JPH09508803A - 固定化酵素調製品の製造方法および固定化酵素調製品の使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本方法は、液体酵素組成物および粒状シリカ担体をグラニュレータ又は押出機に導入することを含んでなる。調製品は安価でありそしてもしも酵素がリパーゼである場合脂肪関連プロセスで用いる期間中満足できる特性を示す。

Description

【発明の詳細な説明】 固定化酵素調製品の製造方法および固定化酵素調製品の使用 本発明は、自由水を欠いている主に有機媒質中で有機合成に対し適用可能な酵 素を含んでなる固定化酵素調製品の製造方法、および固定化酵素調製品の使用に 関する。自由水を欠いている主に有機媒質中で有機合成に対し適用可能な最も普 通の酵素は、リパーゼである。この種の他の酵素の例は、プロテアーゼ、アミダ ーゼ、エステアーゼ、オキシドレダクターゼおよびニトラーゼである。以下にお いて、本発明は、自由水を欠いている主に有機媒質中有機合成に適用可能な酵素 の主な例としてリパーゼを参照しつつ記載されるであろう。語句「有機合成」と は、有機化学において一般に受け入れられるものとして理解されるべきである。 従って、本発明の範囲内に含まれる有機合成の典型的例は以下の如くである：再 エステル化、エステル交換、アシル化、エポキシ化、アミノリシス、アンモノリ シス、酸化および還元。「自由水を欠いている主に有機媒質」とは、一つの相の 媒質として理解でき、その有機部分は少なくとも50％ｗ／ｗに達する。 固定化リパーゼ調製品は、エステル交換および他の脂肪関連プロセス、例えば カカオ脂代替品製造に対する触媒として用いられる。バッチ反応の場合に、反応 が終了すると触媒は再使用のため反応混合物から分解されねばならない。従って 、触媒の良好な濾過性が、満足できる効能に対し必要とされる。 国際公開公報（WO）90／05778は、例えばマーガリン製造に対し使用できる固 定化リパーゼ調製品の製造方法を記載している。この調製品は、マクロポーラス シリカ担体を含んでなる。 ヨーロッパ特許140542は、脂肪のエステル交換用の固定化リパーゼ調製品を記 載している。この調製品はアニオン交換樹脂担体を含んでなる。 双方のこれらの従来技術固定化リパーゼ調製品は、それらが高価であるという 不利益を有する。特に、マーガリン（これは世界的基準で１年当たり数百万トン 生産される）の製造に関し、製造コストを最少化することは重要である。 従って、本発明の目的は特に仕上げられた回分式マーガリン製造後の濾過能力 に関し並びに酵素がリパーゼである場合、連続実施に対しカラム内の圧力降下に 関し、従来技術の固定化酵素調製品と同等又は殆ど同等である技術特性を示すべ き安価な固定化酵素調製品の製造方法およびそのような固定化酵素調製品の使用 を提供することにある。 自由水を欠いている主に有機溶剤中有機合成に適用できる酵素を含んでなる固 定化酵素調製品の製造のための本発明方法は、液体酵素組成物および約100μｍ 未満の粒径を有する粒状シリカ担体が、グラニュレータ又は押出機に導入される べき物質として用いられ、しかる後造粒又は押出しが行なわれる。液体酵素組生 物は、例えばアルコールの主成分に基づく非水性であってよく、あるいは又水性 であってよい。粒状シリカ担体は、幅広い粒度分布、例えば約５μｍ〜100μｍ を示すことができる。請求の範囲と共に本明細書において、「シリカ」はシリカ 又は珪酸塩のいずれかのものとして理解されるべきである。本発明は以下の二つ の態様を含んでなるものと理解すべきである：第一の態様では、粒状シリカ担体 の粒度分布に類似の粒度分布を有する粒状固定化リパーゼ組成物を最初に製造し 、しかる後造粒又は押出しを行う（例６および例７参照）；そして第二の態様で は製造を１つの工程のみで行う（例１〜５参照）。ま た、次のように理解されるべきである；すなわち酵素は造粒又は押出し中結合剤 として作用でき、および／又は特異的結合剤、例えばゼラチン又はポリビニルピ ロリドンが添加できる。本発明に係る発明中、好ましくは噴霧が行なわれるべき であり、通常液体酵素組成物の噴霧および／又は液体形の噴霧剤の噴霧が行なわ れるべきである。また、次のように理解されるべきである；すなわち本発明に係 る方法において使用される装置は任意のグラニュレータ、例えば流動噴霧グラニ ュレータに関する限り、本発明にとって特別な重要性を有さないか、又はミキサ ーが使用できる。 シリカをベースにした粉末固定化リパーゼ調製品は、例えばWO 88／02775，11 頁，21−24行に記載されている。固定化リパーゼ調製品は、バッチプロセス後の 劣った濾過能力並びに連続カラムプロセス中の高い圧力損失の発生のため、回分 式および連続式脂肪関連プロセスの双方に対し完全に不適当である。 固定化リパーゼ調製品は、ヨーロッパ特許579928およびAppl．Microbial．Bio technol．（1988）28：527-530に記載されているが、これらの従来技術のリパー ゼ調製品のいずれもシリカ担体を含んでなる。 Chem．Abstract Vo1.118（1993）：55095vにおいて、シリカ担体上の固定化リ パーゼ調製品が記載されている。しかし、担体の粒径および造粒又は押出しを含 んでなる本発明に係る方法は記載されていない。 驚くべきことに、以下の内容が見出された；すなわち第一の場において本発明 に係る方法は、比較し得る従来技術の固定化酵素調製品と比較して劇的により安 価であり、そして第二の場においてそれはもしも酵素がリパーゼである場合、回 分式脂肪関連プロセス後の濾過能力および連続脂肪関連プロセス中の低圧力損失 の発生に関し 、従来技術の固定化酵素調製品に等しいか又は殆ど等しい技術的性質を示す。 本発明に係る方法の好ましい態様は、酵素がリパーゼであることを特徴とする 。 本発明に係る方法の好ましい態様は、液体リパーゼ組成物中のリパーゼが熱安 定性リパーゼであることを特徴とする。 本発明に係る方法の好ましい態様は、液体リパーゼ組成物中のリパーゼが、フ ミコラ種、カンジダアンタルクチカ又はリゾムコールマイヘイの種から由来する リパーゼをコードしそして発現する遺伝子を含有する微生物を培養することによ り生産される。 本発明に係る方法の好ましい態様は、液体リパーゼ組成物の量と粒状シリカ担 体の重量間の割合は、１ｇ（乾燥重量）の担体当たり少なくとも100,000LUであ る。LUは、AF95．1/2-GB（これは、要求によりノボノルディスクＡ／Ｓから入手 できる）において規定されたリパーゼ単位である。LU分析は、リパーゼ活性の測 定に対する基質としてトリブチリンを用いる。 本発明に係る方法の好ましい態様は、少なくとも50％、好ましくは少なくとも 75％の純度を有することを特徴とする。 本発明に係る方法の好ましい態様は、結合剤、好ましくはゼラチン又はポリビ ニルピロリドンの液体組成物を、造粒又は押出し中グラニュレータ又はミキサー 内に噴霧により導入することを特徴とする。 本発明に係る方法の好ましい態様は、造粒又は押出しが少なくとも90％の量に 相当する粒度分布50μｍ〜2,000μｍを有する固定化リパーゼ調製品の製造に対 して行なわれることを特徴とする。 本発明に係る方法により製造される固定化酵素調製品の使用は、酵素により触 媒化されるプロセスに対するものである。 本発明に係る方法によって製造される固定化リパーゼ調製品の使用は、脂肪関 連プロセスに対するものである。そのような脂肪関連プロセスは、回分式又は連 続的に行うことができると理解すべきである。回分式に行なわれるときに、以下 の内容が見出された；すなわち本発明に係る方法により製造される固定化リパー ゼ調製品は、酵素プロセスが終了に至ったとき満足な濾過能力を示しそして連続 的に行なわれるとき、本発明に係る方法によって製造される固定化リパーゼ調製 品は、カラムの満足できる性能をもたらす良好な物理的強度を示す。 本発明に係る使用の好ましい態様は、脂肪のエステル交換に対してでありそし て脂肪酸又は脂肪エステルを含む液体脂肪又は脂肪混合物を、固定化リパーゼ調 製品と接触させることを特徴とする。 本発明に係る使用の好ましい態様は、グリセリド又は他の脂肪酸エステルの合 成に対するものでありそしてグリセロール又は置換グリセロール又は他のタイプ のアルコールおよび遊離脂肪酸の混合物を、固定化リパーゼ調製品と接触させる ことを特徴とする。 本発明に係る使用の好ましい態様は、糖脂質の合成に対するものである。一般 に、固定化リパーゼ調製品を用いた糖脂質の合成は、ブリックリング，Ｆ．等（ 1989），J．Chem．Soc.，Chem．Commun.，934-935頁に記載されている。 本発明を次の実施例により例示する。 製造例（１−８）は、本発明に係る方法の回分式態様を示す。工業的規模の製 造に対し、通常連続式態様が好ましいであろう。例９は使用例である。 本発明に係る使用は、各BAUN測定が本発明に係る使用（エステル交換）を説明 することの事実を考慮すると、例１−８に間接的に示される。 直接例９に関する図１は、時間に応じ、連続カラム操作として実施されるエス テル合成における変換を示す。 実施例 例 １ 合成ケイ酸マグネシウム（Celkate T-21(Manville)）の粉末65ｇを、900rpmの 速度で操作できるインペラを有する高速ミキサー中に導入した。75ｇのフミコラ ラヌギノサリパーゼ液体コンセントレート（フミコララヌギノサDSM3819を用い 、デンマーク特許157560に従って調製、乾燥物質含量30％、700,000LU／mlの活 性を有する）を、ランニングインペラーを用い約５分にわたりシリカ粉末上に連 続的に噴霧した。形成した粒質物を室温で一夜乾燥しそして篩別した（300−700 μｍ）。水分率を10％に調節し次いでサンプルを2.6BAUN／ｇに分析した。BAUN （Batch Acidolysis Units Novo）で測定したリパーゼ活性分析により、高級オ レエートひまわり油（10％水、70℃）へのデカン酸の導入の初期速度を測定する 。方法の詳細な記載（MP 9410704）は、要求によりノボノルディスクＡ／Ｓから 入手可能である。 例 ２ 65ｇのCelkate T-21を例１に示したように高速ミキサーに導入した。例１に示 した如き1.25ｇのフミコララヌギノサリパーゼ液体コンセントレートを、操作イ ンペラを用い粉末上に連続的に噴霧した。しかる後、３％（ｗ／ｗ）Kollidon K 25ポリビニルピロリドン（BASF）を有する50ｇのフミコララヌギノサリパーゼ液 体コンセントレートを粉末上に噴霧した。形成した粒質物を室温で一夜乾燥し次 いで篩別した（300−700μｍ）。水分率を10％に調節し次いでサンプルを分析し 0.5BAUN／ｇを得た。 例 ３ 40ｇの焼成珪藻上の粉末、Clarcel CBL3（Ceca S.A.）を、例１に示したよう に高速ミキサーに導入した。例１に示した如き11ｇのフミコララヌギノサリパー ゼ液体コンセントレートを、操作インペラを用い粉末上に連続的に噴霧した。し かる後、３％（ｗ／ｗ）Kollidon K25ポリビニルピロリドンを有する47ｇのフミ コララヌギノサリパーゼ液体コンセントレートを粉末上に噴霧した。形成した粒 質物を室温で一夜乾燥し次いで篩別した（300−700μｍ）。水分率を10％に調節 し次いでサンプルを分析し2.4BAUN／ｇを得た。 例 ４ 50ｇのClarcel CBL 3を例１に示したように高速ミキサーに導入した。例１に 示した如き1.72ｇのフミコララヌギノサリパーゼ液体コンセントレートを、操作 インペラを用い粉末上に連続的に噴霧した。形成した粒質物を室温で一夜乾燥し 次いで篩別した（300−700μｍ）。水分率を10％に調節し次いでサンプルを分析 し5.1BAUN／ｇを得た。 例 ５ 30ｇのClarcel CBL3および20ｇのタルク粉末を例１に示したように高速ミキサ ーに導入した。例１に示した如き1.20ｇのフミコララヌギノサリパーゼ液体コン セントレートを、操作インペラを用い粉末上に連続的に噴霧した。しかる後、２ ％（ｗ／ｗ）Methoel A-15メチルセルロース（Dow）を有する28ｇのフミコララ ヌギノサリパーゼ液体コンセントレートを粉末上に噴霧した。形成した粒質物を 室温で一夜乾燥し次いで篩別した（300−700μｍ）。水分率を10％に調節し次い でサンプルを分析し7.7BAUN／ｇを得た。 例 ６ 250ｇのCelkate T-21を、３容量の0.1Ｍアセテート緩衝液（pH 4.5）を用い30分間洗浄し、次いで真空濾過した。Celkate T-21の500,000LU／ｇ に相当する量の例１に示す如きフミコララヌギノサリパーゼコンセントレートを 、３容量の0.1Ｍアセテート緩衝液（pH4.5）と共に添加し次いで室温で２時間撹 拌した。真空濾過後、固定化酵素を室温で24時間乾燥し、水分率を10％に調節し 次いで分析し14.3BAUN／ｇを得た。濾液は、78％の吸着に相当する27565kLU（又 は390kLU／ｇ）を含有していた。 Celkate T-21粉上でこのように乾燥した固定化酵素65ｇを、例１に示すように 高速ミキサーに導入した。55ｇの５％（ｗ／ｗ）ゼラチン溶液を操作インペラを 用い粉末上に噴霧した。しかる後、0.1ｇのAerosil 200二酸化ケイ素（Degussa ）を添加した。水分率を10％に調節し次いで分析し5.9BAUN／ｇを得た。 例 ７ 200ｇのClarcel CBL3を、３容量の0.1Ｍアセテート緩衝液（pH4.5）を用い30 分間洗浄し、次いで真空濾過した。Clarcel CBL3の 500,000LU／ｇに相当する量 の例１に示す如きフミコララヌギノサリパーゼコンセントレートを、３容量の0. 1Ｍアセトテート緩衝液（pH4.5）と共に添加し次いで室温で２時間撹拌した。真 空濾過後、固定化酵素を２−３容量の0.1Ｍアセテート緩衝液（pH4.5）で２回洗 い次いで脱イオン水で２回洗った。濾液は、17％の吸着に相当する合計で82761k LU（又は86kLU／ｇ）を含有していた。 C1arcel CBL3粉上でこのように乾燥した固定化酵素55ｇを、例１に示すように 高速ミキサーに導入した。２％（ｗ／ｗ）ゼラチンおよび１％（ｗ／ｗ）Methoc el A-15メチルセルロース（Dow）を含有する1.61ｇの溶液を操作インペラを用い 粉末上に噴霧した。しかる後、0.1ｇのAerosil 200二酸化ケイ素（Degussa）を 添加した。水分率を10％に調節し次いで分析し8.4BAUN／ｇを得た。 別の部分、すなわち1.5ｇのClarcel CBL3粉末上にこのようにして形成された 固定化リパーゼを例１に示すように高速ミキサー中に導入した。59ｇの５％（ｗ ／ｗ）ゼラチン溶液を、操作インペラを用い粉末上に連続的に噴霧した。しかる 後、0.1ｇのAerosil 200二酸化ケイ素（Degussa）を得た。形成した粒質物を室 温で乾燥し次いで篩別した（300-700μｍ）。水分率を10％に調節し次いで分析 し10.1BAUN／ｇを得た。 例 ８ これは例１−７と同様に製造例であるが、しかし別のリパーゼ生産微生物を用 いた。 サンプルの調製１：250,000LU／ｇの活性を有する12.9ｇのカンジダアンタルク チカＢリパーゼ凍結乾燥粉末および1.4ｇのKollidon K25を、51mlの脱イオン水 に溶解した。50ｇのCelkate T-21を例１に示すように高速ミキサーに導入し次い でカンジダアンタルクチカＢリパーゼの溶液を操作インペラを用い、粉末上に連 続的に噴霧した。形成した粒質物を室温で一夜乾燥し次いで篩別した（300−100 0μｍ）。 サンプルの調製２：12.9ｇのカンジダアンタルクチカＢリパーゼおよび0.86ｇの Methocel A-15を、51mlの脱イオン水に溶解した。50ｇのCelkate T-21を高速ミ キサーに導入し次いで前記溶液を操作インペラを用い、粉末上に連続的に噴霧し た。形成した粒質物を室温で一夜乾燥し次いで篩別した（300−1000μｍ）。 サンプルの調製３：12.8ｇのカンジダアンタルクチカＢリパーゼおよび0.8lｇの Kollidon K25を、48mlの脱イオン水に溶解した。50ｇのCelkate T-21を高速ミキ サーに導入し次いで前記溶液を操作インペラを用い、粉末上に連続的に噴霧した 。形成した粒質物を室温で一夜乾燥し次いで篩別した（300−1000μｍ）。 例 ９ これは、図１に関連し、例８に係る調製品を用いた使用例である。 例８で記載した３種のサンプルを、エチルグルコシド（EG）デカン酸を反応さ せることによるエチルグルコシドエステル（EGE）の連続合成によりカラムにお いて評価した。 反応条件： カラム寸法：直径＝1.5cm；長さ＝20cm サンプル径：5.0ｇ 基 質 ：エチルグルコシド^*) 4.98kg デカン酸 4.92ｇ 第三級ブタノール25％ 3.30ｇ 温度 ：60℃ 流量 ：30ｇ／時 時間 ：162時間 ^*)カチオン交換剤の存在下エタノールとＤ−グルコースとの反応により合成 サンプルを18時、44時、90時および162時後に採取し次いでEGEおよびEGの量を HPLCで測定し次いで％変換を計算した。結果を図１に示す。更に、サンプルの物 理的安定性が良好であることは注目すべきであった。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)， ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｈ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ， ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，Ｍ Ｗ，ＭＸ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ， ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 アースミュレ，ペル デンマーク国，デーコー−2880 バグスバ エルト，ノボ アレ，ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．遊離水を欠いている主に有機媒質中で有機合成に適用可能な酵素を含んで なる、固定化酵素調製品の製造方法であって、液体酵素組成物および約100μｍ 未満の粒径を有する粒状シリカ担体を、グラニュレータ又はミキサーへ導入すべ き物質として用い、しかる後造粒又は押出しを行うことを特徴とする、前記製造 方法。 ２．酵素がリパーゼである、請求の範囲第１項記載の方法。 ３．液体リパーゼ組成物中のリパーゼが熱安定性リパーゼである、請求の範囲 第２項記載の方法。 ４．液体リパーゼ組成物中のリパーゼを、フミコラ種、カンジダアンタルクチ カ又はリゾムコールマイヘイの菌株由来のリパーゼをコードしそして発現する遺 伝子を含有する微生物を培養することによって生産する、請求の範囲第２又は３ 項記載の方法。 ５．液体リパーゼ組成物の量と粒状シリカ担体の重量の割合が、担体（乾燥重 量）１ｇ当たり少なくとも100,000LUである、請求の範囲第２〜４項のいずれか １項に記載の方法。 ６．シリカは、少なくとも50％、好ましくは少なくとも75％の純度を有する、 請求の範囲第１〜５項のいずれか１項に記載の方法。 ７．グラニュレータ、好ましくは高速ミキサー又はミキサーグラニュレータを 用いる、請求の範囲第１〜６項のいずれか１項に記載の方法。 ８．バインダー、好ましくはゼラチン又はポリビニルピロリドンの液体組成物 を、造粒又は押出し中グラニュレータ又は押出機へ噴霧により導入する、請求の 範囲第１〜７項のいずれか１項に記載の方法。 ９．造粒又は押出しが、少なくとも90％の量に相当し50μｍ〜2, 000μｍの粒度分布を有する固定化酵素調製品の製造に対して行なわれる、請求 の範囲第１〜８項のいずれか１項に記載の方法。 10．酵素により触媒化されるプロセスに対する、請求の範囲第１〜９項のいず れか１項に記載の方法によって製造される固定化酵素調製品の使用。 11．脂肪関連プロセスに対する、請求の範囲第２〜９項のいずれか１項に記載 の方法によって製造される固定化リパーゼの使用。 12．遊離脂肪酸又は脂肪酸エステルを含む、液体脂肪又は脂肪混合物を、固定 化リパーゼ調製品と接触させることを特徴とする、脂肪のエステル交換のための 請求の範囲第11項記載の使用。 13．グリセロール又は置換グリセロール又は他のタイプのアルコールの混合物 を、固定化リパーゼ調製品と接触させることを特徴とする、グリセリド又は他の 脂肪酸エステルの合成のための請求の範囲第11項記載の使用。 14．脂肪酸エステルが糖脂質である、請求の範囲第13項記載の使用。