ES2252761T3 - Composiciones de biomoleculas biotiniladas estables y procedimientos. - Google Patents
Composiciones de biomoleculas biotiniladas estables y procedimientos.Info
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Abstract
SE DESCRIBEN COMPOSICIONES Y METODOS PARA MOLECULAS BIOTINILADAS, TALES COMO ENZIMAS. LAS COMPOSICIONES INCLUYEN UNA BIOMOLECULA BIOTINILADA, UNA BIOMOLECULA PROTECTORA, UN TAMPON, UN VEHICULO SELECCIONADO ENTRE UNO O MAS POLIMEROS NO IONICOS SOLUBLES EN AGUA Y PREFERENTEMENTE UN PROTECTOR DE LA ESTERILIZACION TERMINAL. LAS COMPOSICIONES PUEDEN UTILIZARSE TANTO EN FORMA DE DISOLUCION ACUOSA COMO PREFERENTEMENTE EN FORMA SECA, P. EJ., COMO UNA MASA DE POLVO LIOFILIZADO. TIENEN APLICACIONES EN CUALQUIER CASO EN QUE SE UTILICE LA TECNOLOGIA AVIDINA/BIOTINA, Y SON PARTICULARMENTE IMPORTANTES COMO COMPOSICIONES QUE CONTIENEN UN ENZIMA DE TIPO TROMBINA. LA PREPARACION DE UN MONOMERO DE FIBRINA Y SELLADORES BASADOS EN MONOMEROS DE FIBRINA SON UN EJEMPLO EN DONDE SE UTILIZA LA TECNOLOGIA AVIDINA/BIOTINA Y SE DESCRIBEN METODOS PARA PROPORCIONAR TALES MONOMEROS.
Description
Composiciones de biomoléculas biotiniladas
estables y procedimientos.
La tecnología basada en la afinidad avidina
biotina ha encontrado amplia aplicación en numerosos campos de la
biología y la biotecnología desde el trabajo pionero del Dr. Edward
Bayer y el Dr. Meier Wilchek en los años 70. La constante de
afinidad entre la avidina y la biotina es remarcablemente elevada y
no disminuye significativamente cuando la biotina está acoplada a
una amplia variedad de biomoléculas. Además, esta afinidad se
mantiene sustancialmente incluso cuando se emplean formas derivadas
de biotina y se han identificado numerosos compuestos químicos para
acoplar biomoléculas a biotina con una pérdida mínima o
insignificante de la actividad u otras características deseadas de
la biomolécula. En ciertas aplicaciones, la avidina se inmoviliza
sobre un material inerte sobre el que se hace pasar una solución
que contiene biomoléculas biotiniladas. La afinidad de la biotina
por la avidina proporciona la separación de la biomolécula de la
solución. Puede encontrarse una revisión de la tecnología de
biotina y avidina en Applications of
Avidin-Biotin Technology to
Affinity-Based Separation, Bayer y cols., J.
of Chromatography, 1990, páginas 3-11.
El documento EP 592242 describe un sellador de
fibrina novedoso basado en un monómero de fibrina al contrario que
los selladores con base de fibrinógeno tradicionales e implica
someter el fibrinógeno a una enzima tipo trombina que
preferiblemente se elimina después de tal tratamiento. El documento
EP 592242 describe que la captura y separación de la enzima puede
lograrse usando batroxobina biotinilada que pude recapturarse con
un material de avidina. Esta y otras aplicaciones se beneficiarían
de formas más convenientes de materiales de biomoléculas
biotiniladas y de avidina. Actualmente, a veces es difícil trabajar
con estos materiales, que pueden ser inestables, pueden perder la
actividad enzimática durante el procesamiento tal como
liofilización, pueden ser indebidamente higroscópicos y no soportan
procedimientos de esterilización.
De acuerdo con la presente invención, se
describen composiciones y procedimientos novedosos para biomoléculas
biotiniladas y la tecnología de afinidad de biotina y avidina. La
composición estable para una biomolécula biotinilada comprende:
i) dicha biomolécula biotinilada en una
concentración que se selecciona de acuerdo con una aplicación
particular;
ii) 0,01% a 50% en peso de un protector de la
biomolécula capaz de mantener sustancialmente la actividad deseada
de la biomolécula y que se selecciona de trehalosa, glicerol,
sulfato amónico y un aminoácido que es un zwitterion que se
selecciona de glicerina, alanina y valina;
iii) medios de tamponación para mantener el pH de
dicha composición en un valor deseado;
iv) 1 a 50% en peso de uno o más agentes de carga
solubles en agua; y
v) un protector para la esterilización final que
se selecciona de antioxidantes, captadores de radicales libres y
agentes reductores para proteger dichas composición y biomolécula de
la degradación o inestabilidad durante la esterilización final.
Esta composición de forma conveniente es una
solución acuosa. Lo más preferiblemente, esta composición está
liofilizada proporcionando una forma en polvo estable y que puede
radiarse de la biomolécula biotinilada. También se describen
procedimientos para preparar un material monomérico de fibrina, de
utilidad, por ejemplo en un sellador de fibrina.
La presente invención describe composiciones
estables novedosas de biotina-biomolécula. Las
composiciones preferidas están liofilizadas y son estables, fáciles
de manejar y pueden esterilizarse finalmente, por ejemplo, mediante
radiación gamma, sin dañar las composiciones. Esto es especialmente
ventajoso cuando la composición es una biomolécula biotinilada
porque se ha encontrado que es muy eficaz ser capaz de esterilizar
finalmente la biomolécula biotinilada liofilizada sin dañar su
actividad. Las presentes composiciones con base de biotina
liofilizada tienen una amplia aplicabilidad en cualquier caso en el
que es útil la tecnología de avidina y biotina porque estas
composiciones son solubles en agua, su captación de humedad es baja,
representan una carga biológica reducida, pueden esterilizarse
finalmente (por ejemplo, irradiarse), permanecen estables y son
farmacológicamente aceptables. Estas ventajas son proporcionadas por
la excepcional combinación de protectores y agentes de carga tal
como se describen en el presente documento.
Estas composiciones novedosas incluyen, junto con
la biomolécula biotinilada, un protector biomolecular, medios de
tamponación para mantener el pH deseado, uno o más agentes de carga
solubles en agua y un protector para la esterilización final (por
ejemplo, irradiación gamma). La biomolécula puede ser cualquier
enzima o proteína deseada que vaya a usarse en forma biotinilada.
En la técnica anterior existen numerosas biomoléculas biotiniladas
y todas esas biomoléculas anteriores son útiles en el presente
documento también. Con respecto al procesamiento del monómero de
fibrina novedoso en el documento EP 592242 al que se hace referencia
anteriormente, las enzimas tipo trombina son útiles en una forma
biotinilada. Tales enzimas tipo trombina incluyen trombina o una
enzima tipo trombina que se selecciona de Acutina, Venzima, Ancrod,
Asperasa, Batroxobina (de B. Altrox, B. Moojeni o B. Maranhao),
Botropasa, Crotrolasa, Flavoxogina y Gabonasa. Ejemplos no
limitantes de otras biomoléculas biotiniladas incluyen lectinas,
anticuerpos, mitógenos, fragmentos de ADN, ARN, tARN, rARN,
nucleosomas, membranas, proteínas de membrana, glucoproteínas y
péptidos sintéticos biotinilados.
El componente de biotina de la biomolécula
biotinilada puede ser biotina o cualquier forma derivada o análogo
de la misma, o cualquier molécula que tenga afinidad por avidina que
incluye avidina monomérica, estreptavidina, o cualquier proteína
que posea propiedades de unión a biotina que incluye formas
recombinantes de cualquiera de los anteriores. Las patentes y la
bibliografía están repletas de los diversos compuestos de biotina
que incluyen diversos espaciadores, grupos de enlace y similares
para usar en las presentes aplicaciones. Ejemplos no limitantes
pueden encontrarse en M.D. Savage, y cols. (1992), Pierce Chemical
Co., Avidin-Biotin Chemistry: A Handbook; en
los documentos DE 3629194, U.S. 5.180.828, U.S. 4.709.037 y U.S.
5,252,743, U.S. 4.798.795, U.S. 4,794.082, WO 85/05638 que se
incorporan al presente documento por referencia.
Preferiblemente, el protector de la biomolécula
es un aminoácido y más preferiblemente, el aminoácido es un
zwitterion simple tal como glicina, alanina y valina, siendo glicina
el más preferido.
Los medios de tamponación de las presentes
composiciones de biotina pueden ser cualquier tampón conveniente
adecuado para mantener el pH de la composición en un nivel deseado.
En el procesamiento de monómeros de fibrina del documento EP 592242
se desea mantener la biomolécula biotinilada a aproximadamente pH 7,
por lo tanto son útiles los tampones de citrato de barbital sódico,
fosfato de barbital sódico, fosfato potásico,
imidazol-HCl, piperazina, bicarbonato
sódico-CO_{2} al 5%,
trietanoamina-HCl-NaOH,
tris(hidroximetil)aminoetano y fosfato sódico, siendo
preferido el fosfato sódico.
El agente de carga de las presentes composiciones
de biotina-biomolécula se selecciona de polímeros no
iónicos solubles en agua. El agente de carga proporciona tanto
estabilidad química como física a las presentes composiciones y,
por ejemplo, evita que las composiciones novedosas se colapsen
cuando están en forma de torta liofilizada. Los polímeros solubles
en agua no iónicos también proporcionan protección a la biomolécula.
Se ha encontrado que dextrano y polisacáridos similares potencian
la estabilidad de las presentes composiciones. Ejemplos no
limitantes de tales agentes de carga incluyen dextrano,
polivinilpirrolidona, alcohol de polivinilo, polietilenglicol,
almidón hidrolizado y polisacáridos (por ejemplo, lactosa, glucosa,
maltosa, manitol, etc.), prefiriéndose dextrano, especialmente los
dextranos que tienen un peso molecular entre 50.000 y 100.000
Daltons (por ejemplo, Dextrano T-70 de
Pharmacia Co.).
Pharmacia Co.).
Los protectores para la esterilización final
preferidos son antioxidantes tales como glutationa reducida,
\alpha-tocopherol,
N,N-dimetil-p-fenilendiamina
y ascorbato sódico, siendo el más preferido el ascorbato
sódico.
La preparación de la biomolécula biotinilada se
logra mediante técnicas conocidas. Por ejemplo, un derivado de
biotina (que puede ser cualquier compuesto de biotina deseado con un
brazo espaciador y/o grupos salientes tal como se describe
anteriormente) tal como
N-hidroxisuccinimida-biotina
(NHS-biotina) puede hacerse reaccionar con la
biomolécula deseada, por ejemplo, la enzima soluble Batroxobina, en
un disolvente y en presencia de un tampón. La NHS funciona como
grupo saliente proporcionando la así formada
biotina-Batroxobina. Ésta puede purificarse usando
metodología estándar, por ejemplo, sometiendo la
biotina-Batroxobina a purificación en una columna
de cromatografía Sephadex^{TM} eliminando la biotina libre,
NHS-biotina y otros solutos de peso molecular
bajo.
Después de eso, se prepara una solución acuosa
que comprende los componentes de la composición, es decir, la
biomolécula biotinilada, el protector de la biomolécula, medio de
tamponación, agente de carga y protector para la esterilización
final. Preferiblemente, la etapa de purificación anterior puede
utilizar el tampón deseado para que esté en el producto final, lo
que proporciona que se añadan agua y agente de carga a la
biomolécula biotinilada y tampón formando la solución acuosa.
La solución acuosa de esta invención
comprende:
- 0,01 a 50% en peso de protector de biomolécula;
- 1 a 50% en peso de agente de carga;
- la biomolécula biotinilada en una concentración que se selecciona de acuerdo con la aplicación particular;
- el protector para la esterilización final;
- agua; y
- tampón necesario para mantener el pH deseado.
Esta solución o suspensión es también una forma
útil y estable de la biomolécula biotinilada y, como tal, se
considera parte de la presente invención. Si es necesario
esterilizar, la solución puede prepararse asépticamente. El
protector para la esterilización final está típicamente presente en
la solución acuosa en una cantidad desde aproximadamente 0,01% a
aproximadamente 10%.
Estos intervalos son especialmente útiles para
composiciones que contienen de 0,1 a aproximadamente 1,0 mg de
enzima o biomolécula por ml de composición y también proporcionarán
protección significativa para las composiciones que contienen hasta
5 mg de enzima por ml de composición. Preferiblemente, para las
composiciones que contienen más de 1 mg/ml de enzima y
especialmente para las composiciones que contienen más de 5 mg/ml,
los porcentajes de cada componente deberían aumentarse de forma
aproximadamente proporcional al aumento de la concentración de la
enzima.
Una composición acuosa preferida de la presente
invención comprende aproximadamente 2% de protector de biomolécula,
aproximadamente 2% de agente de carga, aproximadamente 50 mM de
tampón, aproximadamente 0,25% de protector para la esterilización
final y la concentración necesaria (preferiblemente
0,1-0,5 mg/ml) de biomolécula.
Lo más preferido es cuando la biomolécula es
Batroxobina en una cantidad desde aproximadamente 60 a 200 unidades
de actividad por mililitro de solución, y cuando la composición
incluye 2% en peso de glicina, tampón de fosfato sódico 50
milimolar (para mantener pH 7), 2% en peso de dextrano y 0,25% en
peso de ascorbato sódico.
En una realización preferida de la presente
invención, la solución acuosa se liofiliza proporcionando una
composición en polvo conveniente típicamente en forma de una torta.
Las técnicas de liofilización son notorias y puede emplearse
cualquier técnica adecuada. Un procedimiento de liofilización
adecuado, implica enfriar previamente el aparato de liofilización a
-45ºC, congelar la solución a -40ºC, calentar el producto a -25ºC y
mantener durante 11 horas o más, enfriando el producto a -43ºC,
introduciendo una presión reducida (es decir, vacío) a
aproximadamente 0,1 milibares y mantener la presión reducida a -43ºC
hasta que se ha completado el secado según se evidencia porque deja
de desprender vapor de agua, reducir la presión a la posición más
baja a la vez que se eleva la temperatura en incrementos de
5ºC/hora hasta 30ºC y mantener el producto así tratado a 30ºC
durante al menos 5 horas. Las composiciones de esta invención que
implican una forma biotinilada de trombina o de una enzima tipo
trombina, por ejemplo, Batroxobina, son útiles para convertir
fibrinógeno, o una composición que contenga fibrinógeno, en
monómero de fibrina, o una composición que contenga monómero de
fibrina. En consecuencia, la presente invención además incluye un
procedimiento novedoso, para preparar un monómero de fibrina de
utilidad, por ejemplo, en la preparación de un sellador de fibrina.
Este procedimiento novedoso implica someter una fuente de
fibrinógeno a una composición estable biotinilada de trombina o de
enzima tipo trombina tal como se define en el presente documento
para convertir fibrinógeno en monómero de fibrina, "capturar"
la enzima biotinilada con un material de avidina y eliminar la
enzima que es parte del complejo de biotina y avidina así
formado.
Aunque en un entorno ideal parte de la avidina
debería lixiviar de su soporte de agarosa (u otro inerte) y sería
de esperar que toda la biomolécula biotinilada fuera capturada por
la avidina y el material de soporte inerte, se entiende que este
puede no ser siempre el caso. Ahora se ha encontrado que la avidina
libre, lixiviada de su soporte inerte, es capaz de acoplarse con
una biomolécula biotinilada (por ejemplo, batroxobina) o viceversa,
produciendo la captura y eliminación del complejo enzimático de la
solución. En consecuencia, la fiabilidad de las presentes
composiciones y procedimientos es potenciada además por el proceso
de autoeliminación que se describe en el presente documento.
Las composiciones de la presente invención además
pueden incorporarse en una unidad de procesamiento, por ejemplo,
una centrifugadora automatizada para preparar monómero de fibrina
tal como se define anteriormente. La composición de biomolécula
biotinilada puede cargarse previamente en la unidad de procesamiento
en forma de polvo o puede liofilizarse in situ en el
dispositivo o en un compartimiento de liberación controlada del
dispositivo.
La biotinilación de la biomolécula puede
lograrse, tal como se describe anteriormente, mediante cualquier
procedimiento de biotinilación. Se ha encontrado que el control
cuidadoso de la relación entre las biotinas y las biomoléculas es
importante para el rendimiento deseado final de la biomolécula. Por
ejemplo, con respecto a batroxobina biotinilada para usar en el
procedimiento de preparar un monómero de fibrina en el documento EP
592242, es importante para la batroxobina mantener una actividad
suficiente de forma que convierta el fibrinógeno en monómero de
fibrina de forma eficiente. También es importante que la batroxobina
biotinilada sea fácilmente capturada por el material de avidina para
una separación minuciosa de la enzima del producto de monómero de
fibrina. En el caso de la batroxobina, en teoría, pueden acoplarse
14 moléculas de biotina a la enzima. De acuerdo con la presente
invención, se ha encontrado que el número medio de moléculas de
biotina por molécula de batroxobina en una composición debería estar
en el intervalo de 5-12 y preferiblemente
6-8. Se cree que si la media está por debajo de
aproximadamente 5, un número significativo de moléculas de
batroxobina puede no ser biotinilado realmente, lo que produciría
una captura incompleta de la enzima. También se ha encontrado que si
la media está por encima de aproximadamente 8, se reduce la
actividad de batroxobina. Esto se cree que es de aplicación a otras
biomoléculas también, especialmente a las enzimas trombina y tipo
trombina. En consecuencia, las composiciones que contienen
biomoléculas que tienen 10 o más sitios de unión por biomolécula
capaces de reaccionar con un reactivo de biotinilación deberían
tener un número medio de al menos 5 y preferiblemente 6
biotinas/biomolécula. Los expertos en la técnica deberían entender
que estos intervalos preferidos de biotinas por biomolécula pueden
reducirse si cualesquiera sitios de reacción de la superficie de la
biomolécula son hiperactivos o si el proceso de biotinilación
implica protección física de parte de la superficie de la
biomolécula (contra los agentes biotinilantes), por ejemplo,
mediante unión reversible de la biomolécula a una superficie
sólida.
Las composiciones de biomoléculas biotiniladas de
la presente invención son composiciones estables que pueden
aguantar la liofilización y la esterilización final manteniendo una
cantidad remarcable de integridad molecular y captación excelente
por las moléculas de avidina. Esta invención se describirá
adicionalmente mediante los Ejemplos siguientes, sin embargo, no
debe estar limitada por los detalles que se describen en ellos.
Ejemplo de referencia
1
A una solución de batroxobina (10,75 mg; 3560
unidades) en tampón de bicarbonato sódico 0,2 M, a pH 8,5 (1, 6 ml)
se añadió agua (1,6 ml) seguida de 0,08 ml de una solución que
comprendía
N-hidroxisuccinimida-biotina (13,5
mg) en DMSO (1 ml). La mezcla se agitó durante 1 hora a 20ºC,
después se aplicó directamente a una columna (1 cm de diámetro x 40
cm) de medio de cromatografía Sephadex G-25
previamente equilibrado en una solución que comprendía tampón de
fosfato sódico 10 mM, a pH 7,0 y glicina (1% p/v). La
biotina-batroxobina eluyó de la columna con un
caudal de 0,4 ml/minuto. El primer pico que absorbía UV que eluyó de
la columna contenía biotina-batroxobina purificada
que se determinó que estaba libre de cualquier reactivo de
biotinilación residual y de productos de degradación asociados.
Estos estaban presentes en el segundo pico que absorbía UV que eluyó
de la columna. La biotina-batroxobina purificada
contenía 6,9 moles de biotina por mol de batroxobina. Cuando la
batroxobina biotinilada purificada se mezcló durante 5 minutos a
20ºC con una suspensión de gel de agarosa con avidina en tampón de
acetato sódico 0,2 M, a pH 4,0, se capturó >99,5% de la
batroxobina biotinilada purificada.
Biotina-batroxobina purificada
preparada tal como se describe en el Ejemplo de Referencia 1 se
diluyó con una solución que comprendía tampón de fosfato sódico 10
mM, a pH 7,0 y glicina (1% p/v) proporcionando una solución de
biotina-batroxobina que contenía 235 unidades de
actividad de batroxobina por mililitro. Un volumen de esta solución
se mezcló con 1 volumen de una solución que comprendía: glicina (3%
p/v), dextrano (4% p/v), ácido ascórbico (0,5% p/v) y dihidrógeno
ortofosfato sódico (90 mM) ajustado a pH 7,0 mediante la adición de
hidróxido sódico. Se encontró que la
biotina-batroxobina formulada de este modo no
mostraba pérdida de actividad enzimática cuando se almacenaba
durante 1 mes a -20ºC, 4ºC y 20ºC.
Se cargó biotina-batroxobina
formulada preparada tal como se describe en el Ejemplo 2 en viales
de cristal (0,3 ml por vial) y se introdujo en un aparato de
liofilización. La biotina-batroxobina formulada se
enfrió a -40ºC, después se calentó a -25ºC y se mantuvo a esta
temperatura durante 11 horas. Al final de este periodo, la
biotina-batroxobina formulada se enfrió a -43ºC y la
presión se redujo a 0,1 milibares. Estas condiciones se mantuvieron
durante toda la fase de secado primaria que se completó después de
22 horas. Al completar el secado primario, la presión se redujo a
0,08 milibares y la biotina-batroxobina liofilizada
se calentó a 30ºC con incrementos de 5ºC por hora. La
biotina-batroxobina liofilizada se mantuvo a 30ºC
durante 5 horas antes de retirarla del aparato de
liofilización.
El examen de la
biotina-batroxobina liofilizada mostró que no se
produjo pérdida de actividad de batroxobina durante el proceso de
liofilización. Las formulaciones liofilizadas de
biotina-batroxobina preparadas de este modo no
mostraban pérdida de la actividad de la batroxobina después de
almacenar a 4ºC durante 3 meses. Cuando se reconstituyó la
biotina-batroxobina liofilizada con agua y se mezcló
durante 5 minutos a 20ºC con una suspensión de gel de agarosa con
avidina en tampón de acetato sódico 0,2 M, a pH 4,0, se capturó
>99,5% de la batroxobina biotinilada.
Biotina-batroxobina liofilizada
preparada tal como se describe en el Ejemplo 3 se sometió a una
dosis esterilizante (25 kilograys) de radiación gamma. Tras una
pérdida inicial de la actividad de la batroxobina que constituía el
10-15% de la actividad inicial presente, no se
observó pérdida adicional de la actividad de batroxobina durante un
periodo de 1 mes. No apareció degradación de la
biotina-batroxobina irradiada tras el análisis
electroforético mediante electroforesis en gel de poliacrilamida.
Cuando se reconstituyó la biotina-batroxobina
liofilizada irradiada con rayos gamma con agua y se mezcló durante 5
minutos a 20ºC con una suspensión de gel de agarosa con avidina en
tampón de acetato sódico 0,2 M, a pH 4,0, se capturó >99,5% de la
batroxobina biotinilada.
La Tabla 1 proporciona ejemplos adicionales de
composiciones de biotina-batroxobina formuladas que
pueden prepararse mediante los procedimientos del Ejemplo de
referencia 1 y el Ejemplo 2 excepto que la columna de tampón de
equilibrado en el Ejemplo de referencia 1 y los tampones de la
formulación del Ejemplo 2 se ajustan para proporcionar la cantidad
correspondiente de dextrano, glicina y ácido ascórbico en la
solución de biotina-batroxobina formulada final tal
como se refleja en las columnas II, III y IV de la Tabla 1. Estas
soluciones formuladas de biotina-batroxobina se
liofilizaron de acuerdo con el procedimiento del Ejemplo 3 y se
sometieron a irradiación gamma de acuerdo con el procedimiento del
Ejemplo 4. El porcentaje de actividad de batroxobina que quedaba
tras la irradiación gamma se refleja en la columna V de la Tabla 1.
El número del ejemplo de esta invención se refleja en la columna I
de la Tabla 1.
| I | II | III | IV | V |
| Dextrano | Glicina | Ácido ascórbico | Actividad de batroxobina | |
| (% p/v) | (% p/v) | (% p/v) | que quedaba | |
| (%) | ||||
| 5 | 2 | 0 | 0 | 40 |
| 6 | 0 | 2 | 0 | 59 |
| 7 | 2 | 2 | 0 | 61 |
| 8 | 2 | 2 | 0,2 | 92 |
| 9 | 5 | 5 | 0,25 | 99 |
Claims (19)
1. Una composición estable para una
biomolécula biotinilada caracterizada porque comprende:
dicha molécula biotinilada en una concentración
que se selecciona de acuerdo con una aplicación particular;
0,01% a 50% en peso de un protector de la
biomolécula capaz de mantener sustancialmente la actividad deseada
de la biomolécula y que se selecciona de trehalosa, glicerol,
sulfato amónico y un aminoácido que es un zwitterion que se
selecciona de glicerina, alanina y valina;
medios de tamponación para mantener el pH de
dicha composición en un valor deseado;
1 a 50% en peso de uno o más agentes de carga
solubles en agua y
un protector para la esterilización final que se
selecciona de antioxidantes, captadores de radicales libres y
agentes reductores para proteger dicha composición y biomolécula de
la degradación o inestabilidad durante la esterilización final.
2. La composición de la reivindicación 1
caracterizada porque dicha biomolécula biotinilada es una
enzima o proteína acoplada a biotina o un análogo o forma derivada
de la misma.
3. La composición de la reivindicación 2
caracterizada porque dicha enzima es trombina o una enzima
tipo trombina que se selecciona de Acutina, Venzima, Ancrod,
Asperasa, Batroxobina (de B. Altrox, B. Moojeni o B. Maranhao),
Botropasa, Crotrolasa, Flavoxogina y Gabonasa.
4. La composición de la reivindicación 3
caracterizada porque la biomolécula biotinilada es
biotina-Batroxo-
bina.
bina.
5. La composición de la reivindicación 1
caracterizada porque el medio de tamponación comprende un
agente capaz de mantener el pH de dicha composición a
aproximadamente 7.
6. La composición de la reivindicación 5
caracterizada porque el medio de tamponación se selecciona
de fosfato sódico, citrato de barbital sódico, fosfato de barbital
sódico, fosfato potásico, imidazol-HCl, piperazina,
bicarbonato sódico-CO_{2} al 5%,
trietanoamina-HCl-NaOH,
tris(hidroximetil)aminometano y fosfato sódico,
siendo preferido el fosfato sódico.
7. La composición de la reivindicación 1
caracterizada porque dichos antioxidantes se seleccionan de
glutationa reducida, \alpha-tocoferol,
N,N-dimetil-p-fenilendiamina
y ascorbato sódico.
8. La composición de la reivindicación 1
caracterizada porque dicho agente de carga es un polímero
soluble en agua no iónico.
9. La composición de la reivindicación 8
caracterizada porque dicho polímero se selecciona de
polivinilpirrolidona, alcohol de polivinilo, polietilenglicol y
polisacáridos.
10. La composición de la reivindicación 9
caracterizada porque dichos polisacáridos se seleccionan de
dextrano, almidón hidrolizado, lactosa, glucosa, maltosa y
manitol.
11. La composición de la reivindicación 10
caracterizada porque dicho dextrano tiene un peso molecular
entre aproximadamente 50.000 y 100.000 Daltons.
12. La composición de la reivindicación 1
que es una solución acuosa.
13. La composición de la reivindicación 12
caracterizada porque dicha biomolécula biotinilada está
presente en una cantidad desde aproximadamente 50 a aproximadamente
200 unidades de actividad por ml de solución.
14. La composición de la reivindicación 13
caracterizada porque dicha biomolécula biotinilada está
presente en una cantidad desde aproximadamente 100 a
aproximadamente 135 unidades de actividad por ml de solu-
ción.
ción.
15. La composición de la reivindicación 1
caracterizada porque comprende entre aproximadamente 0,01 y
aproximadamente 10,0 por ciento en peso de un protector para la
esterilización final.
16. La composición de la reivindicación 15
caracterizada porque dicho protector para la esterilización
final está presente en una cantidad de aproximadamente 0,25 por
ciento en peso.
17. La forma en polvo seco de una cualquiera
de las composiciones de las reivindicaciones 1 y 12.
18. Un procedimiento para la esterilización
final de una biomolécula biotinilada que proporciona esterilidad a
la composición manteniendo la estabilidad y la actividad de la
biomolécula, procedimiento que comprende someter una composición de
la reivindicación 1 a un procedimiento de esterilización final.
19. El procedimiento de la reivindicación 18
caracterizado porque dicha biomolécula biotinilada está en
forma de un polvo seco.
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| US4897364A (en) | 1989-02-27 | 1990-01-30 | Motorola, Inc. | Method for locos isolation using a framed oxidation mask and a polysilicon buffer layer |
| US5026785A (en) | 1989-05-12 | 1991-06-25 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Avidin and streptavidin modified water-soluble polymers such as polyacrylamide, and the use thereof in the construction of soluble multivalent macromolecular conjugates |
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| CN1091315A (zh) * | 1992-10-08 | 1994-08-31 | E·R·斯奎布父子公司 | 血纤维蛋白封闭剂组合物及其使用方法 |
| JP3007785B2 (ja) * | 1993-03-16 | 2000-02-07 | 旭化成工業株式会社 | トロンボモジュリン組成物およびその変性防止方法 |
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