KR100880186B1 - 건조 제한효소 조성물 및 이의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 건조 제한효소 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 제한효소, 반응용 완충용액 및 안정화 물질을 혼합하고, 선택적으로는 침강제 및/또는 수용성 염료를 더 혼합한 혼합 용액을 건조시킴으로써 제조되는 건조 제한효소 조성물 및 이의 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명의 건조제한효소 조성물은 제한효소 반응을 위해 각 구성성분을 혼합해야 하는 다단계 조작을 간편하게 하고, 반응 혼합물의 안정성을 증가시키며, 또한 실험의 재현성에 있어서의 신뢰도를 증가시키고, 각 성분 간의 교차오염의 가능성을 제거시킴으로써, 유전자 분석, 질병진단, 유전자재조합 등의 다양한 분자생물학적 분야에 적용할 때 단시간내에 신뢰도가 높은 결과를 얻을 수 있는 장점이 있다.

제한효소, 안정화 물질, 건조, 보관

Description

건조 제한효소 조성물 및 이의 제조방법{Dried Restriction Enzyme Composition and Method of Producing the Same}

도 1은 실시예 1에서 제조된, 음성대조군 1을 50℃에서 13시간 보관하는 과정을 거쳐 기질 유전자를 반응시킨 후 아가로스 젤 전기영동한 사진으로,

레인 1, 2, 3는 마커로서 다음과 같고,

레인 1; 람다 DNA(마커), 레인 2 ; 람다 DNA/EcoR I Digests (마커),

레인 3; 람다 DNA/Hind Ⅲ Digests (마커),

레인 4부터 레인 15까지 사용된 제한효소는 다음과 같고,

레인 4 BamH Ⅰ, 레인 5 EcoR Ⅰ, 레인 6 Hind Ⅲ, 레인 7 Kpn Ⅰ,

레인 8 Nco Ⅰ(Bsp19 I), 레인 9 Nde Ⅰ(FauND I), 레인 10 Pst Ⅰ,

레인 11 Sac Ⅰ(Psp124B I), 레인 12 Sal Ⅰ, 레인 13 Sma Ⅰ,

레인 14 Xba Ⅰ, 레인 15 Xho Ⅰ(Sfr274 I)

레인 4부터 레인 15까지 사용된 기질 유전자는 다음과 같다.

레인 4,5,6,7,8,9,10,13; 람다 DNA,

레인 11,14,15; 람다 DNA/EcoR Ⅰ Digests,

레인 12; 람다 DNA/Hind Ⅲ Digests

도 2는 실시예 1에서 제조된, 음성대조군 2를 50℃에서 48시간 보관하는 과 정을 거쳐 기질 유전자를 반응시킨 후 아가로스 젤 전기영동한 사진으로, 각 레인에 사용된 마커와 제한효소와 해당 기질 유전자는 도 1의 경우와 동일하다.

도 3은 실시예 1에서 제조된, 음성대조군 3을 50℃에서 13시간 보관하는 과정을 거쳐 기질 유전자를 반응시킨 후 아가로스 젤 전기영동한 사진으로, 각 레인에 사용된 마커와 제한효소와 해당 기질 유전자는 도 1의 경우와 동일하다.

도 4는 실시예 1에서 제조된, 음성대조군 4를 50℃에서 48시간 보관하는 과정을 거쳐 기질 유전자를 반응시킨 후 아가로스 젤 전기영동한 사진으로, 각 레인에 사용된 마커와 제한효소와 해당 기질 유전자는 도 1의 경우와 동일하다.

도 5는 실시예 1에서 제조된, 음성대조군 5를 50℃에서 13시간 보관하는 과정을 거쳐 기질 유전자를 반응시킨 후 아가로스 젤 전기영동한 사진으로, 각 레인에 사용된 마커와 제한효소와 해당 기질 유전자는 도 1의 경우와 동일하다.

도 6은 실시예 1에서 제조된, 안정화 물질로서 솔비톨을 포함하는 제한효소 조성물을 50℃에서 48시간 보관하는 과정을 거쳐 기질 유전자를 반응시킨 후 아가로스 젤 전기영동한 사진으로, 각 레인에 사용된 마커와 제한효소와 해당 기질 유전자는 도 1의 경우와 동일하다.

도 7은 실시예 2에서 제조된, 안정화 물질로서 프럭토스를 포함하는 제한효소 조성물을 50℃에서 13시간 보관하는 과정을 거쳐 기질 유전자를 반응시킨 후 아가로스 젤 전기영동한 사진으로, 각 레인에 사용된 마커와 제한효소와 해당 기질 유전자는 도 1의 경우와 동일하다.

도 8은 실시예 3에서 제조된, 안정화 물질로서 수크로스를 포함하는 제한효 소 조성물을 50℃에서 48시간 보관하는 과정을 거쳐 기질 유전자를 반응시킨 후 아가로스 젤 전기영동한 사진으로, 각 레인에 사용된 마커와 제한효소와 해당 기질 유전자는 도 1의 경우와 동일하다.

도 9은 실시예 4에서 제조된, 안정화 물질로서 트레할로스를 포함하는 제한효소 조성물을 50℃에서 48시간 보관하는 과정을 거쳐 기질 유전자를 반응시킨 후 아가로스 젤 전기영동한 사진으로, 각 레인에 사용된 마커와 제한효소와 해당 기질 유전자는 도 1의 경우와 동일하다.

도 10은 실시예 5에서 제조된, 안정화 물질로서 피콜(Ficoll) 400을 포함하는 제한효소 조성물을 50℃에서 48시간 보관하는 과정을 거쳐 기질 유전자를 반응시킨 후 아가로스 젤 전기영동한 사진으로, 각 레인에 사용된 마커와 제한효소와 해당 기질 유전자는 도 1의 경우와 동일하다.

도 11은 실시예 6에서 제조된, 안정화 물질로서 이노시톨을 포함하는 제한효소 조성물을 50℃에서 48시간 보관하는 과정을 거쳐 기질 유전자를 반응시킨 후 아가로스 젤 전기영동한 사진으로, 각 레인에 사용된 마커와 제한효소와 해당 기질 유전자는 도 1의 경우와 동일하다.

도 12는 실시예 7에서 제조된, 안정화 물질로서 폴리에틸렌 글리콜 8,000을 포함하는 제한효소 조성물을 50℃에서 48시간 보관하는 과정을 거쳐 기질 유전자를 반응시킨 후 아가로스 젤 전기영동한 사진으로, 각 레인에 사용된 마커와 제한효소와 해당 기질 유전자는 도 1의 경우와 동일하다.

도 13은 실시예 8에서 제조된, 안정화 물질로서 알부민을 포함하는 제한효소 조성물을 50℃에서 48시간 보관하는 과정을 거쳐 기질 유전자를 반응시킨 후 아가로스 젤 전기영동한 사진으로, 각 레인에 사용된 마커와 제한효소와 해당 기질 유전자는 도 1의 경우와 동일하다.

본 발명은 건조 제한효소 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 제한효소 반응을 위해 각 구성성분을 혼합해야 하는 다단계 조작을 간편하게 하고, 반응 혼합물의 안정성을 증가시킴으로써, 다양한 분자생물학적 분야에 적용할 때 단시간내에 신뢰도가 높은 결과를 얻을 수 있는 건조 제한효소 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

"제한효소(restriction enzyme or restriction endonuclease)"는 분자생물학의 기본이 되는 효소류 중의 하나로 특정한 염기서열을 인식하여 절단하는 기능을 갖고 있으며, 다양한 유전자의 클로닝(cloning), RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism), SNP (Single Nucleotide Polymorphism) 등의 유전자형 분석(genotyping) 및 유전자 지도작성(physical mapping or genetic mapping) 등의 분야에 널리 사용되고 있다.

제한효소는 타입 Ⅰ과 타입 Ⅱ의 두 가지가 존재하는데, 두 가지 타입 모두 이중사슬의 DNA를 절단한다. 이들 중 타입 Ⅰ 제한효소는 인식한 서열로부터 떨어져 있는 비특이적 서열 부위를 절단하는 반면, 타입 Ⅱ 제한효소는 대상 유전자의 특정 서열을 인식하고 그 특정 서열 혹은 이와 인접한 서열을 절단한다. 따라서, 타입 Ⅱ 제한효소는 분자 클로닝, 유전자 지도작성 및 유전자 서열분석 등의 생물학적 기법에서 매우 큰 유용성을 갖는다(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook et al. 2nd Ed. 1989).

제한효소 반응을 위해서는 필요한 농도의 제한효소, 해당 제한효소에 최적화된 반응용 완충용액 및 대상 유전자를 최종 반응 부피까지 첨가 및 희석한 후 해당 제한효소의 활성에 최적화된 온도에서 일정시간 반응시킨다. 이때, 반응용 완충용액은 특정 pH의 완충용액(Tris-HCl, Tris-Acetate 등), MgCl₂, 염류(NaCl, potassium acetate 등), DTT, BSA 등을 포함하며, 반응의 목적과 대상유전자의 양에 따라 제한효소의 농도 및 부피를 결정하여 첨가한다.

제한효소를 비롯한 단백질의 안정적인 보관을 위해서는 다양한 방법들이 이용되어 왔다. 단백질은 수용액 상태에서 상대적으로 불안정하므로, 화학적 물리적 감성(degradation)을 일으켜 처리 및 보관과정에서 그 생물학적 활성이 상실될 수 있다(Manning, et al. (1989), Pharm. Res., 6:903-918). 일반적으로 단백질을 장기보관시에는 이를 안정화시키기 위해 여러가지 방식이 이용되는데, 이러한 방법들 중, 동결건조방식에 의해 단백질, 특히 제한효소를 보관하는 경우에는 일부 제한효소들이 동결과 해동과정에서 그 활성을 잃게 되는 문제점이 있다.

단백질을 보관하기 위한 다른 방법으로는, 현재 상업적으로 가장 많이 이용되는 방식으로 -20℃ 이하의 온도에서 보관하기 위해 상당량의 글리세롤(glycerol) 을 넣은 보존용 완충용액을 사용하는 저온보관 방식이 있다. 제한효소의 경우 통상 50% 글리세롤 상태의 "보존용 완충용액"(이때, "보존용 완충용액"은 상기한 "반응용 완충용액"과 구분되는 개념으로 사용되었음)이 이용되며, 첨가된 글리세롤은 -20℃의 온도에서 용액의 빙점을 낮추어 효소의 동결을 방지해 주고, 그 이하의 온도에서 동결시에 수용액의 대부분을 차지하는 물분자가 날카로운 결정구조를 이루면서 효소의 구조를 파괴하는 것을 막아주는 역할을 한다. 그러나, 종래의 50%의 글리세롤을 포함하는 보관 방법에서는 글리세롤의 효소반응 저해작용 때문에 즉각적으로 사용할 수 있는 제한효소 조성물을 구성하는 것이 불가능하다.

한편, 제한효소는 회사별로 제공하는 해당 제한효소에 최적화된 반응용 완충용액을 선택하여 냉동상태의 완충용액을 해동한 후, 3차 증류수 및 대상 유전자를 첨가하고, 적정량의 제한효소를 첨가한 후 혼합하여 반응시킨다. 이 과정에서 반응용 완충용액을 선택할 때의 오류 발생 가능성, 냉동 보관상태에서 완충용액을 해동할 때의 불필요한 시간 소모, 여러 혼합과정에서의 오류 및 시료간의 오염 발생 가능성 및 혼합 배치(batch)별 혼합물간의 편차 발생으로 인한 실험의 재현성 감소 등과 같은 문제점이 발생할 가능성이 상존한다(대한민국특허 공고번호 제0162270호 참조).

본 발명은 상기와 같은 종래 제한효소 보관 및 사용상의 문제점들을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 제한효소 반응용 혼합물을 사용에 편리한 일정 단위의 양으로 분리하여 분주하고, 미리 혼합한 후 건조과정을 거침으로써, 제한효소의 안 정적인 보관과 더불어 사용시의 편의성을 도모하고 신속한 반응준비를 가능하게 하는 건조 제한효소 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 제한효소, 반응용 완충용액 및 안정화 물질을 포함하는 용액 조성물을 건조하여 얻어진 건조 제한효소 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 제한효소에 반응용 완충용액 및 안정화 물질을 첨가한 후 건조시킴으로써 제조되는 상기 건조 제한효소 조성물의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 건조 제한효소 조성물을 포함하는 키트를 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 제한효소, 반응용 완충용액 및 안정화 물질을 포함하는 용액 조성물을 건조하여 얻어진 건조 제한효소 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서, 사용할 수 있는 제한효소는 특별히 한정되는 것은 아니며, 시판되는 임의의 제한효소를 사용할 수 있고, 그 예로는 BamH Ⅰ, EcoR Ⅰ, Hind Ⅲ, Kpn Ⅰ, Nco Ⅰ, Nde Ⅰ, Pst Ⅰ, Sac Ⅰ, Sal Ⅰ, Sma Ⅰ, Xba Ⅰ, Xho Ⅰ 등이 있다. 본 발명의 조성물에 있어서, 제한효소의 함량은 특별히 한정되지 않으며, 반응 조건에 따라 당해 분야에서 사용되고 있는 적절한 함량으로 조정하여 사용할 수 있다.

상기 반응용 완충용액은 제한효소를 제공하는 회사별로 그 종류가 수종으로 정해져 있으며, 사용하는 제한효소에 따라 지정된 완충용액을 사용하는 것이 바람 직하다. 예컨대, 본 발명의 바람직한 실시예에서는 MgCl₂, NaCl 및 DTT를 서로 다른 함량으로 포함하는 4 종류의 반응용 완충용액과, 트리스-아세테이트, 마그네슘 아세테이트 및 칼륨 아세테이트를 포함하는 1 종류의 반응용 완충용액을 상기 반응용 완충용액으로 사용하였지만, 사용하는 제한효소의 활성 및/또는 안정성에 영향을 미치지 않는 범위내에서 적당한 반응용 완충용액을 선택사용해도 된다. 본 발명에서는 특정 제한효소에 가장 적합한 반응용 완충용액을 미리 첨가해 둠으로써 사용자가 완충용액의 선택 및 농도 조절의 오류를 방지할 수 있다. 상기 반응용 완충용액의 함량은 대응하는 제한효소에 따라 적절하게 설정할 수 있으며, 특정한 함량으로 제한되는 것은 아니다.

또한, 제한효소의 안정화를 위해 사용되는 안정화 물질로는 탄수화물, 다가 알코올, 수용성 합성중합체 및 단백질로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상을 사용할 수 있다. 상기 안정화 물질은 제한효소의 건조시 물분자의 제거에 따라 효소의 구조가 파괴되는 것을 방지하는 역할을 한다. 이때, 안정화 물질로 탄수화물, 다가 알코올, 수용성 합성중합체 또는 단백질 등을 사용하게 되면, 이 물질들이 침강제로도 작용하게 되므로 반응 이후의 전기영동 과정에서 별도로 침강제를 첨가할 필요가 없다는 장점이 있다.

상기에서, 탄수화물은 단당류, 이당류, 다당류 및 이들의 유도체의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다. 상기 단당류 및 단당류의 유도체는 아라비노스(arabinose), 자일로스(xylose), 라이속스(lysoxe), 라이보스(ribose), 자일룰로스(xylulose), 리그로스(ligrose), 갈락토스(galactose), 글루코스(glucose), 만노스(mannose), 소르보스(sorbose), 프럭토스(fructose), 아라비톨(arabitol), 자일리톨(xylitol), 갈락티톨(galactitol), 솔비톨(sorbitol), 만니톨(mannitol), 메틸글루코피라노시드(methyl glucopyranoside) 등이 사용될 수 있으나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 이당류 및 이당류의 유도체는 트레할로스(trehalose), 자일로비오스(xylobiose), 말토스(maltose), 이소말토스(isomaltose), 라미나리비오스(laminaribiose), 셀로비오스(cellobiose), 젠티오비오스(gentiobiose), 락토스(lactose), 수크로스(sucrose) 등이 사용될 수 있으나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 다당류 및 다당류의 유도체는 피콜(Ficoll), 셀룰로오스(cellulose), 녹말(starch), 글리코겐(glycogen), 키틴(chitin), 펙틴(pectin), 카로닌황산, 콘드로이틴황산 A(chondroitin sulfate A), 히알루론산(hyaluronic acid), 갈락탄(galactan), 알긴산(alginic acid) 등이 사용될 수 있으나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.

제한효소 반응용 혼합물은 건조 후 단기 또는 장기보관 후 사용되는데, 사용 시에는 최종반응부피가 되도록 대상 기질유전자 용액 및 멸균된 3차 증류수를 가하여 용해한 후 반응시킨다. 상기 탄수화물은 제한효소, 반응용 완충용액 및 안정화 물질을 포함하는 용액 조성물 총 100 부피에 대해 0.1 내지 50중량부의 함량으로 첨가한 후 건조시키는 것이 바람직하며, 0.5 내지 20중량부의 함량으로 첨가하는 것이 보다 바람직하다. 상기 탄수화물이 용액 조성물 총 100 부피에 대해 0.1 이하 중량부의 함량으로 첨가되는 경우 건조시 대상 제한효소와 표면 물분자를 충분 히 코팅하여 보호할 수 없기 때문에 효율적인 효소의 안정화 효과를 기대하기 어렵다. 또한, 건조시 음압에 의해 용액의 끓는 효과가 나타나는데, 탄수화물의 함량이 너무 낮은 경우 또는 용액의 점도가 너무 낮은 경우에는 용액이 터지게 되어 튜브 바닥면 전체에 넓게 퍼지면서 건조되는 이상적인 형태로 건조되지 못하는 문제점과 효소가 충분히 보호되지 못하는 문제점이 나타난다. 한편, 상기 탄수화물이 용액 조성물 총 100 부피에 대해 50 이상 중량부의 함량으로 첨가되는 경우에는 탄수화물 자체의 용해도로 인해 수용액으로 용해하기 어려우며, 높은 점도로 인해 충분한 혼합이 이루어지기 어렵고, 건조후 형성되는 건조물의 부피가 필요 이상으로 커지며, 제한효소 반응을 위해 유전자 용액과 멸균된 증류수로 용해시 용해가 쉽게 되지 않는다. 또한, 제한효소 반응시 고농도의 탄수화물이 반응 저해제로 작용할 수 있다는 문제점이 있다. 본 명세서에 있어서, 함량비는 용질의 중량/총 용액의 부피, 즉 w/v으로 표기시의 수치이다.

또한, 상기 다가 알코올은 솔비톨(sorbitol), 이노시톨(inositol), 만니톨(mannitol), 자일리톨(xylitol), 글리세롤(glycerol), 에틸렌글리콜(ethylene glycol), 트레이톨(threitol), 아라비톨(arabitol), 갈락시톨(galactitol) 등이 사용될 수 있으나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 글리세롤은 종래의 효소 용액의 저온 보관 방법에서 사용되는 글리세롤과는 상이한 용도로 사용되며 상이한 기능을 한다. 종래의 효소의 보관방법은 효소 용액을 저온, 즉 -70℃ 내지 4℃에서 보관하며, 이때 수용액의 동결에 의한 효소구조파괴를 막기 위해 효소 용액내에 글리세롤의 농도가 고농도(통상 50%)가 되 도록 용액을 조성한다. 고농도의 글리세롤을 포함한 효소 용액은 저온에서도 쉽게 동결되지 않으며, 동결되더라도 글리세롤 분자가, 동결되어 날카로운 결정을 형성하는 물분자로부터 효소분자를 보호한다. 즉, 종래의 보관방법에서의 글리세롤의 역할은 효소 용액의 저온보관시의 동결방지 등을 통한 효소의 안정화이다. 그러나, 본 발명에서 제한효소 반응용 혼합물의 안정화 물질로 포함된 글리세롤은 제한효소 반응용 혼합물에 포함되어 상기 혼합물의 건조시에 제한효소의 표면 물분자(surface water)의 제거에 따라 효소의 구조가 파괴되는 것을 방지하기 위한 "안정화 물질"의 용도로 사용된다. 또한, 건조후의 혼합물의 단기 또는 장기간의 보관시에 효소의 안정성을 유지하는데 도움을 주는 물질로서 사용된다. 즉, 본 발명에서의 글리세롤 등의 다가 알코올의 역할은 효소 용액의 건조시 및 이후 보관시의 효소분자의 변성을 방지하여 효소를 안정화시키는 것이다.

제한효소 반응용 혼합물은 건조 후 단기 또는 장기보관 후 사용되는데, 사용 시에는 최종반응부피가 되도록 대상 기질유전자용액 및 멸균된 3차 증류수를 가하여 용해한 후 반응시킨다. 상기 다가 알코올은 용액 조성물 총 100 부피에 대해 0.1 내지 50중량부의 함량으로 첨가한 후 건조시키는 것이 바람직하며, 0.5 내지 20중량부의 함량으로 첨가하는 것이 보다 바람직하다. 상기 다가 알코올이 용액 조성물 총 100 부피에 대해 0.1 이하 중량부의 함량으로 첨가되는 경우 건조시 대상 제한효소와 표면 물분자를 충분히 코팅하여 보호할 수 없기 때문에 효율적인 효소의 안정화 효과를 기대하기 어렵다. 또한, 건조시 음압에 의해 용액의 끓는 효과가 나타나는데, 다가 알코올의 함량이 너무 낮은 경우 또는 용액의 점도가 너무 낮은 경우에는 용액이 터지게 되어 튜브 바닥면 전체에 넓게 퍼지면서 건조되는 이상적인 형태로 건조되지 못하는 문제점과 효소가 충분히 보호되지 못하는 문제점이 나타난다. 한편, 상기 다가 알코올이 용액 조성물 총 100 부피에 대해 50 이상 중량부의 함량으로 첨가되는 경우에는 다가 알코올 자체의 용해도로 인해 수용액으로 용해하기 어려우며, 높은 점도로 인해 충분한 혼합이 이루어지기 어렵고, 건조후 형성되는 건조물이 부피가 필요 이상으로 커지며, 제한효소 반응을 위해 유전자 용액과 멸균된 증류수로 용해시 용해가 쉽게 되지 않는다. 또한, 제한효소 반응시 고농도의 다가 알코올이 반응 저해제로 작용할 수 있다는 문제점이 있다.

또한, 상기 수용성 합성중합체는 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol), 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrrolidone), 폴리아크릴산(poly(acrylic acid)), 폴리포스페이트(polyphosphate) 등이 사용될 수 있으나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.

제한효소 반응용 혼합물은 건조 후 단기 또는 장기보관 후 사용되는데, 사용 시에는 최종반응부피가 되도록 대상 기질유전자용액 및 멸균된 3차 증류수를 가하여 용해한 후 반응시킨다. 상기 수용성 합성중합체는 용액 조성물 총 100 부피에 대해 0.1 내지 50중량부의 함량으로 첨가한 후 건조시키는 것이 바람직하며, 0.5 내지 20중량부의 함량으로 첨가하는 것이 보다 바람직하다. 상기 수용성 중합체가 용액 조성물 총 100 부피에 대해 0.1 이하 중량부의 함량으로 첨가되는 경우에는 건조시 대상 제한효소와 표면 물분자를 충분히 코팅하여 보호할 수 없기 때문에 효율적인 효소의 안정화 효과를 기대하기 어렵다. 또한, 건조시 음압에 의해 용액의 끓는 효과가 나타나는데, 수용성 중합체의 함량이 너무 낮은 경우 또는 용액의 점도가 너무 낮은 경우에는 용액이 터지게 되어 튜브 바닥면 전체에 넓게 퍼지면서 건조되는 이상적인 형태로 건조되지 못하는 문제점과 효소가 충분히 보호되지 못하는 문제점이 나타난다. 한편, 상기 수용성 중합체가 용액 조성물 총 100 부피에 대해 50 이상 중량부의 함량으로 첨가되는 경우에는 수용성 중합체 자체의 용해도로 인해 수용액으로 용해하기 어려우며, 높은 점도로 인해 충분한 혼합이 이루어지기 어렵고, 건조후 형성되는 건조물이 부피가 필요 이상으로 커지며, 제한효소 반응을 위해 유전자 용액과 멸균된 증류수로 용해시 용해가 쉽게 되지 않는다. 또한, 제한효소 반응시 고농도의 수용성 중합체가 반응 저해제로 작용할 수 있다는 문제점이 있다.

또한, 상기 단백질은 포스비틴(phosvitin), 알부민(albumin), 젤라틴(gelatin), 아세틸레이트화 알부민(acetylated albumin) 등이 바람직하지만, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.

제한효소 반응용 혼합물은 건조 후 단기 또는 장기보관 후 사용되는데, 사용 시에는 최종반응부피가 되도록 대상 기질유전자용액 및 멸균된 3차 증류수를 가하여 용해한 후 반응시킨다. 상기 단백질은 용액 조성물 총 100 부피에 대해 0.01 내지 10중량부의 함량으로 첨가한 후 건조시키는 것이 바람직하며, 0.01 내지 2중량부의 함량으로 첨가하는 것이 보다 바람직하다. 상기 단백질이 용액 조성물 총 100 부피에 대해 0.01 이하 중량부의 함량으로 첨가되는 경우에는 건조시 대상 제한효소와 표면 물분자를 충분히 코팅하여 보호할 수 없기 때문에 효율적인 효소의 안정화 효과를 기대하기 어렵다. 또한, 건조시 음압에 의해 용액의 끓는 효과가 나타나는데, 단백질의 함량이 너무 낮은 경우 또는 용액의 점도가 너무 낮은 경우에는 용액이 터지게 되어 튜브 바닥면 전체에 넓게 퍼지면서 건조되는 이상적인 형태로 건조되지 못하는 문제점과 효소가 충분히 보호되지 못하는 문제점이 나타난다. 한편, 상기 단백질이 용액 조성물 총 100 부피에 대해 10 이상 중량부의 함량으로 첨가되는 경우에는 단백질 자체의 용해도로 인해 수용액으로 용해하기 어려우며, 높은 점도로 인해 충분한 혼합이 이루어지기 어렵고, 건조후 형성되는 건조물이 부피가 필요 이상으로 커지며, 제한효소 반응을 위해 유전자 용액과 멸균된 증류수로 용해시 용해가 쉽게 되지 않는다. 또한, 제한효소 반응시 고농도의 단백질이 반응 저해제로 작용할 수 있다는 문제점이 있다.

한편, 본 발명의 건조 제한효소 조성물은 제한효소, 반응용 완충용액 및 안정화 물질 외에 침강제 또는 수용성 염료중 1종 이상을 추가로 포함할 수도 있다.

제한효소 반응산물의 분석은 통상적으로 아가로스젤 전기영동을 통해 이루어지는데, 아가로스젤에의 시료주입용 완충용액을 각각의 시료에 대해 첨가 및 혼합 및 선택적으로 혼합후의 간략한 원심분리 과정(spin-down 과정)이 필요하다. 선택적인 간략한 원심분리 과정은 혼합시 용액이 튜브의 내측 벽면 등으로 튀는 경우 등에 더욱 필요하다. 시료주입용 완충용액에는 통상적으로 침강제, 수용성 염료의 성분이 포함된다(Molecular Cloning, 3rd Ed., Sambrook and Russell, A1.18 - A1.19). 상기 침강제는 시료를 아가로스젤에 주입시 및 전기영동시 시료용액 전체의 밀도를 높여주어, 시료의 주입시 신속하게 안정적으로 시료 용액이 아가로스젤 의 주입요면(well)에 침강되도록 하는 역할을 한다. 참고로, 시료용액의 밀도는 전기영동용의 완충용액의 밀도와 거의 같기 때문에 침강제가 포함되지 않은 시료는 아가로스젤에 주입시 신속하고 쉽게 침강되지 않기 때문에 지연된 시간동안 전기영동용의 완충용액에 확산 및 희석되어 대부분의 대상 시료가 유실된다.

상기 수용성 염료는 전기영동시에 시료내의 유전자의 아가로스젤내에서의 이동을 확인할 수 없기 때문에, 수용성 염료의 이동을 육안으로 확인하여 유전자의 대략적인 이동 및 분리 위치를 추정하기 위해 첨가된다. 특정 수용성 염료는 특정 크기의 유전자와 유사한 이동속도를 갖기 때문에 실험자는 이를 통해 대상 유전자들의 이동 및 분리 위치를 추정할 수 있다. 참고로, 수용성 염료가 첨가되지 않은 시료는 전기영동 시 대상 유전자의 시간에 따른 이동위치를 추정할 수 있는 용이한 방법이 없다.

본 발명의 침강제 또는 수용성 염료 중 1종 이상이 첨가된 건조 제한효소 조성물은 다음의 이점을 갖는다.

1. 수용성 염료가 추가되어 있기 때문에 시료의 혼합과정에서 반응액이 완전하게 혼합되는지 여부를 육안으로 쉽게 확인할 수 있다.

2. 아가로스젤 전기영동을 위해서는 각각의 시료에 대해 상기의 첨가 및 혼합 및 간략한 원심분리 과정이 필요한데, 이를 생략할 수 있기 때문에 시료간의 교차오염을 피할 수 있다.

3. 다수 또는 상당수량의 시료를 동시에 처리하는 경우 실험자의 단순 반복작업을 생략하여 신속한 실험수행에 유의한 효과를 갖는다.

4. 각각의 시료에 시료주입용 완충용액을 첨가하는 과정에서 발생할 수 있는 시료간의 편차를 방지하여, 특히 다수 또는 상당수의 시료를 분석하여 정량적인 결과를 도출해내야 하는 경우에 시료간의 편차발생을 방지하여 정확한 정량적인 결과를 얻을 수 있도록 한다.

5. 부가적으로, 다수 또는 상당수량의 시료를 동시에 처리시 실험자의 실수에 의해 시료주입용 완충용액을 미첨가하는 경우 시료를 유실하는 경우가 발생하는데 이를 원천적으로 방지한다.

상기 침강제는 탄수화물, 다가 알코올, 수용성 합성중합체 또는 단백질 등이 사용되는 것이 바람직하지만, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 침강제는 용액 조성물 총 100 부피에 대해 0.5 내지 30 중량부의 함량으로 첨가한 후 건조시키는 것이 바람직하며, 2 내지 20 중량부의 함량으로 첨가하는 것이 보다 바람직하다. 상기 침강제가 용액 조성물 총 100 부피에 대해 0.5 이하 중량부의 함량으로 첨가되는 경우에는 제한효소 반응 후의 분석을 위한 아가로스젤 전기영동시 시료의 점도가 충분하지 않아 효과적인 시료의 침강이 불가능하다는 문제점이 있다. 상기 침강제가 용액 조성물 총 100 부피에 대해 30 이상 중량부의 함량으로 첨가되는 경우에는 침강제 자체의 용해도에 따라 쉽게 용해가 되지 않을 수 있으며, 제한효소 반응시 고농도의 침강제가 반응 저해제로 작용할 수 있다는 문제점이 있다. 또한, 아가로스젤로의 침강이 이루어진 후 전기영동시 시료의 이동을 방해할 수 있다는 문제점이 있다.

또한, 상기 수용성 염료로는 브로모페놀 블루(bromophenol blue), 자일렌시 아놀(xylene cyanole), 브로모크레졸 레드(bromocresol red) 또는 크레졸 레드(cresol red) 등으로부터 선택될 수 있고, 이중에서도 자일렌시아놀을 사용하는 것이 바람직하지만, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 수용성 염료는 용액 조성물 총 100 부피에 대해 0.00001 내지 10 중량부의 함량으로 첨가한 후 건조시키는 것이 바람직하며, 0.001 내지 0.1 중량부의 함량으로 첨가하는 것이 보다 바람직하다. 상기 수용성 염료가 용액 조성물 총 100 부피에 대해 0.00001 이하 중량부의 함량으로 첨가되는 경우에는 제한효소 반응 후의 분석을 위한 아가로스젤 전기영동시 염료의 농도가 낮아 시료의 이동을 육안으로 관측하기 어렵다는 문제점이 있다. 상기 수용성 염료가 용액 조성물 총 100 부피에 대해 10 이상 중량부의 함량으로 첨가되는 경우에는 제한효소 반응시 고농도의 수용성 염료가 반응 저해제로 작용할 수 있다는 문제점이 있다. 또한, 아가로스젤로의 침강이 이루어진 후 전기영동시 시료의 이동을 방해할 수 있다는 문제점이 있다.

본 발명의 건조 제한효소 조성물은 적절한 "보관용기"에 담겨진 형태로 제공될 수 있다. 상기 보관용기는 제한효소 조성물의 시판을 위해 이를 담고 있는 용기를 의미하는 것으로서, 폴리프로필렌 등의 합성수지 용기인 것이 바람직하지만 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 건조 제한효소 조성물은 제한효소의 반응에 필요한 성분들을 미리 혼합하여 건조시켜 놓음으로써, 종래의 제한효소 보관 방법에 비해 다음과 같은 이점을 갖는다:

1. 제한효소 반응용 혼합물을 사용에 편리한 일정한 단위의 양으로 분리하여 분주하고, 미리 혼합하여 안정적으로 보존 및 보관함으로써 사용시의 편의성과 더불어 신속한 반응준비를 가능하게 한다.

2. 반응용 완충용액을 미리 혼합해 놓음으로써, 반응용 완충용액 선택시의 오류를 원칙적으로 차단할 수 있다.

3. 건조 상태로 보관되므로 냉동보관된 경우와 비교하여 완충용액의 해동에 소모되는 시간도 필요치 않으며, 사용시 제한효소의 작용을 저해할 수 있는 보존용 완충용액 성분이 함유되어 있지 않다.

4. 액체 상태로 보관되는 제한효소 용액과 시료를 혼합하는 과정에서의 오염 및 온도에 따른 활성저하를 방지한다.

5. 제한효소 활성의 안정성을 높여, 장기간의 용이한 보관이 가능하다.

6. 제한효소 반응용 혼합물의 대량 생산이 가능하므로, 각 혼합물간의 편차를 최소화하여 반응용 혼합물의 재현성을 높일 수 있다.

7. 제한효소 반응용 혼합물을 일정 단위의 양으로 분리함으로써, 유전자 진단용 키트나 질병 진단용 키트 구성시 사용목적에 맞는 제한효소 제품의 구성을 가능하게 한다.

또한, 본 발명은 제한효소에 반응용 완충용액 및 안정화 물질을 첨가시킨 용액을 준비한 후, 이를 건조시키는 단계를 포함하는 상기 건조 제한효소 조성물의 제조방법을 제공한다.

상기에서, 안정화 물질은 탄수화물, 다가 알코올, 수용성 합성중합체 및 단 백질 등으로부터 선택되는 1종 이상을 사용할 수 있다.

본 발명에 있어서, 건조 제한효소 조성물은 상기 제한효소를 포함하고 있는 반응용 완충용액을 합성수지 용기, 바람직하게는 폴리프로필렌 용기에 소정량으로 분주한 후 각 용기에 1종 이상의 안정화 물질을 첨가하고, 이어서 각 용기를 건조시키는 단계를 거쳐 제조될 수 있으며, 다른 한편으로는 제한효소 용액에 1종 이상의 안정화 물질을 첨가한 혼합 용액을 먼저 제조한 후 이를 합성수지 용기에 분주한 후 건조시키는 단계를 거쳐도 무방하다. 상기에서, 합성수지 용기는 플레이트, 튜브 또는 병과 같은 다양한 형태일 수 있으며, 특별한 형태에 한정되는 것은 아니다.

또한, 본 발명의 건조 제한효소 조성물은 상기 제한효소 용액에 침강제 및/또는 수용성 염료 물질을 유효량 첨가한 후 건조시켜 제조할 수도 있다. 상기에서, 침강제는 탄수화물, 다가 알코올, 수용성 합성중합체 또는 단백질 등이 사용되는 것이 바람직하지만, 반드시 이에 한정되는 것은 아니며, 수용성 염료 물질은 브로모페놀 블루, 자일렌시아놀, 브로모크레졸 레드, 크레졸 레드 등의 수용성 염료가 사용될 수 있으며, 이중에서도 자일렌시아놀을 사용하는 것이 바람직하다.

건조시의 조건은 특별히 한정되는 것은 아니지만, -70℃ 내지 50℃, 바람직하게는 상온의 온도에서 10 Torr 내지 0.00001 Torr의 감압하, 바람직하게는 0.1 Torr 내지 0.0001 Torr의 감압하에서 40 내지 240분, 바람직하게는 60분간 수행된다. 상기 건조조건은 안정화 물질의 종류에 관계없이 공통적으로 적용될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 건조 제한효소 조성물을 포함하는 용기 및 상기 용기 를 포함하는 키트를 제공한다. 상기 "용기"는 본 발명의 건조 제한효소 조성물 제조 후 시판을 위하여 이를 담고 있는 용기를 의미하는 것으로, 폴리프로필렌 등의 합성수지 용기인 것이 바람직하나 반드시 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 키트는 분자생물학과 관련된 다양한 분야, 예를 들면 유전자 분석, 클로닝 또는 유전자 재조합 등의 용도에 광범위하게 제한없이 사용될 수 있다. 상기 건조 제한효소 조성물을 이용한 키트는, 예를 들면 유전자 클로닝 키트, 상세하게는 PCR 클로닝 키트 등의 구성품으로 사용이 가능하다. PCR 수행을 위한 PCR 키트, PCR 산물을 아가로즈 젤에서 확인 후 아가로즈 젤로부터 정제하는 아가로즈 젤 정제 키트, PCR 산물을 직접 정제할 수 있는 PCR 정제 키트, PCR 산물과 벡터를 라이게이션하는 건조 라이게이즈 조성물 키트 등을 조합하여 PCR 클로닝 키트와 같이 종합적인 키트의 구성품으로 사용할 수 있다. 건조 제한효소 조성물을 키트의 구성품으로 사용할 경우 제품의 수송 동안의 실온 보관이 용이하여 수송 비용의 절감을 기대할 수 있다.

이하, 본 발명을 구체적인 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

건조 제한효소 조성물의 제조/건조 및 가혹조건에서의 보관 후 활성 측정

1. 안정화 물질로 단당류 및 단당류의 유도체를 사용하는 경우

<실시예 1> 솔비톨

<1-1> 제한효소 반응용 혼합물의 제조 및 건조

12 품목의 제한효소에 대해서 표 1의 조성에 따라 4종의 용액(제한효소 용액, 반응용 완충용액, 안정화물질(솔비톨) 용액, 수용성 염료(자일렌 시아놀 FF) 용액)을 혼합하여 제한효소 반응용 혼합물을 제조하였다. 표 1에서 사용된 반응용 완충용액의 최종농도는 표 2에 표기되어 있다. 제한효소 반응용 혼합물은 건조 후 단기 또는 장기보관 후 제한효소 반응에 사용되는데, 사용 시에는 최종반응부피가 되도록 대상 기질유전자용액 및 멸균된 3차 증류수를 가하여 용해한 후 반응시킨다. 최종반응부피는 30 ㎕를 기준으로 하였으며, 표 1에 표기된 농도(안정화 물질: 5%, 수용성 염료: 0.005%) 및 표 2에 표기된 모든 mM 단위의 농도는 최종반응부피 30 ㎕를 기준으로 표기된 농도이다. 표기된 바와 같이 첨가된 솔비톨(안정화 물질)의 최종반응부피 대비 농도(w/v)는 5%이다. 신속한 건조를 위하여, 혼합된 제한효소 반응용 혼합물에는 최종반응부피 30 ㎕까지 희석하기 위한 멸균된 3차 증류수가 첨가되지 않았다. 따라서, 표 1에 표기된 '제한효소 반응용 혼합물의 부피(건조전)'는 상기 혼합된 4종의 용액의 부피의 합으로 8 ㎕이다(표 4 참조).

제한효소명	제한효소	반응용 완충용액	안정화 물질 (솔비톨, 50%(w/v) 수용액)	수용성 염료 (Xylene Cyanole FF, 0.15%(w/v) 수용액)	제한효소 반응용 혼합물의 부피 (건조전)	최종반응부피(건조후 용해 및 반응시의 부피)
BamH I (10U/㎕)	1㎕(=10U)	3㎕(타입 3)	3㎕(5%)	1㎕(0.005%)	8㎕	30㎕
EcoR I (10U/㎕)	1㎕(=10U)	3㎕(타입 1)	3㎕(5%)	1㎕(0.005%)	8㎕	30㎕
Hind III (3U/㎕)	1㎕(=3U)	3㎕(타입 1)	3㎕(5%)	1㎕(0.005%)	8㎕	30㎕
Kpn I (3U/㎕)	1㎕(=3U)	3㎕(타입 4)	3㎕(5%)	1㎕(0.005%)	8㎕	30㎕
Nco I (Bsp19 I) (3U/㎕)	1㎕(=3U)	3㎕(타입 1)	3㎕(5%)	1㎕(0.005%)	8㎕	30㎕
Nde I (FauND I) (3U/㎕)	1㎕(=3U)	3㎕(타입 2)	3㎕(5%)	1㎕(0.005%)	8㎕	30㎕
Pst I (3U/㎕)	1㎕(=3U)	3㎕(타입 5)	3㎕(5%)	1㎕(0.005%)	8㎕	30㎕
Sac I (Psp124B I) (3U/㎕)	1㎕(=3U)	3㎕(타입 3)	3㎕(5%)	1㎕(0.005%)	8㎕	30㎕
Sal I (3U/㎕)	1㎕(=3U)	3㎕(타입 5)	3㎕(5%)	1㎕(0.005%)	8㎕	30㎕
Sma I (3U/㎕)	1㎕(=3U)	3㎕(타입 2)	3㎕(5%)	1㎕(0.005%)	8㎕	30㎕
Xba I (3U/㎕)	1㎕(=3U)	3㎕(타입 5)	3㎕(5%)	1㎕(0.005%)	8㎕	30㎕
Xho I (Sfr274 I) (3U/㎕)	1㎕(=3U)	3㎕(타입 4)	3㎕(5%)	1㎕(0.005%)	8㎕	30㎕

	타입 1	타입 3	타입 4	타입 5
Tris-HCl	10 mM (pH 8.5)	10 mM (pH 7.6)	10 mM (pH 7.6)	50 mM (pH 7.6)
MgCl2	10 mM	10 mM	10 mM	10 mM
NaCl	100 M	50 mM	0 mM	100 mM
DTT	1 mM	1 mM	1 mM	1 mM
		타입 2
Tris-Acetate		33 mM (pH 7.9)
Magnesium Acetate		10 mM
Kalium Acetate		66 mM
DTT		1 mM

제조된 각 혼합물의 부피는 8 ㎕로서, 0.2 ㎖ PCR 튜브 또는 1.5 ㎖ 에펜도프(Eppendorf) 튜브에 분주하였다. 이를 감압건조기에서 0.0005 Torr의 감압하에 상온에서 1시간동안 건조시켜 튜브 밑면에 건조 제한효소 조성물을 얻었다.

건조된 제한효소 조성물은 각 튜브의 뚜껑을 닫은 후, 각 튜브의 상하를 수회 뒤집고, 강하게 각 튜브 겉면을 두드려(tapping) 건조가 완벽하게 이루어졌는지 확인하였다. 건조가 불완전한 경우 건조된 제한효소 조성물로부터 용액이 흘러내리는 것을 관찰할 수 있으며, 건조된 제한효소 조성물에 대해 용액이 흘러내리지 않음을 전체 튜브에 대해 확인하였다.

<1-2> 가혹조건에서의 보관

상기 건조 제한효소 조성물을 가혹조건에서 보관하여 안정화물질에 의한 제한효소의 안정화 효과를 확인하기 위하여, 가혹조건에서 보관하였다. 보관조건은 건조된 조성물을 포함하는 각 튜브의 뚜껑을 닫은 채로 50℃에서 48시간동안 보관하였다.

<1-3> 음성대조군

제한효소 반응용 혼합물의 조성과 건조여부에 따라서 5 종류의 음성대조군을 다음과 같이 제조하였다.

<1-3-1> 안정화 물질 미포함 및 건조 미시행 음성대조군

안정화 물질이 포함되지 않은 제한효소 반응용 혼합물을 제조하였다. 안정화 물질을 포함시키지 않은 것과 건조를 시행하지 않은 것을 제외하고는 상기 실시예 <1-1>과 동일한 방식으로 제조하였다. 이후, 가혹조건에서의 보관은 50℃에서 13시간을 시행하였으며, 기타 조건은 실시예 <1-2>와 동일하게 하였다.

<1-3-2> 안정화물질 미포함 음성대조군

안정화 물질이 포함되지 않은 제한효소 반응용 혼합물을 제조하였다. 안정화 물질을 포함시키지 않은 것을 제외하고는 상기 실시예 <1-1>과 동일한 방식으로 제조 및 건조하였다. 이후, 가혹조건에서의 보관을 시행하였다. 음성대조군 2는 50℃에서 48시간을 시행하였고, 음성대조군 3은 50℃에서 13시간을 시행하였다. 기타 조건은 실시예 <1-2>와 동일하게 하였다.

<1-3-3> 저온보관방식의 음성대조군

기존의 제한효소의 용액상의 저온보관방식과의 보관상의 안정성을 비교하기 위해, 50%(v/v)의 글리세롤을 포함하는 보존용 완충용액에 제한효소가 용해되어 저온 보관되는 보관방식에 따른 음성대조군에 대한 테스트를 하기와 같이 진행하였다. 종래 저온보관방식은 고농도의 글리세롤의 효소반응 저해작용 때문에 즉각적으로 사용할 수 있는 제한효소 조성물의 구성이 불가능하다. 이 비교 테스트는 글리세롤의 농도가 낮고, 반응용 완충용액이 첨가되어 즉각적인 사용이 가능한 제한효소 반응용 혼합물을, 안정화물질을 첨가한 후 건조하여 제조하고, 이 제한효소 반응용 혼합물이 기존의 저온 보관방식에 따른 제한효소 용액에 비해 동등 또는 그 이상의 효소안정성 효과를 가진다는 것을 확인하기 위해 시행하였다.

사용된 제한효소 용액은 표 1에 표기된 농도의 시료를 사용하였으며, 이는 실시예 <1-1>에서 첨가된 제한효소 용액과 동일한 시료이다. 제한효소 용액의 조성은 10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 50 mM KCl, 0.1 mM EDTA, 1 mM 2-머캅토에탄올, 50%(v/v) 글리세롤과 3 U/㎕ 또는 10 U/㎕의 제한효소이다. 12 품목의 제한효소용액을 각각 20 ㎕ 분취하여 사용하였으며, 이 용액에 여타 용액의 첨가없이, 실시예 <1-2> 가혹조건에서의 보관을 시행하였다. 이때, 음성대조군 4는 50℃에서 48시간을 시행하였고, 음성대조군 5는 50℃에서 13시간을 시행하였다.

<1-4> 활성확인

상기의 가혹조건에서 보관된 제한효소 조성물에 1 ㎍의 기질유전자가 포함된 28 ㎕의 3차증류수를 가하여 건조 제한효소 조성물을 완전히 용해시켰다. 이때, 사용된 기질유전자는 제한효소의 종류에 따라서, 람다(Lambda) DNA, 람다 DNA/Hind Ⅲ Digest, 람다 DNA/EcoR Ⅰ Digest 3품목 중 한 가지를 사용하였다. 용해된 반응혼합물을 표 3에 기재된 바와 같은 각 제한효소의 최적 활성온도에서 1시간 동안 반응시켰고, 이 반응결과물을 아가로즈 젤(TBE 버퍼 내의 0.7% 아가로즈)에서 120 V로 40분간 전기영동하였다. 음성대조군 1 내지 음성대조군 3에 대해서도 동일한 방식으로 용해 및 전기영동을 실시하였다(도 1: 음성대조군 1, 도 2: 음성대조군 2, 도 3: 음성대조군 3).

음성대조군 4 및 음성대조군 5에 대해서는 가혹조건에서의 보관과정을 거친 12종의 제한효소용액 각 1 ㎕에, 각 1 ㎍의 해당 기질유전자와, 해당 제한효소용 반응용 완충용액 (표 1 참조)을 각각 3 ㎕를 첨가하고, 멸균된 3차 증류수를 첨가하여 부피를 30 ㎕로 조정하였다. 이때, 사용된 기질유전자는 제한효소의 종류에 따라 람다(Lambda) DNA, 람다 DNA/Hind Ⅲ Digest, 람다 DNA/EcoR Ⅰ Digest 3품목 중 한 가지를 사용하였다. 용해된 반응혼합물을 표 3에 기재된 바와 같은 각 제한효소의 최적 활성온도에서 1시간 동안 반응시켰고, 이 반응결과물에 6 X 아가로스젤 주입용 완충용액을 각 6 ㎕를 첨가한 후, 아가로즈 젤(TBE 버퍼 내의 0.7% 아가로즈)에서 120 V로 40분간 전기영동하였다. 6 X 아가로스젤 주입용 완충용액의 조성은 0.01%(w/v) Xylene Cyanole FF (수용성 염료), 50mM EDTA (효소반응 저해제), 50%(v/v) Glycerol (침강제)이다. (도 4 : 음성대조군 4, 도 5 : 음성대조군 5)

그 결과, 도 6에서와 같이 제한효소 12 품목별로 0% ~ 100% 사이의 활성을 나타냄을 알 수 있으며, 제한효소의 12 품목 전체의 활성이 없어진 음성대조군 1(도 1) 및 음성대조군 2(도 2)에 비해 안정화 물질에 의한 제한효소의 활성 안정화 효과가 있음을 알 수 있다. 또한, 음성대조군 4(도 4)와 비교할 때, 제한효소 품목에 따라 차이를 나타내지만, 전체 품목에 대해 평균적으로 동등 또는 그 이상의 제한효소 안정화 효과를 가짐을 확인할 수 있다(표 5).

제한효소명	최적 활성온도
BamH I	37℃
EcoR I	37℃
Hind III	37℃
Kpn I	37℃
Nco I(Bsp19 I)	37℃
Nde I(FauND I)	37℃
Pst I	37℃
Sac I(Psp124B I)	37℃
Sal I	37℃
Sma I	25℃
Xba I	37℃
Xho I(Sfr274 I)	50℃

실시예	안정화물질	안정화물질수용액 농도 (%,w/v)	안정화물질수용액의 첨가부피 (㎕)	최종반응부피에 대한 안정화물질의 농도 (%,w/v)	제한효소 반응용 혼합물의 부피(건조전) (㎕)	최종반응부피 (건조후 용해 및 반응시의 부피) (㎕)
실시예 1	솔비톨	50	3	5	8	30
실시예 2	프럭토스	33.33	4.5	5	9.5	30
실시예 3	수크로스	50	3	5	8	30
실시예 4	트레할로스	34.2	4.39	5	9.39	30
실시예 5	피콜 400	25	6	5	11	30
실시예 6	이노시톨	12.5	12	5	17	30
실시예 7	폴리에틸렌 글리콜 8,000	25	6	5	11	30
실시예 8	알부민	2	9	0.6	14	30

<실시예 2> 프럭토스

안정화물질로서 프럭토스를 최종반응부피 대비 5%(w/v)로 사용하였으며, 제한효소 반응용 혼합물(건조전)의 부피는 9.5 ㎕이고, 가혹조건을 50℃에서 13시간동안 적용했다. 이를 제외하고는 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 실험을 진행하였다(표 4).

그 결과, 도 7에서와 같이 제한효소 12 품목별로 0% ~ 100% 사이의 활성을 나타냄을 알 수 있으며, 50℃에서 13시간동안 보관으로 제한효소 12 품목 전체의 활성이 없어진 음성대조군 1(도 1), 음성대조군 3(도 3)에 비해 안정화 물질에 의한 제한효소의 활성 안정화 효과가 있음을 알 수 있다. 또한, 음성대조군 5(도 5)와 비교할 때, 제한효소 품목에 따라 차이를 나타내지만, 전체 품목에 대해 평균적으로 동등 또는 그 이상의 제한효소 안정화 효과를 가짐을 확인할 수 있다(표 5).

2. 안정화 물질로 이당류 및 이당류의 유도체를 사용하는 경우

<실시예 3> 수크로스

안정화물질로서 수크로스를 최종반응부피 대비 5%(w/v)로 사용하였으며, 제한효소 반응용 혼합물(건조전)의 부피가 8 ㎕인 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 실험을 진행하였다(표 4).

그 결과, 도 8에서와 같이 제한효소 12 품목별로 0% ~ 100% 사이의 활성을 나타냄을 알 수 있으며, 제한효소 12 품목 전체의 활성이 없어진 음성대조군 1(도 1), 음성대조군 2(도 2)에 비해 안정화 물질에 의한 제한효소의 활성 안정화 효과가 있음을 알 수 있다. 또한, 음성대조군 4(도 4)와 비교할 때, 제한효소 품목에 따라 차이를 나타내지만, 전체 품목에 대해 평균적으로 동등 또는 그 이상의 제한효소 안정화 효과를 갖음을 확인할 수 있다(표 5).

<실시예 4> 트레할로스

안정화물질로서 트레할로스를 최종반응부피 대비 5%(w/v)로 사용하였으며, 제한효소 반응용 혼합물(건조전)의 부피가 9.39 ㎕인 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 실험을 진행하였다(표 4).

그 결과, 도 9에서와 같이 제한효소 12 품목별로 0% ~ 100% 사이의 활성을 나타냄을 알 수 있으며, 제한효소 12 품목 전체의 활성이 없어진 음성대조군 1(도 1), 음성대조군 2(도 2)에 비해 안정화 물질에 의한 제한효소의 활성 안정화 효과가 있음을 알 수 있다. 또한, 음성대조군 4(도 4)와 비교할 때, 제한효소 품목에 따라 차이를 나타내지만, 전체 품목에 대해 평균적으로 동등 또는 그 이상의 제한효소 안정화 효과를 갖음을 확인할 수 있다(표 5).

3. 안정화 물질로 다당류 및 다당류의 유도체를 사용하는 경우

<실시예 5> 피콜 400

안정화물질로서 피콜 400을 최종반응부피 대비 5%(w/v)로 사용하였으며, 제한효소 반응용 혼합물(건조전)의 부피가 11 ㎕인 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 실험을 진행하였다(표 4).

그 결과, 도 10에서와 같이 제한효소 12 품목별로 0% ~ 100% 사이의 활성을 나타냄을 알 수 있으며, 제한효소 12 품목 전체의 활성이 없어진 음성대조군 1(도 1), 음성대조군 2(도 2)에 비해 안정화 물질에 의한 제한효소의 활성 안정화 효과가 있음을 알 수 있다. 또한, 음성대조군 4(도 4)와 비교할 때, 제한효소 품목에 따라 차이를 나타내지만, 전체 품목에 대해 평균적으로 동등 또는 그 이상의 제한효소 안정화 효과를 가짐을 확인할 수 있다(표 5).

4. 안정화 물질로 다가 알코올을 사용하는 경우

<실시예 6> 이노시톨

안정화물질로서 이노시톨을 최종반응부피 대비 5%(w/v)로 사용하였으며, 제한효소 반응용 혼합물(건조전)의 부피가 17 ㎕인 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 실험을 진행하였다(표 4).

그 결과, 도 11에서와 같이 제한효소 12 품목별로 0% ~ 100% 사이의 활성을 나타냄을 알 수 있으며, 제한효소 12 품목 전체의 활성이 없어진 음성대조군 1(도 1), 음성대조군 2(도 2)에 비해 안정화 물질에 의한 제한효소의 활성 안정화 효과가 있음을 알 수 있다. 또한, 음성대조군 4(도 4)와 비교할 때, 일부 품목에 대해서는 제한효소의 활성 안정화 효과가 낮지만, 일부 품목에 대해서는 동등 또는 그 이상의 제한효소 안정화 효과를 가짐을 확인할 수 있다(표 5).

5. 안정화 물질로 수용성 중합체를 사용하는 경우

<실시예 7> 폴리에틸렌 글리콜 8,000

안정화물질로서 폴리에틸렌 글리콜 8,000을 최종반응부피 대비 5%(w/v)로 사용하였으며, 제한효소 반응용 혼합물(건조전)의 부피가 11 ㎕인 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 실험을 진행하였다(표 4).

그 결과, 도 12에서와 같이 제한효소 12 품목별로 0% ~ 100% 사이의 활성을 나타냄을 알 수 있으며, 제한효소 12 품목 전체의 활성이 없어진 음성대조군 1(도 1), 음성대조군 2(도 2)에 비해 안정화 물질에 의한 제한효소의 활성 안정화 효과가 있음을 알 수 있다. 또한, 음성대조군 4(도 4)와 비교할 때, 제한효소 품목에 따라 차이를 나타내지만, 전체 품목에 대해 평균적으로 동등 또는 그 이상의 제한효소 안정화 효과를 갖음을 확인할 수 있다(표 5).

6. 안정화 물질로 단백질을 사용하는 경우

<실시예 8> 알부민

안정화물질로서 알부민을 최종반응부피 대비 0.6%(w/v)로 사용하였으며, 제한효소 반응용 혼합물(건조전)의 부피가 14 ㎕인 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 실험을 진행하였다(표 4).

그 결과, 도 13에서와 같이 제한효소 12 품목별로 0% ~ 100% 사이의 활성을 나타냄을 알 수 있으며, 제한효소 12 품목 전체의 활성이 없어진 음성대조군 1(도 1), 음성대조군 2(도 2)에 비해 안정화 물질에 의한 제한효소의 활성 안정화 효과가 있음을 알 수 있다. 또한, 음성대조군 4(도 4)와 비교할 때, 제한효소 품목에 따라 차이를 나타내지만, 전체 품목에 대해 평균적으로 동등 또는 그 이상의 제한효소 안정화 효과를 가짐을 확인할 수 있다(표 5).

	활성도(%)
제한효소명	실시예 1	실시예 2	실시예 3	실시예 4	실시예 5	실시예 6	실시예 7	실시예 8	음성대조군 1	음성대조군 2	음성대조군 3	음성대조군 4	음성대조군 5
BamH I	0%	100%	0%	0%	0%	0%	0%	0%	0%	0%	0%	0%	0%
EcoR I	40%	100%	100%	50%	50%	0%	50%	100%	0%	0%	0%	10%	100%
Hind Ⅲ	90%	100%	100%	100%	0%	20%	50%	0%	0%	0%	0%	100%	100%
Kpn I	0%	0%	0%	0%	0%	0%	0%	0%	0%	0%	0%	0%	0%
Nco I (Bsp19 I)	90%	100%	100%	100%	10%	10%	90%	90%	0%	0%	20%	0%	20%
Nde I (FauND I)	0%	0%	10%	0%	0%	0%	0%	0%	0%	0%	0%	0%	0%
Pst I	0%	10%	20%	10%	10%	0%	0%	80%	0%	0%	0%	0%	0%
Sac I (Psp124B I)	20%	100%	50%	20%	50%	50%	50%	100%	0%	0%	0%	100%	100%
Sal I	100%	90%	90%	90%	50%	0%	20%	0%	0%	0%	0%	0%	0%
Sma I	50%	50%	100%	50%	20%	20%	90%	0%	0%	0%	0%	0%	0%
Xba I	50%	100%	80%	50%	50%	20%	20%	90%	0%	0%	0%	20%	20%
Xho I (Sfr274 I)	50%	100%	50%	50%	50%	20%	20%	90%	0%	0%	0%	20%	20%

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 건조 제한효소 조성물은 제한효소 반응을 위해 각 구성성분을 혼합해야 하는 다단계 조작을 간편하게 하고, 반응 혼합물의 안정성을 증가시키며, 또한 실험의 재현성에 있어서의 신뢰도를 증가시키고, 각 성분간의 교차오염의 가능성을 제거시킴으로써, 유전자 분석, 질병진단, 유전자재조합 등의 다양한 분자생물학적 분야에 적용할 때 단시간내에 신뢰도가 높은 결 과를 얻을 수 있다.

Claims (24)

1. 제한효소, 제한효소반응용 완충용액 및 안정화 물질을 포함하는 용액 조성물을 건조하여 얻어진 조성물로서, 상기 안정화 물질은 하기 a) 내지 d)로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 건조 제한효소반응용 조성물:

   a) 단당류, 이당류, 다당류 및 이들의 환원 또는 축합반응에 의해 생성되거나 이들에 알킬기가 결합된 유도체의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 탄수화물,

   b) 솔비톨, 이노시톨, 만니톨, 자일리톨, 글리세롤, 에틸렌글리콜, 트레이톨, 아라비톨, 갈락티톨, 메틸글루코피라노시드 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 다가 알코올,

   c) 폴리에틸렌 글리콜, 폴리비닐피롤리돈, 폴리아크릴산, 폴리포스페이트 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 수용성 합성 중합체, 및

   d) 포스비틴, 알부민, 젤라틴, 아세틸레이트화 알부민 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 단백질.
2. 삭제
3. 삭제
4. 제 1항에 있어서,

   상기 단당류 및 그 유도체는 아라비노스, 자일로스, 라이속스, 라이보스, 자일룰로스, 리그로스, 갈락토스, 글루코스, 만노스, 소르보스, 프럭토스, 아라비톨, 자일리톨, 갈락티톨, 솔비톨, 만니톨, 메틸글루코피라노시드 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
5. 제 1항에 있어서,

   상기 이당류 및 그 유도체는 트레할로스, 자일로비오스, 말토스, 이소말토스, 라미나리비오스, 셀로비오스, 젠티오비오스, 락토스, 수크로스 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
6. 제 1항에 있어서,

   상기 다당류 및 그 유도체는 피콜, 셀룰로오스, 녹말, 글리코겐, 키틴, 펙틴, 카로닌황산, 콘드로이틴황산 A, 히알루론산, 갈락탄, 알긴산 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
7. 제 1항에 있어서,

   상기 탄수화물은 상기 용액 조성물 총 100 부피에 대해 0.1 내지 50중량부의 함량으로 첨가한 후 건조되는 것을 특징으로 하는 조성물.
8. 삭제
9. 제 1항에 있어서,

   상기 다가 알코올은 상기 용액 조성물 총 100 부피에 대해 0.1 내지 50중량부의 함량으로 첨가한 후 건조되는 것을 특징으로 하는 조성물.
10. 삭제
11. 제 1항에 있어서,

    상기 수용성 합성중합체는 상기 용액 조성물 총 100 부피에 대해 0.1 내지 50중량부의 함량으로 첨가한 후 건조되는 것을 특징으로 하는 조성물.
12. 삭제
13. 제 1항에 있어서,

    상기 단백질은 상기 용액 조성물 총 100 부피에 대해 0.01 내지 10중량부의 함량으로 첨가한 후 건조되는 것을 특징으로 하는 조성물.
14. 제 1항에 있어서,

    상기 조성물은 하기 a) 내지 d)로부터 선택되는 침강제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물:

    a) 단당류, 이당류, 다당류 및 이들의 환원 또는 축합반응에 의해 생성되거나 이들에 알킬기가 결합된 유도체의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 탄수화물,

    b) 솔비톨, 이노시톨, 만니톨, 자일리톨, 글리세롤, 에틸렌글리콜, 트레이톨, 아라비톨, 갈락티톨, 메틸글루코피라노시드 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 다가 알코올,

    c) 폴리에틸렌 글리콜, 폴리비닐피롤리돈, 폴리아크릴산, 폴리포스페이트 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 수용성 합성 중합체 및

    d) 포스비틴, 알부민, 젤라틴, 아세틸레이트화 알부민 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 단백질.
15. 제 14항에 있어서,

    상기 탄수화물은 아라비노스, 자일로스, 라이속스, 라이보스, 자일룰로스, 리그로스, 갈락토스, 글루코스, 만노스, 소르보스, 프럭토스, 아라비톨, 자일리톨, 갈락티톨, 솔비톨, 만니톨, 메틸글루코피라노시드, 트레할로스, 자일로비오스, 말토스, 이소말토스, 라미나리비오스, 셀로비오스, 젠티오비오스, 락토스, 수크로스, 피콜, 셀룰로오스, 녹말, 글리코겐, 키틴, 펙틴, 카로닌황산, 콘드로이틴황산 A, 히알루론산, 갈락탄, 알긴산 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 조성물.
16. 제 14항에 있어서,

    상기 침강제는 상기 용액 조성물 총 100 부피에 대해 0.5 내지 30 중량부의 함량으로 첨가한 후 건조되는 것을 특징으로 하는 조성물.
17. 제 1항 또는 제 14항에 있어서,

    상기 조성물은 브로모페놀 블루, 자일렌시아놀, 브로모크레졸 레드 및 크레졸 레드로 구성된 군으로부터 선택되는 수용성 염료를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
18. 삭제
19. 제 17항에 있어서,

    상기 수용성 염료는 상기 용액 조성물 총 100 부피에 대해 0.00001 내지 10 중량부의 함량으로 첨가한 후 건조되는 것을 특징으로 하는 조성물.
20. 제한효소를 준비하는 단계;

    상기 제한효소에 제한효소반응용 완충용액 및 안정화 물질을 첨가하는 단계; 및

    상기 결과물을 건조시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 건조 제한효소반응용 조성물의 제조방법으로서, 상기 안정화 물질은 하기 a) 내지 d)로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 제조방법:

    a) 단당류, 이당류, 다당류 및 이들의 환원 또는 축합반응에 의해 생성되거나 이들에 알킬기가 결합된 유도체의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 탄수화물,

    b) 솔비톨, 이노시톨, 만니톨, 자일리톨, 글리세롤, 에틸렌글리콜, 트레이톨, 아라비톨, 갈락티톨, 메틸글루코피라노시드 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 다가 알코올,

    c) 폴리에틸렌 글리콜, 폴리비닐피롤리돈, 폴리아크릴산, 폴리포스페이트 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 수용성 합성 중합체 및

    d) 포스비틴, 알부민, 젤라틴, 아세틸레이트화 알부민 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 단백질.
21. 제 20항에 있어서,

    상기 탄수화물은 아라비노스, 자일로스, 라이속스, 라이보스, 자일룰로스, 리그로스, 갈락토스, 글루코스, 만노스, 소르보스, 프럭토스, 아라비톨, 자일리톨, 갈락티톨, 솔비톨, 만니톨, 메틸글루코피라노시드, 트레할로스, 자일로비오스, 말토스, 이소말토스, 라미나리비오스, 셀로비오스, 젠티오비오스, 락토스, 수크로스, 피콜, 셀룰로오스, 녹말, 글리코겐, 키틴, 펙틴, 카로닌황산, 콘드로이틴황산 A, 히알루론산, 갈락탄, 알긴산 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 제조방법.
22. 제 20항에 있어서,

    침강제 또는 브로모페놀 블루, 자일렌시아놀, 브로모크레졸 레드 및 크레졸 레드로 구성된 군으로부터 선택되는 수용성 염료를 더 첨가한 후 건조시켜 제조되는 것을 특징으로 하는 건조 제한효소반응용 조성물의 제조방법으로서, 상기 침강제는 하기 a) 내지 d)로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 제조방법:

    a) 단당류, 이당류, 다당류 및 이들의 환원 또는 축합반응에 의해 생성되거나 이들에 알킬기가 결합된 유도체의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 탄수화물,

    b) 솔비톨, 이노시톨, 만니톨, 자일리톨, 글리세롤, 에틸렌글리콜, 트레이톨, 아라비톨, 갈락티톨, 메틸글루코피라노시드 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 다가 알코올,

    c) 폴리에틸렌 글리콜, 폴리비닐피롤리돈, 폴리아크릴산, 폴리포스페이트 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 수용성 합성 중합체 및

    d) 포스비틴, 알부민, 젤라틴, 아세틸레이트화 알부민 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 단백질.
23. 제 20항에 있어서,

    상기 건조는 -70℃ 내지 50℃의 온도, 10 Torr 내지 0.00001 Torr 의 감압하에서 40분 내지 240분간 수행되는 것을 특징으로 하는 건조 제한효소 조성물의 제조 방법.
24. 제 23항에 있어서,

    상기 건조는 상온의 온도, 0.1 Torr 내지 0.0001 Torr의 감압하에서 60분간 수행되는 것을 특징으로 하는 건조 제한효소 조성물의 제조방법.

Images