよく、補足的なベクターにより提
供されてもよく、ホストに導入するときにベクター自身により供給されてもよい
。
１以上の本発明に従って得た、ｃＤＮＡ分子または増幅された核酸分子をベクタ
ーに挿入して作製してもよい。発明のこの解釈でのベクターは、例えば、ファー
ジまたはプラスミド、好ましくはプラスミドがよい。興味深いポリペプチドをコ
ードする核酸には、シス作動性の制御領域を含むベクターが好ましい。適切なト
ランス作動性の因子はホストから提供されてもよく、補足的なベクターにより提
供されてもよく、ホストに導入するときにベクター自身により供給されてもよい
。
【００５０】
考慮される確実な好ましい実施例では、ベクターは誘導可能な、および／また
は細胞種特異的な特定の発現のために供給される（従って、「発現ベクター」と
呼ばれる）。このようなベクターの中でも特に好ましいのは、温度や栄養添加の
ような操作が簡単な環境因子により誘導可能なものである。
は細胞種特異的な特定の発現のために供給される（従って、「発現ベクター」と
呼ばれる）。このようなベクターの中でも特に好ましいのは、温度や栄養添加の
ような操作が簡単な環境因子により誘導可能なものである。
【００５１】
本発明で有用な発現ベクターは、染色体ベクター、エピソーマルベクター、ウ
ィルス由来のベクターを含み、例えば、バクテリアのプラスミドやバクテリオフ
ァージに由来するものや、コスミドや、ファージミドのようなこれらの組み合わ
せに由来するベクターが挙げられ、好ましくは、バクテリアホスト細胞での培養
のためにテトラサイクリンまたはアンピシリン耐性遺伝子のような選択マーカー
を少なくともひとつ含んでいるものがよい。このような発現ベクターへの挿入に
先立って、発明のｃＤＮＡまたは増幅された核酸は、操作により、ファージラム
ダＰLプロモーター、E.coli lac、trpおよびtacプロモーターのような適切なプ
ロモーターに連結するべきである。他の適切なプロモーターは技術者に周知であ
る。
ィルス由来のベクターを含み、例えば、バクテリアのプラスミドやバクテリオフ
ァージに由来するものや、コスミドや、ファージミドのようなこれらの組み合わ
せに由来するベクターが挙げられ、好ましくは、バクテリアホスト細胞での培養
のためにテトラサイクリンまたはアンピシリン耐性遺伝子のような選択マーカー
を少なくともひとつ含んでいるものがよい。このような発現ベクターへの挿入に
先立って、発明のｃＤＮＡまたは増幅された核酸は、操作により、ファージラム
ダＰLプロモーター、E.coli lac、trpおよびtacプロモーターのような適切なプ
ロモーターに連結するべきである。他の適切なプロモーターは技術者に周知であ
る。
【００５２】
本発明の使用に好ましいベクターには、Quiagenより入手可能な、pQE70、pQE6
0、およびpQE-9；Stratageneから入手可能なpBsベクター、ファージスクリプト
ベクター、ブルースクリプトベクター、pNH8A,pNH16a,pNH18A,pNH46A；Invitrog
eneで入手可能なpcDNA3；Pharmaciaから入手可能なpGEX,pTrxfus,pTrc99a,pET-5
,pET-9,pKK223-3,pKK233-3,pDR540,pRIT5；Life Technologies, Incから入手可
能なpSPORT1,pSPORT2およびpSV・SPRT1およびGatewayTM ベクターが含まれる。他
の適切なベクターは技術者により容易に明示される。
0、およびpQE-9；Stratageneから入手可能なpBsベクター、ファージスクリプト
ベクター、ブルースクリプトベクター、pNH8A,pNH16a,pNH18A,pNH46A；Invitrog
eneで入手可能なpcDNA3；Pharmaciaから入手可能なpGEX,pTrxfus,pTrc99a,pET-5
,pET-9,pKK223-3,pKK233-3,pDR540,pRIT5；Life Technologies, Incから入手可
能なpSPORT1,pSPORT2およびpSV・SPRT1およびGatewayTM ベクターが含まれる。他
の適切なベクターは技術者により容易に明示される。
【００５３】
発明は、発明のｃＤＮＡ分子、増幅された核酸、または組換えベクターを含む
組換えホスト細胞を作製する方法、およびこの方法で作製されたホスト細胞を提
供する。発明に従って作製された代表的なホスト細胞（原核細胞または真核細胞
）は、バクテリア細胞、酵母細胞、植物細胞、および動物細胞を含むがこれに限
定されるものではない。好ましいバクテリアホスト細胞は、Escherichia coli細
胞（特に、市販されている（Life Technologies,Inc;Rockville,Maryland）E.co
li株のDH10BおよびStbl2が最適）を含む。
組換えホスト細胞を作製する方法、およびこの方法で作製されたホスト細胞を提
供する。発明に従って作製された代表的なホスト細胞（原核細胞または真核細胞
）は、バクテリア細胞、酵母細胞、植物細胞、および動物細胞を含むがこれに限
定されるものではない。好ましいバクテリアホスト細胞は、Escherichia coli細
胞（特に、市販されている（Life Technologies,Inc;Rockville,Maryland）E.co
li株のDH10BおよびStbl2が最適）を含む。
【００５４】
Bacillus subtilis細胞、Bacillus megaterium細胞、Streptomyces spp.細胞
、Erwinia spp.細胞、Klebsiella spp.細胞、Saomonella typhimurium細胞。好
ましい動物ホスト細胞は昆虫細胞（最も好ましくは、Spodoptera frugiperda Sf
9およびSf21細胞およびTrichoplusa High-Five細胞である）および哺乳類細胞（
最も好ましくは、CHO,Cos,VERO,BHKおよびヒト細胞）を含む。このようなホスト
細胞は、技術分野における通常の技術のひとつとして知られる周知の形質転換、
エレクトロポレ−ションまたは形質移入技術により用意できる。
、Erwinia spp.細胞、Klebsiella spp.細胞、Saomonella typhimurium細胞。好
ましい動物ホスト細胞は昆虫細胞（最も好ましくは、Spodoptera frugiperda Sf
9およびSf21細胞およびTrichoplusa High-Five細胞である）および哺乳類細胞（
最も好ましくは、CHO,Cos,VERO,BHKおよびヒト細胞）を含む。このようなホスト
細胞は、技術分野における通常の技術のひとつとして知られる周知の形質転換、
エレクトロポレ−ションまたは形質移入技術により用意できる。
【００５５】
加えて、発明は組換えポリペプチドを製造する方法、およびこれらの方法によ
り作製されたポリペプチドを提供する。発明のこの面に従えば、上記組換えホス
ト細胞のいずれかをポリペプチドの生成に好適な条件下で培養して、ポリペプチ
ドを単離して作製されてもよい。組換えホスト細胞を培養する方法、およびこれ
からポリペプチドを作製および単離する方法は、技術者に周知である。
り作製されたポリペプチドを提供する。発明のこの面に従えば、上記組換えホス
ト細胞のいずれかをポリペプチドの生成に好適な条件下で培養して、ポリペプチ
ドを単離して作製されてもよい。組換えホスト細胞を培養する方法、およびこれ
からポリペプチドを作製および単離する方法は、技術者に周知である。
【００５６】
ここに記載される方法および用途へのその他の適切な改良、適合は明白であり
、関連する通常の技術のひとつに容易に明示されており、発明の範囲またはその
実施例から外れることなく行うことができる。本発明を詳細に記載したしたが、
これは以下の実施例を考慮することでより明確に理解されるだろう。実施例は例
示することのみを目的として含まれるのであって、発明の限定を意図するもので
はない。 （実施例） 試薬及び培地は、他の記載が無ければ全てライフテクノロジー社（Life Tech
nologies, Inc, Rockville, MD）のものである。
、関連する通常の技術のひとつに容易に明示されており、発明の範囲またはその
実施例から外れることなく行うことができる。本発明を詳細に記載したしたが、
これは以下の実施例を考慮することでより明確に理解されるだろう。実施例は例
示することのみを目的として含まれるのであって、発明の限定を意図するもので
はない。 （実施例） 試薬及び培地は、他の記載が無ければ全てライフテクノロジー社（Life Tech
nologies, Inc, Rockville, MD）のものである。
【００５７】
（実施例１）固体担体上への核酸の調製および保存
細胞培養：ＨｅＬａ（株）細胞は、４ｍＭグルタミンと熱失活したウマ血清１
０％とを含むＳ−ＭＥＭ内で懸濁培養され、ＢＨＫ−２１細胞は（７）に記載の
ように単層培養された。懸濁液はトリプシン処理された後洗浄され、ダルベッコ
（Dulbecco）のＰＢＳ（Ｃａ２＋とＭｇ２＋とを含む）に適当な細胞密度で再懸
濁された。再懸濁された細胞は、調節可能ピペッターを使用してＦＴＡ（登録商
標）ジーンカード（GeneCards）にスポッティングされ、同様のコントロールサ
ンプルがバイアルされ、ドライアイスエタノール溶液中で瞬間凍結され、−７０
°で保管された。
０％とを含むＳ−ＭＥＭ内で懸濁培養され、ＢＨＫ−２１細胞は（７）に記載の
ように単層培養された。懸濁液はトリプシン処理された後洗浄され、ダルベッコ
（Dulbecco）のＰＢＳ（Ｃａ２＋とＭｇ２＋とを含む）に適当な細胞密度で再懸
濁された。再懸濁された細胞は、調節可能ピペッターを使用してＦＴＡ（登録商
標）ジーンカード（GeneCards）にスポッティングされ、同様のコントロールサ
ンプルがバイアルされ、ドライアイスエタノール溶液中で瞬間凍結され、−７０
°で保管された。
【００５８】
サンプルの調製と保存：２０ｍｌの血液と５ｍｌのＨｅＬａ細胞懸濁液（１×
１０７cells/ml）とがＦＴＡ（登録商標）ジーンカード（GeneCards）に直接ス
ポッティングされ、最大で２時間風乾された後、乾燥剤とともに密封ホイル包装
されて室温、４℃、−２０℃、−７０℃で保管された。頬面細胞を含むジーンガ
ードスワブ（GeneGuardSwabs）が、ＦＴＡ（登録商標）ジーンカード（GeneCard
s）上に塗布され、最大で２時間風乾された後、乾燥剤とともに密封ホイル包装
されて室温で保管された。植物は土壌上で育てられ、葉のサンプルが得られた。
植物の葉のサンプルは、窒素駆動圧縮器（１７．５ｐｓｉ）を使用してＦＴＡ（
登録商標）ジーンカード（GeneCards）上にプレスされ、上述のように処理され
た。
１０７cells/ml）とがＦＴＡ（登録商標）ジーンカード（GeneCards）に直接ス
ポッティングされ、最大で２時間風乾された後、乾燥剤とともに密封ホイル包装
されて室温、４℃、−２０℃、−７０℃で保管された。頬面細胞を含むジーンガ
ードスワブ（GeneGuardSwabs）が、ＦＴＡ（登録商標）ジーンカード（GeneCard
s）上に塗布され、最大で２時間風乾された後、乾燥剤とともに密封ホイル包装
されて室温で保管された。植物は土壌上で育てられ、葉のサンプルが得られた。
植物の葉のサンプルは、窒素駆動圧縮器（１７．５ｐｓｉ）を使用してＦＴＡ（
登録商標）ジーンカード（GeneCards）上にプレスされ、上述のように処理され
た。
【００５９】
（実施例２）ポリ（Ａ＋）ＲＮＡのＦＴＡ（登録商標）ペーパー上の細胞から
の直接単離 ２０〜５０ｍｌのＢＨＫ−２１細胞懸濁液（４．２５×１０７／ｍｌ）は、Ｆ
ＴＡ（登録商標）ジーンカード（GeneCards）上に直接スポッティングされ、上
述のように、あるいは、管に入れられて、ドライアイスエタノールで凍結された
後、−７０℃で保管された。ＲＮＡを単離するために、カミソリの刃を使用して
スポット全体が小片に切断され、７５０ｍｌの滅菌水に添加された。その後、度
々ボルテックスされながら、１５分間室温でインキュベートされた。濾紙片を除
去するために、溶出液はシュレッダーマイクロチューブ（Qiagen,CA）内を通さ
れ、ポリ（Ａ＋）ＲＮＡはオリゴヌクレオチド（ｄＴ）で選択されることによっ
て単離された。これらのサンプルの標準的な収率は、３００ｎｇｍＲＮＡ／２×
１０６cellsであった。ＢＨＫ細胞からのトータルＲＮＡは、製造者の説明書に
従ってＴＲＩｚｏｌ（登録商標）試薬を使用して単離され、ポリ（Ａ＋）ＲＮＡ
はオリゴ（ｄＴ）で選択されることによって、これらのサンプルから単離された
。
の直接単離 ２０〜５０ｍｌのＢＨＫ−２１細胞懸濁液（４．２５×１０７／ｍｌ）は、Ｆ
ＴＡ（登録商標）ジーンカード（GeneCards）上に直接スポッティングされ、上
述のように、あるいは、管に入れられて、ドライアイスエタノールで凍結された
後、−７０℃で保管された。ＲＮＡを単離するために、カミソリの刃を使用して
スポット全体が小片に切断され、７５０ｍｌの滅菌水に添加された。その後、度
々ボルテックスされながら、１５分間室温でインキュベートされた。濾紙片を除
去するために、溶出液はシュレッダーマイクロチューブ（Qiagen,CA）内を通さ
れ、ポリ（Ａ＋）ＲＮＡはオリゴヌクレオチド（ｄＴ）で選択されることによっ
て単離された。これらのサンプルの標準的な収率は、３００ｎｇｍＲＮＡ／２×
１０６cellsであった。ＢＨＫ細胞からのトータルＲＮＡは、製造者の説明書に
従ってＴＲＩｚｏｌ（登録商標）試薬を使用して単離され、ポリ（Ａ＋）ＲＮＡ
はオリゴ（ｄＴ）で選択されることによって、これらのサンプルから単離された
。
【００６０】
（実施例３）ＲＮＡのノーザンブロット解析
全量ＲＮＡとポリ（Ａ＋）ＲＮＡとは、（８）に記載のように１．５％１×Ｍ
ＯＰＳ、３０％ホルムアルデヒドを含むアガロースゲル電気泳動にかけられた後
、ナイロンメンブレンに転写された。ブロットは８０℃で１時間焼かれた後、（
８）も記載の方法でプレハイブリダイゼーションが実施された。３２Ｐで標識さ
れたｂ−アクチンのプローブがラッドプライムキット（ライフテクノロジー：Li
fe Technologies, Inc）を使用して準備され、ハイブリダイゼーションバッフ
ァーに対して最終濃度が５×１０６ｃｐｍ／ｍｌになるように調製された。ハイ
ブリダイゼーションは（８）に記載のようにして４２℃で１６時間実施された。
ブロットは、０．１％のＳＤＳを含む室温の２×ＳＳＣで３×５分間洗浄され、
その後、０．１％ＳＤＳを含む６５℃の０．２５×ＳＳＣで２×３０分間洗浄さ
れた。続いて、上記ブロットはプラスチックの包みに入れられ、Ｘ線フィルムに
露光された。
ＯＰＳ、３０％ホルムアルデヒドを含むアガロースゲル電気泳動にかけられた後
、ナイロンメンブレンに転写された。ブロットは８０℃で１時間焼かれた後、（
８）も記載の方法でプレハイブリダイゼーションが実施された。３２Ｐで標識さ
れたｂ−アクチンのプローブがラッドプライムキット（ライフテクノロジー：Li
fe Technologies, Inc）を使用して準備され、ハイブリダイゼーションバッフ
ァーに対して最終濃度が５×１０６ｃｐｍ／ｍｌになるように調製された。ハイ
ブリダイゼーションは（８）に記載のようにして４２℃で１６時間実施された。
ブロットは、０．１％のＳＤＳを含む室温の２×ＳＳＣで３×５分間洗浄され、
その後、０．１％ＳＤＳを含む６５℃の０．２５×ＳＳＣで２×３０分間洗浄さ
れた。続いて、上記ブロットはプラスチックの包みに入れられ、Ｘ線フィルムに
露光された。
【００６１】
ノーザンブロット解析の結果を図１に示す。全量ＲＮＡ（レーン１）はＴＲＩ
ｚｏｌ試薬を使用してＢＨＫ−２１細胞から単離された。ポリ（Ａ＋）ＲＮＡ（
レーン２−３）は、上述のように上記全量ＲＮＡから単離され、ポリ（Ａ＋）Ｒ
ＮＡ（レーン４−５）は、上述のようにＦＴＡ（登録商標）ジーンカード（Gene
Card）に塗布されたＢＨＫ−２１細胞から直接単離されたものである。使用され
た細胞の数は、レーン２及び４が２．５×１０６個であり、レーン１、３及び５
が４×１０６個であった。
ｚｏｌ試薬を使用してＢＨＫ−２１細胞から単離された。ポリ（Ａ＋）ＲＮＡ（
レーン２−３）は、上述のように上記全量ＲＮＡから単離され、ポリ（Ａ＋）Ｒ
ＮＡ（レーン４−５）は、上述のようにＦＴＡ（登録商標）ジーンカード（Gene
Card）に塗布されたＢＨＫ−２１細胞から直接単離されたものである。使用され
た細胞の数は、レーン２及び４が２．５×１０６個であり、レーン１、３及び５
が４×１０６個であった。
【００６２】
ＦＴＡ（登録商標）の所定期間保存サンプルからの２．２ｋｂシグナルの質及
び強度は、従来の方法によってバイアルされたＢＨＫ−２１細胞から単離された
ＲＮＡの質及び強度と直接比較できる。これらの結果に基づけば、ＦＴＡ（登録
商標）ジーンカード（GeneCards）上にスポッティングされた哺乳類の細胞サン
プルから得られたポリ（Ａ＋）ＲＮＡの完全さが維持されていることは明らかで
ある。しかしながら、（１ヶ月以上の）長期保存の場合には、上記サンプルはＦ
ＴＡ（登録商標）ペーパー上への哺乳類細胞の塗布された後、−２０℃以下で保
管されなければならないということが明らかとなった。長期間室温あるいは４℃
で保管された場合のサンプル内のＲＮＡの強度は、コントロールに比べて劣って
いた。我々のＲＮＡの観察とは全く異なるものであるが、最大で７．５年間室温
で保管されたＦＴＡ（登録商標）所定期間保存サンプル内に含まれるゲノムＤＮ
Ａは、完全な状態であったことが（９）に示されている。
び強度は、従来の方法によってバイアルされたＢＨＫ−２１細胞から単離された
ＲＮＡの質及び強度と直接比較できる。これらの結果に基づけば、ＦＴＡ（登録
商標）ジーンカード（GeneCards）上にスポッティングされた哺乳類の細胞サン
プルから得られたポリ（Ａ＋）ＲＮＡの完全さが維持されていることは明らかで
ある。しかしながら、（１ヶ月以上の）長期保存の場合には、上記サンプルはＦ
ＴＡ（登録商標）ペーパー上への哺乳類細胞の塗布された後、−２０℃以下で保
管されなければならないということが明らかとなった。長期間室温あるいは４℃
で保管された場合のサンプル内のＲＮＡの強度は、コントロールに比べて劣って
いた。我々のＲＮＡの観察とは全く異なるものであるが、最大で７．５年間室温
で保管されたＦＴＡ（登録商標）所定期間保存サンプル内に含まれるゲノムＤＮ
Ａは、完全な状態であったことが（９）に示されている。
【００６３】
（実施例４）核酸の増幅
ゲノムＤＮＡのＰＣＲ：ＨＡＲＲＩＳ ＭＩＣＲＯ−ＰＵＮＣＨ（登録商標）
を使用して、生体サンプルスポットの中心に２ｍｍのパンチが開けられ、そのパ
ンチ部分が１．５ｍｌのマイクロチューブに入れられた。そして、ＦＴＡ（登録
商標）精製試薬（ライフテクノロジー）で、室温の下で３×５分間洗浄された。
続いて、ＴＥ（１０ｍｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．１ｍＭＥＤＴ
Ａ）で室温の下で２×５分間洗浄された。それぞれのパンチ部分は個々に処理さ
れ、薄壁増幅試験管へ移された。増幅はＰＬＡＴＩＮＵＭ（登録商標）Ｔａｑ高
適合ＤＮＡポリメラーゼ（１Ｕ）を使用して、１×ＰＬＡＴＩＮＵＭ（登録商標
）Ｔａｑ高適合ＰＣＲバッファー、２００ｍＭｄＮＴＰｓ、２００ｎＭプライマ
ー、２ｍＭＭｇＳＯ４中で実施された。この増幅反応に使用された上記プライマ
ーの配列は、表１に示される。
を使用して、生体サンプルスポットの中心に２ｍｍのパンチが開けられ、そのパ
ンチ部分が１．５ｍｌのマイクロチューブに入れられた。そして、ＦＴＡ（登録
商標）精製試薬（ライフテクノロジー）で、室温の下で３×５分間洗浄された。
続いて、ＴＥ（１０ｍｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．１ｍＭＥＤＴ
Ａ）で室温の下で２×５分間洗浄された。それぞれのパンチ部分は個々に処理さ
れ、薄壁増幅試験管へ移された。増幅はＰＬＡＴＩＮＵＭ（登録商標）Ｔａｑ高
適合ＤＮＡポリメラーゼ（１Ｕ）を使用して、１×ＰＬＡＴＩＮＵＭ（登録商標
）Ｔａｑ高適合ＰＣＲバッファー、２００ｍＭｄＮＴＰｓ、２００ｎＭプライマ
ー、２ｍＭＭｇＳＯ４中で実施された。この増幅反応に使用された上記プライマ
ーの配列は、表１に示される。
【００６４】
【表１】
【００６５】
ＲＴ−ＰＣＲ：ＨＡＲＲＩＳ ＭＩＣＲＯ−ＰＵＮＣＨ（登録商標）を使用し
て、２ｍｍのパンチが開けられ、そのパンチ部分が低結合性ＲＮａｓｅ及びＤＮ
Ａｓｅを含まない４００ｍｌＲＮＡ処理バッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ（ｐＨ８．０）、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、４００−８００Ｕ／ｍｌ ＲＮＡＳ
ＥＯＵＴ（登録商標）、及び２ｍＭ ＤＴＴ）が入れられた１．５ｍｌのチュー
ブ（マルシュバイオメディカル）に移された。その後、５分おきにボルテックス
されながら、氷上で２５分間インキュベートされた。いくつかの実験では、上記
処理バッファーには、引き続いて実施されるＲＮＡの沈殿反応を促進するために
２５０ｍｇ／ｍｌのグリコーゲンも含まれた。ゲノムＤＮＡとは異なり、ＲＮＡ
はこのインキュベート中に上記フィルターのパンチ部分から溶出する。ＲＴ−Ｐ
ＣＲは、基質として上記処理バッファー溶出液を直接使用するか、またあるいは
、上記溶出液から沈殿したＲＮＡを使用して実施された。上記ＲＮＡは、塩（０
．１容量の３Ｍ酢酸ナトリウム、あるいは、０．５容量の７．５Ｍ酢酸アンモニ
ウム）と０．５容量の氷冷した１００％イソプロパノールとを添加することによ
って沈殿された。上記サンプルは−２０℃で一昼夜置かれた後、１２,０００ｒ
ｐｍでマイクロチューブ内に遠心沈殿され、（氷冷した）７５％エタノールで洗
浄されてから風乾された。ＲＮＡのペレットは５０ｍｌ又は１００ｍｌの殺菌し
たＴＥに再懸濁された。一本鎖ｃＤＮＡの合成は、ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ（登
録商標）ＩＩ ＲＮａｓｅ Ｈ−ＲＴ（ライフテクノロジー）を使用して、５０
℃最終体積５０ｍｌで実施された。増幅反応（５０ｍｌ）には、１０ｍｌ以下の
ｃＤＮＡ反応物及び、以下に挙げるものが含まれた。１×増幅バッファー、１．
８ｍＭ ＭｇＳＯ４、２００ｎＭプライマー、２００ｍＭの各ｄＮＴＰ、及び２
．５Ｕ ＰＬＡＴＩＮＵＭ（登録商標）ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ。４ｋｂ以上
の鋳型として、１−２ＵのＰＬＡＴＩＮＵＭ（登録商標）ＴａｑＤＮＡポリメラ
ーゼＨｉｇｈが使用された。増幅産物は、１．２％ＴＢＥ−ＯＲ０．８％ＴＡＥ
アガロースゲル電気泳動によって解析された。
て、２ｍｍのパンチが開けられ、そのパンチ部分が低結合性ＲＮａｓｅ及びＤＮ
Ａｓｅを含まない４００ｍｌＲＮＡ処理バッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ（ｐＨ８．０）、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、４００−８００Ｕ／ｍｌ ＲＮＡＳ
ＥＯＵＴ（登録商標）、及び２ｍＭ ＤＴＴ）が入れられた１．５ｍｌのチュー
ブ（マルシュバイオメディカル）に移された。その後、５分おきにボルテックス
されながら、氷上で２５分間インキュベートされた。いくつかの実験では、上記
処理バッファーには、引き続いて実施されるＲＮＡの沈殿反応を促進するために
２５０ｍｇ／ｍｌのグリコーゲンも含まれた。ゲノムＤＮＡとは異なり、ＲＮＡ
はこのインキュベート中に上記フィルターのパンチ部分から溶出する。ＲＴ−Ｐ
ＣＲは、基質として上記処理バッファー溶出液を直接使用するか、またあるいは
、上記溶出液から沈殿したＲＮＡを使用して実施された。上記ＲＮＡは、塩（０
．１容量の３Ｍ酢酸ナトリウム、あるいは、０．５容量の７．５Ｍ酢酸アンモニ
ウム）と０．５容量の氷冷した１００％イソプロパノールとを添加することによ
って沈殿された。上記サンプルは−２０℃で一昼夜置かれた後、１２,０００ｒ
ｐｍでマイクロチューブ内に遠心沈殿され、（氷冷した）７５％エタノールで洗
浄されてから風乾された。ＲＮＡのペレットは５０ｍｌ又は１００ｍｌの殺菌し
たＴＥに再懸濁された。一本鎖ｃＤＮＡの合成は、ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ（登
録商標）ＩＩ ＲＮａｓｅ Ｈ−ＲＴ（ライフテクノロジー）を使用して、５０
℃最終体積５０ｍｌで実施された。増幅反応（５０ｍｌ）には、１０ｍｌ以下の
ｃＤＮＡ反応物及び、以下に挙げるものが含まれた。１×増幅バッファー、１．
８ｍＭ ＭｇＳＯ４、２００ｎＭプライマー、２００ｍＭの各ｄＮＴＰ、及び２
．５Ｕ ＰＬＡＴＩＮＵＭ（登録商標）ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ。４ｋｂ以上
の鋳型として、１−２ＵのＰＬＡＴＩＮＵＭ（登録商標）ＴａｑＤＮＡポリメラ
ーゼＨｉｇｈが使用された。増幅産物は、１．２％ＴＢＥ−ＯＲ０．８％ＴＡＥ
アガロースゲル電気泳動によって解析された。
【００６６】
固体担体上に蓄えられた核酸増幅の結果を図２ないし図４に示す。図２には、
ＨｅＬａ細胞由来の核酸の増幅結果を示す。抽出されたＲＮＡは、上述のように
、−２０℃および−７０℃で１年間保管されたＨｅＬａ細胞サンプルの２ｍｍの
パンチ部分から取得され洗浄された後、沈殿された。この増幅反応の標的は以下
の通りである。パネルＡ；ｂ−アクチンｍＲＮＡの６２６ｂｐ配列は、９４℃１
分間、続いて９４℃３０秒間、６０℃３０秒間、７２℃１．５分間を４０サイク
ルという熱サイクル条件の下で増幅された。このときのフォワードプライマー及
びリバースプライマーは、それぞれ５'ＣＣＴＣＧＣＣＴＴＴＧＣＣＧＡＴＣＣ
３'（配列番号９）、５'ＧＧＡＴＣＴＴＣＡＴＧＡＧＧＴＡＧＴＣＡＧＴＣ３'
（配列番号１０）であった。パネルＢ；ＲＰＡ（複製プロテインＡ）のｍＲＮＡ
の１．０８ｂｐ配列は、９４℃１分間、続いて９４℃３０秒間、５５℃３０秒間
、７２℃１．５分間を４０サイクルという熱サイクル条件の下で増幅された。こ
のときのフォワードプライマー及びリバースプライマーは、それぞれ５'ＣＡＡ
ＧＡＴＧＴＧＧＡＡＣＡＧＴＧＧＡＴＴＣ３'（配列番号７）、５'ＣＡＴＣＴＡ
ＴＣＴＴＧＡＴＧＴＴＧＴＡＡＣＡＡＧＣ３'（配列番号８）であった。パネル
Ｃ；クラスリン様タンパク質（Ｄ２１２６０）ｍＲＮＡの５．７６ｂｐ配列は、
９４℃１分間、続いて９４℃２０秒間、６０℃３０秒間、６８℃７分間を３５サ
イクルという熱サイクル条件の下で増幅された。このときのフォワードプライマ
ー及びリバースプライマーは、それぞれ５'ＣＣＣＡＧＴＧＡＣＡＧＧＡＧＧＡ
ＧＡＣＣＡＴＡ３'（配列番号１１）、５'ＡＴＣＣＴＧＴＧＣＴＴＴＴＴＣＴＧ
ＴＧＧＧＡＣ３'（配列番号１２）であった。パネルＡ及びＢに関して、レーン
１−３及びレーン４−６は、ＦＴＡ（登録商標）ジーンカードにサンプル塗布後
に、それぞれ−２０℃又は−７０℃で保管されたサンプルに由来する。一方、レ
ーン７はＲＴ反応からＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ ＩＩ ＲＴが除かれたネガティ
ブコントロールである。Ｍで標識されたレーンは、１ｋｂの梯子状サイズマーカ
ーである。パネルＣに関し、レーン１のポジティブコントロール、ＨｅＬａＲＮ
Ａであるレーン２及び３は、ＦＴＡ（登録商標）ジーンカードにサンプル塗布後
に、−７０℃で保管されたサンプルに由来する。一方、レーン４はネガティブコ
ントロールである。
ＨｅＬａ細胞由来の核酸の増幅結果を示す。抽出されたＲＮＡは、上述のように
、−２０℃および−７０℃で１年間保管されたＨｅＬａ細胞サンプルの２ｍｍの
パンチ部分から取得され洗浄された後、沈殿された。この増幅反応の標的は以下
の通りである。パネルＡ；ｂ−アクチンｍＲＮＡの６２６ｂｐ配列は、９４℃１
分間、続いて９４℃３０秒間、６０℃３０秒間、７２℃１．５分間を４０サイク
ルという熱サイクル条件の下で増幅された。このときのフォワードプライマー及
びリバースプライマーは、それぞれ５'ＣＣＴＣＧＣＣＴＴＴＧＣＣＧＡＴＣＣ
３'（配列番号９）、５'ＧＧＡＴＣＴＴＣＡＴＧＡＧＧＴＡＧＴＣＡＧＴＣ３'
（配列番号１０）であった。パネルＢ；ＲＰＡ（複製プロテインＡ）のｍＲＮＡ
の１．０８ｂｐ配列は、９４℃１分間、続いて９４℃３０秒間、５５℃３０秒間
、７２℃１．５分間を４０サイクルという熱サイクル条件の下で増幅された。こ
のときのフォワードプライマー及びリバースプライマーは、それぞれ５'ＣＡＡ
ＧＡＴＧＴＧＧＡＡＣＡＧＴＧＧＡＴＴＣ３'（配列番号７）、５'ＣＡＴＣＴＡ
ＴＣＴＴＧＡＴＧＴＴＧＴＡＡＣＡＡＧＣ３'（配列番号８）であった。パネル
Ｃ；クラスリン様タンパク質（Ｄ２１２６０）ｍＲＮＡの５．７６ｂｐ配列は、
９４℃１分間、続いて９４℃２０秒間、６０℃３０秒間、６８℃７分間を３５サ
イクルという熱サイクル条件の下で増幅された。このときのフォワードプライマ
ー及びリバースプライマーは、それぞれ５'ＣＣＣＡＧＴＧＡＣＡＧＧＡＧＧＡ
ＧＡＣＣＡＴＡ３'（配列番号１１）、５'ＡＴＣＣＴＧＴＧＣＴＴＴＴＴＣＴＧ
ＴＧＧＧＡＣ３'（配列番号１２）であった。パネルＡ及びＢに関して、レーン
１−３及びレーン４−６は、ＦＴＡ（登録商標）ジーンカードにサンプル塗布後
に、それぞれ−２０℃又は−７０℃で保管されたサンプルに由来する。一方、レ
ーン７はＲＴ反応からＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ ＩＩ ＲＴが除かれたネガティ
ブコントロールである。Ｍで標識されたレーンは、１ｋｂの梯子状サイズマーカ
ーである。パネルＣに関し、レーン１のポジティブコントロール、ＨｅＬａＲＮ
Ａであるレーン２及び３は、ＦＴＡ（登録商標）ジーンカードにサンプル塗布後
に、−７０℃で保管されたサンプルに由来する。一方、レーン４はネガティブコ
ントロールである。
【００６７】
図３には、植物細胞由来の核酸の増幅の結果を示す。上述のようにしてジャガ
イモから葉のサンプルの２ｍｍのパンチ部分からＲＮＡが抽出され、５ｍｌのＲ
ＮＡ溶出液が５０ｍｌの各ＲＴ反応に添加された。この増幅反応の標的は、表１
に示されるプライマーを使用する１．８ｋｂのシステインプロテアーゼ（ＡＪ０
０３１３７）ｍＲＮＡ由来の１．０５ｋｂ配列であった。熱サイクル条件は、９
４℃１分間、続いて９４℃３０秒間、６０℃３０秒間、７２℃２分間を４０サイ
クルで行った。レーン１−３及びレーン４−７は、ＦＴＡ（登録商標）ジーンカ
ードに塗布後に、それぞれ−２０℃又は−７０℃で保管されたサンプルに由来す
る。一方、レーン８は、５０ｎｇのジャガイモの葉由来ＲＮＡがＲＴ反応に添加
されたポジティブコントロールである。
イモから葉のサンプルの２ｍｍのパンチ部分からＲＮＡが抽出され、５ｍｌのＲ
ＮＡ溶出液が５０ｍｌの各ＲＴ反応に添加された。この増幅反応の標的は、表１
に示されるプライマーを使用する１．８ｋｂのシステインプロテアーゼ（ＡＪ０
０３１３７）ｍＲＮＡ由来の１．０５ｋｂ配列であった。熱サイクル条件は、９
４℃１分間、続いて９４℃３０秒間、６０℃３０秒間、７２℃２分間を４０サイ
クルで行った。レーン１−３及びレーン４−７は、ＦＴＡ（登録商標）ジーンカ
ードに塗布後に、それぞれ−２０℃又は−７０℃で保管されたサンプルに由来す
る。一方、レーン８は、５０ｎｇのジャガイモの葉由来ＲＮＡがＲＴ反応に添加
されたポジティブコントロールである。
【００６８】
カードに保管された生体サンプルの量に応じたＲＴ−ＰＣＲシグナルの依存性
が調査され、その結果を図４に示す。異なる細胞濃度におけるＨｅＬａ細胞の懸
濁液のサンプル５ｍｌが、ＦＴＡ（登録商標）ジーンカード上にスポッティング
され、１−２時間風乾された後、一年間以上−７０℃で保管された。このサンプ
ルから２ｍｍのパンチ部分が取得され、上述のように処理された。そのＲＮＡの
一定分量（その洗浄物全量の８０分の１の量）が、方法に記載のＲＴ−ＰＣＲに
使用された。標的は、表１に示されるプライマーを使用したＲＰＡ（複製プロテ
インＡ遺伝子（Ｍ３６９５１））由来の〜１．０８ｋｂ単位複製配列であり、図
２に使用されたＰＣＲ条件で行われた。マーカーは１ｋｂ毎の階段状マーカー、
レーン１−３は２５,０００個の細胞、レーン４−６は５,０００個の細胞、レー
ン７−９は５００個の細胞、レーン１０−１２はSuperScripto II Rnase H-R
TがＲＴ反応から除かれたネガティブコントロールである。
が調査され、その結果を図４に示す。異なる細胞濃度におけるＨｅＬａ細胞の懸
濁液のサンプル５ｍｌが、ＦＴＡ（登録商標）ジーンカード上にスポッティング
され、１−２時間風乾された後、一年間以上−７０℃で保管された。このサンプ
ルから２ｍｍのパンチ部分が取得され、上述のように処理された。そのＲＮＡの
一定分量（その洗浄物全量の８０分の１の量）が、方法に記載のＲＴ−ＰＣＲに
使用された。標的は、表１に示されるプライマーを使用したＲＰＡ（複製プロテ
インＡ遺伝子（Ｍ３６９５１））由来の〜１．０８ｋｂ単位複製配列であり、図
２に使用されたＰＣＲ条件で行われた。マーカーは１ｋｂ毎の階段状マーカー、
レーン１−３は２５,０００個の細胞、レーン４−６は５,０００個の細胞、レー
ン７−９は５００個の細胞、レーン１０−１２はSuperScripto II Rnase H-R
TがＲＴ反応から除かれたネガティブコントロールである。
【００６９】
−２０℃以下で保管されたＦＴＡ（登録商標）ジーンカード上のＲＮＡの安定
性は、異なるｍＲＮＡ標的でＲＴ−ＰＣＲ解析を実施することによって調査され
た。ＦＴＡ（登録商標）パンチ部分の処理過程において、ゲノムＤＮＡとは異な
り、処理過程中にＦＴＡ（登録商標）ペーパー上に残存しないことが観察された
。最初の洗浄におけるＲＮＡ溶出液のほとんど全量、及びこの溶出された細胞性
ＲＮＡは、一本鎖ＲＴ反応へ直接移行することができる。あるいは、洗浄溶液か
らエタノール沈殿された後、解析に先立って滅菌水又はＴＥに懸濁されることが
できる。図２及び３の結果は、哺乳動物細胞及び植物サンプルからそれぞれ異な
るｍＲＮＡ標的の連続的なＲＴ−ＰＣＲを実証している。哺乳動物細胞サンプル
に関し、我々のＲＴ−ＰＣＲの標的は、それぞれｂ−アクチン由来の６２６ｂｐ
、１．０８ｋｂ、５．７６ｂｐ配列（パネルＡ）、複製プロテインＡ（ＲＰＡ：
パネルＢ）のｍＲＮＡ、クラスリン様タンパク質（パネルＣ）であった。ジャガ
イモの葉の植物サンプルに関し、我々のＲＴ−ＰＣＲの標的は、１７５６ｂｐの
システインプロテアーゼのｍＲＮＡ由来の８５２ｂｐ配列で構成された。ネガテ
ィブコントロールは、（植物サンプルでは見られない）最初のｃＤＮＡ合成ステ
ップ中でＲＴが除かれる反応からなり、ポジティブコントロールは、最初のｃＤ
ＮＡ合成ステップにおける１００ｎｇのＨｅＬａ又は５０ｎｇの植物葉ＲＮＡの
直接の添加からなる。微量のゲノムＤＮＡについても、処理過程においてパンチ
部分から溶出することが観察され、ＲＴ−ＰＣＲシグナルが確かにＲＮＡの産物
であり、コンタミしたゲノムＤＮＡではないことを確かめるために必要であるた
め、ネガティブコントロールを含むことは重要である。図２及び図３の結果は、
−２０℃及び−７０℃で保管されたＦＴＡ（登録商標）サンプルを用いて、目的
とするＲＮＡ特異的ＲＴ−ＰＣＲ産物が得られ、上記ポジティブコントロールと
比較できることを実証している。我々は続いて、ＦＴＡ（登録商標）ジーンカー
ド上にスポッティングされたＨｅＬａ細胞の数に対して、得られたＲＴ−ＰＣＲ
シグナルのバランスを調査した。このような実験は、生体サンプルにおける異な
る遺伝子発現を半定量的に測定するというこの方法を使用した場合の実行可能性
を明らかにするであろう。種々の濃度のＨｅＬａ細胞懸濁液が準備され、上記種
々の懸濁液から一定分量（５ｍｌ）がＦＴＡ（登録商標）ペーパー上に等しくス
ポッティングされた。得られたＲＴ−ＰＣＲ産物の相対量は、ＦＴＡ（登録商標
）カード上に置かれた細胞の数に比例した（図４）。これらのデータは、ＦＴＡ
（登録商標）ジーンカードを使用したＲＴ−ＰＣＲによって、少なくとも半定量
的に、ｍＲＮＡレベルの違いを測定することができるということを示している。
性は、異なるｍＲＮＡ標的でＲＴ−ＰＣＲ解析を実施することによって調査され
た。ＦＴＡ（登録商標）パンチ部分の処理過程において、ゲノムＤＮＡとは異な
り、処理過程中にＦＴＡ（登録商標）ペーパー上に残存しないことが観察された
。最初の洗浄におけるＲＮＡ溶出液のほとんど全量、及びこの溶出された細胞性
ＲＮＡは、一本鎖ＲＴ反応へ直接移行することができる。あるいは、洗浄溶液か
らエタノール沈殿された後、解析に先立って滅菌水又はＴＥに懸濁されることが
できる。図２及び３の結果は、哺乳動物細胞及び植物サンプルからそれぞれ異な
るｍＲＮＡ標的の連続的なＲＴ−ＰＣＲを実証している。哺乳動物細胞サンプル
に関し、我々のＲＴ−ＰＣＲの標的は、それぞれｂ−アクチン由来の６２６ｂｐ
、１．０８ｋｂ、５．７６ｂｐ配列（パネルＡ）、複製プロテインＡ（ＲＰＡ：
パネルＢ）のｍＲＮＡ、クラスリン様タンパク質（パネルＣ）であった。ジャガ
イモの葉の植物サンプルに関し、我々のＲＴ−ＰＣＲの標的は、１７５６ｂｐの
システインプロテアーゼのｍＲＮＡ由来の８５２ｂｐ配列で構成された。ネガテ
ィブコントロールは、（植物サンプルでは見られない）最初のｃＤＮＡ合成ステ
ップ中でＲＴが除かれる反応からなり、ポジティブコントロールは、最初のｃＤ
ＮＡ合成ステップにおける１００ｎｇのＨｅＬａ又は５０ｎｇの植物葉ＲＮＡの
直接の添加からなる。微量のゲノムＤＮＡについても、処理過程においてパンチ
部分から溶出することが観察され、ＲＴ−ＰＣＲシグナルが確かにＲＮＡの産物
であり、コンタミしたゲノムＤＮＡではないことを確かめるために必要であるた
め、ネガティブコントロールを含むことは重要である。図２及び図３の結果は、
−２０℃及び−７０℃で保管されたＦＴＡ（登録商標）サンプルを用いて、目的
とするＲＮＡ特異的ＲＴ−ＰＣＲ産物が得られ、上記ポジティブコントロールと
比較できることを実証している。我々は続いて、ＦＴＡ（登録商標）ジーンカー
ド上にスポッティングされたＨｅＬａ細胞の数に対して、得られたＲＴ−ＰＣＲ
シグナルのバランスを調査した。このような実験は、生体サンプルにおける異な
る遺伝子発現を半定量的に測定するというこの方法を使用した場合の実行可能性
を明らかにするであろう。種々の濃度のＨｅＬａ細胞懸濁液が準備され、上記種
々の懸濁液から一定分量（５ｍｌ）がＦＴＡ（登録商標）ペーパー上に等しくス
ポッティングされた。得られたＲＴ−ＰＣＲ産物の相対量は、ＦＴＡ（登録商標
）カード上に置かれた細胞の数に比例した（図４）。これらのデータは、ＦＴＡ
（登録商標）ジーンカードを使用したＲＴ−ＰＣＲによって、少なくとも半定量
的に、ｍＲＮＡレベルの違いを測定することができるということを示している。
【００７０】
（実施例５）ＦＴＡ（登録商標）ペーパー上に保存された生体標本から単離さ
れたＲＮＡを用いたｃＤＮＡライブラリーの構築 ポリ（Ａ＋）ＲＮＡは、ビオチン標識されたオリゴヌクレオチド（ｄＴ）がラ
イブラリー構築に必要な特定のアダプター配列を有すること以外は、上述と同様
の方法を用いて、ＦＴＡ（登録商標）ペーパー上に保存された２．２５×１０６
個のＢＨＫ−２１細胞から直接単離された。プライマーはNot I認識部位を含み
、（ビオチン）４配列：ＧＡＣＴＡＧＴＴＣＴＡＧＡＴＣＧＣＧＡＧＣＧＧＣＣ
ＧＣＣＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ（配列番号１３
）（ＷＯ９８／５１６９９、及び米国出願番号０９／０７６，１１５参照）を有
している。ポジティブコントロールとして、同数の細胞からＴＲＩｚｏｌ試薬に
よって調製された全量ＲＮＡからポリ（Ａ＋）ＲＮＡが単離された。ＷＯ９８／
５１６９９及び米国出願番号０９／０７６，１１５の記載に基づいて、二本鎖ｃ
ＤＮＡが作製され、プラスミドベクターへ組み込まれてクローニングされた。ポ
リ（Ａ＋）ＲＮＡから得られた第１のクローンの数は、ｍＲＮＡがＦＴＡ（登録
商標）から直接単離されたものであろうが、ＴＲＩｚｏｌ精製された全量ＲＮＡ
から単離されたものであろうが同数であった。ライブラリーの平均挿入サイズは
、上記プラスミドベクターへのプライマーを使用したコロニーＰＣＲによって決
定された。ＦＴＡ（登録商標）由来の材料の場合の平均挿入サイズは１０００ｂ
ｐであり、ポジティブコントロールポリ（Ａ＋）ＲＮＡ由来の材料によってライ
ブラリーが構築された場合の６００ｂｐに比べて大きかった。これは、ＦＴＡ（
登録商標）に保存されたサンプルから直接単離されたｍＲＮＡを用いて、良質の
ｃＤＮＡライブラリーが作製できるということを示している。
れたＲＮＡを用いたｃＤＮＡライブラリーの構築 ポリ（Ａ＋）ＲＮＡは、ビオチン標識されたオリゴヌクレオチド（ｄＴ）がラ
イブラリー構築に必要な特定のアダプター配列を有すること以外は、上述と同様
の方法を用いて、ＦＴＡ（登録商標）ペーパー上に保存された２．２５×１０６
個のＢＨＫ−２１細胞から直接単離された。プライマーはNot I認識部位を含み
、（ビオチン）４配列：ＧＡＣＴＡＧＴＴＣＴＡＧＡＴＣＧＣＧＡＧＣＧＧＣＣ
ＧＣＣＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ（配列番号１３
）（ＷＯ９８／５１６９９、及び米国出願番号０９／０７６，１１５参照）を有
している。ポジティブコントロールとして、同数の細胞からＴＲＩｚｏｌ試薬に
よって調製された全量ＲＮＡからポリ（Ａ＋）ＲＮＡが単離された。ＷＯ９８／
５１６９９及び米国出願番号０９／０７６，１１５の記載に基づいて、二本鎖ｃ
ＤＮＡが作製され、プラスミドベクターへ組み込まれてクローニングされた。ポ
リ（Ａ＋）ＲＮＡから得られた第１のクローンの数は、ｍＲＮＡがＦＴＡ（登録
商標）から直接単離されたものであろうが、ＴＲＩｚｏｌ精製された全量ＲＮＡ
から単離されたものであろうが同数であった。ライブラリーの平均挿入サイズは
、上記プラスミドベクターへのプライマーを使用したコロニーＰＣＲによって決
定された。ＦＴＡ（登録商標）由来の材料の場合の平均挿入サイズは１０００ｂ
ｐであり、ポジティブコントロールポリ（Ａ＋）ＲＮＡ由来の材料によってライ
ブラリーが構築された場合の６００ｂｐに比べて大きかった。これは、ＦＴＡ（
登録商標）に保存されたサンプルから直接単離されたｍＲＮＡを用いて、良質の
ｃＤＮＡライブラリーが作製できるということを示している。
【００７１】
より明確な理解を図るために、以上のように図や実施例を用いて本発明を詳細
に説明してきたが、本発明は、幅広く、同等の条件の範囲内で、変更を加えたり
、変化させたりすることによって同様のことを実行することができるということ
は、その技術分野における通常の熟練者の一人であれば明白であろう。また、本
発明の範囲に影響を与えない公式化や他の要因、あるいは、それに伴うあらゆる
特定の具体物、そして、上述のような変更の付加や変化は、添付された請求の範
囲内に包含されることを意味することも明白であろう。
に説明してきたが、本発明は、幅広く、同等の条件の範囲内で、変更を加えたり
、変化させたりすることによって同様のことを実行することができるということ
は、その技術分野における通常の熟練者の一人であれば明白であろう。また、本
発明の範囲に影響を与えない公式化や他の要因、あるいは、それに伴うあらゆる
特定の具体物、そして、上述のような変更の付加や変化は、添付された請求の範
囲内に包含されることを意味することも明白であろう。
【００７２】
この明細書に記載されたあらゆる出版物、特許、特許出願は、本発明が属する
技術分野における熟練者の知識のレベルを示すものである。そして、各々の出版
物、特許、あるいは特許出願が、具体的かつ個々に参考文献によって組み合わさ
れているということが示されるように、本発明の参考文献によって、この中に組
み合わされる。
技術分野における熟練者の知識のレベルを示すものである。そして、各々の出版
物、特許、あるいは特許出願が、具体的かつ個々に参考文献によって組み合わさ
れているということが示されるように、本発明の参考文献によって、この中に組
み合わされる。
【００７３】
（参考文献）
１．Burgoyne, L., Kijas,J., Hallsworh,P. and Turner,J.（1994）Proc.Fifth
Int. Symp. Human Ident. ２．Belgrader, P.,Del Rio, S.A., Turner, K.A.,.Marino, M.A.,Weaver,K.R.
and Williams, P.E.（1995）Automated DNA purification and amplifications
from blood-stained cards using a robotic work-station. Biotechniques 19
；426-432 ３．DelRio, S.A., Marino, M.A. and Belgrader, P.（1996）Reusing the same
blood-stained punch for sequential DNA amplifications and typing. Biote
chniques 20：970-974 ４．Sitaraman, K., Darpler, M. and Westfall, B.（1999）Amplification of
large DNA from Blood Stored at Room Temperature. FOCUS 21（1）：10 ５．Hansn, P. and Blakesley, R.（1998）Simple Archiving of Bacterial and
Plasmid DNAs for Future Use. FOCUS 20（3）：72-74 ６．Rogers, C. and Burgoyne, L.（1997）Bacterial typing：storing and pro
cessing of stabilized reference bacteria for polymerase chain reaction w
ithout preparing DNA-an example of an automatable procedure. Anal. Bioch
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g, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview,NY. ９．Burgoyne, L.A., Carroll, D.J., Rogers, C. and Turner, J.（1997）Conv
entional DNA Collection and Processing：Disposable Toothbrushes and FTA
Paper（登録商標） as a Non-threating Buccal-Cell Collection Kit Compatib
le with Automatable DNA Processing. 8th International Symposium on Human
Identification
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Identification
【配列表】
【図１】
固体担体に保存され、溶出されたＲＮＡのノーザンブロット分析の結果を示す
図面である。
図面である。
【図２】
ＨｅＬａ細胞に由来するサンプルを用い、固体担体に保存され、溶出されたＲ
ＮＡのＲＴ−ＰＣＲ分析の結果を示す図面である。
ＮＡのＲＴ−ＰＣＲ分析の結果を示す図面である。
【図３】
植物細胞に由来するサンプルを用い、固体担体に保存され、溶出されたＲＮＡ
のＲＴ−ＰＣＲ分析の結果を示す図面である。
のＲＴ−ＰＣＲ分析の結果を示す図面である。
【図４】
ＨｅＬａ細胞に由来するサンプルを用い、固体担体に保存され、溶出された細
胞の種々の量の細胞からのＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ分析の結果を示す図面である。
胞の種々の量の細胞からのＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ分析の結果を示す図面である。
【手続補正書】
【提出日】平成１４年７月１２日（２００２．７．１２）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７３】
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─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，
ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ
Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＪＰ
Ｆターム(参考） 4B024 AA11 CA04 CA12 DA03 HA08
HA11 HA19
4B063 QA01 QA18 QQ03 QQ42 QQ52
QR08 QR35 QR38 QR55 QR84
QS25 QS34 QS39 QX01
Claims (7)
- 【請求項１】 以下の（ａ）および（ｂ）の工程を含む、１以上のｃＤＮＡ分子を生成する方
法。 （ａ）１以上のｍＲＮＡのテンプレートを含むサンプルを、固体担体へ接触させ
る工程。 （ｂ）上記テンプレート全体にまたは部分的に相補性を有する１以上のｃＤＮＡ
分子を合成するのに十分な条件下で、上記テンプレートを１以上の逆転写酵素と
接触させる工程。 - 【請求項２】 上記ｃＤＮＡがｃＤＮＡライブラリーである請求項１記載の方法。
- 【請求項３】 上記ｍＲＮＡが、上記ｃＤＮＡ合成の前に上記担体から除去される請求項１記
載の方法。 - 【請求項４】 上記ｃＤＮＡが２本鎖である請求項１記載の方法。
- 【請求項５】 さらに上記ｃＤＮＡの増幅工程を含む請求項１記載の方法。
- 【請求項６】 以下の（ａ）および（ｂ）の工程を含む、ＲＮＡ分子を分類する方法。 （ａ）分類されるＲＮＡ分子を含む細胞を、固体担体へ接触させる工程。 （ｂ）細胞および固体担体を乾燥する工程。
- 【請求項７】 固体担体がＦＴＡ(登録商標)ペーパーである請求項６記載の方法。
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