JP2003500171A - より炎症性応答の少ないフィブリンシーラントおよびこれを用いる方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明によって、先行技術のシーラントより炎症性応答の発生を減少させる新規なフィブリンシーラント、このシーラントを用いる方法を開示する。今回、フィブリンシーラントが、現在は人体の自然な炎症性応答を促進または抑制すると考えられている要素を選択的に包含または排除する数多くの方法で製造され得ることが判明した。本発明の新規シーラントは、フィブリンシーラントの有用性が知られている場合に有用である。実施例はこれらに限定されるものではないが、止血、液体または気体の漏れの密閉、細胞の送達、組織修復および創傷治癒、薬物送達における用途を含み、特に、術後癒着形成の阻害に有効である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 発明の分野 本発明は術後癒着の阻害、更に詳しくは、このような癒着の阻害を強化した、
フィブリンシーラントを用いる方法および組成物に関する。

【０００２】 発明の背景 隣接する組織間の組織癒着の形成は、多くの手術処置における不利な副作用で
ある。腹部手術後の腹膜癒着形成の発生率は、９０％の高さである。これらの術
後癒着は、苦痛、不快、固定（安静）、および婦人科手術の場合は女性の不妊に
至ることが少なくない。また術後癒着は、場合によっては、生命をおびやかす腸
絞扼をもたらすことさえありうる。すなわち、ごく普通の手術後の癒着によって
起こる潜在的な不快と医療リスクおよびこれに伴なう副作用を改善するための財
政負担を仮定すれば、術後癒着を阻害する方法を必要とする重大な解決されてい
ない要求が存在する。

【０００３】 術後癒着を減少または阻害する多くの方法が研究されてきた。提案されたメカ
ニズムの１つは、手術の後の創傷部位における炎症性反応の低減を含む。これに
関して、コルチコステロイド、ＮＳＡＩＤＳ、ヒスタミン拮抗薬およびカルシウ
ムチャネル遮断藥の使用が提案されている。別の阻害法は、たとえばヘパリンま
たは経口抗凝固藥を用いる、創傷部位の凝固の抑制を推奨する。さらに他の方法
では、たとえばフィブリノリジン、ストレプトキナーゼ、ウロキナーゼおよびｔ
−ＰＡの適当な投与によるフィブリン溶解の促進をを含む。最近では、術後癒着
の阻害用のバリヤー物質が提案されている。これらの物質には、これに限定され
るものでないが、羊膜の膜、ラバー、シルバーホイル、Ｔeflon（登録商標）、
デキストラン、ヒアルロン酸、Ｓurgigel（登録商標）（再生セルロース）、Ｉn
terceed（登録商標）（ＴＣ７、酸化した再生セルロース）、Ｐolaxamer４０７
（温度依存性ポリマー）、Ｇore−Ｔex（登録商標）（発泡ポリテトラフルオロ
エチレン）およびＳepraＦilm（登録商標）（ヒアルロン酸誘導体フィルム）が
挙げられる。

【０００４】 上記の物質および方法は、２つの基本的カテゴリー、すなわち、有効に働かな
いものと、いくらかの効果はあるが、その用途または適用性のいずれかが制限さ
れるものに分けられる。従って、この分野では新たな試みが引き続きなされてい
る。

【０００５】 手術処置でのフィブリンシーラントの役割が一般的に、何年もの間再検討され
ている。術後癒着を阻害または減少するフィブリンシーラントの役割が、過去数
年にわたって既に研究されているが、現時点で完全には判明していない。事実、
この分野の文献は多少、意見が分かれているように思われる。何人かの研究者が
、フィブリンシーラントを用いる術後癒着阻害の改善を報告している。たとえば
、子宮内膜腫のレーザー蒸気療法およびフィブリンシーラントで処置された女性
では、卵巣傍体癒着の発生がかなりに減少し［Ｄonner Ｊ．らの「Ｊ．Ｇyneco
l．Ｓurg．」（７：１６３,１９９１年）］；擦過したウサギの子宮角において
、切開した結腸癒着形成が減少し［Ｃhmielewski Ｇ．らの「Ｔhe Ａmerican
Ｓurgeon」（Ｖol．５８, Ｎｏ．９, ５９０, １９９２年）］；ラットにおい
て腹腔内癒着形成が減少し［ｄｅＶirgilioらの「Ａarch Ｓurg．」（Ｖol．１
２５, １３７８, １９９０年）］；ラットにおける、椎弓切除後の硬膜外瘢痕形
成が減少し［Ｖaquero Ｊ．らの「Ａcta．Ｎeurochir．（Ｗien）」（１２０：
１５９−１６３, １９９３年）］；およびウサギにおける、屈筋腱の部分裂傷後
の屈筋腱癒着形成が減少した［Ｆryknra Ｅ．らの「Ｊournal of Ｈand Ｓu
rgery」（Ｖol．１８Ａ, Ｎｏ．１, ６８, １９９３年）］。

【０００６】 術後癒着を阻害するフィブリンシーラントの使用に関する他の報告もあるが、
それほど肯定的でなかった。たとえば、フィブリンシーラントは、イヌの大腿お
よび頚動脈の動脈切開後の脈管周囲癒着の阻害に、統計的に有意の効果がないこ
とが判明し［Ｄickinson Ｃ．らの「Ｖascular Ｓurgery」（１５, １９９３
年）］；フィブリンシーラントは、ラットの結腸吻合において癒着形成を阻害せ
ず［Ｖan der Ｈam Ａ．らの「Ｊ．Ｓurgical Ｒesearch」（５５：２５６
−２６０, １９９３年）］；およびフィブリンシーラントは、ウサギの卵巣再形
成後の術後癒着を減少しなかった［Ｂilgin Ｔ．らの「Ｇynecol．Ｏbstet．Ｉ
nvest．」（３９：１８６−１８７, １９９５年）］。

【０００７】 ＷadstromのＷＯ９２／２２３１２に、伝えられるところによると術後癒着の
阻害に有用な、フィブリンシーラントと生体適合性ポリマーの組合せが開示され
ている。ＷＯ９２／２２３１２の報告によれば、フィブリンシーラントは単独で
、創傷治癒効果があるが、強い瘢痕形成をもたらし、かつ癒着を阻害しないとあ
る。粘度増大ポリマーは、含水シーラント成分の垂直面への塗布を可能ならしめ
るのに有用で、かつ癒着も阻害する。これらのポリマーは、高分子のポリグリカ
ンまたはポリサッカリドである。

【０００８】 ＷＯ９６／２２１１５に、特定範囲の孔径を有し、術後癒着を阻害または減少
する、架橋フィブリンからなる自給シート物質が開示されている。これらのシー
トやその類似物を製造するのにスプレー塗布の使用が、ＷＯ９８／０２０９８に
報告されている。これらのシートは、一般に非密着性および非止血性であり；密
着性と止血能力を有する公知のフィブリンシーラントと共に用いるのが好ましい
と、記載されている。これらのシートは、高濃度のフィブリノーゲンと、孔径お
よび孔分布に関して所望の構造（好ましくは＜２０μｍ、より好ましくは＜５μ
ｍ、最も好ましくは＜１μｍ）を得る高用量トロンビンを用いて製造される。ま
た、このシートは人体の外で予め形成され、かつ固体物質として塗布する必要が
あり、すなわち、スプレーあるいは液体では塗布されない。

【０００９】 フィブリンシーラントは、外科処置における止血や液体および空気漏れに対し
てますます使用されているため、癒着形成を促進しないシーラントの使用が重要
てある。また、フィブリンは自然治癒プロセスの一部でもあるので、術後癒着問
題の解決にも同様にフィブリン使用の試みが望ましいと思われる。このことは、
ポリマー添加物を用いず、高濃度のフィブリノーゲンを用いず、患者を高用量の
トロンビンに付さずに、および好ましくは、標準シーラントといっしょに使用し
なければならない予備成形シートの必要もなく、遂行できることが好ましいだろ
う。当該分野において、より自然で単一工程の、好ましくはスプレーで適用でき
、かつトロンビンの添加のない、シーラント／止血物質／密着性／癒着バリヤー
が、重要な進歩となるだろう。

【００１０】 同時に出願され、発明の名称が「フィブリンモノマー・シーラントを用いる術
後癒着の阻害」である、同時に係属している米国出願第６０／１３６,９０１号は
、フィブリンシーラントとして用いることができるフィブリンポリマーはより化
学的−自然な物質になるとき、術後の癒着阻害に非常に有用であると開示してい
る。人体自身の、好ましくは患者由来の、すなわち自己由来の凝固素材に非常に
よく似ている素材であるとみなしている。この同時係属出願はこの素材が下記の
１つまたはそれ以上に関連していると記載している： 1)フィブリンポリマーを形成させるためのフィブリンモノマーの使用； 2)自己由来のフィブリン−ポリマー−形成物質の使用 3)自己由来血漿タンパク質の組み入れ 4)外来性または添加するトロンビンまたは他の線維素ペプチドＡおよび／また
はＢ−切断酵素の実質的無効化；および／または 5)溶媒／界面活性剤または他の潜在的変性プロセスを避けること。

【００１１】 上記のパラメーターは１つ、複数またはすべては術後の癒着の発生を低下させ
ることが判明した。その正確な機構は不明であるが、それぞれでないとしても、
いくつかのパラメーターは、もし過度に加速されると術後癒着形成をもたらす炎
症性応答を低下させることができる。

【００１２】 上述したように、術後癒着形成の発生の低減のために、抗炎症剤の使用が試み
られたが、この問題はなお存続している。フィブリンシーラントは創傷治癒に重
要な役割を果たしていると信じられているが、先行技術のシーラントは過度に炎
症性応答を促進し、術後癒着形成を生じさせるいくつかの要因を含んでいる。

【００１３】 発明の要約 本発明によって、先行技術のシーラントより炎症性応答の発生を減少させる新
規なフィブリンシーラント、このシーラントを用いる方法を開示する。今回、フ
ィブリンシーラントが、現在は人体の自然な炎症性応答を促進または抑制すると
考えられている要素を選択的に包含または排除する数多くの方法で製造され得る
ことが判明した。本発明の新規シーラントは、フィブリンシーラントの有用性が
知られている場合に有用である。実施例はこれらに限定されるものではないが、
止血、液体または気体の漏れの密閉、細胞の送達、組織修復および創傷治癒、薬
物送達における用途を含み、特に、術後癒着形成の阻害に有効である。

【００１４】 発明の詳細な記載 本発明は、先行技術のフィブリンシーラントより炎症性応答をより起こさせな
いように設計されたフィブリンシーラントを開示する。従って、術後癒着形成の
発生を低減させる一方、優れた止血、付着および液体密閉手段を提供する。炎症
性応答の手がかりは一酸化窒素の産生であると考えられている。本発明のフィブ
リンシーラントはいくつかの方法で、一酸化窒素の生成および炎症性応答を抑え
る。これらの各要素は術後癒着形成の減少させ、本発明はこれらの要素の１つ、
複数またはすべての要素を用いる方法に関する。

【００１５】 従って、これらの特徴点の１つ、幾つかまたは全てを採用する方法は、本発明
の一部である理解される。上述の如く、本発明の方法に由来するフィブリンポリ
マーは、種々のフィブリン濃度にわたり術後癒着を低減または阻害することがで
き、かつ従来技術と比較して、高濃度物質である必要もないこと当然である。さ
らに、手術創傷部位への適用（塗布）のため生体外でシート状物質を予め形成す
る必要が全くなく、また追加のシーラント層を使用する必要もない。本発明のフ
ィブリンシーラントは、本明細書に記載の方法を用いて塗布すると、術後癒着形
成に抵抗する良好なバリヤー品質を有するばかりでなく、その形成を低減させる
。同時に創傷部位において止血、液体の密閉、組織密着性をもたらし、細胞移動
を増大するがシーラント内への移動はない。この細胞移動の増大は、脈管形成お
よび組織修復をもたらすと考えられる。

【００１６】 先行技術のシーラントの多くは、フィブリンIIポリマーであり、フィブリノー
ゲンから線維素ペプチドＡおよびＢの切断によって生成する。米国特許第５,７
５０,６５７号は、フィブリンＩまたはフィブリンIIのいずれであってもよい新
規フィブリンモノマー−ベースのシーラントを開示している。今回、フィブリン
Ｉポリマーシーラントは、先行技術のシーラントと比較して術後癒着形成を意外
にも低減させることが判明した。フィブリノーゲンからフィブリノペプチドＡの
切断の結果であるフィブリンＩは、フィブリンIIよりも炎症性応答を起こさせな
い。フィブリンIIポリマーと比較したとき、フィブリンＩは一酸化窒素の生成を
抑制すると考えられている。一酸化窒素は、自然の炎症および細胞遊走反応、お
よびコラーゲンの癒着を誘導し、高濃度のとき過度に促進し得る。これらは術後
癒着形成に必須のプロセスである。フィブリンIIポリマーシートを用いるＷＯ９
８／０２０９８の好ましい具体例が、術後癒着形成を避けるために生体外で実施
し処置されなければならない理由を説明している(フイブリノーゲンおよびトロ
ンビンの組み合わせによって証明された)。本発明のシーラントおよび方法では
、フィブリンは所望の部位に塗布または噴霧され、得られたフィブリンＩポリマ
ーが止血し、術後癒着を阻害する。本発明の方法によって、フィブリンＩポリマ
ーはまた時間、例えば２、３時間が経過すると、フィブリンIIにゆっくりと変換
され得る。今回、動物実験で受傷１０分後以内に少なくとも脆い形で存在し、受
傷１時間後には比較的強靭になっている。１次線維素癒着は、術後癒着形成期と
称される受傷後１６時間内に形成されると思われる。さらに、術後癒着再形成期
は１６時間後から始まり、その間に線維素癒着(fibrinous adhesions)が線維性
癒着(fibrous)に成熟する。術後最初の１０分〜２ないし３時間後のフィブリン
Ｉ(または、実質的にフィブリンＩ)ポリマーの存在は、他の阻害方法と比較して
術後癒着阻害に顕著な改善をもたらす。本発明の方法に用いられる好ましいフィ
ブリンシーラントは、最初フィブリンＩポリマーとして形成され、適用後２−３
時間かかって、フィブリンIIポリマーまたはフィブリンＩ／フィブリンII混合物
に変化する。初期にシーラント内への癒着形成および可能性のある内殖が生じる
と判明したのがこの重要な特徴であり、好ましくはこのポリマーはフィブリンＩ
である。

【００１７】 上記米国特許５,７５０,６５７はフィブリンシーラントを製造するためにフィ
ブリンモノマーを製造し用いている。術後癒着阻害の改善された方法のためのフ
ィブリンモノマー−ベースのシーラントは前記の同時係属のＣＶ０２７９にクレ
ームされている。適当なフィブリンモノマー溶液の製造方法の１つは非−架橋フ
ィブリンＩポリマーの形成ついでポリマーの可溶化を含む。これは、そうでなけ
ればフィブリンポリマー−形成プロセスに存在するはずの線維素ペプチドＡの濃
度を減少させるように、すなわち、ＦＰＡ切断の酵素触媒作用後で可溶化前に残
存する血漿を傾斜し捨てることによって実現される。線維素ペプチドＡは自然の
炎症性応答のきっかけになるのを促進する。線維素ペプチドＡが炎症性応答を誘
発する程度が単独で術後癒着の形成を促進するのに十分であるかまたはないかも
しれないが、従来技術のシーラントの他の炎症誘発因子との累積効果が考慮され
なければならない。この逆は、線維素ペプチドＡの量の減少した、すなわち、フ
ィブリンポリマーの理論的重合が予想される量より減少した、フィブリンシーラ
ントが、炎症性応答を減らし、従って、術後癒着形成の発生を低下させると今回
判明した。従って、本発明の要素は、線維素ペプチドＡの量が減少したフィブリ
ンシーラント、特にこのシーラントを用いる方法、好ましくは、術後癒着形成の
発生を低下させる方法に関する。好ましくは、患者に適用されるシーラントは、
予測される理論的ＦＰＡより５０％少ない量を含む。

【００１８】 他の一酸化窒素の抑制剤もまた本発明のフィブリンシーラントに採用すること
ができる。本発明者らには、フィブリンモノマー溶液の製造方法があり、アスコ
ルベート(１種のアスコルビン酸)がこの方法に用いられ、少なくともアスコルベ
ートの一部がフィブリンポリマーシーラントに最終的になる。アスコルベートは
また一酸化窒素の抑制剤であり、アスコルベートを含むシーラント製剤も本発明
の一部である。

【００１９】 フィブリンシーラントとしておよび／または術後癒着形成の阻害剤として規定
されるフィブリンポリマーの生成において、他の血漿タンパク質および例えば、
Ｘa因子、tＰaなどの因子が、フィブリンポリマーに結合したとき、炎症性応答
を増大させ得ることが判明した。しかし、それらがフィブリンポリマーに結合さ
れなければ、それらの単なる存在は炎症性応答を誘発しないと考えられる。これ
らおよび他の因子をフィブリンポリマーに結合させるのに重要な役目を果たすの
はフィブロネクチンである。従来技術のシーラントのいくつかはこれらの濃度を
増大させるためにフィブロネクチンを添加している。ヒト血漿中の自然のフィブ
ロネクチンの濃度は３００〜４００μg／mlである。フィブロネクチン濃度を減
少させたフィブリンシーラントは術後癒着の形成を減少させることが判明した。
さらに、フィブロネクチン濃度の低下は細胞透過により抵抗性のあるフィブリン
ポリマーをもたらすことが判明した。すなわち、フィブロネクチン濃度を低下さ
せたフィブリンシーラントは、術後癒着の阻害が望ましくかつ有利である方法に
特に有効である。

【００２０】 さらに、本発明によれば、好ましくはフィブリンポリマーに結合していない、
tＰaを含むシーラントは、創傷治癒／組織修復をもたらし、術後癒着形成をもた
らさない、より制御された炎症性応答を増大させる。好ましくは、tＰaのこれら
の濃度はフィブロネクチン量の低下と協力して、上述したように、tＰaがポリマ
ーに結合するのを回避させる。また、tＰa濃度に当然影響を与えるＰＡＩ−１濃
度はこれに関連する。好ましくは、本発明のシーラントは実質的にＰＡＩ−１を
含まない。

【００２１】 術後癒着を阻害するが、創傷治癒を促進することが判明しているフィブリンシ
ーラントを提供する。炎症性応答の促進が創傷治癒に必要であることが判明した
と仮定すれば、過剰な促進は癒着形成をもたらすかもしれないが、単一のフィブ
リンシーラント生成物がこれらの両方の濃度を提供し得ることは注目すべきであ
る。

【００２２】 本発明のシーラントはまた、親水コロイド、ポリマー、薬剤などの添加剤とと
もに適用することができる。

【００２３】 本発明のフィブリンシーラントはまた、１つまたはそれ以上の追加の自己由来
血漿タンパク質を含む。好ましくは、さもなくば自然の凝固プロセスに存在する
ものから選ばれる、自己由来血漿タンパク質は、本発明の方法において外科創傷
部位に適用前または適用中にシーラント成分に添加することができる。別法とし
て、自己由来血漿タンパク質は、フィブリンシーラントを形成する１つまたはそ
れ以上の自己由来血液成分を産生するプロセスで同時採取することができる。例
えば、自己由来フィブリノーゲンを製造するプロセスは、所望のフィブリノーゲ
ンおよび数個の他のタンパク質および／または成長因子を含む自然の反応混合物
を生じさせ得る。フィブリノーゲンを精製して他の自己由来成分を除去するより
もむしろそれらは単純にフィブリノーゲンとともに全体として同時適用され得る
。同様に、自己由来トロンビンプロセスで同時採取される自己由来成分も採用す
ることができる。別法として、また好ましくは、フィブリンモノマーシーラント
法において、多くの自己由来血液たんぱく質が同時採取され、モノマーとともに
同時適用することができる。ＧＢ９７／１１９２７.５は止血および密閉のため
のフィブリンシーラントとして有用な組成物を記載している。すなわち、フィブ
リンモノマーなどの血液成分(好ましくは、自己由来の)は、添加されるか、また
は同時採取され、プロトロンビン、第XIII因子(活性化され得る)、プラスミノー
ゲン、フィブロネクチン、抗トロンビンIIIおよび第Ｘ因子からなる群から選ば
れ、自己由来であってもよい、１つまたはそれ以上のタンパク質を含む。好まし
くはこの明細書で有用な組成物は、約１０−３０mg／mlの自己由来フィブリンモ
ノマー、約１０−４０μg／mlの自己由来プロトロンビンおよび約１００−２０
０μg／mlのプラスミノーゲンを含む。さらにそれらは５−１００μg／mlの活性
化され得る第XIII因子、および／または４５−１５０μg／mlのフィブロネクチ
ンおよび／または２.０−７.０μg／mlの第Ｘ因子および／または５０−２００
μg／mlの抗トロンビンIIIを含んでいてもよく、これらすべての成分は抗−癒着
治療を受ける患者の自己由来であってもよい。

【００２４】 本発明のシーラントは、止血、他の液体または空気漏れの密閉、創傷治癒およ
び術後癒着の阻害に有用である。

【００２５】 好ましい具体例において、本発明の物質および方法は同時係属の米国出願６０
／１３６,９０１および６０／１３６,９０２の教示するところの確認に用いられ
る。

【００２６】 本発明は下記の実施例と関連させて説明される。

【実施例】

実施例１ 本発明の方法では、Edwardsonら、U.S.５,７５０,６５７、の記載に従い、Hol
m、特にU.S.５,７４１,４２８、U.S.５,６０３,８４５、U.S.５,８２４,２３０
、およびU.S.５,９５８,２５３に開示された方法と装置を用いてフィブリンシー
ラントを製造した。

【００２７】 新鮮抗凝固処理全血（１２０ml、４%クエン酸３ナトリウム１７ml添加 USP)を
遠心分離して得た血漿(６０ml)を３７℃で１０分間ビオチン-バトロキソビン（b
atroxobin）と反応させた。生じた酸溶解性フィブリンＩポリマーを遠心分離し
、カルシウムイオンを含む０.２M酢酸ナトリウム緩衝液(pH４) ３.５-５.２mlに
溶解した。

【００２８】 -２０℃で数日間安定な濃縮フィブリンＩ (２０±２mg/ml)約６mlを得た。フ
ィブリンＩを水和する、微量のビオチン-バトロキソビンを、アガロースと共有
結合させた凍結乾燥アビジンを加えて除去した。５分以内にビオチン-バトロキ
ソビン:アビジンアガロースをろ過して除去し、濃縮フィブリンＩモノマーを以
下の実験で用いる所望のアプリケーター器具に移した。

【００２９】 得られたF１モノマー溶液を炭酸/重炭酸緩衝液(pH１０)と７:１ (Fl:pH１０)
の比で同時に適用した。

【００３０】 実施例２ 本試験は、ウサギ実験モデルにおいて、術後屈筋腱癒着形成に対する実施例１
記載のフィブリンモノマーシーラント(以降、「F１モノマーシーラント」という
)の効果を評価するために行なった。さらに可動および固定術後群に分けること
によりF１モノマーシーラントと癒着形成を減らすことが十分証明されている方
法、すなわち早期の積極的な可動化（mobilization）との相乗効果を評価するこ
とができた。

【００３１】 材料と方法 動物モデルおよび外科手術方法 Murex Lopウサギ２０羽を本試験に用いた。ウサギの性別分布は同じであり体
重は２５００〜４５００gであった。最終評価前に１羽が死亡し、ウサギの総数
は１９羽(雄９羽、雌１０羽)となった。少なくとも手術の７日前に動物をMurex
BioTech Ltd (Dartfort, Kent)から得、環境に馴化させた。試験期間を通して動
物を個別ケージに入れ、自由に餌と水を与えた。動物の一般状態および外科手術
創の定期評価はU.K.Home Office、「Guide for the Care and the Use of Labor
atory Animals」１９９６に従って行った。

【００３２】 外科手術手順は、「Good Laboratory Practice」に準拠した完全に整った手術
室で行った。麻酔導入はHypnorm（登録商標）(Janseen Copenhagen, Denmark,
０.２ml/kg, im）、次いでジアゼパム（Phoenix, ０.５ml/kg, iv)で行った。維
持は麻酔マスクを介して２%ハロタン（Zeneca）および酸素を流速２l／minで供
給した。麻酔した動物の状態は脈拍および酸素飽和プローブを用いて連続的にモ
ニターした。フェイスマスクを介して純酸素を供給して麻酔からの回復を促した
。

【００３３】 外科手術を始める前に、左前足（paw）の屈筋側面を髪切りばさみで短く刈っ
た。麻酔導入後、手術部位をアルコール中クロルヘキシジンおよびアルコール中
ヨードでよく洗って準備した。術野を無菌ドレープで隔離した。手術用顕微鏡を
用いて、左前足の第二および第四指の近位指節骨の底部を縦に切開した。正中線
を鈍性に切開すると指の鞘(腱鞘)とその中の腱が露出した。次いで腱鞘を滑車A
２およびA３の間（近位指節骨の中間に相当する点）で開いた。深指屈筋（flexo
r digitorum profundus)が露出した（図１）。次に、第２および４指の長屈筋腱
の足裏面に１５ブレードで標準的外科損傷を負わせた。損傷を長さ５mmとし、該
腱の芯物質を露出させた。創傷を閉じる前に、第２および４指の深指屈筋の創傷
をF１モノマーシーラント(図３)で処置するか、または無処置とした。F１モノマ
ーシーラント(０.１-０.４ ml)の適用は、WO９７/２０５８５およびWO９８/２０
９３１に開示された可変微細ジェットアプリケーターを介して行った。得られた
コーティングは空気中で３分間重合させ、次いで損傷した腱を創傷の底面に戻し
た。手術した未処置指も３分間空気に曝露した。さらに近位腱を外科的にトラン
スアクションしてすべての第２指を固定した。これは手根管の直遠位の皮膚を横
切開して行った。第２指に向かう深指屈筋および浅指屈筋（flexor digitorum s
uperficialis）を掌内できつくトランスアクトして、指を固定した。全ての皮膚
切開部は、皮内断続水平マットレス縫合(４/０ Vicryl (Ethicon))で閉じた。次
いで、創傷をCicatrin（登録商標）(Wellcome)抗菌パウダーで被い、Opsite（登
録商標）(Smith and nephew)をスプレーした。外部の包帯剤は適用しなかった。
すべての動物には術後の鎮痛のためブプレノルフィン(０.０１-０.０５mg/kg)を
投与した。回復後、動物をケージ内で通常通り動き回らせた。術後１４日目に動
物にバルビツール酸塩の致死量を静脈内注射して安楽死させた。

【００３４】 癒着発生の生体力学的評価 全ての手術群において張力計を用いて癒着の発生を評価した。さらに、右前足
（第２および４指）を手術していない動物を同様に評価して比較分析用の非手術
コントロール群とした。したがって、５群で二重盲検生体力学的評価を行った。

【００３５】 第１群 非手術コントロール。 第２群 固定（第２指）、手術、およびF１モノマーシーラント試験群。 第３群 可動(化)（第４指）、手術、およびF１モノマーシーラント試験群。 第４群 固定（第２指）、手術群（さらなる処置なし）。 第５群 可動（第４指）、手術群（さらなる処置なし）。

【００３６】 張力計 (NE Holm A/S, Denmark)により、深指屈筋をその鞘から引き離すのに
必要な力をグラムで測定した。新たに選んだ動物の前左および右第２および第４
指をそれぞれ切開し、浅指屈筋および深指屈筋を手術損傷部位の近位および遠位
でトランスアクト（transact）した。指鞘の出入口の約１５mm近位で２本の腱を
トランスアクトして近位切開を完結させた。A３およびA４滑車間をトランスアク
トしている深指屈筋腱において指切開を完結し、確実にこれがひも管（vincular
vessels）の挿入部の近位にあるようにした。次いで、深指屈筋腱の近位基部（
stump）を絹２/０-ステイ縫合糸で突き刺した（transfix）。次に、クランプで
堅くつかんだ関連する指の爪と一体になった絹のひもを張力計に繋いだ。鞘がな
い腱をひくのに必要な力をグラムで記録し、これにより癒着形成を表示した。

【００３７】 観察データの統計学的評価は、Stata Release ６ 統計ソフトウエアパッケー
ジを用いローバスト（robust）回帰法を用いて行った。この分析は、動物あたり
数回の測定からなるデータの構造を説明した。この方法は、動物間（必ずしも動
物内ではない）の観察結果に独立性があることを明確に示した。回帰係数の標準
誤差のローバスト推定値は、Huber/White/サンドイッチエスティメーターを用い
て計算した。これは同一試料からの独立性を欠く可能性を考慮している。残る分
散は、最初の測定尺度について群間で一定ではなかった。したがって、それらは
正常に分布していなかった。したがって、log_１０変換を適用した後に統計分析
を行った。回帰分析では群あたりの幾何平均張力の推定値および９５%信頼区間
を得た。これらの値を得るために、対数尺度についての係数および信頼区間を最
初の測定尺度に変換し戻した（表１および２）。生データをボックスおよびウィ
スカープロット(Sigma Plot バージョン４.０)でグラフに示した。該ボックスは
、中央値に印をつけるために内部に線を含む四分位範囲 (データの中央５０%)に
対応する。平均値は破線で示す。ウィスカーの長さは四分位範囲の１.５倍であ
る。ウィスカーの外側の値は個々にプロットしている。

【００３８】 結果 この試験ではウサギ２０羽を用いた。生体力学的評価を行う前に１羽が死亡し
た。動物を無作為に４処置群の１つかまたは非手術コントロール群に割り当てた
。ウサギ１９羽の最大観察可能回数は７６回（ウサギあたり４回）であった。し
かしながら、例えば、可動群で腱が切れるか、または張力計で引く前の指のtran
sactionが不完全であったため、これらのうち６７回のみが統計分析に適してい
た(８８%)。したがって、群あたり以下の数の腱について統計評価を行った。第
１群 (n=３６)、第２群 (n=７)、第３群 (n=６)、第４群 (n=１０)、および最後
の第５群 (n=８)。

【００３９】 各群あたりの張力計による張力の生平均値をグラフ１に示す。全処置Flモノマ
ーシーラント群を比較すると、生データの解釈から、腱をその鞘からはずすのに
要する張力の全体の低下が７５.６%であることがわかった。可動および固定で分
けると非処置群から処置群への低下はそれぞれ７９.７%および７６.８%であった
。

【００４０】 先に示したように、群のデータは正常に分布していなかった。生データを有意
義に解釈するには対数尺度の適用が必要であった。表１は群あたりの幾何平均張
力値と該平均の９５%信頼区間を示す。ローバスト回帰分析を用いて手術群と非
手術群を比較した。Flモノマーシーラント処置群 (固定 p=０.４２、および可動
p=０.４７)と正常非手術コントロール張力を比較すると、この分析では統計学
的な差はみられなかった。このことは、F１モノマーシーラント処置損傷と非手
術コントロールの癒着形成に有意差がないことを意味する。しかしながら、手術
非処置群と非手術コントロール(固定 p<０.００１、および可動 p<０.００１)を
比較すると高い有意差がみられた。このことは、F１モノマーシーラントで処置
しなければ外科手術の損傷は、非手術コントロールと比較して張力計の張力で評
価される有意な癒着形成の増加をもたらすことを示した。さらなるデータの分析
は、術後の可動性が同じタイプの手術群間では、F１モノマーシーラントを加え
ると有意差が生じることを示す(F１モノマーシーラント固定および非処置固定間
の差p=０.０３、F１モノマーシーラント可動および非処置固定間の差 p=０.０３
)。生データのlog_１０について回帰分析を行った後の非手術コントロール側の平
均張力の変化率は以下のごとくであった：

【００４１】 第２群 固定、手術、およびF１モノマーシーラント処置(７２%増加)。 第３群 可動(化)、手術、およびF１モノマーシーラント処置(３９%増加)。 第４群 固定、手術、およびさらなる処置なし(９８０%増加)。 第５群 可動化、手術、およびさらなる処置なし(４９０%増加)。

【００４２】 これらデータから可動および固定F１モノマーシーラント処置群いずれも非手
術コントロール群との有意差はなかったと結論することができる(それぞれ、P=
０.４７およびP=０.４２、表２)。生データのグラフ(グラフ１)は、F１モノマー
シーラントが活発な可動化と共に腱を鞘から引き離すのに要する力を減少させる
ように作用することを示し、処置例で癒着の発生がかなり減少することを示す。
これは、非手術コントロール群と手術非処置群との比較結果と対照的である。可
動および固定非処置群はいずれも非手術コントロールより有意に多くの癒着を形
成する(それぞれP<０.００１(表２))。さらに生データグラフは、癒着形成を減
少させるための可動化の有効性を示す（グラフ１）。

【００４３】

【化１】

【００４４】 グラフＩ 生データの棒グラフおよびウィスカープロット。棒グラフは四分位範囲に対応
する(データの中央５０%)。内部の実線は中央値を示す。水平の点線は平均値で
ある。ウィスカーの長さを個々にプロットしている。これらの外側の点を個々に
グラフに示す。

【００４５】 表１ 群あたりの幾何平均張力および平均の９５%信頼区間

【００４６】 表２ 群平均のペアごとに比較するローバスト回帰分析から得られるP値

【００４７】 実施例３ フィブリンシーラントの臨床的性能は、弾性、伸張強度、およびヒト組織への
癒着（接着）能といった物理特性の影響を受ける。これら特性は、重合により形
成されるフィブリンシーラントの内部構造に関連する。機能的フィブリン(凝)塊
が完成するまでの最小重合時間の分析は臨床的に重要である。フィブリンシーラ
ントが接触時に作用し、血液で洗い流されるかまたは標的組織（例えば心臓また
は肺）の動きにより剥がれることなく適用部位に確実に留まるようにするには、
瞬間的な組織-フィブリンシーラントの癒着が望ましい。フィブリンシーラント
の物理的特徴はフィブリンの架橋の程度に関連する。重合速度を測定することに
より、機能的凝塊を生成するのに必要な最小時間を計算することができる。Vivo
stat（登録商標）フィブリン１モノマーベースのシーラントを適用して２０〜３
００秒後の生体ヒト組織に対する癒着特性および重合動態を分析し、２種類の従
来のフィブリンシーラント、Tissucol（登録商標）およびBeriplast（登録商標
）について得られるものと比較した。実験データの解析により、Vivostat（登録
商標）シーラントの重合は一次速度論に従ったが、Beriplast（登録商標）およ
びTissucol（登録商標）の重合は二次速度論に従った。この試験は、Vivostat（
登録商標）シーラントが従来のフィブリンシーラントより速く重合することを示
している。

【００４８】 １．材料と方法 実施例１に記載のごとく提供された新鮮血液から溶液を調製し１時間以内に使
用した。シーラントをSpraypen（登録商標）アプリケーターとHolmら、WO９７/
２０５８５およびWO９８/２０９３１中に開示の自動化Vivostat適用装置を一緒
に用いてシーラントを供給した。従来のフィブリンシーラントであるTissucol（
登録商標）(Baxter)(１mlおよび２mlキット)およびBeriplast（登録商標）(Aven
tis)(１mlおよび３mlキット)を、製造業者の指示書に従って調製し、適用した。
Tissucol（登録商標）およびBeriplast（登録商標）を、それぞれニードルまた
はスプレーヘッドを取り付けたDuploject（登録商標）およびPantaject（登録商
標）アプリケーターを用いて適用した。

【００４９】 調圧レオメーター、Carri-Med CSL １００オートギャップを用いてトーション
レオメトリー実験を行った。フィブリンシーラント約０.５mlをレオメーターの
底部上に適用した。上端は直径２cmの細かい平行線を引いたプレートであり、試
料プラットホームはPeltierベースプレート上の直径２cmの細かい平行線を引い
たプレートからなった。レオメーターの温度は３７℃にセットした。１１分間、
周波数０.１Hzの１５μNmの一定振動トルクを用いて振動実験を行った。

【００５０】 癒着実験は、ヒト生体組織の使用を含む最近記載のモデル（Kjaergaardetal,
Eur. Surg. Res. １９９９)を用いて行った。ヒト組織試料は、冠状動脈バイパ
ス移植で残った大伏在静脈移植片であった。組織の活力を保証するため、全ての
試料を生理食塩水溶液中で維持し、採取して２４時間以内に使用した。静脈移植
片を縦方向に開いて試料を１cm^２にカットし、これを、Gore-Tex V５リテーニン
グ縫合糸を用いて試料ホルダーに固定した。２つの試料をほぼ４５度の角度にな
るようにし、フィブリンシーラント０.１mlを外膜が露出した組織表面にスプレ
ーした。２つの組織試料を外圧を加えずに接触させ、癒着試験が始まるまで重合
させた。Neneユニバーサル試験モデルM５を１０mm／分の速度で用いて試験を行
った。試料の横断面積で割った力で定義した癒着強度、癒着エネルギー(すなわ
ち、図３に示す実験曲線下面積)、および伸び(すなわち、試料が達成する伸張度
）を各実験について計算した。各重合時間で平均値を計算した。信頼間隔（すな
わち、９５% CI）も各パラメータで９５% CI=１.９５ CV/√nとして計算した（
ここで、nは分析した試料の数であり、癒着強度、伸張度、および癒着エネルギ
ーはそれぞれCV=６.６０、８.３５、および９.８１%であった）。

【００５１】 ２．結果 異なるドナーから提供された新鮮血液から調製した各１６溶液をレオメーター
のステージ上にスプレーし、形成されたフィブリン凝塊のレオロジーを１１分間
にわたり試験した。平均フィブリンＩ濃度は２２.２０mg/ml±１２.７%(CV)であ
った。Tissucol（登録商標）およびBeriplast（登録商標）の４試料もレオメー
ターで分析した。

【００５２】 時間に対するdG'/dtの曲線適合分析では、シーラントの重合は方程式(１)に示
す一次速度論に従うことを示した（ここで、tは時間であり、(dGt'/dt)_０ はt=
０における微分係数（derivative）値であり、kは反応速度定数である）。

【数１】

【００５３】 dG'/dt対時間を示す単一曲線を各時点の１６試料の値を平均して作製した。k
および(dG'/dt)_０について得られた値は、それぞれ１.１７-１０^-２±０.０５・
１０^-２ s^-１、および３.１７±０.１５pa s^-１ (r=０.９９２６; X^２=０.０６
８３)であった。

【００５４】 同様の解析をTissucol（登録商標）およびBeriplast（登録商標）フィブリン
シーラントの試料に適用した。実験データを方程式(１)に当てはめる試みでは相
関が非常に低かった(r=０.８３００-０.９４００)。この場合、dG'/dtは方程式(
２)に示すごとく二次速度論に従った（ここでtは時間であり、(dG'/dt)_０はt=０
における微分係数値であり、kは反応速度定数（パスカル^-１）である）。

【数２】

【００５５】 Tissucol（登録商標）およびBeriplast（登録商標）の速度論パラメーターは
、方程式(２)に平均dG'/dt曲線を当てはめて計算した。表３はこの方法に従って
得られた結果を示す。従来のフィブリンシーラントについては、フィブリンシー
ラントの２成分の混合効率は凝塊の形成速度に大きな影響を与えた。スプレー供
給システムは反応速度定数を、Tissucol（登録商標）でほぼ４３%、Tissucol（
登録商標）で１８%増加させた。

【００５６】 Tissucol（登録商標）およびBeriplast（登録商標）の重合速度論を重合の最
初の２００秒間にわたり比較した。この時間にわたり、比較のために、方程式(
２)で示される二次速度論モデルを用いて実験曲線に当てはめるとよい相関を得
ることができる(r=０.９９７４)。この場合は、反応速度定数は方程式(１)を用
いて得られるものと同様の絶対値（すなわち、k=１.０６.１０^-２±０.０６・１
０^-２pa^-１)を示した。結果を図４に示す。示すように、二次反応速度定数は他
のフィブリンシーラントより６〜２０倍大きかった。

【００５７】 癒着実験は、同様の適用システムを比較するため、スプレーしたフィブリンシ
ーラントの試料を用いて行った。ほとんどの試料は、最大力に達する前に最初の
限界点を示した(すなわち、ＡおよびＢ点の交差点、図３参照）。この点は癒着
強度の突然の低下により検出され（図３）、試料の部分的破損として視覚的に観
察された。これは、該シーラントの弾力性の限界と該システムの最初の破壊を示
しており、このことは臨床的見地から明確な暗示を与える。最初の限界点におけ
る伸び（すなわち、Ｂにおける伸び）と最初の限界点における癒着強度(すなわ
ち、Ａ点における力÷横断面積）を全ての試料について測定した。２つの同じ癒
着実験を各時点で準備し、各シーラント試料について平均値を記録した。結果を
表４-６に示す。

【００５８】 Tissucol（登録商標）およびBeriplast（登録商標）のいずれよりもはるかに
速く高度の弾力性に達した。これは重合速度が競合製品よりはるかに速かったこ
とを示す反応速度分析と一致する。結果として、組織に対する優れた瞬間接着（
図５）とよりよい弾性特性（図６）が得られた。

【００５９】 表３．Tissucol（登録商標）またはBeriplast（登録商標）フィブリンシーラ
ントに対する速度論的パラメーターと回帰分析の相関

【００６０】 表４. Vivostat（登録商標）フィブリンシーラントの癒着特性±95%CI

【００６１】 表５．Tissucol（登録商標）フィブリンシーラントの癒着特性±95%CI ^＊単回試験

【００６２】 表６． Beriplast（登録商標）フィブリンシーラントの癒着特性±９５%CI

【００６３】 実施例４ 本実施例４の目的は、子宮角および向かい合う同側腹(膜)壁に対する外科的損
傷後のウサギの腹腔における術後の癒着（PSA）を阻害するための３種類のフィ
ブリンシーラントの能力を評価することである。この実施例では下記のシリンジ
で適用されるシーラントを評価する。

【００６４】 a) 先の実施例で用いたVivostat（登録商標）フィブリンＩモノマーベースの
フィブリンシーラント； b) Tissucol（登録商標）、ヨーロッパでImmuno AG（Austria）が市販してい
るフィブリンシーラントで、プールヒトフィブリノーゲン（アプロチニム含有溶
液中）と塩化カルシウム溶液中のウシトロンビン成分を同時に適用することを含
む２成分シーラントシステム、および c) Cyroprecipitate (CYRO)、単一ドナー由来のフィブリノーゲンを含む血液
成分を濃縮した寒冷沈降物で、ウシトロンビンを同時に適用する。

【００６５】 Tissucol（登録商標）およびCRYOはすべてウシトロンビン４単位および５００
単位を用いて評価した。

【００６６】 モデル 簡単には、自然に並列の状態にある子宮角および同側腹腔壁にそれぞれ標準的
擦傷を負わせた。

【００６７】 次いで、損傷領域を、実験部位の外側に置いたポジショナル縫合糸を用いて並
べ、処置部位をフィブリンシーラントの層で分けた。次に、実験部位を、試験プ
ロトコールに示した長さの回復時間の間in vivoに放置した。誘導された損傷の
レベルと損傷表面が並んでいることから、このウサギ子宮角擦傷モデルは「より
悪い場合」の筋書きを引き起こす重症の実験的PSAモデルである。

【００６８】 一貫した標準面積の損傷が確実に生じるように、子宮角または腹腔壁に適合す
るように設計したテンプレート（２５mm x ３mm）を特別に作成した。テンプレ
ートの正確な面積に適合した標準的深さ(１.５mm)を持つスクレイパーを用いて
擦傷を生じさせた。各損傷部位について決めた回数引っ掻くさらなるパラメータ
ーを用いて、損傷を最大限、生物学的変動の限度内に標準化した。大きさ、構造
、および腹腔内の位置により腹腔壁と一緒に子宮角を実験部位に選んだ。組織の
ひどい取り扱いによりPSAが形成されることが示されているので (Boys, １９４
２; Connolly & Smith, １９６０)、過剰な組織の取り扱いは避ける必要がある
。さらに、サイズが大きいことが適切な処置を助けることから、経産（ex-breed
ing）ウサギも観察用に選んだ。

【００６９】 処置 右大殿筋にヒプノルム（hypnorm）(クエン酸フェンタニル（Fentanyl）０.３
１５mg/mlおよびフルアニゾン１０mg/ml、Janssen Saunderton, High Wycombe,
Buckinghamshireより供給）(０.２ml/kg体重、筋肉内）を前投薬した。

【００７０】 外科手術用麻酔をヒプノルム(０.３ml/kg体重、筋肉内)、およびジアゼパム(
５mg/mlジアゼパム、Phoenix Pharmaceuticals Limited, Gloucesterより供給)(
２.５mg/kg体重、静脈内）で誘導した。完全無菌手術処置を遵守した。手術部位
に運ばれると肉芽腫や癒着形成を引き起こすかも知れないあらゆる微量の粒状物
質（デンプン、粉末）を除去するため外科手術用手袋を無菌水で洗浄するのに特
に注意を払った。

【００７１】 外科手術野の柔毛を剃り、アルコールクロルヘキシジン、次いでヨードで消毒
した。開腹は高周波切開により、肝臓下縁から腸骨窩の水平線まで、皮膚と筋肉
を通して腹腔壁まで正中線を一回で切開することにより行い、ハサミで分離した
。レトラクションを開腹創端に適用し、子宮角に手を伸ばせるようにした。

【００７２】 自然に互いに並列に位置する、子宮角および対応する腹腔の内部同側表面の各
漿膜表面上に実験領域を選択した。子宮角または腹腔壁のいずれかに特に構築さ
れた標準テンプレートを選択した領域上に置き、各領域をスクレーパーの鋭利な
端で擦傷した。明らかな連続的な出血を起こさない限り、標準回数の１０回引っ
掻くことにより均質な点状出血を起こさせた。したがって、各例において、標準
的で再現性のある損傷が生じた。

【００７３】 Stanniusポジショナル縫合糸(Ethibond ６/０または同様のもの）を一針ずつ
（single throws）擦傷領域（腹腔壁および子宮角）の各末端部の５mm外側に通
した。これら縫合糸は腹膜および対応子宮角の漿膜のみを通した。コントロール
群については、２つの並列した擦傷領域を一致させて締め付け、２領域間の接触
を維持した。この時点から計時を始めた。処置群については、ポジショナル縫合
糸を２つの擦傷領域をぴったり一致させて（ただし、接触させずに）固定し、次
いで、フィブリンシーラントを擦傷領域に適用した。次に、縫合糸を一緒に引き
、密接な縫合を避け、適度に接触するのに必要な張力で２領域を接触させた。こ
の時点で計時を開始した。

【００７４】 損傷後３０分までサンプリングした群では、ウサギを仰臥位で麻酔し続け、組
織クランプで開腹部を閉じて保持した。損傷１時間後からサンプリングした群で
は、開腹部を閉じ、適切な時間後に再度開いた。

【００７５】 開腹創の閉鎖は２層にし、最初に、腹膜および筋層用の無外傷性半丸針と２/
０プレーンカットグットを用い、移植用ロングフロー、オーバーアンダー、非断
続（non-interrupted)交差縫合を、また第二に、半丸角針と２/０ Proleneまた
は同等物を用い、皮膚用の断続マットレス縫合を用いた。傷口を閉じた直後に、
創傷包帯（剤）を傷口とその周りに適用した。

【００７６】 術後１４日で動物を麻酔した（外科手術の場合）。最初の切開部に沿って開腹
部を再び開け実験領域を確認し、巨視的観察結果を記録し、写真撮影した。５mm
以上の非擦傷組織を含む腹膜の擦傷領域と付随する子宮角を切除した。

【００７７】 実験群の要約を下記表７に示す。

【００７８】 結果 肉眼による結果 コントロール群はすべて(１３/１３)、腹腔壁および子宮角の擦傷部位と結び
つくPSAを示した。処置群において実験的に誘導される肉眼によるPSAの発生率は
、下記グラフ２に示すように、Vivostat（登録商標）シーラントで８.３%、CRYO
-４単位 トロンビンで１６.７%、CRYO-５００単位 トロンビンで６６.７%、Tiss
ucol（登録商標)-４単位 トロンビンで１００%、Tissucol（登録商標)-５００単
位 トロンビンで５０%であった。

【００７９】

【化２】 グラフ２．肉眼によるPSA発生率。

【００８０】 顕微鏡的定量結果 PSAの平均容積は、コントロール群で７３.９３mm^３、Vivostat（登録商標）シ
ーラント処置群で１１３０mm^３、CRYO-４および５００単位トロンビン処置群で
はそれぞれ２１.０６および１７９.９８mm^３、Tissucol（登録商標）-４および
５００単位トロンビン処置群ではそれぞれ１０６.１２および６９.４２mm^３であ
った（グラフ３）。平均PSA容積のコントロールに比べて有意な低下がVivostat
（登録商標）シーラント(P<０.００１)およびCRYO (P=０.０１５２)-４単位 ト
ロンビン処置群でみられた。

【００８１】 コントロール群のPSA形成を１００%とすると、各処置におけるPSAの容積パー
セントは、Vivostat（登録商標）シーラントで１５.２８%、CRYO (４単位 トロ
ンビン)で２８.４９%、CRYO (５００単位 トロンビン)で２４３.４６%、Tissuco
l（登録商標）(４単位 トロンビン)で１４３.５５%、およびTissucol（登録商標
）(５００単位 トロンビン)で９３.９０%であった(グラフ４)。

【００８２】

【化３】 グラフ３．平均PSA容積とSEM、および統計的差。

【００８３】

【化４】 グラフ４. 平均PSA容積パーセント。

【００８４】 すなわち、VivostatフィブリンＩモノマーベースのシーラントは、PSAをコン
トロールよりほぼ８５%減少させ、試験した他のシーラントより有意な改善をも
たらすことによりこのモデルにおいてPSAの優れた阻害法であることを示した。

【００８５】 表８ 術後発生率/減少率

【００８６】 実施例５ この実施例の目的は、ヒト血液から製造したVivostat（登録商標）フィブリン
モノマーベースのフィブリンシーラント(実施例１で製造)の、ラットの盲腸癒着
モデルにおける術後癒着を低下もしくは阻害する能力を評価することである。

【００８７】 実験手順 雌のSprague Dawleyラット１６匹を無作為に２群に分けた。各群に、盲腸およ
び向かい合った腹膜に標準化した擦傷を負わせ、これを非処置で放置するか、ま
たはVivostat（登録商標）フィブリンシーラントをスプレーした。次に、擦傷を
縫合糸を用いて並列させた。次に、動物を回復させ、動物ユニットで１４日間維
持した。

【００８８】 第１４日に、コントロールおよびVivostat（登録商標）フィブリンシーラント
処置動物を安楽死させ、実験部位を取り出した。創傷を肉眼的、組織病理学的、
および立体解析学的に試験した。

【００８９】 結果 擦傷法の際に動物２匹で盲腸に不注意に穿孔を生じた（これは４/０バイクリ
ル(Ethicon UK)による巾着縫合で修復した）。該部位はさらに評価に使用した。
すべての他の外科手術法は無事に完結した。

【００９０】 異常な臨床徴候や死亡はみられなかった。

【００９１】 処置した創傷に使用したフィブリンＩ溶液の濃度は１３.４６〜１６.０２ mg/
mlの範囲であった。平均容量０.７９mlのVivostat（登録商標）フィブリンシー
ラントを、スプレー適用法にて実験部位に適用した。

【００９２】 第１４日の創傷の肉眼による検査では、コントロールの創傷の８/８およびViv
ostat（登録商標）フィブリンシーラント処置創傷の０/８に癒着がみられた。す
べての癒着は緻密で頑強であり繊維質であった。

【００９３】 立体解析学的に測定した術後癒着の平均容積はコントロール例が８９.９１mm
^３、Vivostat（登録商標）フィブリンシーラント処置例が１７.８２mm^３であっ
た。繊維素性様の結合があり、これはVivostat（登録商標）フィブリンシーラン
ト処置例では癒着と判断されなかったが、分析のために癒着容積として記録した
。

【００９４】 結論 癒着の平均容積はVivostat（登録商標）フィブリンシーラント処置群でコント
ロール群より有意に少なかった(P<０.１)。このラット盲腸癒着モデルにおいて
、Vivostat（登録商標）フィブリンシーラントは、コントロールに比べて術後癒
着を減少させる有効な物質である。

【００９５】 実施例６ 本実施例は、ブタの胃、結腸、および盲腸において、上記モデルのウサギ子宮
と同様の部位に外科的損傷を導入することによりPSAの形成／阻害を評価するた
めに計画するものである。PSAを観察するために先に用いたブタモデルはブタが
ヒトと同じ病因により損傷または外傷に対するPSAを生じることを示す。この実
施例において、コントロール（非処置／損傷）動物を実施例１で作製したVivost
at（登録商標）フィブリンモノマーベースのフィブリンシーラントで処理した動
物と比較した（ここで、供給源は、(a)ヒトおよび(b)処置されたブタ由来、すな
わち、自己由来のシーラントであった）。

【００９６】 前投薬として、ケタミン（ケタラール５０mg/ml、塩酸ケタミン）（Parke-Dav
is, Pontypool, Gwent.から供給)(５mg/Kg)、およびキシラジン(Rompun ２%-塩
酸キシラジン２３.３２mg/ml(２０mg/mlキシラジンと同等)、および１mg/mlメチ
ル４-ヒドロキシ-ベンゾエート(保存料)（Bayer Plc., Animal Health Business
Group, Bury St. Edmunds, Suffolk.から供給)(１mg/kg))を大殿筋に筋肉内投
与した。手術室で、ブタに酸素中の４%ハロタンおよび酸化窒素それぞれ１.５L/
分および０.５L/分をマスクを介して鼻に供給して全麻酔導入し、維持した。

【００９７】 一旦、麻酔したブタを手術台上で仰臥位とし、各足をソフトテープで固定した
。試験用に固有のブタ確認番号を付したプラスチック耳標を動物の片耳に固定し
た。各ブタの手術部位を剃毛し、アルコール中のクロルヘキシジンで消毒し、次
いでアルコール中のヨードで２回拭いた。この時点から無菌手術法を遵守した。

【００９８】 動物にドレープをかけた。高周波メスとハサミを用い、胸骨の遠位剣状突起の
水平線から遠位方向に１０-１２cm延長する正中開腹術により螺旋状結腸と胃を
露出させた。

【００９９】 螺旋状結腸の側方表面または盲腸の閉塞（blunt)末端、および胃の側方（medi
o-lateral）漿膜面上の１領域を選び、これら各領域が同側腹腔壁に自然に重ね
合わさるようにした。次に、領域を同側腹腔壁上に領域を選んだ。ウサギ子宮角
擦傷モデルを用いる場合と同様に、各選択領域に、テンプレートとスクレーパー
を用いて擦傷をつけ、明らかな連続的な出血を起こさない限り、標準回数の１２
回引っ掻くことにより均質な点状出血を起こさせた。

【０１００】 縫合糸 (Ethibond ０.６または同等のもの)を、実験部位の各末端部の擦傷領
域の外側に一針いれた。これら縫合糸を、腹膜の内漿膜面のみに通し、次いで胃
または結腸の並べた擦傷領域の各末端の漿膜に通した。縫合糸を締め付けて２つ
の並べた擦傷領域が接触しない程度に互いに接近するようにした。処置例につい
ては、ヒトまたはブタフィブリンシーラントを擦傷領域に適用したが（平均容量
１.３ml／実験部位)、コントロール例には処置を行わなかった。次に、ポジショ
ナル縫合糸を締めて２つの擦傷領域が密接に接触するようにした。

【０１０１】 開腹創の閉鎖は２層にし、最初に、腹膜および筋層用の無外傷性半丸針と２/
０ Dexon Plusを、第二に、半丸角針と２/０ Proleneまたは同等物を用いた。最
初の縫合層には「移植用」ロングフロー、オーバーアンダー、非断続交差縫合を
、第二層には皮膚用の断続マットレス縫合を用いた。

【０１０２】 術後７日目に動物を屠殺し、以下のごとく評価した。動物を外科手術時と同様
に麻酔した。最初の切開部に沿って再度開腹術を行い、実験領域を確認し、肉眼
による観察結果を記録し、写真撮影した。

【０１０３】 ポジショナル縫合糸により各末端で腹膜と結合した結腸、盲腸、および胃の実
験部位を切除した。高用量の静注用ペントバルビトン(Expiral-Pentobarbitone
ナトリウムBP ２００mg/ml、Sanofi Animal Health Ltd., Watford, Hertfordsh
ireより供給)(１５０mg/kg体重))により安楽死させた。

【０１０４】 切除した組織の過剰の脂肪組織を取り除き、堅いカードに平らにピンで留めて
生きているときのような組織の標準的な位置関係を保ち、１０%中性緩衝ホルマ
リン生理食塩水に室温で少なくとも２４時間浸漬して固定した。

【０１０５】 下記表に実験結果を要約する。

【０１０６】 結果 全ての動物は腹膜縫合線と下にある組織、最も頻繁にはそれぞれ網（omentum
）、回腸、盲腸、脾臓、および肝臓との間に全体的なPSAを示した。すべてのこ
れらPSAを鈍性切開により分離したが、実験部位とは干渉しなかった。

【０１０７】 すべてのコントロール実験部位は癒着し、その多くは非常に激しかった。ヒト
フィブリンシーラントで処置した８部位の内５部位は癒着がなく、残る部位はPS
Aまたはフィブリンシーラントにより結合していた。４つのブタフィブリンシー
ラント処置部位のうち２つは癒着なしと確認され、他の部位はPSAまたはフィブ
リンシーラントにより結合していた。

【０１０８】 コントロール群のPSAの平均容積は、結腸が２０７.２５mm^３、盲腸が３１.３
３mm^３、胃が２４８.１１mm^３で全体の平均は１８１.７８mm^３であった。ヒトフ
ィブリンシーラント処置群の平均容積は、結腸、盲腸、および胃でそれぞれ４２
.７８mm^３、８.９６mm^３、および２０４.４７mm^３であり、平均容積は７４.７７
mm^３であった。結腸および盲腸にはPSAはみられなかったが（図８.５)、ブタフ
ィブリンシーラント処置した実験部位では胃が６.２５mm^３、群平均１.２７mm^３ であった(グラフ５)。

【０１０９】 コントロール群のPSA容積を１００%とすると、ヒトフィブリンシーラントによ
る減少は、結腸、盲腸、および胃でそれぞれ７９、７１、および１８%であり、
全体の減少率は５９%であった。ブタフィブリンシーラントによる減少は、コン
トロールに比べ、結腸および盲腸でいずれも１００%、胃で９７%であり、PSAの
減少は全体で９９%であった（グラフ６）。

【０１１０】

【化５】 グラフ５ 平均ＰＳＡ容積およびＳＥＭ

【０１１１】

【化６】 グラフ６ 平均ＰＳＡパーセント

【図面の簡単な説明】

【図１】 実施例２の実験におけるウサギの足の屈筋腱を示す。

【図２】 実施例２における時間によるｄＧ’／ｄｔの変化を示すグラフで
ある。

【図３】 実施例３の癒着実験を示すグラフである。

【図４】 最初の２００秒間の重合の２次反応に基づく、Ｖivostat（登録
商標）、Ｔissucol（登録商標）およびＢeriplast（登録商標）の運動速度定数
の比較を示すグラフである。

【図５】 Ｖivostat、ＴissucolおよびＢeriplastの各種重合時間における
第１破断点での癒着強度を示すグラフである。

【図６】 Ｖivostat、ＴissucolおよびＢeriplastの各種重合時間における
第１破断点での伸びを示すグラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ナイジェル・スコット イギリス、ワイオー24・３エヌキュー、ヨ ーク、エイコーム、ハウンズウェイ８番 (72)発明者 マイケル・ウォーカー イギリス、シーエイチ８・８エイエック ス、フリントシャー、ニア・ホーリーウェ ル、ブリンフォード、ブリンサナン、ホー ムリー Ｆターム(参考） 4C081 AC04 BA11 BA14 BA15 BA16 CD171 CD34 DA14

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 フィブリンシーラントを用いる手術部位の術後癒着の阻害方
   法であって、上記フィブリンシーラントが上記手術部位の炎症性応答の誘発が無
   いか殆ど無いように調製されることを特徴とする方法。
2. 【請求項２】 上記フィブリンシーラントが一酸化窒素の生成を抑制する、
   請求項１記載の方法。
3. 【請求項３】 上記シーラントの少なくとも一部がフィブリンＩポリマーで
   ある、請求項１記載の方法。
4. 【請求項４】 上記シーラントが上記部位への適用時にフィブリンＩポリマ
   ーを生成し、上記フィブリンＩのすべてまたは一部がその後ゆっくりと時間をか
   けてフィブリンIIに変化する、請求項３記載の方法。
5. 【請求項５】 上記シーラントが一酸化窒素の生成を抑制するのに十分なア
   スコルベートを含む、請求項１記載の方法。
6. 【請求項６】 上記フィブリンシーラントが、低減された濃度のフィブロネ
   クチンを有する、請求項１記載の方法。
7. 【請求項７】 一酸化窒素生成を抑制するフィブリンシーラント。
8. 【請求項８】 一酸化窒素生成を抑制するために添加された試剤を含むフィ
   ブリンシーラント。
9. 【請求項９】 炎症性応答を低下させるフィブリンシーラント。
10. 【請求項１０】 少なくともその一部がフィブリンＩポリマーであるフィブ
    リンポリマーである、フィブリンシーラント。
11. 【請求項１１】 理論値より少ない量の線維素ペプチドＡを含む、フィブリ
    ンシーラント。
12. 【請求項１２】 一酸化窒素の生成を抑制するのに十分な量のアスコルベー
    トを含む、フィブリンシーラント。
13. 【請求項１３】 低減された濃度のフィブロネクチンを含有する、フィブリ
    ンシーラント。