KR100857889B1 - 건조 라이게이즈 조성물 및 이의 제조 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 건조 라이게이즈 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 라이게이즈, 반응용 완충용액 및 안정화 물질을 혼합하고, 선택적으로는 침강제 및/또는 수용성 염료를 더 혼합한 혼합 용액을 건조시킴으로써 제조되는 건조 라이게이즈 조성물 및 이의 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명의 건조 라이게이즈 조성물은 라이게이션 반응을 위해 각 구성성분을 혼합해야 하는 다단계 조작을 간편하게 하고, 반응 혼합물의 안정성을 증가시키며, 또한 실험의 재현성에 있어서의 신뢰도를 증가시키고, 각 성분 간의 교차오염의 가능성을 제거시킴으로써, 유전자재조합, 유전자 클로닝, 폴리메라아제 연쇄 반응 클로닝 등의 다양한 분자생물학적 분야에 적용할 때 단시간 내에 신뢰도가 높은 결과를 얻을 수 있는 장점이 있다.

라이게이즈, 안정화 물질, 건조, 보관

Description

건조 라이게이즈 조성물 및 이의 제조 방법{Dried Ligase Composition and Method of Producing the Same}

도 1은 실시예 1에 개시된 다양한 안정화제를 첨가하여 제조한 건조 라이게이즈(ligase) 조성물로 50℃에서 5일간 보관한 후, 기질 유전자와 실온에서 한 시간동안 반응시켜 아가로스 젤에서 전기 영동한 사진으로서, 각 레인에 사용된 라이게이즈 조성물의 처리 상태는 표 3에 정리한 바와 같고, 각 레인에 사용된 기질 유전자는 람다 DNA/Hind Ⅲ 절편(1 ㎍)을 사용하였다.

도 2는 실시예 2에 개시된 3가지 안정화제를 조합하여 제조한 건조 라이게이즈 조성물로 50℃에서 5일간 보관한 후, 기질 유전자와 실온에서 한 시간동안 반응시켜 아가로스 젤에서 전기 영동한 사진으로서, 각 레인에 사용된 라이게이즈 조성물의 처리 상태는 표 5에 정리한 것과 같고, 각 레인에 사용된 기질 유전자는 람다 DNA/Hind Ⅲ 절편(1 ㎍)을 사용하였다.

도 3은 실시예 3에 개시된 라이게이즈 조성물을 건조 시킬 때, 건조 시간을 35분부터 70분까지 5분 간격으로 -20℃에서 1일(도 3의 A), 50℃에서 1일(도 3의 B), 50℃에서 3일(도 3의 C)을 각각 보관한 후, 기질 유전자와 상온에서 한 시간 동안 반응시켜 아가로스 젤에서 전기 영동한 사진으로서, 도 3의 각 레인에 사용된 라이게이즈 조성물의 처리 상태는 다음과 같고,

LH 레인: 람다 DNA/Hind Ⅲ 절편(1 ㎍),

레인 1: 35분간 건조, 레인 2: 40분간 건조, 레인 3: 45분간 건조,

레인 4: 50분간 건조, 레인 5: 55분간 건조, 레인 6: 60분간 건조,

레인 7: 65분간 건조, 레인 8: 70분간 건조,

LE 레인: 람다 DNA/EcoR V 절편(1 ㎍)

레인 9: 35분간 건조, 레인 10: 40분간 건조, 레인 11: 45분간 건조,

레인 12: 50분간 건조, 레인 13: 55분간 건조, 레인 14: 60분간 건조,

레인 15: 65분간 건조, 레인 16: 70분간 건조,

각 레인에 사용된 기질 유전자는 다음과 같다.

레인 1,2,3,4,5,6,7,8: 람다 DNA/Hind Ⅲ 절편(1 ㎍; cohesive-end ligation)

레인 9,10,11,12,13,14,15,16: 람다 DAN/EcoR V 절편(1 ㎍; blunt-end ligation)

도 4의 A는 실시예 4에 개시된 안정화제가 포함된 라이게이즈 조성물과 안정화제가 포함되지 않은 라이게이즈 조성물(음성 대조군)을 제조하여 건조 직후 50℃에서 각각 1일에서 7일간 보관 후, 기질 유전자와 실온에서 한 시간 동안 반응시켜 아가로스 젤에서 전기 영동한 사진으로, 각 레인에 사용된 라이게이즈 조성물의 처리 상태는 다음과 같고,

레인 1, 9; 람다 DNA/Hind Ⅲ 절편(1 ㎍)

레인 2; 50℃에서 1일 보관한 안정화제를 포함한 라이게이즈 조성물

레인 3; 50℃에서 2일 보관한 안정화제를 포함한 라이게이즈 조성물

레인 4; 50℃에서 3일 보관한 안정화제를 포함한 라이게이즈 조성물

레인 5; 50℃에서 4일 보관한 안정화제를 포함한 라이게이즈 조성물

레인 6; 50℃에서 5일 보관한 안정화제를 포함한 라이게이즈 조성물

레인 7; 50℃에서 6일 보관한 안정화제를 포함한 라이게이즈 조성물

레인 8; 50℃에서 8일 보관한 안정화제를 포함한 라이게이즈 조성물

레인 10; 50℃에서 1일 보관한 안정화제를 포함하지 않은 라이게이즈 조성물

레인 11; 50℃에서 2일 보관한 안정화제를 포함하지 않은 라이게이즈 조성물

레인 12; 50℃에서 3일 보관한 안정화제를 포함하지 않은 라이게이즈 조성물

레인 13; 50℃에서 4일 보관한 안정화제를 포함하지 않은 라이게이즈 조성물

레인 14; 50℃에서 5일 보관한 안정화제를 포함하지 않은 라이게이즈 조성물

레인 15; 50℃에서 6일 보관한 안정화제를 포함하지 않은 라이게이즈 조성물

레인 16; 50℃에서 7일 보관한 안정화제를 포함하지 않은 라이게이즈 조성물

각 레인에 사용된 기질 유전자는 람다 DNA/Hind Ⅲ 절편(1 ㎍)이다.

도 4의 B에서의 각 레인에 사용한 라이게이즈 조성물의 처리 상태는, 사용된 기질 유전자가 람다 DNA/EcoR V 절편(1 ㎍)인 것을 제외하고는 도 4의 A에서와 동일하며, 레인 1 및 레인 9는 람다 DNA/EcoR V 절편(1 ㎍)을 나타낸다.

도 5의 A는 실시예 5에 개시된 안정화제가 포함된 라이게이즈 혼합물과 안정화제가 포함되지 않은 라이게이즈 혼합물을 제조하여 건조하지 않고, -20℃에서 7일간, 50℃에서 각각 1일 내지 7일간 보관 후, 기질 유전자와 실온에서 한 시간 동 안 반응시켜 아가로스 젤에서 전기 영동한 사진으로, 각 레인에 사용된 라이게이즈 조성물의 처리 상태는 다음과 같고,

레인 1, 10; 람다 DNA/Hind Ⅲ 절편(1 ㎍)

레인 2; -20℃에서 7일 보관한 안정화제를 포함한 라이게이즈 혼합물

레인 3; 50℃에서 1일 보관한 안정화제를 포함한 라이게이즈 혼합물

레인 4; 50℃에서 2일 보관한 안정화제를 포함한 라이게이즈 혼합물

레인 5; 50℃에서 3일 보관한 안정화제를 포함한 라이게이즈 혼물물

레인 6; 50℃에서 4일 보관한 안정화제를 포함한 라이게이즈 혼합물

레인 7; 50℃에서 5일 보관한 안정화제를 포함한 라이게이즈 혼합물

레인 8; 50℃에서 6일 보관한 안정화제를 포함한 라이게이즈 혼합물

레인 9; 50℃에서 7일 보관한 안정화제를 포함한 라이게이즈 혼합물

레인 11; -20℃에서 7일 보관한 안정화제를 포함하지 않은 라이게이즈 혼합물

레인 12; 50℃에서 1일 보관한 안정화제를 포함하지 않은 라이게이즈 혼합물

레인 13; 50℃에서 2일 보관한 안정화제를 포함하지 않은 라이게이즈 혼합물

레인 14; 50℃에서 3일 보관한 안정화제를 포함하지 않은 라이게이즈 혼합물

레인 15; 50℃에서 4일 보관한 안정화제를 포함하지 않은 라이게이즈 혼합물

레인 16; 50℃에서 5일 보관한 안정화제를 포함하지 않은 라이게이즈 혼합물

레인 17; 50℃에서 6일 보관한 안정화제를 포함하지 않은 라이게이즈 혼합물

레인 18; 50℃에서 7일 보관한 안정화제를 포함하지 않은 라이게이즈 혼합물

각 레인에 사용된 기질 유전자는 람다 DNA/Hind Ⅲ 절편(1 ㎍)이다.

도 5의 B에서 각 레인에 사용한 라이게이즈 조성물 처리 상태는, 사용된 기질 유전자가 람다 DNA/EcoR V 절편(1 ㎍)인 것을 제외하고는 도 5의 A와 동일하고, 레인 1 및 레인 10은 람다 DNA/EcoR V 절편(1 ㎍)을 나타낸다.

도 6은 실시예 6에서 제조된 안정화제를 포함한 건조 라이게이즈 조성물을 -20℃에서 1일 보관한 후 최적의 라이게이션(ligation) 반응 시간을 측정하기 위해 기질 유전자와 시간별로 각각 반응시켜 아가로스 젤에서 전기 영동한 사진으로서, 각 레인에 사용된 라이게이즈 조성물의 처리 상태는 다음과 같고,

레인 1; 람다 DNA/Hind Ⅲ 절편(1 ㎍)

레인 2; 실온에서 60분간 라이게이션 반응시킨 라이게이즈 조성물

레인 3; 실온에서 50분간 라이게이션 반응시킨 라이게이즈 조성물

레인 4; 실온에서 40분간 라이게이션 반응시킨 라이게이즈 조성물

레인 5; 실온에서 30분간 라이게이션 반응시킨 라이게이즈 조성물

레인 6; 실온에서 20분간 라이게이션 반응시킨 라이게이즈 조성물

레인 7; 실온에서 10분간 라이게이션 반응시킨 라이게이즈 조성물

레인 8; 실온에서 5분간 라이게이션 반응시킨 라이게이즈 조성물

레인 9; 람다 DNA/EcoR V 절편(1 ㎍)

레인 10; 실온에서 60분간 라이게이션 반응시킨 라이게이즈 조성물

레인 11; 실온에서 50분간 라이게이션 반응시킨 라이게이즈 조성물

레인 12; 실온에서 40분간 라이게이션 반응시킨 라이게이즈 조성물

레인 13; 실온에서 30분간 라이게이션 반응시킨 라이게이즈 조성물

레인 14; 실온에서 20분간 라이게이션 반응시킨 라이게이즈 조성물

레인 15; 실온에서 10분간 라이게이션 반응시킨 라이게이즈 조성물

레인 16; 실온에서 5분간 라이게이션 반응시킨 라이게이즈 조성물

각 레인에 사용된 기질 유전자는 다음과 같다.

레인 2,3,4,5,6,7,8 : 람다 DNA/Hind Ⅲ 절편(1 ㎍)

레인 10,11,12,13,14,15,16 : 람다DNA/EcoRV 절편(1 ㎍)

본 발명은 건조 라이게이즈 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 라이게이션 반응을 위해 각 구성성분을 혼합해야 하는 다단계 조작을 간편하게 하고, 반응 혼합물의 안정성을 증가시킴으로써, 다양한 분자생물학적 분야에 적용할 때 단시간 내에 신뢰도가 높은 결과를 얻을 수 있는 건조 라이게이즈 조성물에 관한 것이다.

"라이게이션"은 문자 그대로 DNA나 RNA의 끝을 이어주는 과정을 가리키는 용어로서, 이 반응에 이용되는 효소를 "라이게이즈"라 한다. 라이게이즈는 분자생물학의 기본이 되는 효소류 중의 하나로서 ATP 등의 고에너지 인산결합의 가수분해에 작용하여 2개의 분자를 결합시키는 반응을 촉매하는 효소 기능을 갖고 있으며, 유전자 재조합, 유전자 클로닝(cloning), 폴리머라아제 연쇄 반응(polymerase chain reaction, PCR) 클로닝 등의 다양한 분자생물학적 분야에 널리 사용되고 있다. DNA를 기질로 사용하는 라이게이즈를 DNA 라이게이즈라 하고, RNA를 기질로 사용하는 라이게이즈를 RNA 라이게이즈라 하며, RNA 라이게이즈는 특수한 목적이 아닌 경우 잘 사용하지 않는다. 유전자 재조합 과정에 사용되는 라이게이즈는 주로 DNA 라이게이즈이며, 원핵세포, 진핵세포, 바이러스 등으로부터 유래한 것이 있는데, 현재 많이 사용되는 라이게이즈는 T4 DNA 라이게이즈와 대장균 DNA 라이게이즈이다. T4 DNA 라이게이즈는 보조 인자(cofactor)로 ATP(adenosine triphosphate)를 필요로 하고, 대장균 라이게이즈는 NAD(nicotinamide adenine dinucleotide)를 필요로 한다. 이들 두 라이게이즈는 무딘 말단(blunt-ended) DNA, 점착성 말단(cohesive-ended or sticky-ended) DNA, 닉(nicked) DNA 등에 모두 작용할 수 있으나, 대장균 DNA 라이게이즈는 T4 DNA 라이게이즈에 비해 무딘 말단 DNA에 작용하는 힘이 약하므로 일반적인 유전자 재조합 과정에서는 T4 DNA 라이게이즈를 더 많이 사용하는 경향이 있다(Enzymology primer for Recombinant DNA Technology, Hyone-Myong Eun, 1996).

라이게이션 반응을 위해서는 필요한 농도의 라이게이즈, 최적화된 반응용 완충용액 및 대상 유전자를 최종 반응 부피까지 첨가 및 희석한 후 라이게이즈의 활성에 최적화된 온도에서 일정시간 동안 반응시킨다. 이때, 반응용 완충용액은 특정 pH의 완충용액(Tris-HCl), MgCl₂, ATP 또는 NAD, DTT, BSA 등을 포함하며, 대상유전자의 형태와 양에 따라 라이게이즈의 농도 및 부피를 결정하여 첨가한다.

한편, 라이게이즈를 비롯한 효소 및 항원과 항체 같은 생물학적 기능을 나타내는 거대분자인 단백질의 활성은 주로 3차원 구조에 의해 결정된다. 이런 3차원 구조가 임의의 인자에 의해 변형되면 단백질의 생물학적 활성 또는 기능성이 감소되거나 소멸될 수 있다. 수분은 단백질 주변에서 소수성/친수성 상호작용을 통해 단백질의 3차원 구조를 안정화시키고, 또한 단백질 표면에서 발견될 수 있는 반응성 화학적 작용기를 차단하는 역할을 한다. 단백질을 건조하는 과정동안 발생하는 이런 수분의 보호적 상호작용이 제거되면, 단백질의 3차원 구조에 뒤틀림이 일어나 변화가 유발될 수 있고, 이 변화가 단백질의 표면에 있는 반응성 화학적 작용기(아민, 인산염, 카르복실기 등)로 하여금 단백질 내부의 작용기 사이에서 또는 다른 인접한 단백질의 반응성 작용기와 자유롭게 반응하여 초기 3차 구조의 상실 및 서로 유사하거나 상이한 다양한 단백질 간의 응집체 형성을 초래할 수 있다. 이는 단백질의 3차 구조 변화뿐만 아니라 생물학적 활성이나 기능성이 감소 또는 소멸되는 것을 의미한다. 이러한 인접 반응성 화학적 작용기 간의 상호작용은 단백질들을 감싸고 있는 매체의 탄력성으로 인해 이들 분자들이 적절하게 건조된 이후에도 발생할 수 있는데, 이로 인해 시간이 경과함에 따라 건조된 단백질의 생물학적 활성 또는 기능성이 감소하게 된다. 결과적으로, 건조하는 과정에서 단백질의 안정성을 잘 유지하기 위해서는 단백질에 대한 보호 작용을 하는 다른 물질로 대체하는 것이 매우 중요한데, 이러한 작용을 하는 것을 안정화제라 한다. 안정화제는 단백질의 3차원 구조를 유지하는 기능 및 표면 반응성 작용기를 안정화시키고 보호하는 기능면에서 수분(물분자)을 대체한다.

일반적으로 단백질을 장기 보관 시에는 이를 안정화시키기 위해 여러 가지 방식의 건조과정이 이용되는데, 이러한 방법들 중 동결건조방식에 의해 단백질, 특히 제한효소나 DNA 중합효소, 라이게이즈 같은 단백질을 보관하는 경우에는 일부 효소들이 동결과 해동과정에서 그 활성을 잃게 되는 문제점이 있을 뿐 아니라, 동결건조를 수행하기 위해서는 동결건조할 용액이나 산물을 동결건조되는 물질의 유형에 맞춤한 온도와 속도로 완전히 동결시켜야만 한다. 여기에 필요한 동결건조 장치는 가격이 비싸고, 동결건조 과정은 상대적으로 속도가 매우 느린데, 이런 경제적 요인은 이의 활용을 어렵게 한다.

단백질을 보관하기 위한 다른 방법으로는, 현재 상업적으로 가장 많이 이용되는 방식으로 -20℃ 이하의 온도에서 보관하기 위해 상당량의 글리세롤(glycerol)을 넣은 보존용 완충용액을 사용하는 방식이 있다. 라이게이즈의 경우 통상 50% 글리세롤 상태의 보존용 완충용액이 이용되며, 첨가된 글리세롤은 용액의 빙점을 낮추어 효소의 동결을 방지해 주는 역할을 한다(미국특허 제5,250,429호 참조). 이런 방법은 보존 온도가 -20℃ 이상으로 상승하지 않으면 활성의 손실 없이 수개월동안 효소 활성을 보존할 수 있으나, 저온 상태를 유지하는 것이 매우 중요하고, 이런 저온 상태가 수 시간 동안 교란되면 효소 활성의 손실 또는 불활성이 초래되는 문제점이 있다. 이런 이유로, 단백질, 특히 각종 효소 등을 이용한 제품들은 이동하는 과정에서의 일정한 저온 상태를 유지하는 것이 무엇보다 중요하고 볼 수 있다. 또, 글리세롤을 이용한 -20℃에서의 보관 방법은 효소 반응에 필요한 모든 반응 성분(반응 완충 용액 등)을 단일 용기 또는 튜브로 보관하여 수송하는 것이 바람직하지 않는데, 그 이유는 반응 성분 간의 바람직하지 않은 화학적 또는 생화학적 반응이 일어나 반응 성분들의 불활성화 또는 실험 결과의 해석을 방해하는 전혀 다른 결과를 초래할 수 있기 때문이다. 이런 이유들로 인하여, 실온에서 효소를 보존하고 수송하는 것이 가능하고, 효소 반응에 필요한 모든 요소(효소, 보조인자, 반응 완충 용액, 이외 첨가제 등)들을 단일 용기에 모두 포함시켜 운송할 수 있는 보존 시스템을 확립하는 것이 요구되고 있다.

본 발명은 상기와 같은 종래 라이게이즈의 보관, 수송 및 사용상의 문제점들을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 라이게이즈 반응용 혼합물을 사용에 편리한 일정 단위의 양으로 분리하여 분주하고, 미리 혼합한 후 건조과정을 거침으로써, 라이게이즈의 안정적인 보관과 더불어 사용 시의 편의성을 도모하고 신속한 반응준비를 가능하게 하는 건조 라이게이즈 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 라이게이즈, 반응용 완충용액 및 안정화 물질을 포함하는 용액 조성물을 건조하여 얻어진 건조 라이게이즈 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 라이게이즈에 반응용 완충용액 및 안정화 물질을 첨가한 후 건조시킴으로써 제조되는 상기 건조 라이게이즈 조성물의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 건조 라이게이즈 조성물을 포함하는 키트를 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 라이게이즈, 반응용 완충용액 및 안정화 물질을 포함하는 용액 조성물을 건조하여 얻어진 건조 라이게이즈 조성물을 제공한다. 본 발명에 있어서, 사용할 수 있는 라이게이즈는 특별히 한정되는 것은 아니며, 시판되는 임의의 DNA 또는 RNA 라이게이즈를 모두 사용할 수 있다. 바람직하게는, 상기 DNA 라이게이즈는 T4 DNA 라이게이즈 또는 대장균 DNA 라이게이즈이다. 본 발명의 조성물에 있어서, 라이게이즈의 함량은 특별히 한정되지 않으며, 라이게이션 조건에 따라 당해 분야에서 사용되고 있는 적절한 함량으로 조정하여 사용할 수 있다.

상기 반응용 완충용액은 라이게이즈를 제공하는 회사별로 약간씩의 차이가 있을 수 있으나, 사용하는 라이게이즈에 따라 지정된 완충용액을 사용하는 것이 바람직하다. 그러나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니며, 사용하는 라이게이즈의 활성 및/또는 안정성에 영향을 미치지 않는 어떠한 종류의 반응용 완충용액을 사용해도 무방하다. 예컨대, 상기 반응용 완충용액은 Tris-HCl, MgCl₂, DTT, ATP 또는 NAD, BSA 등을 포함하는 용액을 사용할 수 있으며, 경우에 따라서 스퍼미딘(spermidine) 등의 보조 인자를 더 첨가하여 사용할 수도 있다. 본 발명에서는 특정 라이게이즈에 가장 적합한 반응용 완충용액을 미리 첨가해 둠으로써 사용자가 완충용액의 선택 및 농도 조절의 오류를 방지할 수 있다. 상기 반응용 완충용액의 함량은 대응하는 라이게이즈에 따라 적절하게 설정할 수 있으며, 특정한 함량으로 제한되는 것은 아니다.

또한, 라이게이즈의 안정화를 위해 사용되는 안정화 물질로는 탄수화물, 다 가알코올, 계면활성제, 수용성 합성중합체, 단백질, 환원제 및 메틸아민으로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상을 사용할 수 있다. 상기 안정화 물질은 라이게이즈의 건조시 물분자의 제거에 따라 효소의 3차원 구조가 파괴되는 것을 방지하는 역할을 한다.

상기에서, 탄수화물은 단당류, 이당류, 다당류 및 이들의 유도체의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다. 상기 단당류 및 단당류의 유도체는 아라비노스(arabinose), 자일로스(xylose), 라이속스(lysoxe), 라이보스(ribose), 자일룰로스(xylulose), 리그로스(ligrose), 갈락토스(galactose), 글루코스(glucose), 만노스(mannose), 소르보스(sorbose), 프럭토스(fructose), 아라비톨(arabitol), 자일리톨(xylitol), 갈락티톨(galactitol), 솔비톨(sorbitol), 만니톨(mannitol), 메틸글루코피라노시드(methyl glucopyranoside) 등이 사용될 수 있으나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 이당류 및 이당류의 유도체는 트레할로스(trehalose), 자일로비오스(xylobiose), 말토스(maltose), 이소말토스(isomaltose), 라미나리비오스(laminaribiose), 셀로비오스(cellobiose), 젠티오비오스(gentiobiose), 락토스(lactose), 수크로스(sucrose) 등이 사용될 수 있으나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 다당류 및 다당류의 유도체는 피콜(Ficoll), 셀룰로오스(cellulose), 녹말(starch), 글리코겐(glycogen), 키틴(chitin), 펙틴(pectin), 카로닌황산, 콘드로이틴황산 A(chondroitin sulfate A), 히알루론산(hyaluronic acid), 갈락탄(galactan), 알긴산(alginic acid) 등이 사용될 수 있으나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.

라이게이즈 반응용 혼합물은 건조 후 단기 또는 장기보관 후 사용되는데, 사용 시에는 최종반응 부피가 되도록 대상 기질유전자용액 및 멸균된 3차 증류수를 가하여 용해한 후 반응시킨다. 상기 탄수화물은 라이게이즈, 반응용 완충용액 및 안정화 물질을 포함하는 용액 조성물 총 100 부피에 대해 0.1 내지 50 중량부의 함량(w/v)으로 첨가한 후 건조시키는 것이 바람직하고, 0.5 내지 20 중량부의 함량으로 첨가한 후 건조시키는 것이 보다 바람직하다. 상기 탄수화물이 용액 조성물 총 100 부피에 대해 0.1 중량부 이하의 함량으로 첨가되는 경우에는 건조시 대상 라이게이즈와 표면 물분자를 충분히 코팅하여 보호할 수 없기 때문에 효율적인 효소의 안정화 효과를 기대하기 어렵다. 또한, 건조시 음압에 의해 용액의 끓는 효과가 나타나는데, 탄수화물의 함량이 너무 낮은 경우나 용액의 점도가 너무 낮은 경우에는, 용액이 터지면서 튜브 바닥면 전체에 넓게 퍼지면서 건조되는 이상적인 형태로 건조되지 못하는 문제점과 효소가 충분히 보호되지 못하는 문제점이 발생할 수 있다. 상기 탄수화물이 용액 조성물 총 100 부피에 대해 50 중량부 이상의 함량으로 첨가되는 경우에는 탄수화물 자체의 용해도로 인해 수용액으로 용해되기 어렵고, 높은 점도로 인해 충분한 혼합이 이루어지기 어려우며, 건조후 형성되는 건조물이 부피가 필요 이상으로 커지게 되고, 라이게이즈 반응을 위해 유전자 용액과 멸균된 증류수로 용해시 용해가 쉽게 되지 않는다. 또한, 라이게이즈 반응시 고농도의 탄수화물이 반응 저해제로 작용할 수 있다는 문제점도 있다. 본 명세서에 있어서, 함량비는 용질의 중량/총 용액의 부피, 즉 w/v으로 표기시의 수치이다.

또한, 상기 수용성 합성중합체는 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol), 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrrolidone), 폴리아크릴산(poly(acrylic acid)), 폴리포스페이트(polyphosphate), FICOLL(수크로스로부터 합성된 비-이온성 중합체, Parmacia) 등이 사용될 수 있으나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.

라이게이즈 반응용 혼합물은 건조 후 단기 또는 장기보관 후 사용되는데, 사용 시에는 최종반응 부피가 되도록 대상 기질유전자용액 및 멸균된 3차 증류수를 가하여 용해한 후 반응시킨다. 상기 수용성 합성중합체는 라이게이즈, 반응용 완충용액 및 안정화 물질을 포함하는 용액 조성물 총 100 부피에 대해 0.1 내지 50 중량부의 함량(w/w)으로 첨가한 후 건조시키는 것이 바람직하고, 0.5 내지 20 중량부의 함량으로 첨가한 후 건조시키는 것이 보다 바람직하다. 상기 수용성 중합체가 용액 조성물 총 100 부피에 대해 0.1 중량부 이하의 함량으로 첨가되는 경우에는 건조시 대상 라이게이즈와 혼합물에 대한 이동성을 충분히 예방하지 못하기 때문에 효율적인 효소의 안정화 효과를 기대하기 어렵다. 또한, 건조시 음압에 의해 용액의 끓는 효과가 나타나는데, 수용성 중합체의 함량이 너무 낮은 경우 및 용액의 점도가 너무 낮은 경우에는 용액이 터지면서 튜브바닥면 전체에 넓게 퍼지면서 건조되는 이상적인 형태로 건조되지 못하는 문제점과 효소가 충분히 보호되지 못하는 문제점이 발생할 수 있다. 상기 수용성 중합체가 용액 조성물 총 100 부피에 대해 50 중량부 이상의 함량으로 첨가되는 경우 수용성 중합체 자체의 용해도로 인해 수용액으로 용해하기 어렵고, 높은 점도로 인해 충분한 혼합이 이루어지기 어려우며, 건조후 형성되는 건조물이 부피가 필요 이상으로 커지고, 라이게이즈 반응을 위해 유전자 용액과 멸균된 증류수로 용해시 용해가 쉽게 되지 않는다. 또한, 라 이게이즈 반응시 고농도의 수용성 중합체가 반응 저해제로 작용할 수 있다는 문제점이 있다.

본 발명의 바람직한 실시예에서는 건조 라이게이즈 조성물을 제조할 때 안정화제로 상기에서 언급한 이당류의 트레할로스와 수용성 합성중합체인 폴리비닐피롤리돈을 혼합하여 라이게이즈 조성물의 안정화제로 사용하였다. 이당류인 트레할로스의 경우에는 건조시 세포반응에 대한 보호 효과가 있음이 보고되어 있어 있으며(Clegg et al. Cryobiology 19:306-316, 1982), 말토즈, 수크로스, 락토즈, 트레할로스 같은 이당류는 건조 이후에 이당인산키나아제 효소의 정제된 제형 활성의 안정성을 증가시킨다는 보고가 있다(Carpenter et al. Cryobiology 24:455-464, 1987). 상기에서 기술할 것처럼 트레할로스는 건조 과정에서 단백질의 3차원 구조를 유지하기 위해 요구되는 수분, 즉 물분자 대신에 보호 작용을 하는 보조 작용제로서 작용하며, 효소와 같은 단백질에 대한 건조 혼합물의 장기 보존시 안정화 효과를 보인다.

본 발명의 바람직한 실시예에서 사용한 또 다른 안정화제인 폴리비닐피롤리돈은 1 종류 또는 그 이상의 단백질과 반응에 필요한 요소들을 혼합한 수용액을 건조할 때, 건조된 혼합물의 이동성을 예방하는 망구조를 만들어 혼합물을 구성하는 다양한 요소의 이동성을 방지하여 이들이 중합체에 의해 형성된 작은 셀에 다소간 고정되도록 함으로써 건조된 반응 혼합물의 저장을 위한 안정성을 강화시키는 역할을 한다. 수용성 합성중합체를 사용하게 되면, 결과적으로 이들 요소들이 서로 근접할 수 없어 표면 반응성 작용기의 화학적 반응을 예방한다. 이러한 이유로 안정 화제로 사용하는 수용성 합성중합체는 반응 혼합물을 구성하는 임의의 시약과 반응하지 않아야 하는 반면, 건조되는 단백질의 3차원 구조의 변형 없이 망에 개별화된 단백질을 포획할 수 있을 만큼 미세하고 주형 가능한 격자를 만들 수 있어야 한다. 상기에 나열한 수용성 합성중합체들이 이에 속한다.

상기에서 설명한 것처럼 단백질을 건조할 때 그 안정성을 유지하기 위해서는 한 종류의 안정화제만을 사용할 수도 있지만, 본 발명의 바람직한 실시예에서와 같이 건조에 대한 보호 작용제인 트레할로스, 망구조를 형성하여 건조된 시약의 이동성을 예방하는 폴리비닐피롤리돈 같이 각각의 기능을 가지고 있는 안정화제들을 혼합하여 사용함으로써, 건조된 단백질의 안정성을 더욱 향상시킬 수도 있다.

아울러, 본 발명의 건조 라이게이즈 조성물은 라이게이즈, 반응용 완충용액 및 안정화 물질 외에 수용성 염료중 1종 이상을 추가로 포함할 수도 있다. 이는 수용성 염료가 추가되어 있기 때문에 시료의 혼합과정에서 반응액이 완전하게 혼합되는지 여부를 육안으로 쉽게 확인할 수 있다.

상기 수용성 염료로는 브로모페놀 블루(bromophenol blue), 자일렌시아놀(xylene cyanole), 브로모크레졸 레드(bromocresol red) 또는 크레졸 레드(cresol red) 등으로부터 선택될 수 있고, 이중에서도 자일렌시아놀을 사용하는 것이 바람직하지만, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 수용성 염료는 라이게이즈, 반응용 완충용액, 안정화 물질에 수용성 염료가 추가로 포함된 용액 조성물 총 100 부피에 대해 0.00001 내지 10 중량부의 함량으로 첨가한 후 건조시키는 것이 바람직하며, 0.001 내지 0.1 중량부의 함량으로 첨가한 후 건조시키는 것이 보다 바람직하다.

본 발명의 건조 라이게이즈 조성물은 적절한 "보관용기"에 담겨진 형태로 제공될 수 있다. 상기 보관용기는 라이게이즈 조성물의 시판을 위해 이를 담고 있는 용기를 의미하는 것으로서, 폴리프로필렌 등의 합성수지 용기인 것이 바람직하지만 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 건조 라이게이즈 조성물은 라이게이즈의 반응에 필요한 성분들을 미리 혼합하여 건조시켜 놓음으로써, 종래의 라이게이즈 보관 방법에 비해 다음과 같은 이점을 갖는다 :

1. 라이게이즈 반응용 혼합물을 사용에 편리한 일정한 단위의 양으로 분리하여 분주하고, 미리 혼합하여 안정적으로 보존 및 보관함으로써 사용시의 편의성과 더불어 신속한 반응준비를 가능하게 한다.

2. 반응용 완충용액을 미리 혼합해 놓음으로써, 반응용 완충용액 선택시의 오류를 원칙적으로 차단할 수 있다.

3. 건조 상태로 보관되므로 냉동 보관된 경우와 비교하여 완충용액의 해동에 소모되는 시간도 필요치 않으며, 사용 시 라이게이즈의 작용을 저해할 수 있는 보존용 완충용액 성분이 함유되어 있지 않다.

4. 액체 상태로 보관되는 라이게이즈 용액과 시료를 혼합하는 과정에서의 오염 및 온도에 따른 활성저하를 방지한다.

5. 라이게이즈 활성의 안정성을 높여, 장기간의 용이한 보관이 가능하다.

6. 라이게이즈 반응용 혼합물의 대량 생산이 가능하므로, 각 혼합물간의 편 차를 최소화하여 반응용 혼합물의 재현성을 높일 수 있다.

7. 라이게이즈 반응용 혼합물을 일정 단위의 양으로 분리함으로써, 유전자 진단용 키트나 질병 진단용 키트 구성시 사용목적에 맞는 라이게이즈 제품의 구성을 가능하게 한다.

또한, 본 발명은 라이게이즈에 반응용 완충용액 및 안정화 물질을 첨가시킨 용액을 준비한 후, 이를 건조시키는 단계를 포함하는 상기 건조 라이게이즈 조성물의 제조방법을 제공한다.

상기에서, 안정화 물질은 탄수화물, 수용성 합성중합체 등으로부터 선택되는 1종 이상을 사용할 수 있다.

본 발명에 있어서, 건조 라이게이즈 조성물은 상기 라이게이즈를 포함하고 있는 반응용 완충용액을 합성수지 용기, 바람직하게는 폴리프로필렌 용기에 소정량으로 분주한 후 각 용기에 1종 이상의 안정화 물질을 첨가하고, 이어서 각 용기를 건조시키는 단계를 거쳐 제조될 수 있으며, 다른 한편으로는 라이게이즈 용액에 1종 이상의 안정화 물질을 첨가한 혼합 용액을 먼저 제조한 후 이를 합성수지 용기에 분주한 후 건조시키는 단계를 거쳐도 무방하다. 상기에서, 합성수지 용기는 플레이트, 튜브 또는 병과 같은 다양한 형태일 수 있으며, 특별한 형태에 한정되는 것은 아니다.

또한, 본 발명의 건조 라이게이즈 조성물은 상기 라이게이즈 용액에 수용성 염료 물질을 유효량 첨가한 후 건조시켜 제조할 수도 있다. 상기에서 수용성 염료 물질은 브로모페놀 블루, 자일렌시아놀, 브로모크레졸 레드, 크레졸 레드 등의 수 용성 염료가 사용될 수 있으며, 이중에서도 자일렌시아놀을 사용하는 것이 바람직하다.

건조시의 조건은 특별히 한정되는 것은 아니지만, -70℃ 내지 50℃, 바람직하게는 15 내지 30℃의 온도에서, 감압건조기를 이용하여 -500 ㎜Hg 내지 -760 ㎜Hg, 바람직하게는 -700 ㎜Hg 내지 -750 ㎜Hg의 감압 하에 40 내지 120분, 바람직하게는 70 내지 110분간 수행된다. 상기 건조조건은 안정화 물질의 종류에 관계없이 공통적으로 적용될 수 있다.

본 발명의 방법에 따르면, 번거롭고 사용비용이 비싼 동결건조 방식이 아닌 감압건조기를 사용하여 실온에서 건조를 수행하는 방식으로 라이게이즈 반응용 혼합물의 안정성을 높일 수 있다. 이처럼 실온에서 감압건조기를 이용함으로써, 번거롭고 사용비용이 비싼 동결건조 방식 대신 손쉽고 값싼 비용으로 단백질의 안정성을 높일 수 있다. 상기 감압건조기를 이용한 건조방법에서는 건조 시간, 즉 건조 단백질 조성물에 남아 있는 수분의 양이 단백질의 안정성을 높이는데 중요한 요인으로 작용하는데, 본 발명의 건조 라이게이즈 조성물의 경우 남아 있는 수분의 양이 1 내지 10%, 바람직하게는 2% 내지 5% 이하일 때 장기 보관 시의 안정성과 건조된 반응 조성물을 재수화에 최적의 조건이 된다.

또한, 본 발명은 상기 건조 라이게이즈 조성물을 포함하는 용기 및 상기 용기를 포함하는 키트를 제공한다. 상기 "용기"는 본 발명의 건조 라이게이즈 조성물 제조 후 시판을 위하여 이를 담고 있는 용기를 의미하는 것으로, 폴리프로필렌 등의 합성수지 용기인 것이 바람직하나 반드시 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 키트는 분자생물학과 관련된 다양한 분야, 예를 들면 유전자 분석, 클로닝 또는 유전자 재조합 등의 용도에 광범위하게 제한없이 사용될 수 있다. 상기 건조 라이게이즈 조성물을 이용한 키트는, 예를 들면 유전자 클로닝 키트, 상세하게는 PCR 클로닝 키트 등의 구성품으로 사용이 가능하다. PCR 수행을 위한 PCR 키트, PCR 산물을 아가로즈 젤에서 확인 후 아가로즈 젤로부터 정제하는 아가로즈 젤 정제 키트, PRC 산물을 직접 정제할 수 있는 PCR 정제 키트, PCR 산물과 벡터를 라이게이션하는 건조 라이게이즈 조성물 키트 등을 조합하여 PCR 클로닝 키트와 같이 종합적인 키트의 구성품으로 사용할 수 있다. 이외에도 라이게이션 실험 방법이 포함되는 키트의 구성품으로 건조 라이게이션 조성물을 사용할 수 있다. 건조 라이게이즈 조성물을 키트의 구성품으로 사용할 경우 제품의 수송 동안의 실온 보관이 용이하여 수송 비용의 절감을 기대할 수 있다.

이하, 본 발명을 구체적인 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

건조 라이게이즈 조성물의 제조 및 건조 후 활성 측정

< 실시예 1> 라이게이즈 조성물에 대한 각종 안정화제의 활성 측정

라이게이즈 조성물의 안정화에 기여하는 안정화제를 선별하기 위하여, 탄수화물, 다가 알코올, 수용성 합성중합체, 계면활성제 및 메틸 아민에 속하는 10 종류의 안정화제를 이용하여 표 1의 조성에 따라 라이게이즈 반응용 혼합물을 제조하 였다. 이때, 안정화제가 첨가되지 않은 것을 음성 대조군으로 사용하였다. 그 외에 라이게이션 반응에 필요한 반응용 완충용액은 하기 표 2의 조성으로 제조하였다.

안정화제 명	안정화제의 분류	원액 농도	사용 농도 /반응(2X)	사용 용량 /10 ㎕(2X)
트레할로스	이당류 및 그 유도체 ; 이당류	1 M	50 mM	0.5 ㎕
			100 mM	1 ㎕
			150 mM	1.5 ㎕
폴리비닐피롤리돈 40000	수용성 합성중합체	20%	5%	2.5 ㎕
			7.5%	3.75 ㎕
			10%	5 ㎕
폴리비닐피롤리돈 360000	수용성 합성중합체	12.5%	5%	4 ㎕
			7.5%	6 ㎕
			10%	8 ㎕
D-솔비톨	단당류의 유도체 ; 육가 당알코올	98%	5%	0.51 ㎕
			10%	1.02 ㎕
			15%	1.53 ㎕
메틸-α-D-글루코피라노시드	단당류의 유도체	2 M	50 mM	0.25 ㎕
			100 mM	0.5 ㎕
			150 mM	0.75 ㎕
피콜 400	탄수화물 중합체	25%	5%	2 ㎕
			10%	4 ㎕
			15%	6 ㎕
트윈 20	계면활성제	100%	5%	0.5 ㎕
			10%	1 ㎕
			15%	1.5 ㎕
트리톤 X-100	계면활성제	100%	5%	0.5 ㎕
			10%	1 ㎕
			15%	1.5 ㎕
미오(myo)-이노시톨	다가알코올 ; 육가 알코올	12.5%	5%	4 ㎕
			7.5%	6 ㎕
			10%	8 ㎕
베타인(betaine)	메틸 아민	3 M	100 mM	0.33 ㎕
			200 mM	0.67 ㎕
			300 mM	1 ㎕

반응용 완충용액 조성 성분명	원액 농도	사용 농도/반응(2X)
Tris-HCl(pH 7.6) 용액	1 M	132 mM
MgCl2 용액	1 M	13.2 mM
ATP 용액	10 mM	0.2 mM
Spermidine 용액	10 mM	0.2 mM
DTT 용액	1 M	20 mM
BSA 용액	20 ㎎/㎖	200 ㎍/㎖

상기에서, 2X란 반응에 필요한 농도를 1X 라고 할 때, 건조시 1X 농도로 건조하는 것이 2X 일 때보다 전체 부피가 늘어나기 때문에 더욱 힘들게 되므로, 2배의 농도가 되게 건조한 후 최종 부피를 1X 때의 부피, 즉 20 ㎕로 맞추어 1X의 반응 농도가 되도록 하기 위한 것이다.

본 실시예에서는 T4 DNA 라이게이즈로 (주)바이오니아(대한민국)에서 재조합 대장균(E.coil)으로부터 분리, 정제한 것을 사용하였다. 정제 이후, 상기 효소는 10 mM Tris-HCl(pH7.5), 50 mM KCl, 1 mM EDTA, 10 mM 2-메르캅토에탄올, 50% 글리세롤을 함유하는 저장 완충 용액에 -20℃로 저장하여 보관하였으며, 이하 모든 실시예에서 사용한 T4 DNA 라이게이즈는 동일한 시간에 분리, 정제한 것을 사용하였다. 본 실시예에서 건조한 각각의 건조 라이게이즈 조성물에는 2 바이스 유닛(Weiss unit)의 라이게이즈가 첨가되어 있다.

상기 표 1 조성의 안정화제와 표 2 조성의 반응 완충용액을 이용하여 제조된 각각의 혼합물을 부피가 13 ㎕가 되도록 하기 표 3의 조성으로 1.5 ㎖ 에펜도프(Eppendorf) 튜브에 분주하였다.

레인 번호	라이게이즈 농도/샘플	안정화제 종류	사용 농도/반응
1	2 바이스 유닛	안정화제가 포함 안된 조성물	-
2	람다 DNA/Hind Ⅲ 절편(1 ㎍)
3	2 바이스 유닛	트레할로스	50 mM
4	2 바이스 유닛		100 mM
5	2 바이스 유닛		150 mM
6	2 바이스 유닛	폴리비닐피롤리돈 40000	5%
7	2 바이스 유닛		7.5%
8	2 바이스 유닛		10%
9	2 바이스 유닛	폴리비닐피롤리돈 360000	5%
10	2 바이스 유닛		7.5%
11	2 바이스 유닛		10%
12	2 바이스 유닛	안정화제가 포함 안된 조성물	-
13	람다 DNA/Hind Ⅲ 절편(1 ㎍)
14	2 바이스 유닛	D-솔비톨	5%
15	2 바이스 유닛		10%
16	2 바이스 유닛		15%
17	2 바이스 유닛	메틸-α-D-글루코피라노시드	50 mM
18	2 바이스 유닛		100 mM
19	2 바이스 유닛		150 mM
20	2 바이스 유닛	안정화제가 포함 안된 조성물	-
21	람다 DNA/Hind Ⅲ 절편(1 ㎍)
22	2 바이스 유닛	피콜 400	5%
23	2 바이스 유닛		10%
24	2 바이스 유닛		15%
25	2 바이스 유닛	트윈 20	5%
26	2 바이스 유닛		10%
27	2 바이스 유닛		15%
28	2 바이스 유닛	트리톤 X-100	5%
29	2 바이스 유닛		10%
30	2 바이스 유닛		15%
31	2 바이스 유닛	안정화제가 포함 안된 조성물	-
32	람다 DNA / Hind Ⅲ 절편(1 ㎍)
33	2 바이스 유닛	미오-이노시톨	5%
34	2 바이스 유닛		7.5%
35	2 바이스 유닛		10%
36	2 바이스 유닛	베타인	100 mM
37	2 바이스 유닛		200 mM
38	2 바이스 유닛		300 mM

이를 감압건조기((주)바이오니아에서 제작, 제품명: CENTRA Evaporator^TM; 5X10^-4 Torr의 성능을 갖는 감압 펌프를 장착한 감압건조기)를 사용하여 -740 ㎜Hg 내지 -750 ㎜Hg의 압력 하에 실온에서 50분간 건조시킴으로써 튜브 밑면에 건조 라이게이즈 조성물을 얻었다.

건조 이후, 상기 건조 라이게이즈 조성물을 50℃에서 5일간 보관한 후에 1 ㎍의 기질유전자(람다 DNA/Hind Ⅲ 절편)가 포함된 20 ㎕의 3차 증류수를 가한 후 건조 라이게이즈 조성물을 볼텍스(vortex)하여 용해시켰다. 용해된 반응혼합물을 실온에서 1시간 동안 반응시키고, 그 반응 결과물을 아가로즈 젤(TBE 버퍼 내의 1% 아가로즈)에서 150 V로 40분간 전기영동하였다.

그 결과, 10 종류의 안정화제 중에서 T4 DNA 라이게이즈의 안정화와 1 ㎍의 기질유전자의 라이게이션 반응 활성이 가장 잘 보이는 것은 트레할로스, 폴리비닐피롤리돈 40000과 폴리비닐피롤리돈 360000 임을 알 수 있었다(도 1).

< 실시예 2> 트레할로스 , 폴리비닐피롤리돈 40000, 폴리비닐피롤리돈 360000의 안정화제를 조합한 건조 라이게이즈 조성물의 활성 및 최적의 라이게이즈 함량 결정

본 실시예에서는 실시예 1에서 확인한 결과를 기반으로 트레할로스, 폴리비닐피롤리돈 40000, 폴리비닐피롤리돈 360000의 3가지 안정화제를 이용하여 표 4의 조성에 따라 실시예 1의 표 2에서 기술한 반응 완충용액과 함께 라이게이즈 반응용 혼합물을 제조하였다.

조성물 번호	라이게이즈 농도/조성물	안정화제 조성 및 농도 / 조성물
		트레할로스	폴리비닐피롤리돈 40000	폴리비닐피롤리돈 360000
1	2 바이스 유닛	100 mM	-	-
2	2 바이스 유닛	150 mM	7.5%	5%
3	2 바이스 유닛	100 mM	7.5%	5%
4	2 바이스 유닛	50 mM	7.5%	5%
5	2 바이스 유닛	-	7.5%	-
6	2 바이스 유닛	100 mM	10%	5%
7	2 바이스 유닛	100 mM	7.5%	-
8	2 바이스 유닛	100 mM	5%	5%
9	2 바이스 유닛	-	-	5%
10	2 바이스 유닛	100 mM	7.5%	7%
11	2 바이스 유닛	100 mM	-	5%
12	2 바이스 유닛	100 mM	7.5%	3%
13	0.8 바이스 유닛	100 mM	-	-
14	0.8 바이스 유닛	150 mM	7.5%	5%
15	0.8 바이스 유닛	100 mM	7.5%	5%
16	0.8 바이스 유닛	50 mM	7.5%	5%
17	0.8 바이스 유닛	-	7.5%	-
18	0.8 바이스 유닛	100 mM	10%	5%
19	0.8 바이스 유닛	100 mM	7.5%	-
20	0.8 바이스 유닛	100 mM	5%	5%
21	0.8 바이스 유닛	-	-	5%
22	0.8 바이스 유닛	100 mM	7.5%	7%
23	0.8 바이스 유닛	100 mM	-	5%
24	0.8 바이스 유닛	100 mM	7.5%	3%
25	0.4 바이스 유닛	100 mM	-	-
26	0.4 바이스 유닛	150 mM	7.5%	5%
27	0.4 바이스 유닛	100 mM	7.5%	5%
28	0.4 바이스 유닛	50 mM	7.5%	5%
29	0.4 바이스 유닛	-	7.5%	-
30	0.4 바이스 유닛	100 mM	10%	5%
31	0.4 바이스 유닛	100 mM	7.5%	-
32	0.4 바이스 유닛	100 mM	5%	5%
33	0.4 바이스 유닛	-	-	5%
34	0.4 바이스 유닛	100 mM	7.5%	7%
35	0.4 바이스 유닛	100 mM	-	5%
36	0.4 바이스 유닛	100 mM	7.5%	3%
37	2 바이스 유닛	안정화제가 포함되지 않은 라이게이즈 조성물
38	0.4 바이스 유닛	안정화제가 포함되지 않은 라이게이즈 조성물
39	0.8 바이스 유닛	안정화제가 포함되지 않은 라이게이즈 조성물

건조 라이게이즈 조성물에 필요한 최적의 라이게이즈의 양을 결정하기 위하여 각각의 건조 라이게이즈 조성물에 라이게이즈의 양이 2 바이스 유닛, 0.8 바이스 유닛, 0.4 바이스 유닛이 포함되도록 3 부류의 라이게이즈 반응용 혼합물을 제조하였다. 제조된 각각의 혼합물은 부피가 13 ㎕가 되도록 하기 표 5의 조성으로 1.5 ㎖ 에펜도프 튜브에 분주하였다.

레인 번호	라이게이즈 농도/샘플	안정화제 조성 및 농도 / 반응
		트레할로스	폴리비닐피롤리돈 40000	폴리비닐피롤리돈 360000
1	2 바이스 유닛	100 mM	-	-
2	2 바이스 유닛	150 mM	7.5%	5%
3	2 바이스 유닛	100 mM	7.5%	5%
4	2 바이스 유닛	50 mM	7.5%	5%
5	2 바이스 유닛	-	7.5%	-
6	2 바이스 유닛	100 mM	10%	5%
7	2 바이스 유닛	100 mM	7.5%	-
8	2 바이스 유닛	100 mM	5%	5%
9	2 바이스 유닛	-	-	5%
10	2 바이스 유닛	100 mM	7.5%	7%
11	2 바이스 유닛	100 mM	-	5%
12	2 바이스 유닛	100 mM	7.5%	3%
LH	람다 DNA / Hind Ⅲ 절편(1 ㎍)
13	0.8 바이스 유닛	100 mM	-	-
14	0.8 바이스 유닛	150 mM	7.5%	5%
15	0.8 바이스 유닛	100 mM	7.5%	5%
16	0.8 바이스 유닛	50 mM	7.5%	5%
17	0.8 바이스 유닛	-	7.5%	-
18	0.8 바이스 유닛	100 mM	10%	5%
19	0.8 바이스 유닛	100 mM	7.5%	-
20	0.8 바이스 유닛	100 mM	5%	5%
21	0.8 바이스 유닛	-	-	5%
22	0.8 바이스 유닛	100 mM	7.5%	7%
23	0.8 바이스 유닛	100 mM	-	5%
24	0.8 바이스 유닛	100 mM	7.5%	3%
25	0.4 바이스 유닛	100 mM	-	-
26	0.4 바이스 유닛	150 mM	7.5%	5%
27	0.4 바이스 유닛	100 mM	7.5%	5%
28	0.4 바이스 유닛	50 mM	7.5%	5%
29	0.4 바이스 유닛	-	7.5%	-
30	0.4 바이스 유닛	100 mM	10%	5%
31	0.4 바이스 유닛	100 mM	7.5%	-
32	0.4 바이스 유닛	100 mM	5%	5%
33	0.4 바이스 유닛	-	-	5%
34	0.4 바이스 유닛	100 mM	7.5%	7%
35	0.4 바이스 유닛	100 mM	-	5%
36	0.4 바이스 유닛	100 mM	7.5%	3%
LH	람다 DNA / Hind Ⅲ 절편(1 ㎍)
37	2 바이스 유닛	안정화제가 포함되지 않은 조성물
38	0.8 바이스 유닛	안정화제가 포함되지 않은 조성물
39	0.4 바이스 유닛	안정화제가 포함되지 않은 조성물

이를 감압건조기를 사용하여 -740 ㎜Hg 내지 -755 ㎜Hg의 압력 하에 실온에서 50분간 건조시킴으로써 튜브 밑면에 건조 라이게이즈 조성물을 얻었다.

건조 이후, 상기 건조 라이게이즈 조성물을 50℃에서 5일간 보관한 후에 1 ㎍의 기질유전자(람다 DNA/Hind Ⅲ 절편)가 포함된 20 ㎕의 3차 증류수를 가하여 건조 라이게이즈 조성물을 볼텍스하여 용해시켰다. 용해된 반응혼합물을 실온에서 1시간 동안 반응시키고, 그 반응 결과물을 아가로즈 젤(TBE 버퍼 내의 1% 아가로즈)에서 150 V로 40분간 전기영동하였다.

그 결과, 트레할로스 50 mM, 폴리비닐피롤리돈 40000 7.5%, 폴리비닐프롤니돈 360000 5%의 조성(이하, '안정화제 조성 4'라 함)과 트레할로스 100 mM, 폴리비닐피롤리돈 40000 7.5%, 폴리비닐프롤니돈 360000 7%의 조성(이하, '안정화제 조성 10'이라 함)을 포함하는 건조 라이게이즈 조성물에서의 T4 DNA 라이게이즈의 안정화와 라이게이션 활성이 가장 뚜렷하게 남아 있는 것을 확인할 수 있었다(도 2).

< 실시예 3> 건조 시간과 건조 라이게이즈 조성물의 안정성과의 관계 확인

라이게이즈 반응용 혼합물은 실시예 2에서 기재된 표 4의 안정화제 조성물 중에서 T4 DNA 라이게이즈의 안정성과 라이게이션 활성이 가장 뚜렷하게 남아 있는 것으로 보였던 트레할로스 100 mM, 폴리비닐피롤리돈 40000 7.5%, 폴리비닐프롤니돈 360000 7%인 안정화제 조성 10과 실시예 1의 표 2에 기재된 반응 완충용액을 혼합하여 제조하였다. 이번 라이게이즈 반응용 혼합물에 사용된 라이게이즈 용량은, 실시예 2의 도 2에서와 같이, 건조하여 50℃에서 5일간 보관한 후에도 T4 DNA 라이게이즈의 안정성과 라이게이션 활성에서 가장 좋은 결과를 보였던 용량인 2 바이스 유닛을 사용하였다.

제조된 라이게이즈 반응용 혼합물은 부피가 13 ㎕가 되도록 1.5 ㎖ 에펜도프 튜브에 분주하였다. 이를 감압건조기를 사용하여 -740 ㎜Hg 내지 -755 ㎜Hg의 압력 하에 실온에서 35분부터 70분까지 5분 간격으로 8 단계의 건조 시간으로 건조시켜 튜브 밑면에 건조 라이게이즈 조성물을 얻었다.

건조 이후, 상기 건조 라이게이즈 조성물을 -20℃에서 1일(도 3의 A), 50℃에서 1일(도 3의 B), 50℃에서 3일간(도 3의 C) 보관한 후에 1 ㎍의 기질유전자(람다 DNA/Hind Ⅲ 절편(cohesive-end ligation activity); 람다 DNA/EcoR V 절편(blunt-end ligation activity))가 포함된 20 ㎕의 3차 증류수를 가하여 건조 라이게이즈 조성물을 볼텍스하여 용해시켰다. 용해된 반응혼합물을 실온에서 1시간 동안 반응시키고, 그 반응 결과물을 아가로즈 젤(TBE 버퍼 내의 1% 아가로즈)에서 150 V로 40분간 전기영동하였다.

그 결과, 건조 후에 -20℃에서 1일 보관 후 람다 DNA/Hind Ⅲ 절편과 람다 DNA/EcoR V 절편의 기질 유전자를 이용한 경우에는 모든 단계의 건조 시간에서 라이게이션 활성이 좋은 것을 볼 수 있었으나(도 3의 A), 50℃에서 1일 보관 후(도 3의 B)나, 50℃에서 3일 보관 후(도 3의 C)에 동일한 기질 유전자를 이용하여 라이게이션 활성을 확인하였을 경우에는 건조 시간이 길어질수록 활성이 더 좋아지는 것을 확인하였다. 이는 전술한 바와 같이, 건조 시간에 따라 건조 라이게이즈 조성물에 남아 있는 수분의 양이 줄어들수록 안정화제에 의한 안정성이 증가하는 것을 의미한다.

< 실시예 4> 안정화제를 포함하는 건조 라이게이즈 조성물의 장기 보관 시 안정성 테스트

라이게이즈 반응용 혼합물은 실시예 3과 동일한 조건인 트레할로스 100 mM, 폴리비닐피롤리돈 40000 7.5%, 폴리비닐프롤니돈 360000 7%인 안정화제 조성 10과 실시예 1의 표 2에 기술되어 있는 반응 완충용액에 2 바이스 유닛의 라이게이즈를 사용하여 혼합 제조하였고, 장기 보관 시 안정화제의 첨가가 안정성에 영향을 미치는 것을 확인하기 위해 음성 대조군으로 안정화제를 첨가하지 않고 반응 완충용액과 2 바이스 유닛의 라이게이즈만을 혼합하여 제조하였다.

제조된 라이게이즈 반응용 혼합물은 부피가 13 ㎕가 되도록 1.5 ㎖ 에펜도프 튜브에 분주하였다. 이를 감압건조기를 사용하여 -740 ㎜Hg 내지 -755 ㎜Hg의 압력 하에 실온에서 70분간 건조시켜 건조 라이게이즈 조성물을 얻었다.

건조 이후, 상기 건조 라이게이즈 조성물은 50℃에서 1일에서 7일까지 각각 보관한 후에 1 ㎍의 기질유전자가 포함된 20 ㎕의 3차 증류수를 가하여 건조 라이게이즈 조성물을 볼텍스하여 용해시켰다. 용해된 반응혼합물을 실온에서 1시간 동안 반응시키고, 그 반응 결과물을 아가로즈 젤(TBE 버퍼 내의 1% 아가로즈)에서 150 V로 40분간 전기영동하였다.

그 결과, 안정화제를 포함한 라이게이즈 조성물은 50℃에서 7일 보관한 샘플까지 두 기질 유전자에서 라이게이션 활성을 완전히 보존(람다 DNA/Hind Ⅲ 절편; 도 4의 A)하거나, 90% 이상 보존(람다 DNA/EcoR V 절편; 도 4의 B)하고 있는 것을 확인할 수 있으나, 음성 대조군으로 사용한 안정화제를 포함하고 있지 않은 라이게이즈 조성물의 경우에는 50℃에서 1일 보관한 샘플부터 두 기질 유전자에서 라이게이션 활성이 거의 없거나 전혀 나타나지 않음을 확인할 수 있다(도 4의 A 및 도 4의 B).

< 실시예 5> 라이게이즈 혼합물의 건조가 장기 보관 시 안정성에 미치는 영향 확인

라이게이즈 반응용 혼합물은 상기 실시예 4와 동일한 조건으로 혼합 제조하였고, 대조군으로는 실시예 4에서 사용한 음성 대조군과 동일한 조건으로 혼합 제조하였다. 제조된 라이게이즈 반응용 혼합물은 부피가 13 ㎕가 되도록 1.5 ㎖ 에펜도프 튜브에 분주만 하였다.

분주 이후, 상기 라이게이즈 반응용 혼합물을 -20℃에서 7일 및 50℃에서 1일에서 7일까지 각각 보관한 후에 1 ㎍의 기질유전자가 포함된 20 ㎕의 3차 증류수를 가하여 건조 라이게이즈 조성물을 볼텍스하여 혼합시켰다. 반응혼합물을 실온에서 1시간 동안 반응시키고, 그 반응 결과물을 아가로즈 젤(TBE 버퍼 내의 1% 아가로즈)에서 150 V로 40분간 전기영동하였다.

그 결과, 안정화제를 포함하거나, 포함하지 않은 라이게이즈 반응용 혼합물모두에서 -20℃에서 7일 보관한 경우에는 두 기질 유전자에서 라이게이션 활성이 상당량 보존되어 있지만, 50℃에서 1일 보관한 샘플부터 두 기질 유전자에서 라이게이션 활성이 전혀 나타나지 않는 것을 확인하였다(도 5의 A 및 도 5의 B).

실시예 4와 실시예 5의 결과를 종합하여 볼 때, T4 DNA 라이게이즈의 장기 보관 시 안정성과 활성에 있어서 안정화제의 첨가와 함께 건조된 형태가 큰 영향을 미친다는 것을 확인하였다.

< 실시예 6> 건조 라이게이즈 조성물의 최적의 라이게이션 시간 측정

라이게이즈 반응용 혼합물은 실시예 3과 동일한 조건인 트레할로스 100 mM, 폴리비닐피롤리돈 40000 7.5%, 폴리비닐프롤니돈 360000 7%인 안정화제 조성 10과 실시예 1의 표 2에 기술되어 있는 반응 완충용액에 2 바이스 유닛의 라이게이즈를 사용하여 혼합 제조하였다. 제조된 라이게이즈 반응용 혼합물은 부피가 13 ㎕가 되도록 1.5 ㎖ 에펜도프 튜브에 분주하였다. 이를 감압건조기를 사용하여 -740 ㎜Hg 내지 -755 ㎜Hg의 압력 하에 실온에서 70분간 건조시켜 건조 라이게이즈 조성물을 얻었다.

건조 이후, 상기 건조 라이게이즈 조성물은 -20℃에서 1일 보관 후에 1 ㎍의 기질유전자가 포함된 20 ㎕의 3차 증류수를 가하여 건조 라이게이즈 조성물을 볼텍스하여 용해시켰다. 용해된 반응혼합물을 실온에서 60분, 50분, 40분, 30분, 20분, 10분, 5분 동안 차례로 반응시키고, 그 반응 결과물을 아가로즈 젤(TBE 버퍼 내의 1% 아가로즈)에서 150 V로 40분간 전기영동하였다.

그 결과, 람다 DNA/Hind Ⅲ 절편 기질 유전자를 이용한 반응에서는 전 반응 시간대에서 완전한 라이게이션 활성을 보였으며, 람다 DNA/EcoR V 절편 기질 유전자를 이용한 반응에서는 5분과 10분의 반응 시간대에서만 약 90% 정도의 라이게이션 활성을 보였고, 나머지 반응 시간대에서는 완전한 라이게이션 활성을 보이는 결과를 확인할 수 있었다(도 6).

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 건조 라이게이즈 조성물은 라이게이션 반응을 위해 각 구성성분을 혼합해야 하는 다단계 조작을 간편하게 하고, 반응 혼합물의 안정성을 증가시키며, 또한 실험의 재현성에 있어서의 신뢰도를 증가시키고, 각 성분 간의 교차오염의 가능성을 제거시킴으로써, 유전자재조합, PCR 클로닝 등의 다양한 분자생물학적 분야에 적용할 때 단시간 내에 신뢰도가 높은 결과를 얻을 수 있다.

Claims (19)

1. 라이게이즈, 라이게이션 반응용 완충용액, 및 탄수화물 및 수용성 합성중합체로 구성된 군으로부터 선택된 안정화 물질을 포함하는 용액 조성물을 건조하여 얻어진 조성물로서, 상기 탄수화물은 단당류, 이당류, 다당류 및 이들의 환원 또는 축합반응에 의해 생성되거나 이들에 알킬기가 결합된 유도체의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되고 상기 수용성 합성중합체는 폴리비닐피롤리돈, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리아크릴산, 폴리포스페이트 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 라이게이션 반응용 조성물.
2. 제1항에 있어서,

   상기 안정화 물질은 이당류 및 수용성 합성중합체로 구성된 것을 특징으로 하는 조성물.
3. 삭제
4. 제1항에 있어서,

   상기 탄수화물은 아라비노스, 자일로스, 라이속스, 라이보스, 자일룰로스, 리그로스, 갈락토스, 글루코스, 만노스, 소르보스, 프럭토스, 아라비톨, 자일리톨, 갈락티톨, 솔비톨, 만니톨, 메틸글루코피라노시드, 트레할로스, 자일로비오스, 말토스, 이소말토스, 라미나리비오스, 셀로비오스, 젠티오비오스, 락토스, 수크로스, 피콜, 셀룰로오스, 녹말, 글리코겐, 키틴, 펙틴, 카로닌황산, 콘드로이틴황산 A, 히알루론산, 갈락탄, 알긴산 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
5. 제1항에 있어서,

   상기 탄수화물은 상기 용액 조성물 총 100 부피에 대해 0.1 내지 50 중량부의 함량(w/v)으로 첨가한 후 건조되는 것을 특징으로 하는 조성물.
6. 삭제
7. 제1항에 있어서,

   상기 수용성 합성중합체는 폴리비닐피롤리돈 40000 또는 폴리비닐피롤리돈 360000인 것을 특징으로 하는 조성물.
8. 제1항에 있어서,

   상기 수용성 합성중합체는 상기 용액 조성물 총 100 부피에 대해 0.1 내지 50 중량부의 함량(w/v)으로 첨가한 후 건조되는 것을 특징으로 하는 조성물.
9. 제2항에 있어서,

   상기 이당류는 트레할로스이고, 수용성 합성중합체는 폴리비닐피롤리돈인 것을 특징으로 하는 조성물.
10. 제1항 또는 제2항에 있어서,

    상기 조성물은 브로모페놀 블루, 자일렌시아놀, 브로모크레졸 레드 및 크레졸 레드로 구성된 군으로부터 선택되는 수용성 염료를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
11. 삭제
12. 제10항에 있어서,

    상기 수용성 염료는 상기 용액 조성물 총 100 부피에 대해 0.00001 내지 10 중량부의 함량(w/v)으로 첨가한 후 건조되는 것을 특징으로 하는 조성물.
13. 제1항에 있어서,

    상기 조성물은 건조 후 수분 함량이 2% 내지 5%인 것을 특징으로 하는 조성물.
14. 라이게이즈를 준비하는 단계;

    상기 라이게이즈에 라이게이션 반응용 완충용액, 및 탄수화물 및 수용성 합성중합체로 구성된 군으로부터 선택된 안정화 물질을 첨가하는 단계; 및

    상기 결과물을 건조시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 라이게이션 반응용 조성물의 제조방법으로서,

    상기 탄수화물은 단당류, 이당류, 다당류 및 이들의 환원 또는 축합반응에 의해 생성되거나 이들에 알킬기가 결합된 유도체의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되고, 상기 수용성 합성중합체는 폴리비닐피롤리돈, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리아크릴산, 폴리포스페이트 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
15. 제14항에 있어서,

    상기 탄수화물은 아라비노스, 자일로스, 라이속스, 라이보스, 자일룰로스, 리그로스, 갈락토스, 글루코스, 만노스, 소르보스, 프럭토스, 아라비톨, 자일리톨, 갈락티톨, 솔비톨, 만니톨, 메틸글루코피라노시드, 트레할로스, 자일로비오스, 말토스, 이소말토스, 라미나리비오스, 셀로비오스, 젠티오비오스, 락토스, 수크로스, 피콜, 셀룰로오스, 녹말, 글리코겐, 키틴, 펙틴, 카로닌황산, 콘드로이틴황산 A, 히알루론산, 갈락탄, 알긴산 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
16. 제14항에 있어서,

    브로모페놀 블루, 자일렌시아놀, 브로모크레졸 레드 및 크레졸 레드로 구성된 군으로부터 선택되는 수용성 염료를 더 첨가한 후 건조시켜 제조되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
17. 제14항에 있어서,

    상기 건조는 -70℃ 내지 50℃의 온도, -500 ㎜Hg 내지 -760 ㎜Hg의 압력하에서 40분 내지 120분간 수행되는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
18. 제17항에 있어서,

    상기 건조는 15 내지 30℃의 온도, -700 ㎜Hg 내지 -750 ㎜Hg의 압력하에서 70 내지110분간 수행되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
19. 제14항에 있어서,

    건조공정은 건조 후 수분 함량이 2% 내지 5%가 되는 조건으로 수행하는 것을 특징으로 하는 제조방법.

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